專利名稱：增強(qiáng)噬菌體溶菌基因打孔效率的dna序列及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種增強(qiáng)子樣DNA序列，尤其涉及一種經(jīng)基因重排后獲得的非編 碼區(qū)的DNA序列，該DNA序列能夠有效提高噬菌體溶菌基因(mE)編碼蛋白對(duì) 細(xì)菌的打孔效率，本發(fā)明還涉及該DNA序列在制備細(xì)菌菌蛻中的用途，屬于基因 工程領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
增強(qiáng)子(enhancer)是指增加同它連鎖的基因轉(zhuǎn)錄頻率的DNA序列，增強(qiáng)子是通 過(guò)啟動(dòng)子來(lái)增加轉(zhuǎn)錄的。有效的增強(qiáng)子可以位于基因的5'端，也可位于基因的3， 端，有的還可位于基因的內(nèi)含子中。增強(qiáng)子的效應(yīng)很明顯， 一般能使基因轉(zhuǎn)錄頻率 增加10 200倍，有的甚至可以高達(dá)上千倍。
增強(qiáng)子是真核細(xì)胞中增強(qiáng)啟動(dòng)子功能的順式作用元件。隨著人們對(duì)原核生物基 因表達(dá)調(diào)控的深入研究，人們發(fā)現(xiàn)在原核生物的調(diào)控系統(tǒng)和某些病毒基因組DNA 片段中也具有增強(qiáng)子樣功能。這些研究對(duì)揭示原核系統(tǒng)的基因表達(dá)調(diào)控和增強(qiáng)外源 基因在原核系統(tǒng)中的表達(dá)水平具有重要的理論意義和實(shí)用價(jià)值。
1981年，Benerji在SV40DNA中發(fā)現(xiàn)一個(gè)140bp的序列，它能大大提高 SV40DNA/兔(3-血紅蛋白融合基因的表達(dá)水平，這是發(fā)現(xiàn)的第一個(gè)增強(qiáng)子。它位 于SV40早期基因的上游，由兩個(gè)正向重復(fù)序列組成，每個(gè)長(zhǎng)72bp。目前發(fā)現(xiàn)的增 強(qiáng)子多半是重復(fù)序列， 一般長(zhǎng)50bp,通常有一個(gè)8-12bp組成的"核心"序列，如SV40 增強(qiáng)子的核心序列是5，-GGTGTGGAAAG-3，。增強(qiáng)子有別于啟動(dòng)子處有兩點(diǎn)1) 增強(qiáng)子對(duì)于啟動(dòng)子的位置不固定，而能有很大的變動(dòng)；2)它能在兩個(gè)方向產(chǎn)生相 作用。 一個(gè)增強(qiáng)子并不限于促進(jìn)某一特殊啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄，它能刺激在它附近的任一 啟動(dòng)子。
增強(qiáng)子可分為細(xì)胞專一性增強(qiáng)子和誘導(dǎo)性增強(qiáng)子兩類1 )組織和細(xì)胞專一性 增強(qiáng)子。許多增強(qiáng)子的增強(qiáng)效應(yīng)有很高的組織細(xì)胞專一性，只有在特定的轉(zhuǎn)錄因子 (蛋白質(zhì))參與下，才能發(fā)揮其功能。例如免疫球蛋白基因的增強(qiáng)子只有在B淋巴胞
3內(nèi)，活性才最高。除此以外，在胰島素基因和胰凝乳蛋白酶基因的增強(qiáng)子中都發(fā)現(xiàn) 了有很強(qiáng)的組織特異性。此外，所有的增強(qiáng)子中均有一段由交替的嘧啶-嘌呤殘基組
成的DNA，這種DNA極易形成Z-DNA型；故有人認(rèn)為在形成一小段Z-DNA后， 增強(qiáng)子才有功能。在酵母中有類似增強(qiáng)子的順序，稱為上游激活順序(UAS)。 UAS 能向兩個(gè)方向起作用。并位于啟動(dòng)子上游的任何距離處，但在啟動(dòng)子下游則無(wú)作用 (有別于一般的增強(qiáng)子)。小鼠乳腺腫瘤病毒(MMTV)DNA的轉(zhuǎn)錄可受糖類固醇激素 的刺激。這個(gè)能受激素影響的順序位于轉(zhuǎn)錄起點(diǎn)上游約100bp處。此順序能和激素 及其蛋白受體組成的復(fù)合物相結(jié)合。當(dāng)將此順序放在某基因的啟動(dòng)子的任一方面(即 上游或下游)和各種不同的距離時(shí)，它仍能刺激該基因的轉(zhuǎn)錄。所以增強(qiáng)子激活作用 可能是糖類固醇調(diào)控一組靶基因的機(jī)制:糖類固醇激素進(jìn)入細(xì)胞后即與其受體結(jié)合。 結(jié)合作用激活受體，使其能識(shí)別存在于增強(qiáng)子中的共同順序，進(jìn)而激活了在增強(qiáng)子 附近能對(duì)糖類固醇起反應(yīng)的基因。即當(dāng)糖類固醇-受體復(fù)合物和增強(qiáng)子結(jié)合時(shí)，其附 近的啟動(dòng)子即起始轉(zhuǎn)錄。2)誘導(dǎo)性增強(qiáng)子。這種增強(qiáng)子的活性通常要有特定的啟 動(dòng)子參與。例如，金屬硫蛋白基因可以在多種組織細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄，又可受類固醇激素、
鋅、鎘和生長(zhǎng)因子等的誘導(dǎo)而提高轉(zhuǎn)錄水平。 1、原核生物基因組中增強(qiáng)子樣序列的研究
在氮缺乏培養(yǎng)基中,大腸桿菌g/" ALG操縱子的轉(zhuǎn)錄激活需低濃度的ntrc基因產(chǎn) 物NR1。 Reifzer及Magasam等研究發(fā)現(xiàn)，該操縱子的glnAP啟動(dòng)子上游區(qū)有兩個(gè)NRl 強(qiáng)結(jié)合位點(diǎn)。缺失突變研究表明，定位于2 100bp及2 150bp附近的這兩個(gè)NRl強(qiáng)結(jié)合 位點(diǎn)與轉(zhuǎn)錄活性密切相關(guān)。它們的缺失會(huì)使低濃度NR1的轉(zhuǎn)錄激活作用喪失。將這 段DNA序列向上移動(dòng)1 400bp或向下移動(dòng)2 OOObp,不影響他們對(duì)NR1的應(yīng)答。 Drummond等對(duì)i:. ;7MeMmom'ae操縱子的研究也發(fā)現(xiàn)，該啟動(dòng)子上游159bp處的缺失 會(huì)使其依賴高濃度NR1的轉(zhuǎn)錄起始減弱4倍。缺失的2170bp至2 156bp的核苷酸序列 為GCACNsCGGCCC，僅3個(gè)堿基與glnAP2的結(jié)合序列GCACN5TGGTGC不同，這可 能是它與其它氮調(diào)節(jié)基因 一樣需高濃度而不是低濃度NR1激活的原因。Ames和 Nikaido在研究X 0^^w,^m系統(tǒng)時(shí)也發(fā)現(xiàn)了 一個(gè)NR1強(qiáng)結(jié)合位點(diǎn)，定位于ArgT基因 下游60bp和hisJ基因上游120bp處，NR1結(jié)合該位點(diǎn)可激活這兩個(gè)基因的啟動(dòng)子。這 些原核生物基因調(diào)控區(qū)的結(jié)合位點(diǎn)都具有不依賴于位置及方向激活啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄的 特征,與真核細(xì)胞中的增強(qiáng)子極為相似。Buckd等發(fā)現(xiàn)，X. ;wewmom'ae的m/H啟動(dòng)子 上游272bp至2 184bp間的缺失可極大降低m/特異激活物m/ A對(duì)它的轉(zhuǎn)錄活化。對(duì) "i/H、 myU和myB啟動(dòng)子上游序列的研究分析表明，這種上游序列只存在于m/A激活的基因中。他們確定了一個(gè)在K/7wewmom'ae、 i /z/zoWwn和爿zoto6fl"er的m/啟動(dòng)子 中共同存在的保守序列，它是一個(gè)蛋白質(zhì)結(jié)合位點(diǎn)，m/A在此與m/啟動(dòng)子相互作 用。該序列位于轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)上游100bpA處，是一個(gè)由AT富含序列隔開(kāi)的TGTNACA 序列。它本身不具啟動(dòng)子活性，必須與轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)上游的224區(qū)及212區(qū)保守序列一 起才能啟動(dòng)高效的轉(zhuǎn)錄。進(jìn)一步的研究表明，該序列對(duì)下游啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄活化作用 與位置及方向無(wú)關(guān)，即使移位至2 000bp以外，也具轉(zhuǎn)錄活化作用。但其最佳位置在 2 136bp附近。Better等也發(fā)現(xiàn)iC戶"ewmo"/ae的基因m'/A產(chǎn)物對(duì)i /zizo6/wm 的m/HDK啟動(dòng)子的最大激活作用需上游序列的存在，相似的上游序列要求也存在于 i /zizo6/"w乂w/ om'Mm的m/H和m/D啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄活化中，可見(jiàn)m/A結(jié)合序列也是一 種增強(qiáng)子相似序列。Goreiarrubio和Grarmbias對(duì)大腸桿菌g/" ALG及鄰近的82kD蛋白 基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控進(jìn)行了對(duì)比研究。82kD蛋白基因的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)位于上游2 272bp 處，轉(zhuǎn)錄方向與g/"ALG相反，這樣g/"AP上游的兩個(gè)NRl強(qiáng)結(jié)合位點(diǎn)也同樣處于 82kD上游相似位置。但研究結(jié)果表明結(jié)合NRl位點(diǎn)僅對(duì)g/" AP2有作用，它存在與否 對(duì)82kD的轉(zhuǎn)錄無(wú)明顯影響，這說(shuō)明g/n AP2上游的原核增強(qiáng)子樣序列的作用具啟動(dòng) 子特異性。進(jìn)一步研究分析表明，這種特異性是由RNA聚合酶cj因子種類及啟動(dòng)子 結(jié)構(gòu)共同決定的。g/" AP2啟動(dòng)子保守區(qū)位于227bp至2410bp間的 TTGGCACANTCGCT , 與Ntr-型啟動(dòng)子的224bp和212bp保守區(qū)序 CTGGYAYRNTTGCA相似，可被60識(shí)別。而82P啟動(dòng)子保守區(qū)是235區(qū)和210區(qū)間的 TTGTAGNTACAAT，屬于Pribnow2型啟動(dòng)子，識(shí)別它的o因子為o70。 Herendeew等 在對(duì)T4噬菌體的轉(zhuǎn)錄控制機(jī)制進(jìn)行深入研究后，進(jìn)一步闡明原核增強(qiáng)子與真核增強(qiáng) 子的不同在于其具較強(qiáng)的啟動(dòng)子特異性，可分為兩大類Pribnow-型啟動(dòng)子的保守 區(qū)為210區(qū)及235區(qū)，為o70識(shí)另'J,位于它們上游區(qū)的增強(qiáng)子樣序列為AT豐富區(qū)；Ntr-型啟動(dòng)子的保守區(qū)為212區(qū)和224區(qū)，可為cj60識(shí)別，位于其上游區(qū)的增強(qiáng)子序列為 TGTNACA。
1990年中國(guó)學(xué)者潘衛(wèi)等發(fā)現(xiàn)，大腸桿菌JM103染色體DNA中一個(gè)1 000 bp長(zhǎng)的片段(M)能以方向不依賴的特性促進(jìn)痘苗病毒P715及N啟動(dòng)子對(duì)CAT基 因及]32半乳糖苷酶基因的表達(dá)，但具一定的位置依賴性，位于基因的3端或上游2 000bp外則無(wú)增強(qiáng)作用。它也具有一定的宿主特異性，在JM103、 MC1061及C600中 增強(qiáng)表達(dá)的效應(yīng)大致相近，但在HB101中則無(wú)明顯的增強(qiáng)作用。同時(shí)，該片斷本身 還具有啟動(dòng)子功能,可啟動(dòng)檢測(cè)載體中位于其下游的CAT基因的表達(dá)。此片段的轉(zhuǎn) 錄增強(qiáng)作用不能簡(jiǎn)單地以串聯(lián)啟動(dòng)子功能來(lái)解釋，因?yàn)橐訫2P7.52CAT方式排列時(shí)，M可增強(qiáng)P7.5的轉(zhuǎn)錄活性；而以P7.52M2CAT方式排列時(shí)，CAT表達(dá)不明顯增加。上 述研究結(jié)果表明，該l殳具有原核增強(qiáng)子樣功能。宮慶紅等對(duì)此M片^R進(jìn)行了進(jìn)一步 研究，他們用BstI將M片段消化成LM(2 535bp)及SM(2 355bp)兩個(gè)小片段，克隆入 檢測(cè)載體后發(fā)現(xiàn)，M片段的原核增強(qiáng)子樣功能主要集中在5，端355bp的SM小片段上。 該小片段可在大腸桿菌中使疫苗病毒N啟動(dòng)子控制下的CAT基因表達(dá)提高3-7倍，其 增強(qiáng)活性與M片段相似，也無(wú)方向依賴性。它也具相對(duì)的宿主依賴性，在不同大腸 桿菌中的增強(qiáng)作用依次JM103〉DH5cOLE392〉HB101 。謝明等采用缺失突變對(duì)M片段 的研究進(jìn)一步證明，M片段的活性部位位于該序列的5，端，為多位點(diǎn)協(xié)同作用。在 M序列3，端上游440bp-2 500bp、 5 80bp-2 640bp和740bp-2 800bp處各存在一個(gè)長(zhǎng)度為 60bp的活性位點(diǎn)，取中間值標(biāo)定410bp、 610bp和770bp處左右范圍30bp。三個(gè)位點(diǎn) 同時(shí)存在增強(qiáng)活性最高，同時(shí)缺失兩個(gè)位點(diǎn)時(shí)增強(qiáng)活性即喪失。 2真核病毒基因組中原核增強(qiáng)子樣序列的研究
原核增強(qiáng)子樣序列除存在于原核生物基因組中外，在某些真核病毒基因組中也 發(fā)現(xiàn)了一些序列可以增強(qiáng)子樣功能促進(jìn)外源基因在大腸桿菌中的表達(dá)。1985年我國(guó) 學(xué)者侯云德在探討SV40增強(qiáng)子對(duì)原核表達(dá)系統(tǒng)的影響時(shí)發(fā)現(xiàn),SV40歷'"c/ IIIB片段 對(duì)人aD型IFN基因在大腸桿菌中的表達(dá)有明顯的增強(qiáng)作用。SV40基因組DNA經(jīng) 頂^/III酶切后可產(chǎn)生A、 B、 C、 D、 E、 F六個(gè)片段，其中B片段(4 002bp-2 517bp) 含有完整的t抗原基因，C片段(517bp-2 1046bp)含SV40DNA的ori及721bp重復(fù)序列。 將它們分別插入PL啟動(dòng)子控制的IFN基因上游1200bp處，歷m/ IIIB片段的插入可使 IFN的表達(dá)提高711倍,而C片段的插入無(wú)明顯增強(qiáng)作用。吳激華等的研究也表明預(yù)V^ niB片段在大腸桿菌中可使PL控制下IFN-(3的表達(dá)水平提高515倍。1996年吳激華等 又發(fā)現(xiàn)不僅SV40歷'wt/IIIBl 100bp片段(SV40-HB)具原核增強(qiáng)子樣功能，痘苗病毒的 MM III K的211 OOObpBgl片段(w-k)及呼吸道合胞病毒(RSV)SflmH I-G的0.7KB片段 (RSV-G)也具有原核增強(qiáng)子樣功能。這些片段正向插入可使外源基因表達(dá)增強(qiáng) 3.7-7.3倍，反向插入可增強(qiáng)1.5-7.6倍，增強(qiáng)強(qiáng)度次序?yàn)镽SV2G〉w-k〉SV40-HB。這些 片段也均具有原核啟動(dòng)子功能，可使克隆至下游的CAT基因表達(dá)。對(duì)w-k片^殳的
列進(jìn)行比較,采用微機(jī)與已知的原核和真核轉(zhuǎn)錄激活蛋白的DNA結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行對(duì)比 檢索發(fā)現(xiàn)，在SV40-HB片斷中具SV40中Ap-l結(jié)合位點(diǎn)的共同序列，w-k中有細(xì)菌F13 因子和真核NF-III結(jié)合位點(diǎn)，JM103-M中有兩處SPI結(jié)合位點(diǎn)(GCbox)和一處Ap-l結(jié)合
位點(diǎn)，提示這些序列可能以順式作用元件方式與反式作用因子相互作用,來(lái)增強(qiáng)基因
6在原核細(xì)胞中的表達(dá)。劉哲偉等1992年又發(fā)現(xiàn)人乳頭瘤病毒6b型(HPV-6b)的上游調(diào) 控區(qū)在大腸桿菌中也具有增強(qiáng)子樣功能。HPV-6b基因組中位于E6的ATG起始密碼 子上游310bp至852bp間的540bp片段，即其非編碼區(qū)(uuR)的上游端,在大腸桿菌 JM103及MC 1061中可使痘苗病毒P715啟動(dòng)子及P 11啟動(dòng)子控制下的CAT及P-半乳糖 苷酶基因表達(dá)顯著增強(qiáng)。正向插入可使p-半乳糖苷酶基因表達(dá)在JM103及MC1061中 分別提高10倍和6倍，反向插入可提高3倍左右。序列分析表明，這段DNA序列中有 74bp的排列順序?yàn)猷溥枢奏らg隔排列，可分為三組,前兩組均為24bp，呈重復(fù)排列順 序，第三組為26bp,但組合方式與前兩者略有不同。曾有報(bào)道指出這種。票呤嘧"定排 列結(jié)構(gòu)傾向于形成Z-DNA,在真核增強(qiáng)子中，SV40增強(qiáng)子也含這種形式排列,這可 能就是該540bp片段增強(qiáng)子功能的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。
增強(qiáng)子作為一種順式調(diào)控元件，其功能的實(shí)施必然離不開(kāi)反式因子，如增強(qiáng)子 對(duì)相應(yīng)啟動(dòng)子的正確選擇，就需要與一些組織特異性及公共蛋白因子的協(xié)同作用， 這些蛋白因子可能負(fù)責(zé)識(shí)別啟動(dòng)子的核心序列及增強(qiáng)子的保守序列。
從上述研究可以看出，存在于真核生物病毒基因組中的原核增強(qiáng)子樣序列與原 核生物基因組中增強(qiáng)子樣序列具有不同的特性。它們沒(méi)有顯著的宿主特異性，但具 有一定的方向特異性，雖然兩種方向的插入均具增強(qiáng)子樣功能，但正向插入一般較 反向插入增強(qiáng)作用更強(qiáng)。更為顯著的是，真核生物病毒基因組中的原核增強(qiáng)子樣序 列還同時(shí)具有原核啟動(dòng)子功能，^提示兩類原核增強(qiáng)子樣序列在結(jié)構(gòu)及作用^L理上有 一定的差異。這些機(jī)理的進(jìn)一步闡明，無(wú)論是對(duì)原核生物表達(dá)調(diào)控的理論研究還是 對(duì)原核基因工程的實(shí)際應(yīng)用都將是極為重要、極具價(jià)值的。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的之一是提供一種能夠增強(qiáng)噬菌體溶菌基因編碼蛋白對(duì)細(xì)菌的打孔 效率的DNA序列；
本發(fā)明目的之二是將上述的DNA序列應(yīng)用于制備細(xì)菌菌蛻(包括大腸桿菌菌 蛻和禽沙門氏菌菌蛻等)。
本發(fā)明上述目的是通過(guò)以下技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn)的
本發(fā)明將PhiX174噬菌體E基因經(jīng)過(guò)基因重排后獲得PhiX174噬菌體E基因 (mE )非編碼序列DNA序列，該DNA序列長(zhǎng)度為74bp ( SEQ ID NO: 1 )，具有增
強(qiáng)子作用。
本發(fā)明將包含有本發(fā)明增強(qiáng)子序列(SEQ ID NO:l)的噬菌體mE基因(SEQ IDNO:2 )與質(zhì)粒pBV220相連接得到打孔載體pBV-mE;將沒(méi)有包含本發(fā)明增強(qiáng)子序 列的噬菌體AE基因(SEQ ID NO:3 )與質(zhì)粒pBV220相連接得到打孔載體pBV-AE; 將打孔載體pBV-mE轉(zhuǎn)化到大腸桿菌通過(guò)對(duì)選取的菌落進(jìn)行28""C過(guò)夜震蕩培養(yǎng)和 42。C培養(yǎng)以誘導(dǎo)mE基因表達(dá)，肉眼觀察打孔效率，可以觀察到非常顯著的打孔結(jié) 果。即呈現(xiàn)清澈透明的菌液，打孔效率達(dá)99.9999%。表明本發(fā)明DNA序列(SEQ IDNO:l)具有增強(qiáng)mE基因的轉(zhuǎn)錄的功效，表達(dá)出更多的mE蛋白，從而有更多的 mE蛋白參與了對(duì)細(xì)菌的打孔，使打孔效率有顯著提高。
同樣的，將打孔載體pBV-AE轉(zhuǎn)化到大腸桿菌，通過(guò)對(duì)選取菌落進(jìn)行28°C過(guò)夜 震蕩培養(yǎng)和42。C培養(yǎng)以誘導(dǎo)AE基因表達(dá)，肉眼觀察打孔效率。結(jié)果表明，在缺失 SEQ ID NO:l序列的情況下，打孔質(zhì)粒載體pBV-AE呈現(xiàn)出非常低的打孔效率，培 養(yǎng)的菌液混濁；打孔載體pBV-mE的打孔效率要高于打孔載體pBV-AE的打孔效率 1000倍以上，說(shuō)明SEQ ID NO:l序列確實(shí)具有增強(qiáng)子樣作用。


圖1大腸桿菌菌影的肉眼觀察結(jié)果 圖2禽沙門氏菌菌影的肉眼觀察結(jié)果
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合具體實(shí)施例來(lái)進(jìn)一步描述本發(fā)明，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和特點(diǎn)將會(huì)隨著描述 而更為清楚。但這些實(shí)施例僅是范例性的，并不對(duì)本發(fā)明的范圍構(gòu)成任何限制。本 領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該理解的是，在不偏離本發(fā)明的精神和范圍下可以對(duì)本發(fā)明技術(shù)方 案的細(xì)節(jié)和形式進(jìn)行修改或替換，但這些^^改和替換均落入本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。
試驗(yàn)材料
菌才朱及質(zhì)粒大腸桿菌TG1以及為^研究室自藏；噬菌體PhiX174購(gòu)于Promega (北京)生物技術(shù)有P艮^^司。質(zhì)粒pBV220的構(gòu)建過(guò)程可按照以下文獻(xiàn)構(gòu)建張智 清，姚立紅，侯云德，含PrPl啟動(dòng)子的原核高效表達(dá)載體的組建及其應(yīng)用，病毒學(xué) 報(bào)，19卯，6 (2), 111 - 116。
實(shí)施例1 打孔質(zhì)粒載體pBV-mE的構(gòu)建、篩選和打孔效果觀察
1.1基因重排技術(shù)制備PhiX174溶菌基因E (mE)
根據(jù)GenBank中逸菌體PhiX174溶菌基因E的編碼序列設(shè)計(jì)引物
8Lysis mE陽(yáng)U: 5'-AGGGAATTCTGGTACGCTGGACTTTGTGG-3' ( SEQ ID N0.4)
Lysis mE-L: 5'-AGGGGATCCGAGCTCTCACTCCTTCCG-3' (SEQ ID N0.5) 上、下游引物5'端分別引入了限制性酶切位點(diǎn)￡coR I和5am H I，由上海生工 合成。以噬菌體PhiX174雙鏈DNA為模板擴(kuò)增溶菌基因E: PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系為 50jiL,其中MgS042mM，上、下游引物各l一， dNTP200 ^M， 10x %《buffer, 7^TMDNA聚合酶2U (TaKaRa),模板DNA10ng。 PCR反應(yīng)程序?yàn)?5°C預(yù)變 性5 min, 94°C 30 s, 59°C 30 s, 72°C 30 s, 30個(gè)循環(huán)，72°C 5 min。 PCR擴(kuò)增后的mE 基因經(jīng)凝膠電泳后用膠回收試劑盒回收，大小為275bp (SEQ ID NO:2 ),其中，增 強(qiáng)子序列為SEQ ID NO: 1所示。
1.2打孔質(zhì)粒載體pBV-mE的構(gòu)建
將溶菌基因mE純化后用￡coR I/Bam H I進(jìn)行雙酶切，用T4 DNA連接酶 (TaKaRa)與經(jīng)五coR I和萬(wàn)am H I雙酶切消化的pBV220載體相連接，16。C過(guò)夜 連接并熱激轉(zhuǎn)化入大腸桿菌TGI感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)菌落PCR鑒定為陽(yáng)性的克隆進(jìn)行 增菌并利用堿裂解法小量提取質(zhì)粒，命名為pBV-mE。
1.3含打孔質(zhì)粒載體pBV-mE大腸桿菌的打孔效率觀察及與74bp非編碼基因的 相關(guān)性
選取含打孔質(zhì)粒載體pBV-mE的大腸桿菌TGI的菌落，接種在5 mL含50(ig/mL 氨芐青霉素的LB中，28"過(guò)夜震蕩培養(yǎng)(220 r/min),然后轉(zhuǎn)接1-2 mL于50mL 含50)ig/mL氨節(jié)青霉素的LB中，28。C震蕩培養(yǎng)至OD,咖達(dá)0.4左右。取出lOO^il 培養(yǎng)物備用，將剩余培養(yǎng)物迅速調(diào)高到42。C培養(yǎng)以誘導(dǎo)mE基因表達(dá)，繼續(xù)培養(yǎng)3-5 小時(shí)，肉眼可以觀察到非常顯著的打孔效率，即呈現(xiàn)出清澈透明的菌液，打孔效率 達(dá)99.9999%,而對(duì)照組則為非?；鞚岬木?。表明SEQ ID NO:l能夠增強(qiáng)打孔質(zhì) 粒載體pBV-mE的打孔效果，具有增強(qiáng)子樣作用。
的相關(guān)性試驗(yàn)
1.1 PCR擴(kuò)增PhiX174缺失74bp的E基因(AE) 沖艮據(jù)GenBank中噬菌體PhiX174溶菌基因E的編碼序列設(shè)計(jì)引物 LysisAE隱U: 5'-AATGGATCCTCACTCCTTCCGCAC-3' ( SEQ ID N0.6 ) LysisAE-L: 5'-GTGGAATTCATGTTCATCCCGTCAAC-3' (SEQ ID N0.7)上、下游引物5'端分別引入了限制性酶切位點(diǎn)￡coR I和萬(wàn)am H I，由上海生工 合成。以噬菌體PWX174雙鏈DNA為模板擴(kuò)增溶菌基因AE: PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系 為50fiL,其中MgS042mM,上、下游引物各1 dNTP200pM， 10x %《buffer, rfl《TMDNA聚合酶2U (TaKaRa),模板DNA10ng。 PCR反應(yīng)程序?yàn)?5°C預(yù)變 性5 min, 94°C 30 s, 59°C 30 s, 72。C 30 s, 30個(gè)循環(huán)，72°C 5 min。 PCR擴(kuò)增后的mEA 基因經(jīng)凝膠電泳后用膠回收試劑盒回收，大小為201bp ( SEQIDN0.3 )。
1.2打孔質(zhì)粒載體pBV-AE的構(gòu)建
將純化溶菌基因AE用五coR I/^zm HI進(jìn)行雙酶切，用T4 DNA連接斷TaKaRa) 與經(jīng)￡coRI和5flm H I雙酶切消化的pBV220載體相連接，16"過(guò)夜連接并熱激轉(zhuǎn) 化入大腸桿菌TGI感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)菌落PCR鑒定為陽(yáng)性的克隆進(jìn)行增菌并利用堿 裂解法小量提取質(zhì)粒，命名為pBV-AE。
1.3含pBV-AE大腸桿菌的打孔效率及與74bp非編碼基因的相關(guān)性 選取含打孔質(zhì)粒載體pBV-AE的大腸桿菌TGI的菌落，接種在5 mL含50嗎/mL 氨卡青霉素的LB中，28。C過(guò)夜震蕩培養(yǎng)(220 r/min)，然后轉(zhuǎn)接1-2 mL于50mL 含50嗎/mL氨芐青霉素的LB中，28。C震蕩培養(yǎng)至OD60(tan達(dá)0.4左右。取出100^1 培養(yǎng)物備用，將剩余培養(yǎng)物迅速調(diào)高到42。C培養(yǎng)以誘導(dǎo)AE基因表達(dá)，繼續(xù)培養(yǎng)3-5 小時(shí)，肉眼可以觀察到打孔效率微弱，效果不明顯，即呈現(xiàn)出混濁的菌液，與對(duì)照 組非?；鞚峋旱牟町惒伙@著。AE基因在缺失74bp非編碼基因的情況下，非但沒(méi) 有提高打孔效率，反而降低了打孔效率。表明含有74bp非編碼基因的mE基因及編 碼蛋白打孔效率非常顯著，而缺失74bp非編碼基因的AE基因及蛋白沒(méi)有打孔^:果。 結(jié)果證明了 74bp非編碼基因具有增強(qiáng)子樣作用。
實(shí)施例3 禽沙門氏菌菌影疫苗的制備
在5 mL含50pg/mL氨芐青霉素的LB中接種含打孔質(zhì)粒載體pBV-mE的禽沙 門氏菌，28°C過(guò)夜震蕩培養(yǎng)(220 r/min )，然后轉(zhuǎn)接1-2 mL于50mL含50昭/mL氨 千青霉素的LB中，28。C震蕩培養(yǎng)至OD6oo^達(dá)0.8(l()9cfo)左右。取出10(^1培養(yǎng) 物備用，將剩余培養(yǎng)物迅速調(diào)高到42。C培養(yǎng)以誘導(dǎo)mE基因表達(dá)，繼續(xù)培養(yǎng)3-5小 時(shí)；取誘導(dǎo)前后的培養(yǎng)物各10(^1適當(dāng)稀釋后涂LB平板進(jìn)行活菌CFU檢測(cè)。試驗(yàn) 結(jié)果溶菌前后的培養(yǎng)物溶菌滅活效率達(dá)99.99%。溶菌結(jié)束后形成的菌影用PBS 洗滌3次，經(jīng)過(guò)紫外消除殘留的活菌，凍干保存，即得。
10實(shí)施例4 大腸桿菌Ghost (菌蛻)的制備
在5 mL含50昭/mL氨卡青霉素的LB中接種含打孔質(zhì)粒載體pBV-mE的大腸 桿菌TGI, 28。C過(guò)夜震蕩培養(yǎng)(220 r/min )，然后轉(zhuǎn)接1-2 mL于50mL含50ng/mL 氨芐青霉素的LB中，28。C震蕩培養(yǎng)至OD6oo^達(dá)0.4左右。取出lOOpl培養(yǎng)物備用， 將剩余培養(yǎng)物迅速調(diào)高到42。C培養(yǎng)以誘導(dǎo)E基因表達(dá)，繼續(xù)培養(yǎng)3-5小時(shí)；取誘導(dǎo) 前后的培養(yǎng)物各100|lU適當(dāng)稀釋后涂LB平板進(jìn)行活菌CFU檢測(cè)。溶菌結(jié)束后形成 的ghost菌蛻用PBS洗涂3次，凍干保存，并對(duì)凍干后的菌蛻進(jìn)行活菌CFU檢觀'J。
試驗(yàn)結(jié)果溶菌前后的培養(yǎng)物從3.1xl()S下降到1.2xl04(CFU/ml),溶菌滅活效 率達(dá)99.99%。序列表
<110>中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所
<120>增強(qiáng)噬菌體溶菌基因打孔效率的DNA序列及其應(yīng)用
<130〉 KLPI08078
〈160> 5
<170> Patentln version 3. 5
<210〉 1
<211〉 74
〈212> DNA
<213> phage
<400> 1
tggtacgctg gactttgtgg gataccctcg ctttcctgcc cctgttgagt ttattgctgc cgtcattgct tatt
60 74
<210〉 2
〈211〉 275
<212> DNA
〈213〉 phage
〈400> 2
tggtacgct ggactttgtg ggataccctc gctttcctgc ccctgttgag tttattgctg ccgtcattgc ttattatgtt catcccgtca acattcaaac ggcctgtctc atcatggaag gcgctgaatt tacggdaaac attattaatg gcgtcgagcg tccggttaaa gccgctgaat tgttcgcgtt taccttgcgt gtacgcgcag gaaacactga cgttcttact gacgcagaag aaaacgtgcg tcaaaaatta. cgtgcggaag gagtga
60 120
180 240 275
<210> 3
〈211〉 201
<212> DNA
<213> phage
<400> 3
atgttcatcc cgtcaacatt caaacggcct
aaaacattat taatggcgtc gagcgtccgg
tgcgtgtacg cgcaggaaac actgacgttc
aaUacgtgc ggaaggagtg a
<210〉 4
<211〉 29
〈212〉 DNA
<213〉 artifical
<400> 4
agggaattct ggtacgctcg acttt gtgg
gtctcatcat ttaaagccgc ttactgacgc
ggaaggcgct tgaattgttc
gaatttacgg gcgtttacct gtgcgtcaaa
60 120 180 201
29
<210〉 5
<211〉 29
〈212〉 腿
〈213〉 artifical
〈400> 5
aggggatccg agctctcact ccttc eg
27
<210〉 6 <211〉 29 <212> DNA<213> artifical <400> 6
agggaattct ggtacgctgg actttgtgg 29
<210> 7
<211> 27
〈212〉 DNA
〈213〉 artifical
<400> 7
aggggatccg agctctcact ccttccg 27
1權(quán)利要求
1、增強(qiáng)噬菌體溶菌基因編碼蛋白打孔效率的DNA序列，其特征在于其核苷酸序列為SEQ ID NO1所示。
2、 重排噬菌體溶菌基因，其特征在于其核苷酸序列為SEQ ID NO: 2所示。
3、 含有權(quán)利要求1所述DM序列的打孔載體。
4、 含有權(quán)利要求2所述重排噬菌體溶菌基因的打孔載體。
5、 按照權(quán)利要求3或4所述的打孔載體，其特征在于所述打孔載體是pBV-mE, 其中，所述mE的核苷酸序列為SEQ ID NO: 2所示。
6、 權(quán)利要求1所述的DNA序列在制備細(xì)菌菌蛻中的用途。
7、 權(quán)利要求2所述的重排噬菌體溶菌基因在制備細(xì)菌菌蛻中的用途。
8、 按照權(quán)利要求6或7所述的用途，其特征在于所述的細(xì)菌菌蛻包括大腸 桿菌菌蛻和禽沙門氏菌菌蛻。
9、 一種制備細(xì)菌菌蛻的方法，包括(l)將權(quán)利要求4所述的打孔載體轉(zhuǎn)化 到細(xì)菌中；(2)增殖培養(yǎng)；(3)誘導(dǎo)噬菌體溶菌基因表達(dá)；(4)收集溶菌結(jié)束后形 成的細(xì)菌菌蛻，凍干保存，即得。
10、 按照權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于步驟(1)中所述的細(xì)菌是大 腸桿菌；步驟(2)中所述的增殖培養(yǎng)是在28。C過(guò)夜震蕩培養(yǎng)至OD6i達(dá)0M;步驟(3 )中所述的誘導(dǎo)是在42。C溫度下進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了增強(qiáng)噬菌體溶菌基因打孔效率的DNA序列及其應(yīng)用。本發(fā)明利用基因重排技術(shù)對(duì)噬菌體E基因進(jìn)行重排，使其閱讀框架為276個(gè)核苷酸的E突變成閱讀框架為201個(gè)核苷酸的ΔE(SEQ ID NO3)，而前74bp基因變?yōu)榉蔷幋a區(qū)序列(SEQ ID NO1)，具增強(qiáng)子類作用。本發(fā)明非編碼區(qū)DNA序列能夠提高噬菌體溶菌基因?qū)Υ竽c桿菌和禽沙門氏菌的打孔效率，由含有本發(fā)明非編碼區(qū)DNA序列的mE基因構(gòu)建到的打孔質(zhì)粒在大腸桿菌中具有很高的裂解效率，而由不含有該非編碼區(qū)DNA序列的ΔE基因構(gòu)建得到的打孔質(zhì)粒pBV-ΔE則只有微弱的打孔效果，二者打孔效果相差1000倍以上。
文檔編號(hào)A61K39/02GK101503686SQ200910118380
公開(kāi)日2009年8月12日 申請(qǐng)日期2009年3月2日 優(yōu)先權(quán)日2009年3月2日
發(fā)明者劉思國(guó), 劉慧芳, 微 司, 常月紅, 偉 彭, 王春來(lái) 申請(qǐng)人:中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所