專利名稱：：恒河猴顳葉癲癇點燃模型及其藥物篩選方法
技術領域：
：本發(fā)明涉及恒河猴顳葉癲癇點燃模型，具體地，是用馬桑內酯在制備恒河猴顳葉癲癇點燃模型的藥物中的用途。
背景技術：
：癲癇是最常見的神經系統疾病之一，在我國發(fā)病率為35/10萬年，患病率為5%0，其中難治性癲癇約占30%。反復癲癇發(fā)作不但給患者造成身心損害，而且長期服藥、社會歧視等同樣也使病人及其家屬背上沉重心理負擔。盡管近年來新型抗癲癇藥物不斷應用于臨床，但是從多項臨床試驗來看，除安全和副作用小外，它們并沒有為難治性癲癇患者的治療帶來明顯改觀，只有約5%的難治性癲癇患者通過新型抗癲癇藥物治療獲得緩解。而成人中常見的顳葉癲癇的預后是各種癲癇類型中最差的，約60-70%的患者為難治性癲癇。因此難治性癲癇尤其是顳葉難治性癲癇的基礎研究和臨床治療是目前世界神經病學界研究的一個熱點。難治性癲癇病因和發(fā)病機制復雜，發(fā)作無預見性，發(fā)作程度難以控制，目前主要通過建立難治性癲癇動物模型探討其發(fā)病機理、耐藥機制以及篩選鑒定新的抗癲癇藥。Loscher(LoscherW.Animalmodelsofintractableepilepsy.ProgNeurobiol01997，53:239-258.)提出耐藥性癲癇模型應具備以下特點(1)發(fā)作類型與臨床耐藥性癲癇的發(fā)作類型相似；(2)模型具有腦部的陣發(fā)性異常放電，并可以從電生理方面評價藥物療效；AED不能滿意控制其發(fā)作；(4)模型動物能存活較長時間。國際上唯一被認可的耐藥性癲癇模型是由Loscher等建立的大鼠耐苯妥英鈉杏仁核電點燃模型，但是該模型的缺點是操作復雜，動物不易飼養(yǎng)，點燃率低，容易死亡，耐藥譜窄，對大鼠腦組織有機械損傷。癲癇動物模型是癲癇發(fā)病機制和治療研究的重要手段之一。點燃癲癇模型是目前應用最廣泛的癲癇模型，其發(fā)病機制被認為與人類癲癇的發(fā)病機制相似。目前常用的主要是化學致癇劑匹羅卡品、紅藻氨酸和戊四唑等點燃的嚙齒類動物模型，還有電刺激腦內敏感部位如杏仁核點燃的動物模型和經雙側角膜反復電刺激(角膜點燃)點燃的模型等，其中有些模型被認為是難治性癲癇模型，但是它們對標準抗癲癇藥物耐藥發(fā)生率低，而且存在對藥物反應不穩(wěn)定的現象，因此極大的限制了這些模型在難治性癲癇研究中的應用。通過肌肉局部注射一種新化學致癇劑馬桑內酯的方法，建立并證實了馬桑內酯點燃大鼠癲癇模型為耐藥性模型，腦電圖顯示為顳葉癲癇，免疫組化法顯示點燃模型腦血管內皮細胞和血腦屏障周圍星形膠質細胞P-gp蛋白表達明顯高于對照組。該顳葉癲癇模型優(yōu)點是建立容易，點燃率高，而且對標準抗癲癇藥物卡馬西平，苯妥英鈉，丙戊酸鈉耐藥。這是國內外第一個該致癇劑點燃的耐藥顳葉癲癇動物模型，文章已于2003年在Epilepsi雜志發(fā)表。因為嚙齒類動物與人類的種屬差異較大，僅從嚙齒類動物的研究來推論人類癲癇的生理和病理生理過程，極易出現偏移和誤導。另一方面大鼠腦容量小，組織檢查取材困難，行為學觀察及腦電圖操作難度大，不利于進一步深入研究。恒河猴屬靈長類動物，在解剖、生理機能及生化代謝等方面與人類相似，是了解人類生理和病理生理知識的較為理想的實驗動物。而目前對靈長類動物癲癇模型研究較少，國內尚未有報道，國外也主要局限在腦內局部注射致癇劑如氧化鋁凝膠、荷包牡丹堿等和電刺激杏仁核、扣帶回等點燃模型。
發(fā)明內容本發(fā)明的技術方案是提供了一種恒河猴顳葉癲癇模型。本發(fā)明的另一技術方案是提供了該動物模型的制備方法和用途。本發(fā)明提供了一種恒河猴顳葉癲癇點燃模型，它是將閾下致癇劑量為0.5ml/kg的馬桑內酯施于恒河猴制備而成的動物模型，其中，每Iml馬桑內酯注射劑相當于6.7g生藥材馬桑葉。其中，所述的馬桑內酯的用法為臀部肌肉注射馬桑內酯，間隔72小時注射一次，共注射48至60次，在模型點燃后改為每隔7天重復注射一次，以維持點燃效果。其中，所述的顳葉癲癇點燃模型是癲癇耐藥動物模型。本發(fā)明還提供了一種制備恒河猴顳葉癲癇模型的方法，將劑量為0.5ml/kg的馬桑內酯施用于恒河猴，其中，每Iml馬桑內酯注射劑相當于6.7g生藥材馬桑葉。其中，所述的馬桑內酯的用法為臀部肌肉注射馬桑內酯，間隔72小時注射一次，共注射48至60次，在模型點燃后改為每隔7天重復注射一次，以維持點燃效果。本發(fā)明還提供了所述的動物模型在篩選治療顳葉癲癇的藥物中用途。其中，所述的動物模型是癲癇耐藥動物模型。本發(fā)明還提供了一種篩選治療顳葉癲癇的藥物的方法，它包括如下步驟a、用馬桑內酯建立顳葉癲癇動物模型；b、將候選藥物施用于a步驟制備的動物模型；C、觀察候選藥物抑制馬桑內酯引起的模型動物顳葉癲癇作情況，并進行評分，評價潛在的治療顳葉癲癇的藥物。其中，a步驟所述的動物模型的制備方法是將劑量為0.5ml/kg的馬桑內酯施用于恒河猴，其中，每1ml馬桑內酯注射劑相當于6.7g生藥材馬桑葉。其中，a步驟所述的動物模型是癲癇耐藥動物模型。步驟c所述的評價方法是通過觀察期內癲癇發(fā)作頻率，癇性發(fā)作持續(xù)時間和癇性發(fā)作級別的下降是否顯著差異進行評分。觀察期內癲癇發(fā)作頻率，癇性發(fā)作持續(xù)時間和癇性發(fā)作級別的下降的顯著差異表示該候選藥物是治療顳葉癲癇的藥物；所述的觀察期為1個月；癇性發(fā)作級別按racine分級。其中，所述的藥物是治療耐藥性癲癇的藥物。本發(fā)明建立的靈長類動物恒河猴的馬桑內酯點燃癲癇模型，并從行為學和電生理兩方面予以評價；同時進行了經典抗癲癇藥物卡馬西平的耐藥實驗。該模型表現為復雜部分性發(fā)作，及繼發(fā)全面性強直陣攣發(fā)作，模擬了人類顳葉癲癇的發(fā)作形式；該模型建立的過程簡單，易操作易重復，對腦沒有直接的機械損傷，且致癇時間短等優(yōu)點，且對經典抗癲癇藥物卡馬西平耐藥，因此可用于顳葉癲癇發(fā)病機制和新抗癲癇藥物開發(fā)的研究。用馬桑內酯肌肉注射點燃的方法建立靈長類動物恒河猴顳葉癲癇耐藥模型，該模型是第一個化學性點燃的靈長類動物顳葉癲癇耐藥模型。該模型的成功建立有助于研究癲癇發(fā)生過程的機制以及癲癇耐藥的機制，精確定位癲癇的發(fā)生區(qū)域并研究癇性活動擴布模式，有助于抗癲癇藥物的篩選和新型抗癲癇藥物的研發(fā)，并為癲癇預防及治療的研究提供載體。相對于其它的顳葉癲癇模型，本研究具有以下優(yōu)點1、采用肌肉注射的途徑系統給藥，易操作；2、重復性好；3、對腦沒有直接的機械損傷；4、藥物安全性好；5、證實該模型對經典抗癲癇藥物卡馬西平耐藥。本實驗首次成功建立了靈長類動物恒河猴的馬桑內酯點燃癲癇模型，并從行為學和電生理兩方面予以評價；該模型表現為復雜部分性發(fā)作繼發(fā)全面性強直陣攣發(fā)作，模擬了人顳葉癲癇的發(fā)作形式。綜上，本發(fā)明方法建立過程簡單，易操作易重復，對腦沒有直接的機械損傷，且致癇時間短等優(yōu)點，對經典抗癲癇藥物卡馬西平耐藥，因此可用于顳葉癲癇發(fā)病機制和新抗癲癇藥物開發(fā)的研究。顯然，根據本發(fā)明的上述內容，按照本領域的普通技術知識和慣用手段，在不脫離本發(fā)明上述基本技術思想前提下，還可以做出其它多種形式的修改、替換或變更。以下通過實施例形式的具體實施方式，對本發(fā)明的上述內容再作進一步的詳細說明。但不應將此理解為本發(fā)明上述主題的范圍僅限于以下的實例。凡基于本發(fā)明上述內容所實現的技術均屬于本發(fā)明的范圍。圖1基礎腦電2陣發(fā)棘波多棘波圖3連續(xù)多棘波圖4棘慢復合波圖5頭皮腦電圖未見常，海馬電極偶發(fā)尖波棘波圖6.用標準抗癲癇藥物卡馬西平治療實驗(治療前后癇性發(fā)作頻率比較)(P>0.05)圖7用標準抗癲癇藥物卡馬西平治療實驗(治療前后癇性發(fā)作時間比較)(P>0.05)具體實施例方式實施例1本發(fā)明顳葉癲癇動物模型的建立1材料1.1實驗動物健康雄性恒河猴5只，購于平安動物飼養(yǎng)中心，年齡3歲，體重分別為7.5kg、4.7kg、5.lkg、4.2kg，均單獨飼養(yǎng)于(80*90*100)cm猴籠中，每日飼喂2次，輔以蔬菜、水果，自動飲水器飲水，室內平均溫度(21.1士13.6)V，相對濕度87.5士12.6，用同于實驗前均有3周的適應時間，均進行神經系統檢查和腦電圖檢查以排除異常者。1.2實驗藥物馬桑內酯注射液10月份于四川西昌采集馬桑葉63.5公斤，由成都中醫(yī)藥大學提供出馬桑內酯注射液提取方法馬桑葉加水煎煮3次，合并濾液濃縮，加95%乙醇混勻靜置過夜，減壓回收乙醇，濃縮，加NaCl至飽和，靜置過夜，濾過保留濾液，濾液有氯仿萃取5次，合并氯仿液加無水Na2S04，減壓回收氯仿，保留沉淀，水浴加熱干燥沉淀，少量無水乙醇溶解沉淀，加聚酰胺顆粒拌勻，水浴揮發(fā)乙醇，將聚酰胺顆粒上柱，蒸餾水洗脫至無色，洗脫液濃縮滅菌，消毒，最終得馬桑內酯注射液9.5L(每Iml馬桑內酯注射劑相當于6.7g生藥材馬桑葉)。其主要成分是羥基馬桑毒素(C15H1906)和馬桑毒素(C15H1805)(17)權利要求1.一種恒河猴顳葉癲癇點燃模型，其特征在于它是將閾下致癇劑量為0.5ml/kg的馬桑內酯施于恒河猴制備而成的動物模型，其中，每Iml馬桑內酯注射劑相當于6.7g生藥材馬桑葉。2.根據權利要求1所述的恒河猴顳葉癲癇點燃模型，其特征在于所述的馬桑內酯的用法為臀部肌肉注射馬桑內酯，間隔72小時注射一次，共注射48至60次，在模型點燃后改為每隔7天重復注射一次，以維持點燃效果。3.根據權利要求1或2所述的恒河猴顳葉癲癇點燃模型，其特征在于所述的顳葉癲癇點燃模型是癲癇耐藥動物模型。4.權利要求1-3任意一項所述的動物模型在篩選治療顳葉癲癇的藥物中用途。5.一種制備權利要求1-3任意一項所述的恒河猴顳葉癲癇點燃模型的方法，其特征在于將劑量為0.5ml/kg的馬桑內酯施于恒河猴，其中，每Iml馬桑內酯注射劑相當于6.7g生藥材馬桑葉。6.根據權利要求5所述的恒河猴顳葉癲癇點燃模型的制備方法，其特征在于所述的馬桑內酯的用法為臀部肌肉注射馬桑內酯，間隔72小時注射一次，共注射48至60次，在模型點燃后改為每隔7天重復注射一次，以維持點燃效果。7.一種篩選候選治療顳葉癲癇的藥物的方法，它包括如下步驟a、采用權利要求1-3任意一項所述的恒河猴顳葉癲癇點燃模型；b、將藥物施用于a步驟所述的模型；C、觀察候選藥物抑制馬桑內酯引起的模型動物顳葉癲癇作情況，并進行評分，評價潛在的治療顳葉癲癇的藥物。8.根據權利要求7所述的篩選方法，其特征在于步驟c所述的評價方法是通過觀察期內癲癇發(fā)作頻率，癇性發(fā)作持續(xù)時間和癇性發(fā)作級別的下降是否顯著差異進行評分。9.根據權利要求8所述的篩選方法，其特征在于觀察期內癲癇發(fā)作頻率，癇性發(fā)作持續(xù)時間和癇性發(fā)作級別的下降的顯著差異表示該候選藥物是治療顳葉癲癇的藥物；所述的觀察期為1個月；癇性發(fā)作級別按racine分級方法進行分級。10.根據權利要求7-9任意一項所述的篩選方法，其特征在于所述的藥物是治療耐藥性癲癇的藥物。全文摘要本發(fā)明提供了一種恒河猴顳葉癲癇點燃模型，它是由閾下致癇劑量為0.5ml/kg的馬桑內酯施于恒河猴，其中，每1ml馬桑內酯注射劑相當于6.7g生藥材馬桑葉。本發(fā)明還提供了一種篩選治療顳葉癲癇的藥物的方法。本發(fā)明方法建立過程簡單，易操作易重復，對腦沒有直接的機械損傷，且致癇時間短等優(yōu)點，對經典抗癲癇藥物卡馬西平耐藥，因此可用于顳葉癲癇發(fā)病機制和新抗癲癇藥物開發(fā)的研究。文檔編號A61K31/365GK101991569SQ20091016420公開日2011年3月30日申請日期2009年8月20日優(yōu)先權日2009年8月20日發(fā)明者何俐,周東,張勤,李勁梅,李宏霞,楊天華,洪楨,王莉,辜蕊,鄢波申請人:四川大學華西醫(yī)院;成都華西海圻醫(yī)藥科技有限公司;國家成都中藥安全性評價中心