專利名稱：Tau蛋白病治療用疫苗的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種表達(dá)可以用于Tau蛋白病(tauopathy)的預(yù)防或治療的突變體Tau蛋白的載體及該載體作為醫(yī)藥品的用途。
背景技術(shù)：
Tau(tau)蛋白質(zhì)是在正常腦內(nèi)以結(jié)合于細(xì)胞內(nèi)的微管的狀態(tài)存在的可溶性的磷酸化蛋白質(zhì)，有助于微管的聚合促進(jìn)和穩(wěn)定化，并且在重復(fù)進(jìn)行與微管的結(jié)合和解離時(shí)保持平衡狀態(tài)。該平衡狀態(tài)因磷酸化/脫磷酸化酶異常等崩潰時(shí)，細(xì)胞質(zhì)中的游離Tau蛋白增加，并導(dǎo)致聚集或纖維化。在以阿爾茨海默氏病或額顳葉型癡呆癥為主的高齡者的癡呆癥的大多數(shù)中，將其中不一定伴隨淀粉樣蛋白的積累的Tau蛋白聚集體的積累被認(rèn)為是特征性的病變的神經(jīng)變性疾病總稱為Tau蛋白病(非專利文獻(xiàn)I)。在我國(guó)，在65歲以上高齡者中約7%被認(rèn)為是癡呆癥，加上輕度癡呆癥達(dá)到約 10%。其中7成被認(rèn)為是Tau蛋白病型癡呆癥，患者數(shù)約為200萬人。關(guān)于癡呆癥的研究開發(fā)迄今為止先施行對(duì)P淀粉樣蛋白(AP)蛋白的研究，通過P淀粉樣蛋白的肽免疫進(jìn)行臨床試驗(yàn)，但在試驗(yàn)中途，接種患者的6%發(fā)生脊髓腦膜炎，因此試驗(yàn)中止(非專利文獻(xiàn)2)。雖然該試驗(yàn)中止，但根據(jù)對(duì)疫苗接種后引起腦炎并康復(fù)、隨后因其它疾病而死亡的患者的病例報(bào)告，確認(rèn)疫苗接種具有消除老人斑或神經(jīng)變性突起的效果(非專利文獻(xiàn)3)。另夕卜，根據(jù)對(duì)疫苗接種患者的后續(xù)的隨訪，在疫苗接種后，疾病甚至在通過尸檢確認(rèn)老人斑消失的患者中進(jìn)展，暗示該疫苗不具有對(duì)疾病進(jìn)展的預(yù)防效果(非專利文獻(xiàn)4)。另外，在迄今為止的研究中也得知，對(duì)由P淀粉樣蛋白的抗體引起的被動(dòng)免疫是有效的，但關(guān)于抑制疾病進(jìn)展的效果不明顯(非專利文獻(xiàn)5)。而且，也驗(yàn)證了在腺伴隨病毒(AAV)載體上搭載有P淀粉樣蛋白的口服疫苗的效果。在小鼠的實(shí)驗(yàn)中，雖然觀察到該AAV載體的口服施用具有對(duì)經(jīng)由腸管粘膜的P淀粉樣蛋白產(chǎn)生抗體的效果、學(xué)習(xí)功能改善的效果(非專利文獻(xiàn)6)，但在其后的猴的實(shí)驗(yàn)中，可以確認(rèn)老人斑的減少，卻不能確認(rèn)明確的病情進(jìn)展的抑制效果。與此相對(duì)，關(guān)于Tau蛋白，以前沒有作為阿爾茨海默氏病等的治療的目標(biāo)被重視，近年來，Tau蛋白替代P淀粉樣蛋白作為阿爾茨海默氏的治療藥的目標(biāo)，正在成為伴有Tau蛋白過量積累的Tau蛋白病的治療及疫苗的目標(biāo)(非專利文獻(xiàn)7)。作為與本發(fā)明有關(guān)的治療劑，雖然報(bào)道有在腺伴隨病毒上搭載有編碼P淀粉樣蛋白的基因的阿爾茨海默氏病治療劑(專利文獻(xiàn)1、2、非專利文獻(xiàn)8)、通過Tau蛋白的接種治療阿爾茨海默氏病及Tau蛋白病的方法(專利文獻(xiàn)3、非專利文獻(xiàn)9)等，但在Tau蛋白接種的Tau蛋白病模型小鼠中確認(rèn)有協(xié)調(diào)運(yùn)動(dòng)/運(yùn)動(dòng)學(xué)習(xí)的改善效果，卻在社交性的缺乏、記憶力下降的癡呆癥患者中，沒有確認(rèn)有被看作特征性的癥狀的改善效果?，F(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)專利文獻(xiàn)I :日本特表2008-536476專利文獻(xiàn)2 :日本特開2005-021149
專利文獻(xiàn) 3 US2008/0050383A非專利文獻(xiàn)I :齊藤裕子，臨床檢查，Vol. 50，No. 10，p. 1121-1129(2006)(日本)非專利文獻(xiàn)2 0rgogozo, J. M. et al. , Neurology, 61 :46-54(2003)非專利文獻(xiàn)3 :Nicoll, J. A. et al. , Nature Medicine, 9 :448-452 (2003)非專利文獻(xiàn)4 Holmes, C. et al.，Lancet, 372 :216-223(2008)非專利文獻(xiàn)5 :松岡康治，實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)，Vol. 26，No. 16，p. 2572-2576 (2008)(日本)非專利文獻(xiàn)6 :田平武，老年精神醫(yī)學(xué)雜志第20卷增刊號(hào)，p. 68-74(2009)(日本)非專利文獻(xiàn)7 Martin-Jones, Z and Lasagna-Reeves, C. , Alzheimer Disease Associate Disorder,22(2) :111(2008)非專利文獻(xiàn)8 Mouri, A. et al.，The FASEB Journal, 21 :2135-2148(2007)非專利文獻(xiàn)9 Asuni, A. A. et al. , J. Neurosci. ,27 :9115-9129(2007)發(fā)明概述本發(fā)明的目的在于提供一種Tau蛋白病、尤其是Tau蛋白病型癡呆癥的預(yù)防或治療用疫苗。本發(fā)明人等發(fā)現(xiàn)，通過使用Tau蛋白病模型小鼠的試驗(yàn)，確認(rèn)含有編碼突變體Tau蛋白的核酸的載體與該蛋白質(zhì)相比具有長(zhǎng)期的持續(xù)的抗體誘導(dǎo)作用，而且，該載體具有Tau蛋白病、尤其是Tau蛋白病型癡呆癥的顯著的改善作用，從而完成了本發(fā)明。因此，本發(fā)明概括為包含以下的特征。本發(fā)明在其第I方面中提供一種Tau蛋白病的預(yù)防或治療用疫苗，該疫苗，其是含含有編碼連接于分泌信號(hào)序列的突變體Tau蛋白的核酸的載體作為有效成分，其中，該突變體Tau蛋白包含在Tau蛋白的氨基酸序列中對(duì)應(yīng)于選自由序列號(hào)I的257位、260位、266位、272 位、279 位、280 位、284 位、296 位、301 位、303 位、305 位、315 位、317 位、320 位、335位、336位、337位、342位、352位、369位、389位及406位構(gòu)成的組中的至少I個(gè)位置的位置的氨基酸殘基的突變，并且與突變體Tau蛋白的直接施用相比，該載體在受試者中可以更持續(xù)地誘導(dǎo)對(duì)Tau蛋白(任選地磷酸化的)的抗體。在該實(shí)施方式中，所述突變?yōu)檫x自由K257T、I260V、L266V、G272V、N279K、K280 A、L284L、N296 A、N296H、P301L、P301S、P301T、G303V、S305N、L315R、K317M、S320F、G335S、6335￥、03361 、￥337]\^342￥、53521、1(3691、63891 及1 4061(在此，A 為缺失)構(gòu)成的組中的至少I種突變。在其它的實(shí)施方式中，所述突變?yōu)橹辽侔琍301L、P301S或P301T的突變。在其它的實(shí)施方式中，所述分泌信號(hào)序列為淀粉樣前體蛋白信號(hào)序列或CD59分泌信號(hào)序列。在其它的實(shí)施方式中，所述載體為仙臺(tái)病毒載體。在其它的實(shí)施方式中，所述載體為質(zhì)粒載體。 在其它的實(shí)施方式中，所述疫苗被配制為用于鼻內(nèi)施用。在其它的實(shí)施方式中，所述疫苗具有改善Tau蛋白病型癡呆癥的作用。在其它的實(shí)施方式中，所述疫苗在受試者中具有改善記憶力下降和/或社會(huì)行為異常、焦慮行為異常及記憶障礙的至少I種癥狀的作用。在其它的實(shí)施方式中，所述疫苗具有將受試者的腦內(nèi)的小神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞進(jìn)行活化、由此抑制突變體Tau蛋白的積累的作用。在其它的實(shí)施方式中，Tau蛋白(包含突變體Tau蛋白)是任選地磷酸化的。本發(fā)明的疫苗對(duì)于有Tau蛋白病的受試者，具有改善癡呆癥的記憶カ下降和/或社會(huì)行為異常和/或焦慮行為異常和/或記憶障礙的顯著的效果，尤其具有在現(xiàn)有的疫苗中無效的、抑制(或延遲)Tau蛋白病的癥狀進(jìn)展的作用。本說明書包含在作為本申請(qǐng)的優(yōu)先權(quán)的基礎(chǔ)的日本專利申請(qǐng)2010-3424號(hào)的說明書和/或附圖中所記載的內(nèi)容。附圖簡(jiǎn)述圖I表示通過搭載GFP的F基因缺失型仙臺(tái)病毒載體(Sev-GFP)的經(jīng)鼻施用對(duì)于Tau蛋白病模型小鼠(P301S Tau轉(zhuǎn)基因小鼠)的感染效率的研究結(jié)果。用多功能顯微鏡(BZ-9000, Keyence)進(jìn)行熒光成像(A)和亮視場(chǎng)像(B)的拍攝，對(duì)Sev-GFP接種小鼠的腦進(jìn)行GFP表達(dá)分析。圖2表示對(duì)Tau蛋白病模型小鼠接種搭載Tau蛋白的F基因缺失型仙臺(tái)病毒載體(Sev-TauP301S)并進(jìn)行關(guān)于磷酸化Tau蛋白表達(dá)抑制效果的分析的結(jié)果。作為對(duì)照，使用Sev-GFP (在此，GFP表示編碼綠色熒光蛋白的核酸)。在接種后第5個(gè)月，在小鼠海馬冠狀剖面上通過抗磷酸化Tau蛋白抗體(AT8, Innogenetics)進(jìn)行免疫染色。箭頭表示Tau病變。免疫染色后，用多功能顯微鏡(BZ-9000，Keyence)附屬分析軟件測(cè)定在海馬CA3區(qū)域內(nèi)積累的區(qū)域的面積。對(duì)于Sev-GFP接種組、SeV-TauP301S接種組，分別用學(xué)生t檢驗(yàn)進(jìn)行平均值土標(biāo)準(zhǔn)誤差、統(tǒng)計(jì)學(xué)的分析。圖3的(A)表示在野生型小鼠(Non-Tg)或Tau蛋白病模型小鼠(Tg)上經(jīng)鼻接種Sev-TauP301S或Sev_GFP、用蛋白質(zhì)印跡法評(píng)價(jià)接種5個(gè)月后整個(gè)海馬中的磷酸化Tau蛋白(pTAU)的積累的結(jié)果。而且,就蛋白量而言，(B)表示用圖像分析軟件(NIH Image,Ver. I. 63,NIH,US)測(cè)定條帶的信號(hào)強(qiáng)度、取得作為內(nèi)部對(duì)照蛋白的￠-肌動(dòng)蛋白和信號(hào)強(qiáng)度之比并定量化的結(jié)果。對(duì)于Sev-GFP接種組、SeV-TauP301S接種組，分別用學(xué)生t檢驗(yàn)進(jìn)行平均值土標(biāo)準(zhǔn)誤差、統(tǒng)計(jì)學(xué)的分析。用于試驗(yàn)的小鼠組及對(duì)照如下所述。Non-Tg/Sev-GFP :對(duì)野生型小鼠經(jīng)鼻接種 Sev-GFP 的組，Non-Tg/Sev_TauP301S 對(duì)野生型小鼠經(jīng)鼻接種Sev-TauP301S的組，Tg/Sev-GFP :對(duì)Tau蛋白病模型小鼠經(jīng)鼻接種Sev-GFP的組，Tg/Sev-TauP301S :對(duì)Tau蛋白病模型小鼠經(jīng)鼻接種Sev_tauP301S的組，-陰性對(duì)照(從野生型小鼠中提取的蛋白質(zhì))、+ :陽性對(duì)照(從不進(jìn)行任何施用的tau蛋白病模型小鼠海馬中提取的蛋白質(zhì))。圖4的(a)表示對(duì)Tau蛋白病模型小鼠或野生型小鼠接種Sev_TauP301S后、采取血清并基于各自的小鼠的海馬組織(白盒部分)中的反應(yīng)性對(duì)血清中與組織Tau反應(yīng)的抗體的效價(jià)進(jìn)行評(píng)價(jià)的結(jié)果。將施用Sev_TauP301S的小鼠的血清分別稀釋為30倍、100倍、300倍、1000倍、3000倍，在4°C下反應(yīng)過夜，將作為2次抗體的Alexa546標(biāo)記的抗小鼠IgG抗體在室溫下反應(yīng)I小時(shí)。(b)表示作為對(duì)照、不便Tau蛋白病模型小鼠與抗體反應(yīng)而進(jìn)行免疫染色的結(jié)果。(C)表示對(duì)接種Sev-GFP或Se v_TauP301S的Tau蛋白病模型小鼠的血清中抗體效價(jià)用觀察到與組織的反應(yīng)的最大稀釋倍率進(jìn)行評(píng)價(jià)的結(jié)果。對(duì)Sev-GFP接種組、Sev-TauP301S接種組，分別由曼-惠特尼U檢驗(yàn)進(jìn)行平均值+/_標(biāo)準(zhǔn)誤差、統(tǒng)計(jì)學(xué)的分析。圖5表示對(duì)Sev_TauP301S接種引起的腦內(nèi)的小神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的活化進(jìn)行分析的結(jié)果。接種SeV-TauP301S，施用5個(gè)月后，使用識(shí)別接種小鼠的海馬的組織中的活化小神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的抗Ibal抗體進(jìn)行免疫染色(A)。作為對(duì)照，接種Sev-GFP(B)。箭頭表示不與IgG共同存在的小神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞。圖6表示對(duì)野生型小鼠或Tau蛋白病模型小鼠的Sev-GFP或SeV_TauP301S的接種引起的血清中的抗磷酸化Tau抗體的產(chǎn)生及腦脊髓液中磷酸化Tau蛋白的產(chǎn)生進(jìn)行分析的結(jié)果。關(guān)于抗體產(chǎn)生的分析，使用接種Sev-GFP或SeV-TauP301S的小鼠的血清，進(jìn)行以重組突變體Tau蛋白(TAUP301S)為抗原的ELISA。關(guān)于磷酸化Tau蛋白的產(chǎn)生，使用接種Sev-GFP或SeV_TauP301S的小鼠的腦脊髓液，進(jìn)行與抗磷酸化Tau抗體(AT8抗體)的結(jié)合的ELISA。
(a)表示接種Sev-GFP或Sev_TauP301S后第5個(gè)月的血清中的對(duì)人P301S突變Tau蛋白的抗體效價(jià)。(b)表示接種Sev-GFP或Sev_TauP301S后第5個(gè)月的CSF中的磷酸化Tau的量。圖7的⑷表示對(duì)野生型小鼠或Tau蛋白病模型小鼠接種Sev-GFP或Sev_TauP301S、進(jìn)行社會(huì)行為測(cè)定實(shí)驗(yàn)(Social interaction test)的結(jié)果。在tau蛋白病患者中確認(rèn)有許多社會(huì)行為的異常，因此，進(jìn)行與社會(huì)行為有關(guān)的“Social interactiontest(社會(huì)行為測(cè)定實(shí)驗(yàn))”(在箱中放入2只小鼠，測(cè)定10分鐘期間的接觸時(shí)間)。(B)進(jìn)ー步根據(jù)Crawley’s Social Interaction test (記憶力及社會(huì)行為測(cè)定實(shí)驗(yàn))，通過測(cè)定在籠子的附近的停留時(shí)間來評(píng)估對(duì)最初見到的小鼠具有多大接近的興趣。圖8表示對(duì)野生型小鼠或Tau蛋白病模型小鼠接種Sev-GFP或Sev_TauP301S、進(jìn)行了高架十字迷宮實(shí)驗(yàn)(焦慮行為的實(shí)驗(yàn))的結(jié)果。在接種Sev-TauP301S或Sev-GFP的小鼠中，對(duì)從迷宮中心向4個(gè)方向的每ー個(gè)方向的總進(jìn)入次數(shù)(A)、向沒有柵欄的方向的進(jìn)入次數(shù)的比例(B)、小鼠的總移動(dòng)距離(C)、在沒有柵欄的場(chǎng)所的停留時(shí)間的比例⑶觀察10分鐘，使用Image EP軟件自動(dòng)地測(cè)量。就統(tǒng)計(jì)學(xué)的分析而言，單因素方差分析，事后比較檢驗(yàn)用 Fisher 的 Protected Least Signicicant Difference (PLSD)法進(jìn)行。圖9表示對(duì)野生型小鼠或Tau蛋白病模型小鼠接種重組Tau蛋白、進(jìn)行了曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)(用于測(cè)定活動(dòng)量或情緒性的實(shí)驗(yàn))的結(jié)果。接種重組Tau蛋白(TAUP301S)，在接種后第一個(gè)月進(jìn)行曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)。關(guān)于接種小鼠的移動(dòng)距離(A)、伸腰的次數(shù)(B)、在曠場(chǎng)中央的停留時(shí)間(C)、刻板行為(D)，觀察120分鐘的自由行為并進(jìn)行評(píng)價(jià)。

圖10表示對(duì)野生型小鼠或Tau蛋白病模型小鼠接種重組Tau蛋白、進(jìn)行了高架十字迷宮實(shí)驗(yàn)(焦慮行為的實(shí)驗(yàn))的結(jié)果。將重組Tau蛋白(TAUP301S) IOOiig/只/次、每2周一次總計(jì)3次皮下施用接種的Tau蛋白病模型小鼠及野生型小鼠分別在迷宮中心的正方形的部分(5X5cm)以朝向閉合臂的方向的方式放置，記錄10分鐘行為。作為對(duì)照，接種Sev-GFP。使用Image EP軟件自動(dòng)地測(cè)量從迷宮中央向4個(gè)方向的每ー個(gè)方向的總進(jìn)入次數(shù)(A)、向沒有柵欄的方向的進(jìn)入次數(shù)的比例(B)、小鼠的總移動(dòng)距離(C)、在沒有柵欄的場(chǎng)所的停留時(shí)間的比例(D)。就統(tǒng)計(jì)學(xué)的分析而言，單因素方差分析，事后比較檢驗(yàn)用Fisher的 Protected Least Signicicant Difference (PLSD)法進(jìn)オ于。圖11表示對(duì)野生型小鼠或Tau蛋白病模型小鼠接種pcDNA3. l_CD59_TauP301S(ATG-)(以下為cDNA-Tau P301S)、進(jìn)行曠場(chǎng)試驗(yàn)的結(jié)果。接種cDNA-Tau P301S，在接種后第一個(gè)月進(jìn)行曠場(chǎng)試驗(yàn)。關(guān)于接種小鼠的移動(dòng)距離(A)、伸腰的次數(shù)(B)、在曠場(chǎng)中央的停留時(shí)間(C)、刻板行為(D)，觀察120分鐘的自由行為并進(jìn)行評(píng)價(jià)。圖12表示對(duì)野生型小鼠或Tau蛋白病模型小鼠接種cDNA_Tau P301S、進(jìn)行社會(huì)行為測(cè)定實(shí)驗(yàn)(Social interaction test)的結(jié)果。在Tau蛋白病患者中經(jīng)常觀察到社會(huì)行為的異常，因此，進(jìn)行與社會(huì)行為有關(guān)的“ Social interaction test (社會(huì)行為測(cè)定實(shí)驗(yàn))”(在箱中放入2只小鼠，測(cè)定10分鐘期間的接觸時(shí)間)。圖13表示cDNA-Tau P301S的結(jié)構(gòu)和插入序列(序列號(hào)12)。圖14的(a)表示對(duì)于P301S，Tau蛋白的最長(zhǎng)同種型中的序列號(hào)中第301位 的氨基酸的突變。Sev/AF表示仙臺(tái)病毒的F基因缺失的情況。(b)表示淀粉樣前體蛋白(APP)信號(hào)序列從人突變體Tau蛋白(P301S，同種型1N4R)的N末端連接于缺失蛋氨酸的位點(diǎn)。C表示pcDNA3-APP-TauP301S中的插入序列(序列號(hào)13)。在此的APP信號(hào)序列用 NT_011512. 11、NW_001838706. I、NM_201414. I、NM_201413. I、NM_000484. 2、NM_001136130. 1、NM_001136129. I的登錄號(hào)碼注冊(cè)于序列數(shù)據(jù)庫。及P301S Tau的序列以用NM_001123067. 2的登錄號(hào)碼注冊(cè)于序列數(shù)據(jù)庫的序列為基礎(chǔ)加以突變。圖15的(A)表示對(duì)于接種Sev-GFP或Sev_TauP301S的野生型小鼠及Tau蛋白病模型小鼠的巴恩斯迷宮試驗(yàn)(空間記憶)的結(jié)果。放入筒中，對(duì)小鼠進(jìn)行蒙眼并固定在規(guī)定的位置，取下筒使其自由地行走，在正解的孔上安裝暗箱，使其記住暗箱的場(chǎng)所(訓(xùn)練)。
(B):訓(xùn)練后，記錄在卸下暗箱的孔(靶點(diǎn))的周圍的停留時(shí)間(探測(cè)試驗(yàn))。測(cè)定在訓(xùn)練期間至到達(dá)靶點(diǎn)的時(shí)間、在探測(cè)試驗(yàn)中至到達(dá)靶點(diǎn)的時(shí)間、在各孔的周圍停留的時(shí)間。圖16表示對(duì)于接種Sev-GFP或Sev_TauP301S的野生型小鼠及Tau蛋白病模型小鼠的恐怖條件反射試驗(yàn)(情景記憶)的結(jié)果。在箱中對(duì)小鼠使用聲音和電休克組合以對(duì)小鼠進(jìn)行條件反射、再放入同一箱中，對(duì)引起的凍結(jié)(フリージング)(畏縮行為)的出現(xiàn)比例進(jìn)行評(píng)價(jià)。圖17表示對(duì)于接種Sev-GFP或Sev_TauP301S的野生型小鼠及tau蛋白病模型小鼠的身體測(cè)定(體重(A)、體溫(B)、握力(C)、鋼絲繩懸掛實(shí)驗(yàn)(D))的結(jié)果。圖18表示對(duì)于接種有Sev-GFP或Sev_TauP301S的野生型小鼠及Tau蛋白病模型小鼠的社會(huì)行為測(cè)定實(shí)驗(yàn)(接觸的總持續(xù)時(shí)間(A)、接觸次數(shù)(B)、活躍接觸的總持續(xù)時(shí)間
(C)、接觸的持續(xù)時(shí)間的平均值(D)、總移動(dòng)距離(E))的結(jié)果。圖19表示對(duì)于接種Sev-GFP或Sev_TauP301S的野生型小鼠及Tau蛋白病模型小鼠的前脈沖抑制試驗(yàn)(驚愕反應(yīng)(A)、前脈沖引起的驚愕反應(yīng)的抑制效果(B))的結(jié)果。通過首先使其聽到弱的聲音、比較其后聽到大的聲音時(shí)的驚愕反應(yīng)的抑制效果而進(jìn)行評(píng)價(jià)。圖20表示對(duì)于接種Sev-GFP或Sev_TauP301S的野生型小鼠及Tau蛋白病模型小鼠的曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。(A)表示總移動(dòng)距離，(B)表示垂直方向的活動(dòng)量，(C)表示在中心部的停留時(shí)間，(D)表示刻板行為次數(shù)。圖21表示對(duì)于野生型小鼠及Tau蛋白病模型小鼠的曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。(A)表示總移動(dòng)距離，(B)表示垂直方向的活動(dòng)量，(C)表示在中心部的停留時(shí)間，(D)表示刻板行為次數(shù)。
圖22表示對(duì)于野生型小鼠及Tau蛋白病模型小鼠的高架十字迷宮實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。
(A)表示侵入于開放臂的數(shù)，(B)表示侵入于開放臂的比例，(C)表示移動(dòng)距離，(D)表示停留在開放臂上的時(shí)間。圖23表示對(duì)于野生型小鼠及Tau蛋白病模型小鼠的前脈沖抑制試驗(yàn)的結(jié)果。(A)表示由聲音的不同引起的驚愕反應(yīng)的不同，(B)表示前脈沖抑制的比例(預(yù)先發(fā)出小的聲音、其后發(fā)出大的聲音時(shí)存在驚愕反應(yīng)的抑制效果的比例)。圖24的⑷ ⑶4個(gè)月齡的Tau蛋白病模型小鼠，(E) ⑶4個(gè)月齡的野生型小鼠，(A)、(E):外側(cè)淡蒼白球，(B), (F):大腦皮質(zhì)扁桃核、(C), (G):聽覺皮質(zhì)，(CA3 ;D、H):腹側(cè)海馬。行為學(xué)的分析后的6個(gè)月齡的小鼠的分析，(I 、L):扣帶回皮質(zhì)，(J，M) 大腦皮質(zhì)扁桃核，(CA3 ;K，N):海馬。紅的染色部位表示磷酸化Tau，藍(lán)的染色部位表示細(xì)胞核。箭頭表示磷酸化Tau蛋白的積累，圓圈表示對(duì)血管的抗小鼠IgG抗體的非特異反應(yīng)。圖25表示對(duì)于13周齡的野生型小鼠及Tau蛋白病模型小鼠的一般的身體測(cè)定的結(jié)果。(A)表示體重，(B)表示直腸溫度，(C)表示握力，(D)表示鋼絲繩懸掛實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。圖26表示社會(huì)行為測(cè)定實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。(A)表示接觸的繼續(xù)時(shí)間，(B)表示接觸次數(shù)，(C)表示活躍接觸的持續(xù)時(shí)間，(D)表示毎次接觸的平均持續(xù)時(shí)間，(E)表示實(shí)驗(yàn)中的總移動(dòng)距離。圖27表示對(duì)于野生型小鼠及Tau蛋白病模型小鼠的恐怖條件反射試驗(yàn)(情景記憶)的結(jié)果。圖28表示對(duì)野生型小鼠及Tau蛋白病模型小鼠的巴恩斯迷宮試驗(yàn)(空間記憶)的結(jié)果。(A) (C)表示訓(xùn)練期間的分析結(jié)果，(D)表示訓(xùn)練后的探測(cè)試驗(yàn)的結(jié)果。發(fā)明的最佳實(shí)施方式對(duì)本發(fā)明進(jìn)ー步詳細(xì)地進(jìn)行說明。本發(fā)明的特征在于，使用含有編碼突變體Tau蛋白的核酸的載體作為有效成分的疫苗用于Tau蛋白病的預(yù)防或治療。本說明書中使用的“Tau蛋白病”是指在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中磷酸化的Tau蛋白異常地積累、與神經(jīng)障礙(神經(jīng)變性等)有關(guān)的疾病群。 本說明書中使用的“核酸”是指DNA或RNA。本說明書中使用的“受試者”是指哺乳動(dòng)物，優(yōu)選靈長(zhǎng)類，進(jìn)ー步優(yōu)選人。〈突變體Tau蛋白〉Tau蛋白為微管相關(guān)結(jié)合蛋白的I種，也稱為MAPT (microtubule-associatedprotein tau),存在通過Tau基因的選擇性剪接而產(chǎn)生的6種同種型，根據(jù)C末端側(cè)的微管結(jié)合位點(diǎn)的重復(fù)次數(shù)，分類為3次重復(fù)型Tau和4次重復(fù)型Tau(齊藤裕子，臨床檢查，Vol. 50，No. 10，p. 1121-1129(2006)(日本))。人MAPT存在于17號(hào)染色體上(NG_007398. I),例如轉(zhuǎn)錄變體(transcript variant) I 6 分別以注冊(cè)■號(hào)碼 NM_016835. 3、NM_005910. 4、NM_016834. 3、NM_016841. 3、NM_001123067. 2、NM_001123066. 2 注冊(cè)于序列數(shù)據(jù)庫(美國(guó))。Tau蛋白可以是3次重復(fù)型Tau、4次重復(fù)型Tau的任ー種，尤其是眾所周知4次重復(fù)型Tau為在人腦中表達(dá)最多的同種型?！癟au蛋白”優(yōu)選為人Tau蛋白。
本發(fā)明的突變體Tau蛋白包含在Tau蛋白的氨基酸序列中對(duì)應(yīng)于選自由序列號(hào)I (NM_005910. 4 ;同種型 2N4R 型)的 257 位、260 位、266 位、272 位、279 位、280 位、284 位、296 位、301 位、303 位、305 位、315 位、317 位、320 位、335 位、336 位、337 位、342 位、352 位、369位、389位及406位構(gòu)成的組中的至少I個(gè)位置的位置的氨基酸殘基的突變。優(yōu)選的突變位置為在Tau蛋白的氨基酸序列中對(duì)應(yīng)于序列號(hào)I的257位、260位、272位、279位、296位、301位、303位、305位、335位、337位、342位、369位、389位或406位的位置，更優(yōu)選的突變位置為在Tau蛋白的氨基酸序列中對(duì)應(yīng)于序列號(hào)I的至少301位的位置。該情況是指突變位置可以為僅對(duì)應(yīng)于序列號(hào)I的301位的位置，或者，除對(duì)應(yīng)于序列號(hào)I的301位的位置之外，可以含有對(duì)應(yīng)于選自由上面指定的序列號(hào)I的257位、260位、266位、272位、279 位、280 位、284 位、296 位、303 位、305 位、315 位、317 位、320 位、335 位、336 位、337 位、342位、352位、369位、389位及406位構(gòu)成的組中的至少I個(gè)位置的位置的氨基酸殘基的突變。所述突變?yōu)槿〈蛉笔?。取代的情況，Tau蛋白的所述位置的氨基酸殘基取代為其它氨基酸殘基、優(yōu)選在自然突變體中被認(rèn)定的氨基酸殘基的，這種取代的例子在序列號(hào)I的氨基酸序列中為 K257T、I260V、L266V、G272V、N279K、L284L、N296H、P301L、P301S、G303V、 S305N、L315R、K317M、S320F、G335S、G335V、Q336R、V337M、E342V、S352L、K369I、G389R 或R406W的氨基酸取代。另外，缺失的情況，為在自然突變體中被認(rèn)定的缺失、例如序列號(hào)I的280位的K或296位的N的缺失。在本發(fā)明中，所述突變由所述位置中的I個(gè)或多個(gè)(例如數(shù)個(gè)(例如2 10的整數(shù)))突變構(gòu)成。本發(fā)明中優(yōu)選的突變?yōu)樗?01位的氨基酸殘基的取代，例如P301S、P301L或P301T的氨基酸取代。關(guān)于本說明書中使用的氨基酸取代，例如“P301S”這樣的記載是指序列號(hào)I的氨基酸序列的301位的脯氨酸殘基(P)被絲氨酸殘基(S)取代。關(guān)于301位的突變，已知有額顳葉型癡呆的患者的發(fā)病年齡比較小、發(fā)病時(shí)進(jìn)展快速(Sperfeld AD et al, Ann Neurol. 1999Nov ；46 (5) :708-715 ；Yasuda M et al.，Neurology, 55 :1224-1227，2000)等，因此，作為起因于該301位的突變的青少年年齡中的發(fā)病或(一旦發(fā)病時(shí))進(jìn)展快速的Tau蛋白病的治療或預(yù)防的靶點(diǎn)，301位的突變是重要的，本發(fā)明的疫苗對(duì)這種Tau蛋白病是有效的。< 載體 >本發(fā)明的載體包含編碼上面說明的突變體Tau蛋白的核酸。在該突變體Tau蛋白的N末端側(cè)上連接有分泌信號(hào)序列，由此，被載入細(xì)胞內(nèi)的載體表達(dá)該核酸，利用細(xì)胞內(nèi)的翻譯機(jī)構(gòu)翻譯成突變體Tau蛋白前體后，轉(zhuǎn)移至細(xì)胞膜，利用信號(hào)肽酶切斷信號(hào)序列，該突變體Tau蛋白分泌到細(xì)胞外。編碼連接于分泌信號(hào)序列的突變體Tau蛋白的DNA可以使用常用的基因重組技術(shù)進(jìn)行合成。這種技術(shù)記載于例如 J. Sambrook et al.，Molecular Cloning A LaboratoryManual, 2nd Ed. , Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989) > F. M. Ausubel et al.,Short Protocols in Molecular Biology,5th Ed. , John ffiley&Sons(2002)等。編碼突變體Tau蛋白的DNA可以通過如下方法來制備，S卩，例如由利用Tau蛋白基因編碼的mRNA，使用逆轉(zhuǎn)錄酶合成cDNA，將該cDNA編入適當(dāng)?shù)馁|(zhì)粒載體中，以所得的載體為模板，且使用導(dǎo)入有目的突變的引物進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)，將含有該突變的編碼Tau蛋白的序列部分進(jìn)行擴(kuò)增，進(jìn)行限制酶處理，取得含有該序列部分的片段，將該片段編入用同一限制酶進(jìn)行處理的質(zhì)粒載體中，以所得載體為模板，使用可以擴(kuò)增Tau蛋白編碼序列全長(zhǎng)的引物同樣地進(jìn)行PCR并擴(kuò)増。PCR包含將由變性、退火及擴(kuò)增構(gòu)成的3個(gè)步驟設(shè)定為I個(gè)循環(huán)、將其進(jìn)行約20 45個(gè)循環(huán)。變性是使雙鏈DNA變成單鏈的步驟，在92 98°C的溫度下熱處理約30秒 2分鐘。退火是在單鏈DNA上結(jié)合引物的步驟，在50 65°C的溫度下處理約10秒 60秒。擴(kuò)增是以結(jié)合有引物的單鏈DNA為模板合成互補(bǔ)鏈的步驟，在約72°C的溫度下處理約10秒 7分鐘。在開始循環(huán)之前，可以在約94°C下熱處理約30秒 5分鐘，另外，在循環(huán)結(jié)束后，在約72°C下進(jìn)行約I分鐘 10分鐘的擴(kuò)增反應(yīng)。反應(yīng)是使用PCR緩沖液、dNTP(N =A，T，C，G)、耐熱性DNA聚合酶進(jìn)行的。作為耐熱性DNA聚合酶，可以使用Taq聚合酶、Pfu聚合酶等市售的聚合酶。使用如用于自動(dòng)地進(jìn)行PCR的熱循環(huán)儀等市售的PCR裝置(寶酒 造、Applied Biosystems、Perkin-Elmer、Bio-Rad 等)非常便利。分泌信號(hào)序列為利用存在于人細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)肽酶可切斷的任何信號(hào)序列。在這種信號(hào)序列中也包含細(xì)胞特異的信號(hào)序列。分泌信號(hào)序列的非限制性例子是編碼淀粉樣前體蛋白(APP)的信號(hào)序列的 DNA(NT_011512. 11、NW_001838706. I、NM_201414. I、NM_201413. 1、NM_000484. 2、NM_001136130. 1NM_001136129. I) :5’ ggtctagaatgctgcccggtttggcactgctcctgctggccgcctggacggctcgggcgctt-3’ (序列號(hào) 2)(在此，實(shí)際的 APP 信號(hào)序列由起始密碼子atg(下劃線)開始。另外，其5’側(cè)的tctaga序列為限制酶位點(diǎn)。)、編碼 CD59 的信號(hào)序列的 DNA (NMJ)Ol 127227. 1、NM_001127226. 1、NM_000611. 5、NM_203331. 2、NM_001127225. 1、NM_203329. 2、NM_203330. 2、NM_001127223. I) :5’-atgggaatccaaggagggtctgtcctgttcgggctgctgctcgtcctggctgtcttctgccattcaggtcatagc-3> (序列號(hào) J)等。由5’側(cè)依次連接編碼分泌信號(hào)序列的DNA和編碼突變體Tau蛋白的DNA，以該連接體為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，在用適當(dāng)?shù)南拗泼高M(jìn)行消化之后，在質(zhì)粒載體上進(jìn)行亞克隆。在上述方法中能夠使用的質(zhì)粒載體可以是克隆用載體的任ー種。這種載體的非限制性例子是pBluescript系、pUC系、pBR系、pET系等。就用于搭載編碼連接有如上述那樣得到的分泌信號(hào)的突變體Tau蛋白的核酸的載體而言，只要是可以在人細(xì)胞等哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)表達(dá)該核酸的載體，可以為任ー種載體，包含例如基因治療用的質(zhì)粒、病韋載體等。非限制性基因治療用質(zhì)粒含有例如pBK-CMV、pcDNA3. I、pZeoSV(Invitrogen公司、Stratagene 公司)、pCAGGS(Gene Bridges 公司)等。非限制性基因治療用病毒載體含有例如仙臺(tái)病毒(SeV)載體、腺病毒載體、腺伴隨病毒載體、慢病毒載體、單純皰疹病毒載體、復(fù)制缺陷逆轉(zhuǎn)錄病毒載體、麻疹病毒載體、狂犬病病毒載體、流感病毒載體、呼吸道合胞病毒(RSV)載體、水皰性口炎病毒(VSV)載體、牛痘病毒載體、辛德畢斯病毒載體等。優(yōu)選這些載體的復(fù)制缺陷型等安全性高的載體。在本發(fā)明中，上述的任一種載體都可以使用，可以優(yōu)選使用的載體為質(zhì)粒載體、仙臺(tái)病毒載體、腺病毒載體、腺伴隨病毒載體或慢病毒載體，其中，特別優(yōu)選的病毒載體為仙臺(tái)病毒載體。在載體上可插入在外來DNA的表達(dá)所需要的真核生物細(xì)胞內(nèi)可以工作的啟動(dòng)子、例如CMV IE、dectin-l、dectin-2、人CDllc、F4/80、MHC II類等各啟動(dòng)子。除該元件之外，可以在載體中含有增強(qiáng)子、復(fù)制起始點(diǎn)、核糖體結(jié)合位點(diǎn)、終止子、多聚腺苷酸化位點(diǎn)等調(diào)節(jié)序列、藥物抗性基因等選擇標(biāo)記等。另外，所述載體可以是作為目的核酸能夠組成地、自主地或誘導(dǎo)地表達(dá)的任ー種載體，但在安全性方面，優(yōu)選自主地表達(dá)核酸的載體。仙臺(tái)病毒載體不僅基因表達(dá)率比較高，而且具有不存在染色體插入突變引起的致癌危險(xiǎn)的高的安全性。該載體在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)進(jìn)行復(fù)制而不進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)，可以以高的外來蛋白質(zhì)水平進(jìn)行表達(dá)。眾所周知，在仙臺(tái)病毒中參與自主復(fù)制的基因是NP、P/C及L基因，另外，參與傳播性的基因?yàn)镸、F及HN基因。在利用該病毒作為載體的情況下，其可以具備所述的基因類型，或其中一部分基因例如F基因、M基因、HN基因等也可以缺失(蛋白質(zhì) 核酸 酶Vol. 51，27-37,2006)。特別是通過缺失作為參與侵入宿主細(xì)胞的膜融合蛋白的F蛋白的基因，確保高的安全性(日本特開2009-268471、日本特表2008-536476、WO 00/70070)。 仙臺(tái)病毒的所述基因的核苷酸序列注冊(cè)于如下所述序列數(shù)據(jù)庫等(日本特表2008-536476)。關(guān)于NP 基因，M29343、M30202、M30203、M30204、M51331、M55565、M69046、X17218
坐寸。關(guān)于P 基因，M30202、M30203、M30204、M55565、M69046、X00583、X17007、X17008
坐寸。關(guān)于L 基因，D00053、M30202、M30203、M30204、M69040、X00587、X58886 等。關(guān)于M 基因，D11446、K02742、M30202、M30203、M30204、M69046、U31956、X00584、X53056 等。關(guān)于F 基因，D00152、D11446、D17334、D17335、M30202、M30203、M30204、M69046、X00152、X02131 等。關(guān)于HN 基因，D26475、M12397、M30202、M30203、M30204、M69046、X00586、X02808、X56131 等。另タ卜，仙臺(tái)病毒基因組cDNA可以按照例如Y u, D. et al. , Genes Cells2 457-466，1997、Hasan, M. K. et al.，J. Gen. Virol. 78 :2813-2820,1997 等中所記載的方法構(gòu)建。而且，來自該cDNA的病毒的重建可以按照W097/16539;W0 97/16538 ；W000/70055 ；W0 00/70070 ；W0 01/18223 ；W0 03/025570 ;日本特表 2008-536476 ；Tokusumi,T. et al.，Virus Res. 86 :33-38 (2002) ；Li, H. et al.，J. Virol. 74 :6564-6569 (2000)等中所記載的方法進(jìn)行。作為可以用于重建病毒載體的宿主細(xì)胞，已知有例如來自猴腎臟的LLC-MK2細(xì)胞(ATCC CCL-7)及CV-1細(xì)胞(例如ATCC CCL-70)、來自倉鼠腎臟的BHK細(xì)胞(例如ATCC CCL-10)等培養(yǎng)細(xì)胞、來自人的293T細(xì)胞等，而且，為了得到大量的病毒載體，可以使雞胚感染由上述的宿主細(xì)胞得到的病毒載體并對(duì)其進(jìn)行擴(kuò)增，然后純化(日本特表2008-536476、W000/70055、WO 00/70070)。被回收的病毒的滴度可以通過測(cè)定例如CIU (Cell-Infectious Unit，細(xì)胞感染単位)或紅細(xì)胞凝集活性(HA)來確定(W000/70070)。關(guān)于F基因缺失型仙臺(tái)病毒載體的重建，也可以按照WO 00/70055.W0 00/70070、日本特表2008-536476等中所記載的方法進(jìn)行。此時(shí)，建立表達(dá)仙臺(tái)病毒F蛋白的輔助細(xì)胞株，使用其由F基因缺失基因組回收感染病毒粒子。根據(jù)后述的實(shí)施例，參考上述的方法，并用限制酶NotI消化F基因缺失型仙臺(tái)病毒載體(Z株)的cDNA，在仙臺(tái)病毒核殼體(NP)蛋白質(zhì)基因的轉(zhuǎn)錄起始序列和翻譯區(qū)域(ORF)之間的非翻譯區(qū)域內(nèi)插入分泌信號(hào)序列(例如APP信號(hào)序列或⑶59信號(hào)序列)和突變體Tau蛋白(TAU(P301S))的結(jié)合片段，由此，構(gòu)建搭載突變體Tau基因的F基因缺失型仙臺(tái)病毒載體(Sev-TauP301S)。實(shí)際上構(gòu)建的仙臺(tái)病毒載體重建用質(zhì)粒為pcDNA3-APP-TauP301S(圖14)，在分泌信號(hào)序列的5’末端上結(jié)合起始密碼子(atg)，而且，可以在起始密碼子之前連接科茲(kozak)的共有序列(例如gccacc或ccacc)。為了載體的重建，使用表達(dá)仙臺(tái)病毒F蛋白的輔助細(xì)胞株(W0 00/70070)。在腺病毒載體的情況下，可以使用El區(qū)域缺失型腺病毒載體。除El區(qū)域之外，E3區(qū)域也可以缺失，但E3區(qū)域的缺失不一定是必須的。關(guān)于腺病毒載體，記載于日本特開2008-017849、日本特開 2000-166581、日本特表 2003-518915、Hitt, M.等，“Construction and propagation of human adenovirus vectors，，In Cell Biology A LaboratoryHandbook (Celis, J. E. ed. ) , Third Ed. , Vol. I, Academic Press (2005) > Hitt, M.等，“Techniques for human adenovirus vector construction and characterization，，InMethods in Molecular Genetics (Adolph, K. ff. ed. ), Vol. 7, Academic Press (1995)等。關(guān)于其它病毒載體，在基因治療用中被改良的載體記載于文獻(xiàn)中，因此，可以用于本發(fā)明?！匆呙纭当景l(fā)明的疫苗可以用于tau蛋白病的預(yù)防或治療。與突變體Tau蛋白的直接施用相比，該疫苗在受試者中可以更持續(xù)地誘導(dǎo)對(duì)于Tau蛋白(任選地磷酸化的)的抗體(參照?qǐng)D4、圖6)。本發(fā)明的疫苗將受試者的腦內(nèi)的小神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞進(jìn)行活化，由此吞噬突變體Tau蛋白。作為tau蛋白病的原因物質(zhì)的突變體Tau蛋白利用小神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞被清除，由此，阻礙該蛋白質(zhì)的積累，抑制tau蛋白病的癥狀的進(jìn)展。根據(jù)tau蛋白病模型小鼠(P301S Tau轉(zhuǎn)基因小鼠)中的體內(nèi)試驗(yàn)得知本發(fā)明的疫苗具有改善tau蛋白病、尤其是tau蛋白病型癡呆癥的作用。即，被認(rèn)為癡呆癥的記憶力下降或社交性的缺乏通過接種本發(fā)明的疫苗而得以改善，但在接種重組突變體Tau蛋白時(shí)，沒有看到該改善效果，因此，確認(rèn)本發(fā)明的疫苗的優(yōu)越性。另外，與重組突變體Tau蛋白一祥，觀察到本發(fā)明的疫苗對(duì)癡呆癥中經(jīng)常觀察到的多動(dòng)性(喪失沉著)的改善效果。這樣，本發(fā)明的疫苗具有改善癡呆癥中觀察到的記憶カ下降和/或社會(huì)行為異常和/或焦慮行為異常和/或記憶障礙的效果。就本發(fā)明的疫苗而言，由于具有上述的功效，可以用于tau蛋白病、尤其是阿爾茨海默氏病、FTDP-17(伴有與第17號(hào)染色體有關(guān)的帕金森的額顳葉型癡呆癥)、唐氏綜合征、匹克病、帕金森病-癡呆癥復(fù)合病、神經(jīng)原纖維變化優(yōu)越型癡呆癥、拳擊手癡呆癥、進(jìn)行性核上性麻痹、嗜銀顆粒性癡呆癥、大腦皮質(zhì)基底核變性癥、腦炎后帕金森癥、亞急性硬化性全腦炎、肌肉緊張性營(yíng)養(yǎng)不良、福山型肌肉營(yíng)養(yǎng)不良、關(guān)島肌肉萎縮性側(cè)索硬化癥-帕金森病復(fù)合病、伴有紀(jì)伊半島的神經(jīng)原纖維變化的肌肉萎縮性側(cè)索硬化癥等疾病的預(yù)防或治療。本發(fā)明的疫苗可以根據(jù)需要含有藥學(xué)上允許的載體及添加剤，例如生理鹽水、林格液、緩沖液、植物油、懸浮劑、表面活性剤、穩(wěn)定劑、防腐劑等。另外，可以在疫苗中添加用于提高免疫原性的佐劑。作為佐劑，包含例如鋁鹽(alum)、皂甙類、胞壁酰(ニ)肽、細(xì)胞因子類(IL-2、4、6等)、霍亂毒素、沙門氏菌毒素等免疫促進(jìn)劑。本發(fā)明的疫苗的接種可以通過皮下、皮內(nèi)、鼻內(nèi)、肌肉內(nèi)、靜脈內(nèi)、腹腔內(nèi)等施用路徑來進(jìn)行。優(yōu)選的制劑為注射劑、吸入劑等。吸入劑被封入于可以通過量取用量而吸入的吸入裝置內(nèi)。施用量應(yīng)該根據(jù)受試者(哺乳動(dòng)物、優(yōu)選人)的癥狀、嚴(yán)重度、年齡、性別、體重等而從臨床醫(yī)學(xué)方面適當(dāng)判斷，可以根據(jù)疫苗的形態(tài)或施用方法等而變動(dòng)，對(duì)于病毒載體的情況，非限制的量是例如IO4 IO14Pfu(噬菌斑形成単位)、優(yōu)選IO5 IO13Pfiu更優(yōu)
選IO6 IO11Pfu或IO5 IO9CIU (細(xì)胞感染單位)，另外，對(duì)于質(zhì)粒載體的情況，為例如約I ii g 500ii g,無論如何,只要發(fā)揮疫苗效果,可以在上述的范圍外。另外，為了促進(jìn)細(xì)胞膜的透過，也可以利用脂質(zhì)體。作為脂質(zhì)體優(yōu)選的物質(zhì)為陽離子性脂質(zhì)體。已顯示陽離子性脂質(zhì)體介導(dǎo)質(zhì)粒DNA的細(xì)胞內(nèi)運(yùn)送(Nature 337387(1989))。陽離子性脂質(zhì)體還可以通過結(jié)合膜透過性肽而容易進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)運(yùn)送。關(guān)于脂質(zhì)體，可以參照例如 Brigham 等，Am. J. Med. Sci.，298 278 (1989)、Osaka 等，J. Pharm.Sci.，85 (6) :612-618(1996)、San 等，Human Gene Therapy, 4 :781-788 (1993), Senior等，Biochemica et Biophysica Acta,1070 :173-179(1991)、Kabanov and Kabanov,Bioconjugate Chem. 1995 ；6 :7_20、Remy 等，Bioconjugate Chem. ,5 :647-654(1994)；Behr, J-P. , Bioconjugate Chem. ,5 :382-389 (1994)、Wyman 等，Biochem. ,36 3008-3017(1997)等文獻(xiàn)。
實(shí)施例以下，列舉實(shí)施例具體地說明本發(fā)明，但本發(fā)明的范圍不受這些實(shí)施例限制。[實(shí)施例I]搭載突變體Tau基因的F基因缺失型仙臺(tái)病毒載體的構(gòu)建I)分泌信號(hào)序列和表達(dá)Tau蛋白的仙臺(tái)病毒載體的構(gòu)建分泌型信號(hào)序列以淀粉樣前體蛋白(APP，序列數(shù)據(jù)庫登錄號(hào)NT_011512. 11、Nff_001838706. I、麗_201414. I、NM_201413. I、麗_000484. 2、麗_001136130. I、NM_001136129. I)為基礎(chǔ)，使用以下的序列。5’ -ggtctagaatgctgcccggtttggcactgctcctgctggccgcctggacggctcgggcgctt-3(序列號(hào) 2)突變體Tau蛋白(TauP301S)的cDNA以在人1N4R型Tau蛋白(序列數(shù)據(jù)庫登錄號(hào)NM_001123067. 2)的堿基序列上加入了突變的序列[從記載于NM_001123067. 2的氨基酸序列的272位(對(duì)應(yīng)于序列號(hào)I的301位的位置)的脯氨酸(P)密碼子向絲氨酸(S)密碼子的突變；序列號(hào)13的884 886位的絲氨酸密碼子(tcg)]為模板，使用以下的引物用PCR進(jìn)行擴(kuò)增。5 ’ 側(cè)正向引物gctgagccccgccaggag (序列號(hào) 4)3’ 側(cè)反向引物tcacaaaccctgcttggccag(序列號(hào) 5)
將APP分泌信號(hào)和用PCR進(jìn)行擴(kuò)增的Tau蛋白的cDNA結(jié)合，以其為模板，使用以下的引物進(jìn)行PCR。5’ 側(cè)正向引物aaagaattcggcttggtctagaatgctgcccggtttggcac (序列號(hào) 6)3’ 側(cè)反向引物aaagaattctcacaaaccctgcttggccag(序列號(hào) 7)將所得的PCR產(chǎn)物用限制酶EcoRI進(jìn)行消化，接著，在pcDNA3 (Invitrogen)上進(jìn)行亞克隆。搭載突變體Tau基因的F基因缺失型仙臺(tái)病毒載體的構(gòu)建按照Li等的報(bào)道(Li Het al. J. Virology. 74. 6564-6569 (2000) ；W0 00/70070)中記載的方法進(jìn)行。將 F 基因缺失型仙臺(tái)病毒載體(Z株)的cDNA用限制酶NotI進(jìn)行消化，將分泌信號(hào)序列和突變體Tau蛋白的結(jié)合片段插入于仙臺(tái)病毒核殼體(NP)蛋白基因的轉(zhuǎn)錄起始序列和翻譯區(qū)域之間的 非翻譯區(qū)域，由此，構(gòu)建搭載突變體Tau基因的F基因缺失型仙臺(tái)病毒載體。另外，用作対照的表達(dá)EGFP的F基因缺失型仙臺(tái)病毒載體也使用pTRES2-EGFP載體(Clonetech)的EGFP部分進(jìn)行構(gòu)建。2)搭載突變體Tau基因的F基因缺失型仙臺(tái)病毒載體的重建和擴(kuò)增缺失有F基因的仙臺(tái)病毒載體的重建以上述的Li等的報(bào)道(Li H et al. J. Virology. 74. 6564-6569(2000) ；W0 00/70070)為參考來實(shí)施。由于該仙臺(tái)病毒載體為F基因缺失型，因此，使用表達(dá)F蛋白的包裝細(xì)胞，制備搭載突變體Tau基因的F基因缺失型仙臺(tái)病毒載體(以下稱為“Sev-TauP301S”)及搭載EGFP基因的F基因缺失型仙臺(tái)病毒載體(以下稱為 “Sev-GFP”)。
[實(shí)施例2]搭載有突變體Tau基因的質(zhì)粒載體的構(gòu)建I)分泌信號(hào)序列和表達(dá)Tau蛋白的質(zhì)粒載體的構(gòu)建分泌信號(hào)序列使用⑶59蛋白(序列數(shù)據(jù)庫登錄號(hào)NM_001127227. I、NM_001127226. I、麗_000611. 5、NM_203331. 2、NM_001127225. I、NM_203329. 2、NM_203330. 2、NM_001127223. I)的堿基序列中的以下的序列。5’ -atgggaatccaaggagggtctgtcctgttcgggctgctgctcgtcctggctgtcttctgccattcaggtcatagc-3’ (序列號(hào) 3)突變體Tau蛋白(TauP301S)的cDNA以在人1N4R型Tau蛋白(序列數(shù)據(jù)庫登錄號(hào)NM_001123067. 2)的序列上加入了突變的序列[從記載于NM_001123067. 2的氨基酸序列的272位(對(duì)應(yīng)于序列號(hào)I的301位的位置)的脯氨酸(P)密碼子向絲氨酸(S)密碼子的突變；序列號(hào)12的898 900位的絲氨酸密碼子(agt)]為模板，使用以下的引物用PCR進(jìn)行擴(kuò)増。另外，為了對(duì)搭載于本質(zhì)粒載體的突變體Tau與搭載于仙臺(tái)病毒載體的突變體Tau進(jìn)行區(qū)別，使其具有不同的絲氨酸密碼子的序列。5’ 側(cè)正向引物gctgagccccgccaggag(序列號(hào) 8)3’ 側(cè)反向引物tcacaaaccctgcttggccag(序列號(hào) 9)將⑶59分泌信號(hào)和用PCR進(jìn)行擴(kuò)增的Tau蛋白的cDNA結(jié)合，以其為模板，使用以下的引物進(jìn)行PCR。5’ 側(cè)正向引物ttgaattcgccaccatgggaatccaaggag(序列號(hào) 10)3’ 側(cè)反向引物aattctcgagtcacaaaccctgcttggc (序列號(hào) 11)
將所得的PCR產(chǎn)物用限制酶EcoRI和XhoI進(jìn)行消化，接著，將pcDNA3. I (+)質(zhì)粒載體(Invitrogen)的多克隆位點(diǎn)用限制酶EcoRI和XhoI進(jìn)行消化,插入于各自的切斷位點(diǎn)間。2)搭載突變體Tau基因的質(zhì)粒載體的擴(kuò)增質(zhì)粒載體的擴(kuò)增以Invitrogen公司發(fā)行的pcDNA3. I制品使用說明書為基礎(chǔ),按照以下的要領(lǐng)進(jìn)行。將大腸桿菌DH5ci株用質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)化。接著，播種于LB-氨芐青霉素培養(yǎng)基，對(duì)每個(gè)單ー克隆進(jìn)行少量培養(yǎng)并純化。用Nucleobond質(zhì)粒純化試劑盒(MACHEREY-NAGEL)提取質(zhì)粒，進(jìn)行測(cè)序以確認(rèn)是否正確地復(fù)制，選擇有效的克隆。接種于小鼠的質(zhì)粒載體的擴(kuò)增通過選擇的克隆的大量培養(yǎng)進(jìn)行，在質(zhì)粒的提取中使用無內(nèi)毒素等級(jí)的Nucleobond質(zhì)粒純化試劑盒。[實(shí)施例3] 利用搭載突變體Tau基因的F基因缺失型仙臺(tái)病毒載體的體內(nèi)試驗(yàn)I)表達(dá)GFP的F基因缺失型仙臺(tái)病毒載體對(duì)小鼠的經(jīng)鼻施用使用3個(gè)月齡的Tau蛋白病模型小鼠(P301S Tau轉(zhuǎn)基因小鼠)(由Yoshiyama，Y，et al. Neuron 53, 337-351 (2007) !University of Pennsylvania Dr. Tro janowski 提供)，進(jìn)行本發(fā)明的搭載GFP的F基因缺失型仙臺(tái)病毒載體(以下稱為“Sev-GFP”)的經(jīng)鼻施用，并進(jìn)行感染效率的探討。每I只小鼠施用Sev-GFP 5xl06CIU，用多功能顯微鏡(BZ-9000，Keyence)進(jìn)行熒光成像和亮視場(chǎng)像的拍攝，對(duì)I周后鼻粘膜中的GFP的表達(dá)進(jìn)行分析。分析的結(jié)果，在鼻粘膜的寬廣的范圍看到GFP的表達(dá)，確認(rèn)仙臺(tái)病毒載體的經(jīng)鼻施用是有效的(圖I)。2) Sev-TauP301S接種對(duì)磷酸化Tau蛋白表達(dá)的抑制效果(其I)對(duì)3個(gè)月齡的Tau蛋白病模型小鼠經(jīng)鼻(鼻內(nèi))施用SeV_TauP301S 5 X IO6CIU/只，在施用5個(gè)月后進(jìn)行解剖，制備海馬冠狀的組織切片。作為對(duì)照疫苗，使用Sev-GFP。另夕卜，在上述2個(gè)組中，分別對(duì)13只、11只tau蛋白病模型小鼠進(jìn)行接種。為了測(cè)定磷酸化Tau的表達(dá)水平，對(duì)海馬的組織切片進(jìn)行免疫染色。在小鼠海馬冠狀剖面中使抗磷酸化Tau蛋白質(zhì)抗體(AT8, Innogenetics)反應(yīng)并清洗后,進(jìn)行使用作為2次抗體的生物素標(biāo)記的馬抗小鼠IgG抗體(Vector)的免疫染色。免疫染色后，用多功能顯微鏡(BZ-9000，Keyence)附屬分析軟件測(cè)定在海馬CA3區(qū)域內(nèi)積累的區(qū)域的面積。用學(xué)生t檢驗(yàn)進(jìn)行Sev-GFP組、Sev-TauP301S組各自的平均值土標(biāo)準(zhǔn)誤差、統(tǒng)計(jì)學(xué)的分析。作為結(jié)果，與Sev-GFP施用組相比，在Sev-TauP301S施用組中，暗示了海馬中磷酸化Tau的表達(dá)的抑制(圖2)。3) Sev-TauP301S接種對(duì)磷酸化Tau蛋白表達(dá)的抑制效果(2)關(guān)于Sev-TauP301S或Sev-GFP接種對(duì)Tau蛋白表達(dá)的抑制效果，使用來自海馬的蛋白質(zhì)利用免疫印跡法進(jìn)行分析。免疫印跡法的方法如下所述。用RAB-HS緩沖液將海馬組織均質(zhì)化后，在4°C下用50，OOOXg,進(jìn)行40分鐘離心分離，將上清液進(jìn)行SDS處理，用15 y g/樣品在SDS-PAGE上電泳。電泳后，進(jìn)行PVDF膜轉(zhuǎn)移，與抗磷酸化Tau蛋白質(zhì)抗體(AT8, Innogenetics)反應(yīng)，清洗后，使用作為2次抗體的HR 標(biāo)記的綿羊抗小鼠IgG抗體(GE Healthcare)，利用ECL(GE Healthcare)的化學(xué)發(fā)光進(jìn)行檢測(cè)。磷酸化Tau蛋白的評(píng)價(jià)后，用Strippingsolution(Nakalai)剝離抗體,然后使用抗P _肌動(dòng)蛋白抗體(SIGMA)再次用同樣的方法進(jìn)行檢測(cè)。就積累的磷酸化Tau蛋白質(zhì)量而言，用圖像分析軟件(NIH Image, Ver. I. 63,NIH,US)測(cè)定條帶的信號(hào)強(qiáng)度，取得作為內(nèi)部對(duì)照蛋白質(zhì)的￠-肌動(dòng)蛋白和信號(hào)強(qiáng)度之比，并進(jìn)行定量化。對(duì)照疫苗(Sev-GFP)接種組、Tau疫苗(Sev-TauP301S)接種組各自的平均值土標(biāo)準(zhǔn)誤差、統(tǒng)計(jì)學(xué)的分析用學(xué)生t檢驗(yàn)進(jìn)行。作為結(jié)果得知，與Sev-GFP接種組相比，在Sev-TauP301S接種組中，抑制了海馬中磷酸化Tau的表達(dá)(圖3)。4)與海馬中磷酸化Tau反應(yīng)的抗體的誘導(dǎo)血清中與組織Tau反應(yīng)的抗體效價(jià)用相對(duì)于沒有施用Sev_TauP301S的Tau蛋白病模型小鼠海馬組織的反應(yīng)性進(jìn)行評(píng)價(jià)。將施用有Sev_TauP301S或Sev-GFP (各5 X IO6CIU/只)的小鼠的血清分別稀釋30倍、100倍、300倍、1000倍、3000倍，在4°C下放置一晩，與Tau蛋白病模型小鼠海馬組織切片反應(yīng)后，使Alexa546標(biāo)記的抗小鼠IgG抗體 (Invitrogen)在室溫下用I小時(shí)反應(yīng)并進(jìn)行檢測(cè)。各小鼠的抗體效價(jià)用觀察到與組織反應(yīng)的最大稀釋倍率進(jìn)行評(píng)價(jià)。用Mann-Whitney的U檢驗(yàn)進(jìn)行Sev-GFP接種組、Sev_TauP301S接種組各自的平均值土標(biāo)準(zhǔn)誤差、統(tǒng)計(jì)學(xué)的分析。作為結(jié)果，與來自施用有Sev-GFP的小鼠的血清相比，使來自SeV_TauP301S接種小鼠的血清反應(yīng)時(shí)，在海馬中進(jìn)行反應(yīng)的抗體效價(jià)顯著地高。由以上的結(jié)果確認(rèn)，通過接種Sev_TauP301S,在血清中所產(chǎn)生的抗體與表達(dá)磷酸化Tau的海馬進(jìn)行反應(yīng)(圖4a、4c)。5)Sev-TauP301S接種對(duì)腦內(nèi)的小神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的活化進(jìn)行實(shí)驗(yàn)以確認(rèn)SeV-TauP301S接種引起的腦內(nèi)的神經(jīng)免疫活性細(xì)胞小神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的變化。對(duì)3個(gè)月齡的Tau蛋白病模型小鼠接種Sev-TauP301S 5X IO6CIU/只，接種5個(gè)月后取出腦組織，制備海馬的組織切片，如下進(jìn)行免疫染色。在小鼠海馬冠狀剖面中使抗Ibal抗體(WAKO)在4°C下反應(yīng)ー晚，清洗后，與作為二次抗體的Alexa488標(biāo)記的山羊抗兔IgG抗體(Invitrogen)和檢測(cè)組織中小鼠IgG的Alexa546標(biāo)記的抗小鼠IgG抗體(Invitrogen)的組合在室溫下反應(yīng)I小時(shí)，用突光雙重免疫染色進(jìn)行檢測(cè)。免疫染色后，用多功能顯微鏡(BZ-9000，Keyence)對(duì)海馬CA3區(qū)域拍攝熒光成像。其結(jié)果，與作為對(duì)照的Sev-GFP施用組相比，就Sev-TauP301S施用組而言，在海馬中看到許多Ibal陽性細(xì)胞，這些陽性細(xì)胞的許多與抗小鼠IgG抗體共染色。報(bào)道Ibal (Ionized calcium binding adapter molecule I)伴隨小神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的活化而增加其表達(dá)量，因此，Ibal是與小神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的活化有關(guān)的分子(Ito D. et al.，Brain Res.Mol. Brain Res. 57. 1-9，1998)，而且認(rèn)為，小鼠IgG識(shí)別組織中的TauP301S，因此認(rèn)為，通過Sev-TauP301S的接種，活化小神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞與TauP301S的反應(yīng)(圖5)。關(guān)于由Tau疫苗接種引起的小神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的活化增加，暗示如下可能性1)在外周血中，巨噬細(xì)胞受到抗原呈遞而活化，通過血腦屏障聚集于腦，成為活化小神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，吞噬突變體Tau蛋白；或2)突變體Tau蛋白通過血腦屏障，在腦內(nèi)小神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞直接受到抗原呈遞而活化，吞噬突變體Tau蛋白。6)以重組磷酸化Tau蛋白為抗原的ELISA
為確認(rèn)接種Sev_TauP301S導(dǎo)致的血清中所產(chǎn)生的抗體是否為磷酸化Tau特異的抗體，因此，進(jìn)行了以重組突變體Tau蛋白(TAUP301S)為抗原的ELISA。重組突變體Tau蛋白的制備基于坂上等(Sakaue F et al. J. Biol.Chem. 280. 31522-31529,2005)的方法進(jìn)行。具體而言，使插入有TauP301S (1N4R型)的PRK172載體在大腸桿菌(BL21-DE3株)中表達(dá)，由菌體利用磷酸纖維素柱(Pll)、50%硫酸銨沉淀、熱處理、進(jìn)而反相HPLC純化，并進(jìn)行冷凍干燥，在4°C下保存。
關(guān)于血清中的抗磷酸化Tau抗體的產(chǎn)生，利用以下的ELISA法進(jìn)行分析。將用前述的方法制備的重組TAUP301S蛋白質(zhì)(lug/ml/孔)在96孔板上、在4°C下過夜進(jìn)行固相化。在臨接種Sev-TauP301S或Sev-GFP之前及接種后第I個(gè)月采集血清，使用將從接種小鼠上采取的血清稀釋了 50倍的血清，在室溫下放入平板上2小時(shí)并使其反應(yīng)。反應(yīng)后，經(jīng)過清洗，使HR標(biāo)記的綿羊抗小鼠IgG抗體(GE Healthcare)在室溫下反應(yīng)I小時(shí)。反應(yīng)后進(jìn)行清洗，用Opti-EIATMB Substrate Reagent Set (BD)進(jìn)行顯色,通過450nm的波長(zhǎng)中的吸光度測(cè)定進(jìn)行定量化。在測(cè)定的陽性對(duì)照血清中使用皮下接種有重組TAUP301S蛋白質(zhì)的小鼠血清進(jìn)行系列稀釋，使用將血清原液中的抗體滴度作為1，000単位制備的吸光度-単位間的標(biāo)準(zhǔn)曲線，將吸光度變換為単位。根據(jù)這樣求出的每個(gè)小鼠的接種后單位量評(píng)價(jià)抗體效價(jià)的增加。該ELISA的結(jié)果可以確認(rèn),通過接種Sev-TauP301S,在血清中較多地產(chǎn)生抗磷酸化Tau抗體(圖6a)。在接種有重組蛋白質(zhì)的小鼠中顯著產(chǎn)生Tau特異的抗體，認(rèn)為是因?yàn)檫M(jìn)行接種后早期的血液中存在大量突變體Tau蛋白，因而大量抗原呈遞細(xì)胞暴露于突變體Tau蛋白。另外，腦脊髓液中的磷酸化Tau蛋白的量利用以下的方法進(jìn)行測(cè)定。96孔板預(yù)先用3 V- g/ml抗磷酸化抗體(AT8抗體)在4°C下包覆處理過夜。將從接種有Sev-TauP301S或Sev-GFP的小鼠上采取的腦脊髓液(CSF)稀釋50倍，添加于各孔并使其反應(yīng)。作為陽性對(duì)照，將14個(gè)月齡的Tau蛋白病模型小鼠的腦進(jìn)行均質(zhì)化，使用將所得的液體系列稀釋為100 102400倍的液體。作為2次抗體，使兔抗人Tau蛋白抗體、其后過氧化物酶標(biāo)記的綿羊抗兔IgG F(ab’ ) 2抗體反應(yīng),使用Tetramethyl Benzidone液體進(jìn)行顯色。450nm 的吸光度利用自動(dòng)平板檢測(cè)儀(Model 353 ；Thermo Scientific, Japan)進(jìn)行測(cè)量。作為結(jié)果，在進(jìn)行了 Sev-TauP301S接種的Tau蛋白病模型小鼠的腦脊髓液中觀察到高濃度的磷酸化Tau蛋白(圖6b)。7)小鼠行為分析全部的行為實(shí)驗(yàn)在受到京都大學(xué)醫(yī)學(xué)研究科動(dòng)物實(shí)驗(yàn)委員會(huì)(京都，日本)認(rèn)可的基礎(chǔ)上進(jìn)行。通過對(duì)本實(shí)驗(yàn)中使用的Tau蛋白病模型小鼠(P301STau轉(zhuǎn)基因小鼠)施用Tau疫苗，用以下的方法評(píng)價(jià)癡呆癥患者中觀察到的行為學(xué)的異常(記憶カ下降、社交性的缺乏、焦慮行為、多動(dòng)性、活動(dòng)量、空間學(xué)習(xí)、參照記憶、感覺中樞、聽カ等)的改善效果。(I)對(duì)tau蛋白病模型小鼠的SeV-TauP301S接種的新奇環(huán)境下的社會(huì)行為實(shí)驗(yàn)(bocial interaction test)社會(huì)行為實(shí)驗(yàn)是用于評(píng)價(jià)在新奇場(chǎng)面中的行為的實(shí)驗(yàn)。將接種有Sev-TauP301S (5 X IO6CIU/只)的Tau蛋白病模型小鼠或接種有Sev-GFP(5X IO6CIU/只)的Tau蛋白病模型小鼠在接種后第3個(gè)月，與至今沒有進(jìn)入過同一籠子的小鼠每I只放入I個(gè)箱(40 X 40 X 30cm)中，使其自由地探尋10分鐘。社會(huì)行為通過CXD照相機(jī)(Sony DXC-151A)進(jìn)行監(jiān)視，將圖像載入計(jì)算機(jī)并使用Image SI軟件自動(dòng)地測(cè)定接觸次數(shù)、每I次接觸的平均時(shí)間、移動(dòng)距離。進(jìn)行了分析，與施用有Sev-GFP的Tau蛋白病模型小鼠相比，接種Sev-TauP301S的Tau蛋白病模型小鼠對(duì)陌生小鼠接觸的時(shí)間長(zhǎng)。根據(jù)該分析，確認(rèn)了社會(huì)行為、以及對(duì)新的小鼠的出現(xiàn)的響應(yīng)能力的改善效果(圖7A)。(2)對(duì)Tau蛋白病模型小鼠的SeV_TauP301S接種產(chǎn)生的社會(huì)行為測(cè)定實(shí)驗(yàn)(しrawley versionノ社會(huì)行為測(cè)定實(shí)驗(yàn)(Crawley’s social interaction test, Crawley 社會(huì)行為測(cè)定實(shí)驗(yàn))是用于對(duì)各類的小鼠的記憶力、社會(huì)關(guān)系的形成、社交性的評(píng)價(jià)的實(shí)驗(yàn)。裝置利用嵌板隔成3個(gè)空間，在兩端的空間的一角落分別設(shè)定小的籠子各I個(gè)。將至今沒有進(jìn)入過同一籠子的小鼠放入籠子中，其后，對(duì)Tau蛋白病模型小鼠接種Sev-TauP301S (5 X IO6CIU/只)或Sev-GFP (5 X IO6CIU/只)，將接種后第3個(gè)月的小鼠放置于籠子之外，10分鐘期間原封不動(dòng)放置。10分鐘后，在另外的籠子中放入其它的至今沒有進(jìn)入過同一籠子的小鼠后，接種Sev-TauP301S或接種Sev-GFP的Tau蛋白病模型小鼠在已經(jīng)進(jìn)入了 10分鐘的小鼠(Familiar Side,熟悉側(cè))、新的陌生小鼠(Stranger Side,陌生側(cè))中哪ー個(gè)小鼠的附近長(zhǎng)時(shí)間停留，通過測(cè)定停留時(shí)間進(jìn)行社會(huì)行為的評(píng)價(jià)。作為結(jié)果，與Sev-GFP接種Tau蛋白病模型小鼠在熟悉側(cè)的停留時(shí)間長(zhǎng)相比，接種Sev-TauP301S的Tau蛋白病模型小鼠在陌生側(cè)的停留時(shí)間長(zhǎng)，確認(rèn)了社會(huì)行為、以及對(duì)不同小鼠的記憶カ的改善效果(圖7B)。(3)對(duì)tau蛋白病模型小鼠的Sev-TauP301S接種的高架十字迷宮實(shí)驗(yàn)高架十字迷宮是用于評(píng)價(jià)焦慮行為的裝置，由相同大小的2個(gè)開放臂和附有高度15cm的透明的壁的2個(gè)閉合臂構(gòu)成。在閉合臂上安裝有高度15cm的透明的壁。臂以及中心的正方形的部分由白的塑料板形成，位于離地板50cm的高度。將接種SeV-TauP301S(5xl07CIU/只，每I周一次，共3次)的Tau蛋白病模型小鼠或同滴度的Sev-GFP接種給Tau蛋白病模型小鼠，將接種后第3個(gè)月的小鼠分別在迷宮中心的正方形的部分(5X5cm)以朝向閉合臂的方向的方式放置，記錄10分鐘行為。使用Image EP軟件自動(dòng)地測(cè)量從迷宮中心向4個(gè)方向的每ー個(gè)方向的全部出入次數(shù)(A)、向沒有柵欄的方向的出入次數(shù)的比例(B)、小鼠的總移動(dòng)距離(C)、向沒有柵欄的場(chǎng)所的停留時(shí)間的比例(D)。接種Sev-TauP301S的Tau蛋白病模型小鼠，向沒有柵欄的場(chǎng)所的停留時(shí)間顯著地變少，確認(rèn)了焦慮行為、以及對(duì)落下的危險(xiǎn)的判斷力的改善(圖8D)。(4)對(duì)Tau蛋白病模型小鼠的重組Tau蛋白接種的曠場(chǎng)試驗(yàn)曠場(chǎng)試驗(yàn)是用于測(cè)定活動(dòng)量或情緒性的實(shí)驗(yàn)。隨著將重組Tau蛋白(TAUP301S)100ii g/只/次、每2周一次共3次、用Adju-Phos佐劑(Gentaur公司)對(duì)Tau蛋白病模型小鼠進(jìn)行皮下接種，在接種后第一個(gè)月進(jìn)行曠場(chǎng)試驗(yàn)。對(duì)接種小鼠，在附有高度30cm的柵欄的40cm見方的曠場(chǎng)試驗(yàn)用裝置(AccuscanInstruments)中放入小鼠,將120分鐘的自由行為劃分為5分鐘時(shí)段,評(píng)價(jià)移動(dòng)距離(A)、伸腰的次數(shù)(B)、在視野中央的停留時(shí)間(C)、刻板行為(D)。對(duì)于接種TAUP301S的Tau蛋 白病模型小鼠，移動(dòng)距離顯著地變短，確認(rèn)有多動(dòng)性(沉著的喪失)的改善效果(圖9A)。
(5)對(duì)Tau蛋白病模型小鼠的重組Tau蛋白接種的高架十字迷宮實(shí)驗(yàn)隨著將重組Tau蛋白(TAUP301S) 100 ii g/只/次、每2周一次共3次、用Adju-Phos佐劑(Gentaur公司)對(duì)Tau蛋白病模型小鼠進(jìn)行皮下接種，在接種后第一個(gè)月進(jìn)行高架十字迷宮的分析。將接種小鼠分別在迷宮中心的正方形的部分(5X5cm)以朝向閉合臂的方向放置，記錄10分鐘行為。使用Image EP軟件自動(dòng)地測(cè)量從中央向4個(gè)方向的每ー個(gè)方向的全部的出入次數(shù)(A)、出入于沒有柵欄的方向的的次數(shù)的比例(B)、小鼠的總移動(dòng)距離(C)、向沒有柵欄的場(chǎng)所的停留時(shí)間的比例⑶。接種TAUP301S的Tau蛋白病模型小鼠，與對(duì)照(佐劑施用)的小鼠的結(jié)果相比，在高架十字迷宮分析中沒有確認(rèn)有大的差異(圖10)。(6)對(duì)Tau蛋白病模型小鼠的DNA-Tau P301S接種的曠場(chǎng)試驗(yàn) 在開始的時(shí)刻，在5個(gè)月齡的Tau蛋白病模型小鼠左后肢大腿肌肉上進(jìn)行肌肉內(nèi)接種cDNA-Tau P301S 100 y g/只/次，每周一次共6次，接著，每2周一次共3次，總計(jì)9次，在接種后第一個(gè)月進(jìn)行曠場(chǎng)試驗(yàn)。對(duì)接種小鼠，在附有高度30cm的柵欄的40cm見方的曠場(chǎng)試驗(yàn)用裝置(Accuscan Instruments)中放入小鼠,將120分鐘的自由行為劃分為5分鐘時(shí)段，評(píng)價(jià)移動(dòng)距離(A)、伸腰的次數(shù)(B)、在視野中央的停留時(shí)間(C)、刻板行為(D)。接種cDNA-Tau P301S的Tau蛋白病模型小鼠證實(shí)移動(dòng)距離縮短，確認(rèn)有多動(dòng)性(沉著的喪失)的改善效果(圖11A)。(7)對(duì)Tau蛋白病模型小鼠的cDNA-Tau P301S接種的新奇環(huán)境下的社會(huì)行為實(shí)驗(yàn)在開始的時(shí)刻，在5個(gè)月齡的Tau蛋白病模型小鼠左后肢大腿肌肉上進(jìn)行肌肉內(nèi)接種cDNA-Tau P301S 100 u g/只/次，每周一次共6次，接著，每2周一次共3次，總計(jì)9次，在接種后第一個(gè)月與至今沒有進(jìn)入過同一籠子的小鼠每I只放入I個(gè)箱(40X40X30cm)中，自由地探尋10分鐘。就社會(huì)行為而言，通過CXD照相機(jī)(Sony DXC-151A)進(jìn)行監(jiān)視，將圖像載入計(jì)算機(jī)，使用Image SI軟件自動(dòng)地測(cè)定接觸次數(shù)、每I次接觸的平均時(shí)間、移動(dòng)距離。進(jìn)行了分析，接種cDNA-Tau P301S的Tau蛋白病模型小鼠與作為對(duì)照的接種有pcDNA3. l(ATG-)(以下為cDNA-空白)的Tau蛋白病模型小鼠相比，對(duì)陌生小鼠接觸的時(shí)間顯著縮短& = 0.0164，學(xué)生セ檢驗(yàn))(圖12A)。另外，接種cDNA-Tau P301S的Tau蛋白病模型小鼠與接種cDNA-空白的Tau蛋白病模型小鼠相比，移動(dòng)距離也縮短。(圖12B)。其結(jié)果，與曠場(chǎng)試驗(yàn)同樣地，通過cDNA-Tau P301S接種，確認(rèn)有對(duì)多動(dòng)性的改善。(8)對(duì)Tau蛋白病模型小鼠的Sev-TauP301S接種的巴恩斯迷宮試驗(yàn)巴恩斯迷宮試驗(yàn)是用于研究空間學(xué)習(xí)或參照記憶的實(shí)驗(yàn)。在I張圓狀的板上打12個(gè)孔，僅在其中的I個(gè)孔的下面放置有暗箱。對(duì)Tau蛋白病模型小鼠及野生型小鼠接種Sev-TauP301S(5X IO6CIU/ 只)或 Sev-GFP (5 X IO6CIU/ 只)，在接種后第 4 個(gè)月進(jìn)行本實(shí)驗(yàn)。首先，在一定期間內(nèi)以使小鼠記憶暗箱的空間的位置的方式進(jìn)行訓(xùn)練(訓(xùn)練期間)，訓(xùn)練結(jié)束后經(jīng)過24小時(shí)后，根據(jù)停留于(放置有暗箱)靶點(diǎn)的孔的周圍的時(shí)間，評(píng)價(jià)空間學(xué)習(xí)或參照記憶(探測(cè)試驗(yàn))。通過Sev_TauP301S接種,在Tau蛋白病模型小鼠中，至到達(dá)革巴點(diǎn)的時(shí)間減少(圖15B)，而且，停留于靶點(diǎn)的孔的周圍的時(shí)間變長(zhǎng)(圖15C)，因此，確認(rèn)有改善效果。(9)對(duì)Tau蛋白病小鼠的Sev_TauP301S接種的恐怖條件反射試驗(yàn)恐怖條件反射試驗(yàn)是用于測(cè)定情景記憶或注意能力的實(shí)驗(yàn)。對(duì)Tau蛋白病小鼠及野生型小鼠接種Sev-TauP301S(5X IO6CIU/只)或Sev-GFP (5 X IO6CIU/只)，在接種后第4個(gè)月進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。對(duì)放入箱中的小鼠施加電休克，在該體驗(yàn)有電休克的同一箱中給予其它的刺激(例如聲音)，經(jīng)過一定的時(shí)間后，在同一箱中放入小鼠或者放入其它箱中并進(jìn)行同一聲音引起的刺激的，由此在小鼠中產(chǎn)生凍結(jié)(畏縮行為)現(xiàn)象。根據(jù)該凍結(jié)的出現(xiàn)率評(píng)價(jià)情景記憶或注意能力。通過Sev-TauP301S接種，在Tau蛋白病模型小鼠中，凍結(jié)的出現(xiàn)率減少，確認(rèn)有改善效果(圖16C)。(10)對(duì)Tau蛋白病模型小鼠的Sev-TauP301S接種的身體測(cè)定圖17表示對(duì)Tau蛋白病模型小鼠及野生型小鼠接種SeV_TauP301S(5X IO6CIU/只)或Sev-GFP(5X IO6CIU/只)、在接種后第一個(gè)月進(jìn)行與體重、體溫、握力、抓住金屬絲的時(shí)間有關(guān)的測(cè)定的結(jié)果。沒有確認(rèn)有各組中的優(yōu)勢(shì)差。
(11)對(duì)Tau蛋白病模型小鼠的Sev-TauP301S接種產(chǎn)生的社會(huì)行為測(cè)定試驗(yàn)社會(huì)行為測(cè)定試驗(yàn)是將被試小鼠2只放入箱中、對(duì)10分鐘的接觸次數(shù)或接觸持續(xù)時(shí)間、小鼠的移動(dòng)距離等進(jìn)行測(cè)定的用于社會(huì)行為測(cè)定的實(shí)驗(yàn)。對(duì)Tau蛋白病模型小鼠及野生型小鼠接種Sev-TauP301S (5 X IO6CIU/只)或Sev-GFP (5 X IO6CIU/只)，在接種后第2個(gè)月進(jìn)行本實(shí)驗(yàn)。作為結(jié)果，在接種Sev-TauP301S的Tau蛋白病模型小鼠中，確認(rèn)在接觸次數(shù)的増加(圖18B)、活躍接觸的持續(xù)時(shí)間的延長(zhǎng)(圖18C)及總移動(dòng)距離的増加(圖18E)方面有改善效果。(12)通過對(duì)Tau蛋白病模型小鼠的Sev-TauP301S接種的前脈沖抑制實(shí)驗(yàn)前脈沖抑制實(shí)驗(yàn)是進(jìn)行感覺中樞或聽力、(對(duì)于刺激)跳起的反應(yīng)等的評(píng)價(jià)的實(shí)驗(yàn)。對(duì)于接種Sev-TauP301S(5X IO6CIU/只)的Tau蛋白病模型小鼠及野生型小鼠或接種Sev-GFP (5X IO6CIU/只)的Tau蛋白病模型小鼠及野生型小鼠，在接種后第3個(gè)月進(jìn)行了前脈沖抑制實(shí)驗(yàn)。作為結(jié)果，也沒有確認(rèn)有通過Sev-TauP301S接種的凍結(jié)抑制效果，在各組間沒有確認(rèn)有優(yōu)勢(shì)的差異(圖19)。(13)對(duì)Tau蛋白病模型小鼠的SeV_TauP301S接種的曠場(chǎng)試驗(yàn)對(duì)Tau蛋白病模型小鼠及野生型小鼠接種Sev-TauP301S (5X106CIU/只)或Sev-GFP(5X106CIU/只)，在接種后第一個(gè)月進(jìn)行了曠場(chǎng)試驗(yàn)。(A)表示總移動(dòng)距離，(B)表示垂直方向的活動(dòng)量，(C)表示在中心部的停留時(shí)間，(D)表示刻板行為次數(shù)。在各組間沒有確認(rèn)有優(yōu)勢(shì)的差異(圖20)。(14)對(duì)Tau蛋白病模型小鼠及野生型小鼠的曠場(chǎng)試驗(yàn)對(duì)野生型小鼠及Tau蛋白病模型小鼠進(jìn)行了曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)。(A)表示總移動(dòng)距離，(B)表示垂直方向的活動(dòng)量，(C)表示中心部中的停留時(shí)間，(D)表示刻板行為次數(shù)。與野生型小鼠相比，Tau蛋白病模型小鼠總移動(dòng)距離長(zhǎng)(A)，垂直方向的運(yùn)動(dòng)量多
(B)，停留在中心部的時(shí)間(C)長(zhǎng)。對(duì)于刻板行為次數(shù)(D)，沒有確認(rèn)有優(yōu)勢(shì)的差異(圖21)。(15)對(duì)Tau蛋白病模型小鼠及野生型小鼠的高架十字迷宮實(shí)驗(yàn)對(duì)Tau蛋白病小鼠或野生型小鼠進(jìn)行了高架十字迷宮實(shí)驗(yàn)。作為結(jié)果，對(duì)于Tau蛋白病小鼠，侵入沒有柵欄的開放臂的比例⑶和停留在沒有柵欄的開放臂的時(shí)間(D)與野生型小鼠相比顯示優(yōu)勢(shì)高的值(圖22)。(16)對(duì)Tau蛋白病模型小鼠及野生型小鼠的前脈沖抑制實(shí)驗(yàn)
對(duì)Tau蛋白病模型小鼠及野生型小鼠進(jìn)行了前脈沖抑制實(shí)驗(yàn)。Tau蛋白病模型小鼠與野生型小鼠相比，對(duì)聲音的驚愕反應(yīng)低(圖23A)，但通過預(yù)先發(fā)出小的聲音后發(fā)出大的聲音的驚愕反應(yīng)的抑制的比例顯示高的值(圖23B)。(17)對(duì)Tau蛋白病模型小鼠及野生型小鼠的腦組織的Tau蛋白的表達(dá) 對(duì)于Tau蛋白病模型小鼠和野生型小鼠的腦組織中的Tau蛋白的表達(dá)水平的比較在病理組織學(xué)上進(jìn)行了探討。
雖然沒有觀察到Tau的聚集圖像或包含體，但是，與野生型小鼠相比，在Tau蛋白病小鼠的腦組織中顯著地確認(rèn)有磷酸化Tau蛋白(圖24)?？梢哉J(rèn)為，較多地看到磷酸化Tau的帯狀回皮質(zhì)、大腦皮質(zhì)扁桃核、海馬等與不安障礙有關(guān)，海馬與記憶障礙有夫，因此暗示這些組織中磷酸化Tau的積累可能導(dǎo)致呈現(xiàn)行為異常。(18)對(duì)Tau蛋白病模型小鼠及野生型小鼠的身體測(cè)定對(duì)13周齡的Tau蛋白病模型小鼠及野生型小鼠進(jìn)行了一般的身體測(cè)定。(A)表示體重，⑶表示直腸溫度，(C)表示握力，⑶表示鋼絲繩懸掛實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。在Tau蛋白病模型小鼠和野生型小鼠之間沒有確認(rèn)有優(yōu)勢(shì)的差異(圖25)。(19)對(duì)Tau蛋白病模型小鼠及野生型小鼠的社會(huì)行為測(cè)定實(shí)驗(yàn)(新奇場(chǎng)面)對(duì)Tau蛋白病小鼠或野生型小鼠進(jìn)行了社會(huì)行為測(cè)定實(shí)驗(yàn)。社會(huì)行為測(cè)定實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，是在Tau蛋白病模型小鼠和野生型小鼠之間沒有確認(rèn)有優(yōu)勢(shì)的差異(圖26)。(20)對(duì)Tau蛋白病模型小鼠及野生型小鼠的恐怖條件反射試驗(yàn)對(duì)野生型小鼠及Tau蛋白病模型小鼠進(jìn)行了恐怖條件反射試驗(yàn)。在Tau蛋白病模型小鼠中，凍結(jié)的出現(xiàn)率與野生型小鼠相比顯示低的值，但總體上沒有大的優(yōu)勢(shì)差異(圖27)。(21)對(duì)Tau蛋白病模型小鼠及野生型小鼠的巴恩斯迷宮試驗(yàn)對(duì)野生型小鼠及Tau蛋白病模型小鼠進(jìn)行了巴恩斯迷宮試驗(yàn)。圖28的(A) (C)表示訓(xùn)練期間的結(jié)果。圖28的(D)表示訓(xùn)練后經(jīng)過24小時(shí)后的探測(cè)實(shí)驗(yàn)。訓(xùn)練期間，在Tau蛋白病模型小鼠和野生型小鼠之間沒有確認(rèn)有優(yōu)勢(shì)的差異(圖28A-C)。在探測(cè)實(shí)驗(yàn)中，在Tau蛋白病模型小鼠和野生型小鼠之間，Tau蛋白病模型小鼠在靶點(diǎn)的鄰近孔周圍及靶點(diǎn)的孔周圍的停留時(shí)間短(圖28D)。(22)對(duì)Tau蛋白病模型小鼠及野生型小鼠的腦組織的Tau蛋白的表達(dá)對(duì)于Tau蛋白病模型小鼠和野生型小鼠的腦組織中的Tau蛋白的表達(dá)水平的比較在病理組織學(xué)上進(jìn)行了探討。雖然沒有確認(rèn)有Tau蛋白的聚集圖像或包含體，但是，與野生型小鼠相比，在Tau蛋白病小鼠的腦組織中顯著地確認(rèn)有磷酸化Tau蛋白(圖24)。可以認(rèn)為，較多地看到酸化Tau的帯狀回皮質(zhì)、大腦皮質(zhì)扁桃核、海馬等與不安障礙有關(guān)，海馬與記憶障礙有夫，因此暗示這些組織中磷酸化Tau蛋白的積累可能導(dǎo)致呈現(xiàn)行為異常。エ業(yè)上的可應(yīng)用性本發(fā)明的疫苗在Tau蛋白異常地積累于中樞神經(jīng)系而引起的疾病(Tau蛋白病)的癥狀中，尤其是對(duì)Tau蛋白病型癡呆癥的改善是有效的，因此，醫(yī)療上是有用的。序列表自由文本
序列號(hào)4 11引物序列號(hào)12、13合成DNA 將本說明書中引用的全部的出版物、專利及專利申請(qǐng)通過引用并入本說明書中。
權(quán)利要求
1.一種Tau蛋白病的預(yù)防或治療用疫苗，該疫苗包含含有編碼連接于分泌信號(hào)序列的突變體Tau蛋白的核酸的載體作為有效成分，其中，所述突變體Tau蛋白包含在Tau蛋白的氨基酸序列中對(duì)應(yīng)于選自由序列號(hào)I的257位、260位、266位、272位、279位、280位、284位、296 位、301 位、303 位、305 位、315 位、317 位、320 位、335 位、336 位、337 位、342 位、352位、369位、389位及406位構(gòu)成的組中的至少I個(gè)位置的位置的氨基酸殘基的突變，并且與突變體Tau蛋白的直接施用相比，該載體在受試者中可以更持續(xù)地誘導(dǎo)對(duì)Tau蛋白的抗體。
2.如權(quán)利要求I所述的疫苗，其中，所述突變?yōu)檫x自由K257T、I260V、L266V、G272V、N279K、K280 Δ、L284L、N296 Δ、N296H、P301L、P301S、G303V、S305N、L315R、K317M、S320F、G335S、G335V、Q336R、V337M、E342V、S352L、K369I、G389R 及 R406W 構(gòu)成的組中的至少 I 種突變，其中△為缺失。
3.如權(quán)利要求I或2所述的疫苗，其中，所述突變至少包含P301L、P301S或P301T的突變。
4.如權(quán)利要求I 3中任一項(xiàng)所述的疫苗，其中，所述分泌信號(hào)序列為淀粉樣前體蛋白信號(hào)序列或CD59信號(hào)序列。
5.如權(quán)利要求I 4中任一項(xiàng)所述的疫苗，其中，所述載體為仙臺(tái)病毒載體。
6.如權(quán)利要求I 4中任一項(xiàng)所述的疫苗，其中，所述載體為質(zhì)粒載體。
7.如權(quán)利要求I 6中任一項(xiàng)所述的疫苗,該疫苗被配制為用于鼻內(nèi)施用。
8.如權(quán)利要求I 7中任一項(xiàng)所述的疫苗，該疫苗具有改善Tau蛋白病型癡呆癥的作用。
9.如權(quán)利要求I 8中任一項(xiàng)所述的疫苗，該疫苗在受試者中具有改善社會(huì)行為異常、焦慮行為異常及記憶障礙的至少I種癥狀的作用。
10.如權(quán)利要求I 9中任一項(xiàng)所述的疫苗，其中，該疫苗具有將受試者腦內(nèi)的小神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞活化、由此抑制突變體Tau蛋白的積累的作用。
11.如權(quán)利要求I 10中任一項(xiàng)所述的疫苗，其中，Tau蛋白是磷酸化的。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種Tau蛋白病的預(yù)防或治療用疫苗，該疫苗包含含有編碼連接于分泌信號(hào)序列的突變體Tau蛋白的核酸的載體作為有效成分，其中，與突變體Tau蛋白的直接施用相比，該疫苗在受試者中可以更持續(xù)地誘導(dǎo)對(duì)Tau蛋白(任選地磷酸化的)的抗體。
文檔編號(hào)A61P25/14GK102711812SQ201180005511
公開日2012年10月3日 申請(qǐng)日期2011年1月11日 優(yōu)先權(quán)日2010年1月8日
發(fā)明者井上治久, 季斌, 樋口真人, 竹內(nèi)啟喜, 須原哲也, 高橋良輔 申請(qǐng)人:國(guó)立大學(xué)法人京都大學(xué), 獨(dú)立行政法人放射線醫(yī)學(xué)綜合研究所