專利名稱：：用于治療和預(yù)防青光眼的疫苗滴眼液及制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種疫苗，特別涉及一種用于治療和預(yù)防青光眼的疫苗滴眼液及制備方法。
背景技術(shù)：
：青光眼是世界上第二大致盲性疾病，可引起不可逆的視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞(RetinalganglioncellsRGCs)凋亡和視神經(jīng)萎縮，最終導(dǎo)致失明。視神經(jīng)損傷也是臨床常見的外傷類型和致盲原因，其它眼部多種疾病如視神經(jīng)炎，缺血性視神經(jīng)病變、視網(wǎng)膜血管阻塞、視網(wǎng)膜變性性疾病均可累及視神經(jīng)導(dǎo)致視神經(jīng)萎縮最終失明。目前青光眼的主要治療手段是用藥物或手術(shù)降低眼壓；然而，即使去除高眼壓等誘因，視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的丟失和視神經(jīng)萎縮仍然繼續(xù)，常規(guī)的降眼壓治療無法阻止或預(yù)防這種繼發(fā)性的損害。研究發(fā)現(xiàn)，高眼壓和視神經(jīng)損傷后神經(jīng)元缺乏軸突遠(yuǎn)端及神經(jīng)元局部營養(yǎng)因子的支持導(dǎo)致視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的進(jìn)行性丟失及其神經(jīng)纖維的變性。大量的研究證實給予外源性的神經(jīng)營養(yǎng)因子如腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(brain-derivedneurotrophicfactor,BDNF)，膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(glialcelline-derivedneurotrophicfactor,GDNF)睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子(ciliaryneurotrophicfactor,CNTF)可有效的促進(jìn)損傷后視網(wǎng)膜節(jié)細(xì)胞的存活和軸突生長，但時間較短。通過眼內(nèi)注射的方法易引起眼部感染，對青光眼及其它視網(wǎng)膜變性性疾病不是終生用藥的途徑。Bakalash(2003)應(yīng)用感光細(xì)胞間維生素A類結(jié)合蛋白(interphotorec印torretinoid-bindingprotein,IRBP)對高眼壓大鼠進(jìn)行眼內(nèi)接種后發(fā)現(xiàn)，視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的高眼壓性損傷得到遏制。故Bakalash認(rèn)為，對于神經(jīng)變性損傷而言，損傷部位內(nèi)源性抗原激活特異性T淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的神經(jīng)免疫保護(hù)是有效的治療策略。研究發(fā)現(xiàn)，視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞受損后存活或再生困難的一個主要原因是由于髓磷脂蛋白的存在，抑制因子Nogo是其中重要成員之一，Nogo在正常中樞神經(jīng)系統(tǒng)(centralnervoussystem,CNS)、視神經(jīng)及視網(wǎng)膜少量表達(dá)。中樞神經(jīng)受損后Nogo因子釋放增加、表達(dá)增強，不僅抑制神經(jīng)纖維再生，而且可啟動神經(jīng)元凋亡過程，導(dǎo)致神經(jīng)元死亡。Schwab等制備出Nogo的單克隆抗體IN-1，并進(jìn)行大量在體試驗，證實IN-1可促進(jìn)脊髓和腦損傷后軸突長距離的再生長。Liebscher等切斷2_6周齡大鼠皮質(zhì)脊髓束后將IN_1單抗雜交瘤細(xì)胞移入腦內(nèi)，在損傷處見到神經(jīng)軸突明顯的側(cè)向發(fā)芽生長。Hauben等用髓磷脂抗原或被動轉(zhuǎn)移髓磷脂活化T細(xì)胞均可減少外傷性脊髓和視神經(jīng)損傷引起的神經(jīng)退化，并提高功能恢復(fù)。眾多研究表明，主動免疫或被動免疫阻遏Nogo或髓磷脂均能夠促進(jìn)CNS再生。視神經(jīng)是CNS的一部分，相同的手段是否也能促進(jìn)視神經(jīng)損傷后的再生呢？Nogo有66個氨基酸殘基在胞膜外形成拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)，即Nogo66，是Nogo的活性區(qū)域，介導(dǎo)了Nogo的神經(jīng)抑制活性。我們在前期利用基因重組技術(shù)原核表達(dá)和純化了Nogo66蛋白，并制備成Nogo66福氏佐劑疫苗，接種于慢性高眼壓大鼠四肢軀干皮下，可誘導(dǎo)大鼠機體產(chǎn)生特異性IgG抗體和T淋巴細(xì)胞增殖，并證實對慢性高眼壓大鼠RGCs的數(shù)量和功能有一定保護(hù)作用。青光眼是一種需要終身治療的疾病，而Nogo66蛋白疫苗通過傳統(tǒng)途徑接種后產(chǎn)生的免疫效應(yīng)持續(xù)時間較短，需要不斷加強免疫才能維持一定的抗體滴度和活化T細(xì)胞數(shù)量，患者必須經(jīng)常到醫(yī)院就診接受皮下注射接種疫苗，對于行動不便或邊遠(yuǎn)地區(qū)的患者，以及不太理解注射疫苗意義的患者，很難做到按時到醫(yī)院就診，難以維持有效的免疫效應(yīng)，不能達(dá)到應(yīng)有的治療效果。另外，Nogo66是一個分子量為7.53461kD的小分子蛋白，小劑量皮下接種很難完全激活機體免疫系統(tǒng)，在眼球視網(wǎng)膜這樣的免疫特赦器官獲得較好的免疫效應(yīng)。如果增加劑量，則有致實驗性自身免疫性腦脊髓炎(e鄧erimentalautoimmuneenc印halomyelitis，EAE)的風(fēng)險。因此，通過眼局部結(jié)膜淋巴途徑或角膜途徑直接接種，可減少疫苗中蛋白的使用劑量，提高局部免疫能力，并且患者可以將疫苗拿回家，按照醫(yī)囑自行點眼接種，使用方便等優(yōu)點。不僅可治療青光眼，主動保護(hù)受損的RGCs，減少其凋亡，增加其數(shù)量，對青光眼的進(jìn)一步發(fā)展也起到預(yù)防的作用。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種用于治療和預(yù)防青光眼視網(wǎng)膜視神經(jīng)損傷的疫苗滴眼液及制備方法，本發(fā)明所述疫苗滴眼液用于青光眼所致的視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞凋亡或外傷引起的視神經(jīng)損傷，能有效地提高視網(wǎng)膜視神經(jīng)自身免疫保護(hù)能力改善受損神經(jīng)元的微環(huán)境，促使神經(jīng)元的修復(fù)與再生，使用安全，并且具有價格低廉，接種方便的優(yōu)點。本發(fā)明的技術(shù)方案是用于青光眼的疫苗滴眼液，包括Nogo66蛋白和殼聚糖，其中Nogo66蛋白與殼聚糖的體積比為1:1，Nogo66蛋白的濃度為0.1-1.5mg/ml，殼聚糖的濃度為H5mg/ml。較好的技術(shù)方案是所述滴眼液中Nogo66蛋白與殼聚糖的體積比為1:1，Nogo66蛋白的濃度為1-1.5mg/ml，殼聚糖的濃度為10-15mg/ml。最好的技術(shù)方案是所述滴眼液中Nogo66蛋白與殼聚糖的體積比為1:1，Nogo66蛋白的濃度為lmg/ml，殼聚糖的濃度為10mg/ml。所述疫苗中殼聚糖包裹Nogo66蛋白。制備用于青光眼的疫苗滴眼液的方法，其特征在于有以下步驟1)取Nogo66蛋白溶液加入雙蒸水配成0.1-1.5mg/mlNogo66蛋白；2)取殼聚糖，加入雙蒸水，滴加醋酸，使其膠溶，配制l-15mg/ml殼聚糖溶液；3)步驟1)、2)所得溶液分別過濾3-5次，除菌；4)將步驟3)所得的兩溶液等體積混合，充分?jǐn)噭颍?)將步驟4)所得溶液中滴加1.0mol/L氫氧化鈉，調(diào)整其ra值為6.0-8.0，即用于青光眼的疫苗滴眼液。步驟3)中所述的過濾，采用0.22iim無菌微孔濾器過濾。我們在前期實驗中純化表達(dá)了Nogo66蛋白，檢驗其N末端氨基酸序列證實為目的蛋白，并檢測了蛋白濃度、純度，均達(dá)到了制備疫苗的標(biāo)準(zhǔn)。并應(yīng)用ProPredwebinterface程序，ProPredMHCClass-IIBindingP印tidePredictionServer抗原表位分析軟件進(jìn)行Nogo-66抗原表位分析，證明Nogo-66有明確的T淋巴細(xì)胞抗原表位，能夠被抗原提呈細(xì)胞識別，引起Nogo-66抗原特異性T淋巴細(xì)胞活化。證明了重組Nogo-66蛋白具有免疫原性，能夠提高中樞神經(jīng)系統(tǒng)和視網(wǎng)膜T淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的免疫保護(hù)反應(yīng)，達(dá)到對受損的RGC或神經(jīng)元的保護(hù)作用。在此基礎(chǔ)上，我們制備了Nogo66蛋白-殼聚糖疫苗滴眼液(Nogo66-CS疫苗滴眼液)并考察其ra值、滲透壓等一般性質(zhì)，在確定其符合眼用制劑藥物的標(biāo)準(zhǔn)后，于正常實驗動物進(jìn)行了眼剌激性試驗和毒性試驗，證明其安全性。給予實驗動物Nogo66-CS疫苗滴眼液試驗性點眼，發(fā)現(xiàn)其可激活實驗動物粘膜免疫系統(tǒng)和視網(wǎng)膜小膠質(zhì)細(xì)胞活化；并行Nogo66-CS疫苗滴眼液體外剌激培養(yǎng)小膠質(zhì)細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)亦可使其活化，證實Nogo66-CS疫苗滴眼液具有免疫原性。在慢性高眼壓模型大鼠及視神經(jīng)鉗夾傷模型大鼠點用Nogo66-CS疫苗滴眼液后，血清及淚液中可檢測出特異性IgG抗體，視網(wǎng)膜表達(dá)大量神經(jīng)營養(yǎng)因子GDNF、BDNF和神經(jīng)再生標(biāo)志蛋白GAP-43，視網(wǎng)膜RGCs數(shù)量較未點用疫苗的模型對照組有所增加，證實Nogo66-CS疫苗滴眼液可促使神經(jīng)元的修復(fù)與再生，并有效的改善受損神經(jīng)元的微環(huán)境，在治療高眼壓或視神經(jīng)損傷的同時，對繼發(fā)性神經(jīng)損傷起到了預(yù)防的作用。眼結(jié)膜血管分布密集，血液供應(yīng)非常豐富，存在淺層和深層兩個網(wǎng)狀淋巴系統(tǒng)，在眼瞼結(jié)膜皺褶中，存在大量免疫細(xì)胞、免疫分子，彌散在粘膜上皮內(nèi)或粘膜下固有層，即淋巴組織。Nogo66-CS疫苗滴眼液通過點眼途徑接種能夠產(chǎn)生免疫效應(yīng)，對受損的神經(jīng)細(xì)胞具有保護(hù)作用，其原因如下1、Nogo66-CS疫苗滴眼液接種大鼠結(jié)膜后可剌激產(chǎn)生免疫反應(yīng)。接種方法于0、21、35天各接種1次，每次1滴(0.05ml)。發(fā)現(xiàn)大鼠結(jié)膜有淋巴細(xì)胞浸潤，淚液中產(chǎn)生了抗原特異性IgG抗體，表明疫苗激活了結(jié)膜淋巴系統(tǒng)，產(chǎn)生了結(jié)膜相關(guān)的免疫反應(yīng)；視網(wǎng)膜小膠質(zhì)細(xì)胞CDllb和MHC-II表達(dá)，表明疫苗在佐劑殼聚糖的輔助下可能穿透角膜到達(dá)眼內(nèi)，被視網(wǎng)膜小膠質(zhì)細(xì)胞識別，使小膠質(zhì)細(xì)胞活化并行使抗原遞呈細(xì)胞的功能，產(chǎn)生了視網(wǎng)膜相關(guān)的免疫反應(yīng)；視網(wǎng)膜未見iN0S、TNF-a表達(dá)。證明無小膠質(zhì)細(xì)胞激活的副反應(yīng)。另外血液中產(chǎn)生低度的抗原特異性IgG抗體，表明疫苗亦可一定程度激活全身免疫系統(tǒng)但反應(yīng)輕微，可避免全身免疫的并發(fā)癥；血液中產(chǎn)生了抗原特異性IgG抗體，表明疫苗亦可一定程度激活全身免疫系統(tǒng)。這種接種方法的優(yōu)點通過點眼接種，簡單便捷；接種間隔時間2-3周，頻率低；每次1滴，給藥量少；可主要通過結(jié)膜淋巴細(xì)胞和視網(wǎng)膜小膠質(zhì)細(xì)胞兩個途徑激活大鼠機體免疫系統(tǒng)，產(chǎn)生免疫效應(yīng)。2、Nogo66-CS疫苗滴眼液對青光眼和視神經(jīng)損傷有神經(jīng)保護(hù)作用。慢性高眼壓模型是我們前期為研究青光眼而制備的大鼠模型，經(jīng)檢驗制備方法簡單有效，可很好的模擬青光眼疾病過程和視神經(jīng)損傷特點。在慢性高眼壓大鼠和視神經(jīng)鉗夾傷大鼠接種疫苗后，發(fā)現(xiàn)視網(wǎng)膜RGCs數(shù)量均增多，說明疫苗可延長青光眼和視神經(jīng)外傷時受損神經(jīng)元的存活；視網(wǎng)膜有GAP43大量表達(dá)，GAP43即生長相關(guān)蛋白_43，是細(xì)胞再生的標(biāo)志性蛋白，其大量表達(dá)，表明接種疫苗后視網(wǎng)膜RGCs再生活躍。Nogo66-CS疫苗滴眼液不僅可增加受損神經(jīng)元的存活，還可促進(jìn)神經(jīng)元的再生，有明確的神經(jīng)保護(hù)作用。成熟個體神經(jīng)元已喪失了有絲分裂的能力，一旦死亡則不可再生，所以RGCs存活數(shù)量的提高意義重大，它可以大大增加軸突的數(shù)量，軸突數(shù)量的增加使得軸漿運輸?shù)哪芰υ鰪姡瑥亩s短軸突再生時間，并使更多的神經(jīng)纖維修復(fù)，最大限度地恢復(fù)視功3、Nogo66-CS疫苗滴眼液可增加視網(wǎng)膜神經(jīng)營養(yǎng)因子表達(dá)。慢性高眼壓大鼠和視神經(jīng)鉗夾傷大鼠接種疫苗后視網(wǎng)膜大量表達(dá)腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(brain-derivedneurotrophicfactor,BDNF)禾口膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(glialcelline-derivedneurotrophicfactor,GDNF)，二者是神經(jīng)營養(yǎng)因子(腦rotrophicfactors，NTF)的重要成員。神經(jīng)營養(yǎng)因子是指機體產(chǎn)生的能夠促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞存活、生長、分化的一類蛋白質(zhì)因子。具有支持運動神經(jīng)元存活，阻止成年神經(jīng)元損傷后神經(jīng)元的死亡、減少神經(jīng)變性，促進(jìn)感覺和運動神經(jīng)元軸突生長、調(diào)節(jié)突觸可塑性、促進(jìn)再生等多種功能。但BDNF，GDNF等神經(jīng)生長因子均為蛋白質(zhì)，在正常情況下不能通過血腦屏障及脊髓屏障，限制了其在臨床的實際應(yīng)用。有很多研究通過移植可分泌神經(jīng)營養(yǎng)因子的成纖維細(xì)胞、腺病毒轉(zhuǎn)染神經(jīng)營養(yǎng)因子RNA后移植入腦內(nèi)或直接顱內(nèi)注射神經(jīng)營養(yǎng)因子的方法增加CNS受損部位神經(jīng)營養(yǎng)因子，來促進(jìn)受損神經(jīng)元再生，結(jié)果證實外源性BDNF、GDNF等神經(jīng)營養(yǎng)因子的確可以促進(jìn)神經(jīng)元存活、再生和功能恢復(fù)，然而這些方法均很復(fù)雜，且需要多次治療，距臨床使用有一定距離。利用Nogo66疫苗滴眼液，簡單有效的間接誘導(dǎo)增加內(nèi)源性神經(jīng)營養(yǎng)因子分泌，很好的克服了血視網(wǎng)膜屏障的阻礙。本疫苗接種后可增加視網(wǎng)膜CD3陽性細(xì)胞，CD3是T細(xì)胞的標(biāo)志物，表明視網(wǎng)膜有T細(xì)胞浸潤。視網(wǎng)膜存在血視網(wǎng)膜屏障，一般情況下血液中的大分子物質(zhì)無法穿過，而活化的T細(xì)胞可以進(jìn)入視網(wǎng)膜?；罨腡細(xì)胞可分泌多種神經(jīng)營養(yǎng)因子?；罨男∧z質(zhì)細(xì)胞亦可分泌多種神經(jīng)營養(yǎng)因子，我們的實驗證實Nogo66-CS疫苗滴眼液可激活大鼠視網(wǎng)膜小膠質(zhì)細(xì)胞。因此，Nogo66-CS疫苗滴眼液促使活化的T細(xì)胞浸潤視網(wǎng)膜和視網(wǎng)膜小膠質(zhì)細(xì)胞活化，二者分泌了多種神經(jīng)營養(yǎng)因子，對視網(wǎng)膜受損的神經(jīng)元起到了保護(hù)作用。通過追加點眼即可加強免疫保護(hù)作用，維持T細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞的活化，不斷維持視網(wǎng)膜神經(jīng)營養(yǎng)因子的表達(dá)，促進(jìn)神經(jīng)元再生和視功能恢復(fù)。視神經(jīng)損傷后在受損部位有少量的內(nèi)源性T細(xì)胞聚集，這種自身免疫性T細(xì)胞可拯救瀕危神經(jīng)元，減輕損傷引起的繼發(fā)性損害；移植髓磷脂反應(yīng)性T細(xì)胞可減輕視神經(jīng)繼發(fā)性退行性變，提高視神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的存活率和視神經(jīng)的傳導(dǎo)程度。在中樞神經(jīng)系統(tǒng)受損部位聚集的自身反應(yīng)性T細(xì)胞，可能通過誘導(dǎo)受損神經(jīng)元處于靜止?fàn)顟B(tài)來發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用，這種靜止?fàn)顟B(tài)的誘導(dǎo)，減少了能量和葡萄糖的需求，可以增加神經(jīng)元存活。采用Nogo66-CS疫苗滴眼液接種后浸入視網(wǎng)膜的活性T細(xì)胞，其本身可能對視網(wǎng)膜受損的神經(jīng)元起到了保護(hù)作用。4、Nogc)66-CS疫苗滴眼液安全無剌激。通過眼剌激性實驗證實了高頻率(1次/10minX6次+l次/周X8次)點眼接種后，Nogo66-CS疫苗滴眼液對大鼠眼部無剌激，不會導(dǎo)致眼部不適和損害，不會使眼分泌物增加；對大鼠視網(wǎng)膜和各主要器官無病理損害。本發(fā)明所述疫苗滴眼液，有如下優(yōu)點1.疫苗抗原成分是機體自身髓磷脂蛋白Nogo的66個氨基酸成份，Nogo66-CS疫苗滴眼液能夠直接剌激眼結(jié)膜相關(guān)的淋巴細(xì)胞對其識別、呈遞，并產(chǎn)生免疫效應(yīng)；2.所述疫苗滴眼液可剌激視網(wǎng)膜小膠質(zhì)細(xì)胞等抗原遞呈細(xì)胞，產(chǎn)生自身保護(hù)性免疫效應(yīng)；對高眼壓和視神經(jīng)鉗夾傷所致的視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞有促進(jìn)存活和再生的效果。3.通過點眼途徑接種，無痛、無創(chuàng)、便利，易于被患者接受；無全身和眼局部的副作用。64.所述疫苗滴眼液成本較低，易于推廣。綜上，本發(fā)明所述疫苗滴眼液，通過眼局部結(jié)膜淋巴途徑或角膜途徑直接接種，可減少疫苗中蛋白的使用劑量，提高局部免疫能力，并且患者可以按照醫(yī)囑自行點眼接種，使用方便的優(yōu)點。不僅可治療青光眼，主動保護(hù)受損的RGCs，減少其凋亡，增加其數(shù)量，對青光眼的進(jìn)一步發(fā)展也起到預(yù)防的作用。圖1為Nogo66-CS剌激體外培養(yǎng)小膠質(zhì)細(xì)胞CDllb表達(dá)；圖2為Nogo66-CS疫苗滴眼液接種后大鼠結(jié)膜抗原特異性IgG型漿細(xì)胞增殖(A、B、C、D分別表示不同濃度組)；圖3為Nogo66-CS疫苗滴眼液接種后大鼠結(jié)膜淋巴細(xì)胞浸潤(A、B、C、D分別表示不同濃度組)；圖4為Nogo66-CS疫苗滴眼液接種后視網(wǎng)膜小膠質(zhì)細(xì)胞CDllb表達(dá)；圖5為Nogo66-CS疫苗滴眼液接種模型大鼠后RGCs逆行染色；圖6為Nogo66-CS疫苗滴眼液接種后慢性高眼壓和視神經(jīng)鉗夾傷模型大鼠視網(wǎng)膜GAP-43表達(dá)；圖7為Nogo66-CS疫苗滴眼液接種后慢性高眼壓和視神經(jīng)鉗夾傷模型大鼠視網(wǎng)膜GDNF、BDNF表達(dá)；圖8為Nogo66-CS疫苗滴眼液接種后視網(wǎng)膜病理切片圖9為Nogo66-CS疫苗滴眼液接種后各主要器官病理切片(A肺、B肝、C睪丸、D腎、E腦、F心)圖10為Nogo66-CS疫苗滴眼液接種后視網(wǎng)膜小膠質(zhì)細(xì)胞TNF-a、iN0S表達(dá)。具體實施例方式主要儀器設(shè)備及試劑1.Zeiss光學(xué)手術(shù)顯微鏡Zeiss，德國2.532-二極管激光Alcon公司，美國3.光學(xué)生物顯微鏡0L預(yù)PUSCH20，日本4.電子微量天平DT100常熟市衡器廠，中國5.恒溫水浴箱北京長鳳儀器儀表公司，中國6.超凈工作臺SPEG，杭州，中國7.磁力攪拌器79-1型，江蘇江陰科研器械廠，中國8.721型分光光度計上海光學(xué)儀器廠，中國9.標(biāo)準(zhǔn)型pH測試筆pHScanlTPI，美國10.冷藏、冷凍兩用冰箱Haier，中國11.微量移液器Beckman，美國12.ND-1型勃氏粘度測試儀天津市國銘醫(yī)藥設(shè)備有限公司，中國13.FM-8P-FM-8P冰點滲透壓儀上海隆拓儀器設(shè)備有限公司，中國14.DU-640分光光度計美國貝克曼庫爾特有限公司15.0.22iim無菌微孔濾器16.Tono-PenXL眼壓計17.倒置熒光顯微鏡18.電子微量天平19.恒溫水浴箱20.全光譜激光共聚焦顯微鏡21.臺式水平離心機22.低溫高速離心機23.恒冷冰凍切片機24.眼科顯微手術(shù)器械25.電泳儀26.凝膠成像系統(tǒng)27.水平脫色搖床(py-120)28.超聲儀29.轉(zhuǎn)膜槽30.PVDF膜31.電轉(zhuǎn)儀32.潔瑞無菌注射器(帶針)33.晶牌載玻片34.0.4%倍諾喜眼液35.微量移液器36.殼聚糖粉劑37.Nogo66蛋白38.氫氧化鈉39.醋酸40.雙蒸水41.牛血清白蛋白42.二喹啉甲酸43.0.Olmol/LPBS44.戊巴比妥鈉45.0.OIM枸櫞酸鹽PH6.046.Rabbitanti-ratGAP4347.Rabbitanti-ratCD348.Sheepanti_ratBDNF49.Rabbitanti-ratGDNF50.FITCGoatAntiRabbitIgG51.FITCRabbitAntiGoatIgG52.CY3GoatAntiRabbitIgG美國密理博MILLIP0RE公司MedtronicSALON公司，美國ECLIPSETE2000-U型，日本DT100常熟市衡器廠，中國北京長鳳儀器儀表公司，中國Nikon，日本BECKMANCS-15R，美國J2-21M，美國LeicaCM1900，德國蘇州醫(yī)療設(shè)備儀器廠，中國天能公司，中國Bio-Rad鼎國科研器械公司，中國基因公司Bio-RadMILLIPORE天能公司，中國山東威高醫(yī)用高分子制品股份有限公司江蘇世泰實驗器材有限公司，中國日本參天株氏會社，日本Beckman，美國浙江金殼生物化學(xué)有限公司，中國(生產(chǎn)批號YK090408113)本實驗室表達(dá)純化重慶北碚化學(xué)試劑有限公司，中國重慶北碚化學(xué)試劑有限公司，中國本實驗室制備上海伯奧生物科技有限公司，中國上海伯奧生物科技有限公司，中國北京中杉生物技術(shù)有限公司，中國SIGMA，美國北京中杉生物技術(shù)有限公司ABCAM，美國ABCAM，美國ABCAM，美國SANTACRUZBiotechnology,美國SANTACRUZBiotechnology,美國SANTACRUZBiotechnology,美國SANTACRUZBiotechnology,美國0101]53.DAPI(C-1005)上海碧云天生物技術(shù)有限公司，中國0102]54.抗熒光淬滅封片劑上海碧云天生物技術(shù)有限公司，中國0103]55.甘油乙烯醇水溶性封片劑北京中杉生物技術(shù)有限公司，中國0104]56.考馬斯亮藍(lán)北京天根公司，中國0105]57.熒光金(FG)SIGMA，美國0106]58.4%多聚甲醛(PFA)天津大茂化學(xué)試劑有限公司，中國0107]59.1%多聚賴氨酸武漢博士德生物工程有限公司，中國0108]60.0.01mol/LPBS北京中杉生物技術(shù)有限公司，中國0109]61.RPMI1640培養(yǎng)基上海生物工程有限公司，中國0110]62.胎牛血清上海生物工程有限公司，中國0111]63.0.25%胰酶溶液上海生物工程有限公司，中國0112]64.山羊抗大鼠CDllb抗體SANTACRUZBiotechnology,美國0113]65.蘇木精重慶北碚化學(xué)試劑有限公司，中國0114]66.二甲苯重慶北碚化學(xué)試劑有限公司，中國0115]67.鉀明砜重慶北碚化學(xué)試劑有限公司，中國0116]68.95%、100%乙醇重慶北碚化學(xué)試劑有限公司，中國0117]69.30%(V/V)過氧化氫重慶北碚化學(xué)試劑有限公司，中國0118]70.30%HCL重慶北碚化學(xué)試劑有限公司，中國0119]實施例1Nogo66-CS疫苗滴眼液的制備0120]無菌條件下，取1.5mg/mlNogo66蛋白溶液(謝琳，賀翔鴿，蘇踴躍等，"Nogo-合蛋白的原核表達(dá)及鑒定"《免疫學(xué)雜志》，2005，21(3):251)0.lml、0.5ml、1.Oml、1.5ml，分另U力B入雙蒸水1.4ml、lml、0.5ml、0ml，配成0.lmg/m1、0.5mg/ml、1.0mg/ml、1.5mg/mlNogo66蛋白溶液。另取殼聚糖10mg、50mg、100mg、150mg，分別加入10ml雙蒸水，滴加適量醋酸，使其完全溶解，配制lmg/ml、5mg/ml、10mg/ml、15mg/ml殼聚糖溶液。將上述Nogo66蛋白溶液和殼聚糖溶液分別用0.22iim無菌微孔濾器過濾3-5次，除菌。將除菌后的上述O.lmg/mlNogo66蛋白溶液和lmg/ml殼聚糖溶液等體積混合，充分?jǐn)噭颍?.0mol/L氫氧化鈉液調(diào)節(jié)ra值至6.0-8.0，即得本發(fā)明所述濃度為lmg/ml的用于治療和預(yù)防青光眼的疫苗滴眼液，命名為Nogo66-CS疫苗滴眼液，表示為A。將除菌后的上述O.5mg/mlNogo66蛋白溶液和5mg/ml殼聚糖溶液等體積混合，充分?jǐn)噭?，?.0mol/L氫氧化鈉液調(diào)節(jié)ra值至6.0-8.0，即得本發(fā)明所述濃度為5mg/ml的用于治療和預(yù)防青光眼的疫苗滴眼液，命名為Nogo66-CS疫苗滴眼液，表示為B。將除菌后的上述lmg/mlNogo66蛋白溶液和10mg/ml殼聚糖溶液等體積混合，充分?jǐn)噭?，?.0mol/L氫氧化鈉液調(diào)節(jié)ra值至6.0-8.0，即得本發(fā)明所述濃度為10mg/ml的用于治療和預(yù)防青光眼的疫苗滴眼液，命名為Nogo66-CS疫苗滴眼液，表示為C。將除菌后的上述1.5mg/mlNogo66蛋白溶液和15mg/ml殼聚糖溶液等體積混合，充分?jǐn)噭颍?.0mol/L氫氧化鈉液調(diào)節(jié)ra值至6.0-8.0，即得本發(fā)明所述濃度為15mg/ml的用于治療和預(yù)防青光眼的疫苗滴眼液，命名為Nogo66-CS疫苗滴眼液，表示為D。分裝后密封，4t:保存。殼聚糖具有良好的生物相容性和親水性，可包裹Nogo66蛋白。實施例2—般檢驗1、性狀為微黃色微粘澄明液體2、ra值用ra值檢測儀測得A、B、C、DNogo66-CS疫苗滴眼液樣品ffl值分別為7.014、7.127、7.046、7.068。3、滲透壓取4個濃度的Nogo66-CS疫苗滴眼液樣品各3份和3份0.9%NaCl溶液樣品，分別檢測滲透壓。結(jié)果A、B、C、DNogo66-CS疫苗滴眼液樣品平均滲透壓分別為285mosm/L、286mosm/L、291mosm/L、299mosm/L，0.9%NaCl溶液樣品平均滲透壓為301mosm/L。A、B、C、DNogo66-CS疫苗滴眼液滲透壓相當(dāng)于0.95-0.99倍0.9%NaCl溶液滲透壓，符合滴眼液制劑的要求。4、含量測定精密配制濃度分別為0.25、0.5、1、2、3、4、5mg/ml的牛血清白蛋白溶液，加入1.0mL二喹啉甲酸工作液混勻，6(TC恒溫水浴30min，冷卻至室溫后于紫外分光光度計562nm處測定吸光值，得回歸方程為Y=0.00468X+0.0038，r=0.9996。樣品含量測定精密移取A、B、C、DNogo66-CS溶液各5份，每份100iiL，加入二喹啉甲酸工作液1000iiL，充分混勻，37t:恒溫水浴30分鐘，冷卻至室溫，以標(biāo)準(zhǔn)曲線0號管做參比，在562nm波長下比色，記錄吸光值；根據(jù)所測樣品的吸光值，在標(biāo)準(zhǔn)曲線上即可查得相應(yīng)的蛋白含量(Pg)，除以樣品稀釋液總體積(100i!L)，即為樣品實際濃度(單位Pg/yL)，根據(jù)吸光值計算Nogo66蛋白含量平均值為49.624yg/mL。計算精密度RSD=1.22%，回收率=99.25%。實施例3Nogo66-CS疫苗眼液急性眼睛剌激性、腐蝕性試驗選擇雙眼肉眼檢查及角膜熒光素檢查正常的健康成年SD大鼠10只。3%戊巴比妥鈉以1.3ml/kg行大鼠腹腔注射麻醉，待麻醉完全后將動物頭左傾，右眼側(cè)向斜上方，輕輕提起雙瞼，將A、B、C、DNogo66-CS滴于右眼角膜0.05ml，1次/10min，持續(xù)lh共6次；同時左眼以相同的策略點生理鹽水，為對照眼。于點藥當(dāng)時和點藥后lh、24h、48h、72h和第4天、第7天觀察流淚及分泌物情況、結(jié)膜充血水腫、結(jié)膜濾泡乳頭、角膜水腫混濁、角膜點狀上皮損傷、虹膜損傷情況。并按照眼剌激反應(yīng)評分標(biāo)準(zhǔn)給予計分。表l眼剌激反應(yīng)評分標(biāo)準(zhǔn)眼刺激反應(yīng)分值角膜渾濁0-4虹膜0陽2結(jié)膜0-3水肺0-4分泌物0-3積分16認(rèn)為積分在0-3范圍表示無剌激性，積分在4-8范圍表示輕度剌激性，積分在9-12范圍表示中度剌激性，積分在13-16范圍表示重度剌激性。Nogo66-CS疫苗滴眼液和生理鹽水的眼剌激試驗評分如下表表2Nogo66-CS疫苗滴眼液眼剌激性試驗評分10<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>T檢驗表明5組眼刺激性反應(yīng)評分無顯著差異(P〉0.05)，按照眼剌激性反應(yīng)評分標(biāo)準(zhǔn)，可認(rèn)為Nogo66-CS疫苗滴眼液和生理鹽水對眼均無刺激性。整個試驗觀察期間各實驗大鼠對兩組實驗藥物適應(yīng)性好，未見流淚、畏光等眼部刺激癥狀，未見角膜熒光素染色陽性，無中毒癥狀，無死亡發(fā)生。實驗表明Nogo66-CS疫苗滴眼液是一種安全無刺激性的眼用制劑。實施例4Nogo66-CS疫苗眼液免疫原性研究—、Nogo66-CS對體外小膠質(zhì)細(xì)胞的免疫原性研究1、復(fù)蘇小膠質(zhì)細(xì)胞株-7(TC冰箱取出小膠質(zhì)細(xì)胞株(第三軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院病理科提供)，37t:水浴溶解完全，無菌下取出細(xì)胞，1000rpm離心5-10min棄上液，加入含10%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)液，移入培養(yǎng)瓶，在37t:5%C02培養(yǎng)箱孵育2-3天后，胰酶消化傳代，待細(xì)胞生長穩(wěn)定后，以105的密度接種于24孔培養(yǎng)板，37t:5%C02培養(yǎng)箱繼續(xù)孵育。2、爬片細(xì)胞貼壁后，將預(yù)先消毒好的小玻片放入培養(yǎng)孔，改用不含胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)12h。3、Nogo66-CS處理小膠質(zhì)細(xì)胞將小膠質(zhì)細(xì)胞接種在玻片上，24孔培養(yǎng)板分成6組，分別加入1.Omg/mlNogo66蛋白，A、B、C、DNogo66-CS或lmg/mlCS各0.5ul，一式4孔，生長24h。4、細(xì)胞免疫化學(xué)法檢測CDllb表達(dá)將6孔板從培養(yǎng)箱中取出，倒掉培養(yǎng)液。每孔加室溫lXPBS液2-3ml，輕輕晃動培養(yǎng)板以清洗孔壁，倒掉。反復(fù)3次。吸水紙吸掉孔內(nèi)多余液體。每孔加入2ml4%多聚甲醛固定2處。加入3XH202作用30min，0.3XTriton-100破膜處理30min，PBS洗板3次，每次5min;加入1:100被稀釋的CDllb單克隆抗體，4t:濕盒過夜，PBS漂洗3次后加辣根過氧化物酶(HR)-鏈霉親和素，室溫孵育1小時，PBS漂洗3次，加入DAB顯色劑，室溫作用2-3min，倒置顯微鏡下觀察，待細(xì)胞著色后PBS沖洗直至顯色；梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。激光共聚焦顯微鏡下觀察結(jié)果如圖l所示。圖1中顯示C、DNogo66-CS組小膠質(zhì)細(xì)胞呈現(xiàn)很強的綠色熒光，表明才、C、D濃度的Nogo66-CS剌激后小膠質(zhì)細(xì)胞大量表達(dá)CDllb;A、BNogo66-CS組、Nogo66組小膠質(zhì)細(xì)胞呈現(xiàn)較弱的綠色熒光，表明A、B濃度的Nogo66-CS和Nogo66可剌激小膠質(zhì)細(xì)胞表達(dá)一定量的CDllb;CS組呈現(xiàn)積弱的綠色熒光，表明CS可剌激小膠質(zhì)細(xì)胞表達(dá)極少量的CDllb。結(jié)果表明Nogo66-CS可明顯剌激小膠質(zhì)細(xì)胞活化，具有被小膠質(zhì)細(xì)胞識別的特性，即存在免疫原性，其中C、D濃度的Nogo66-CS可最佳程度的活化小膠質(zhì)細(xì)胞。Nogo66和CS亦可一定程度的剌激小膠質(zhì)細(xì)胞活化。二、Nogo66-CS疫苗滴眼液接種SD大鼠的免疫原性研究1、選擇健康成年SD大鼠，隨機分為實驗組和對照組。實驗組大鼠分別給予A、B、C、DNogo66-CS疫苗滴眼液眼液點眼。點眼策略右眼側(cè)向斜上方，輕輕提起雙瞼，將Nogo66-CS疫苗滴眼液滴于右眼結(jié)膜囊，第21天和第35天各加強點眼1次，共3次。對照組大鼠給予lmg/ml殼聚糖溶液點右眼，點眼策略同實驗組。2、第0、20、34、49天分別采尾靜脈血，收集淚液。靜脈血置5000rpm離心5min，分離收集血清。_201:保存。3、ELISA法檢測血清及淚液中抗Nogo66特異性IgG抗體滴度以包被稀釋液稀釋Nogo66蛋白濃度為5ii1/ml，在96孔板中每孔加入100y1以包被酶聯(lián)板，保鮮膜包裹后放入37t:孵箱2h。棄抗原，以洗滌液沖洗3-5遍，棄液，厚疊吸水紙吸干。加入封閉液50ii1/孔，37t:孵箱孵育l-2h。棄封閉液，以洗滌液沖洗3-5遍。取室溫溶解的血清標(biāo)本或淚液標(biāo)本于抗體稀釋液中稀釋為i:500，并依次進(jìn)行5倍比稀釋，設(shè)立空白對照，iooia/孔，37t:孵育ih。棄標(biāo)本液，洗滌后每孔各加入用抗體稀釋液i:5000稀釋酶標(biāo)二抗(山羊抗大鼠IgG辣根過氧化物酶)100ii1，37。C孵育40min。洗滌，加入底物液100y1/L37。C避光顯色10min，加入終止液50y1/孔。波長495nm處讀取吸光度(0D)值。血清和淚液特異性IgG抗體滴度檢測結(jié)果如下表12表3接種Nogo66-CS疫苗滴眼液后大鼠血清及淚液特異性IgG抗體滴度(0D值)時間(天)0203449A組血清0.5090.5930.6710.885淚液0.5250.7570.9461.573B組血清0.5220.6120.7030.947淚液0.5280.8641.3361,638C組血清0.5360.6510.8181.462淚液0.513l掘2.5473.093D組血清0.5150.6430.7761.034對照組淚液血清0.5100.5320.9850.5151.6480.5302.3600.556淚液0.5070.5460.6120.572結(jié)果顯示A、B、C、D組血清IgG抗體滴度在第34天以前未見明顯增高；第49天時血清IgG抗體滴度顯著增高，均高于O天時，其中C組增高幅度最大，與其他各組比較有顯著差異(P<0.05)。A、B、C、D組淚液IgG抗體均從第20天開始增高，第34天顯著增高，均高于0天時(P<0.05)，第49天時達(dá)最高值，其中C組增高幅度最大，與其他各組比較有顯著差異(P<0.05)。對照組血清和淚液中的IgG抗體滴度隨接種時間的增加未見明顯變化(P>0.05)。結(jié)果表明，不同濃度Nogo66-CS疫苗滴眼液均可誘導(dǎo)機體的粘膜免疫反應(yīng)和體液免疫反應(yīng)，其中C濃度組能夠最佳程度的誘導(dǎo)免疫效應(yīng)，D濃度組能夠較好的誘導(dǎo)免疫效應(yīng)。4、免疫組化法檢測結(jié)膜淋巴細(xì)胞浸潤及Nogo66特異性漿細(xì)胞增生于第49天結(jié)膜囊中滴加腎上腺素或去甲腎上腺素，取眼結(jié)膜組織，立即浸入10%中型緩沖福爾馬林固定48h，石蠟包埋切片，行HE染色，和Nogo66特異性IgG型漿細(xì)胞染色，觀察結(jié)膜淋巴細(xì)胞浸潤、IgG型漿細(xì)胞增殖，參見圖2、圖3。圖2顯示經(jīng)過Nogo66-CS疫苗滴眼液點眼接種后，大鼠結(jié)膜產(chǎn)生抗原特異性IgG型漿細(xì)胞，其中C、D濃度組IgG型陽性細(xì)胞較多。圖3顯示結(jié)膜組織有淋巴細(xì)胞浸潤，其中C濃度組大量淋巴細(xì)胞浸潤。表明Nogo66-CS疫苗滴眼液可被結(jié)膜相關(guān)淋巴組織識別，激活局部的眼結(jié)膜免疫組織，產(chǎn)生粘膜免疫反應(yīng)，其中C、D濃度，尤其是C濃度能誘導(dǎo)更多淋巴細(xì)胞活化。5、免疫組化法檢測視網(wǎng)膜小膠質(zhì)細(xì)胞CDllb表達(dá)3%戊巴比妥鈉以1.3ml/kg行大鼠腹腔麻醉。左心室-主動脈插管，結(jié)扎固定導(dǎo)管，剪開右心耳。將生理鹽水從導(dǎo)管處注入，使血液從右心排出，直至排除透明的生理鹽水為止。換4X多聚甲醛250ml灌注，致SD13大鼠肢體伸直僵硬。取左右眼球，浸入4%多聚甲醛固定48小時。將固定好的標(biāo)本蒸餾水稍洗，修成大約2cmX2cmX0.2cm的組織塊，脫水透明包埋70%乙醇4小時一80%乙醇4小時一95%乙醇2小時一95%乙醇2小時一無水乙醇1小時20分鐘一無水乙醇2小時20分鐘一二甲苯l:1無水乙醇10分鐘一二甲苯30分鐘一二甲苯30分鐘一60度熔點石蠟10分鐘一62度熔點石蠟15分鐘一62度熔點石蠟1小時一包埋，蠟塊自然冷卻后，修掉標(biāo)本周圍多余的蠟，貼上標(biāo)本對應(yīng)的標(biāo)簽于蠟塊正上方。蠟塊稍凍，3-5微米切片，62度烤箱烘烤1小時。脫蠟至水；二甲苯IO分鐘，二甲苯10分鐘，100%乙醇2分鐘，95%乙醇2分鐘，80%乙醇2分鐘，自來水洗1分鐘，蒸餾水洗1分鐘。將盛有0.OlM(p朋.0)檸檬鹽溶液加熱至沸騰(9810(TC)，切片放入進(jìn)行抗原修復(fù)，其中繼續(xù)加熱10min。置室溫下自然冷卻20min。PBS洗5minX3次，每片滴加50yl過氧化酶阻斷劑，以阻斷內(nèi)源性過氧化物酶活性，室溫孵育10min。5XBSA封閉15分鐘，傾掉。滴加50ylCDllb第一抗體，4t:冰箱過夜。PBS洗5minX3次，每片滴加50yl生物素標(biāo)記的二抗，37。C溫箱孵育10min。PBS洗5minX3次，每片滴加50yl鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶溶液，37。C溫箱孵育10min。PBS洗5minX3次；每片滴加100y1新鮮配制的DAB+H202溶液，顯色5min;流水沖洗，蘇木素復(fù)染3分鐘，自來水洗，O.6%鹽酸酒精分化15秒，自來水沖洗15分鐘。梯度酒精干燥脫水80%乙醇2分鐘，95%乙醇2分鐘，100%乙醇2分鐘，100%乙醇2分鐘。透明二甲苯10分鐘，二甲苯10分鐘。中性樹膠封片。顯微鏡下觀察實驗結(jié)果。見圖4。圖4結(jié)果顯示Nogo66-CS疫苗滴眼液接種后，視網(wǎng)膜呈現(xiàn)棕色的CDllb陽性細(xì)胞，表明Nogo66-CS可剌激大鼠視網(wǎng)膜表達(dá)CDllb，其中C濃度組CDllb陽性細(xì)胞較其他濃度組密度高。結(jié)果表明Nogo66-CS疫苗滴眼液可剌激視網(wǎng)膜小膠質(zhì)細(xì)胞活化，其中C濃度可最明顯剌激視網(wǎng)膜小膠質(zhì)細(xì)胞活化。表明Nogo66-CS疫苗滴眼液接種后可被視網(wǎng)膜小膠質(zhì)細(xì)胞識別，存在免疫原性，C濃度能最佳程度被小膠質(zhì)細(xì)胞識別遞呈。實施例5Nogo66-CS疫苗滴眼液的視神經(jīng)損傷保護(hù)效應(yīng)分別采用SD大鼠慢性高眼壓模型和視神經(jīng)鉗夾傷模型檢測Nogo66-CS疫苗滴眼液的視神經(jīng)損傷免疫保護(hù)效應(yīng)?！⒙愿哐蹓耗Ｐ痛笫蠛鸵暽窠?jīng)鉗夾傷大鼠模型制備1、建立慢性高眼壓大鼠模型532-二極管激光光凝SD大鼠小梁網(wǎng)及顳上、顳下鞏膜淺層靜脈血管，T0N0-PenXL眼壓計檢測試驗動物眼壓。2、建立視神經(jīng)鉗夾傷大鼠模型剪開右眼上眼瞼及上方結(jié)膜、眼外肌，暴露視神經(jīng)，在球后2mm處用動脈夾夾持視神經(jīng)40秒，縫合傷口，結(jié)膜囊涂金霉素眼膏，肌注青霉素5萬單位。二、Nogo66-CS疫苗滴眼液接種模型給予模型大鼠C濃度和D濃度Nogo66-CS疫苗滴眼液點眼接種右眼側(cè)向斜上方，輕輕提起雙瞼，將Nogo66-CS疫苗滴眼液滴于右眼結(jié)膜囊，第21天和第35天各加強點眼1次，共3次。三、Nogo66-CS疫苗滴眼液對慢性高眼壓模型大鼠和視神經(jīng)鉗夾傷模型大鼠的視神經(jīng)損傷免疫保護(hù)效應(yīng)1、熒光金逆行標(biāo)記視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞利用立體定位儀確定上丘及外側(cè)膝狀體的位置。在相對應(yīng)位置，用牙科鉆鉆開顱骨，通過微量進(jìn)樣器向雙側(cè)上丘及外側(cè)膝狀體分別緩慢注入2XFGliU，2min內(nèi)注射完。人工骨粉封閉骨孔，縫合皮膚。肌注青霉素10萬單位。7天后左心室-主動脈插管，結(jié)扎固定導(dǎo)管，剪開右心耳。將生理鹽水從導(dǎo)管處注入，使血液從右心排出，直至排除透明的生理鹽水為止。換4X多聚甲醛250ml灌注，致SD大鼠肢體伸直僵硬。分別取出左右眼球。沿角鞏膜緣剪去角膜，去除晶狀體、玻璃體，再置于4%多聚甲醛液中固定過夜，仔細(xì)剝離視網(wǎng)膜，以玻璃體面朝上，將其平鋪于多聚賴氨酸處理的載玻片上。75%甘油封片。在熒光顯微鏡下(激發(fā)波長323nm)觀察視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞并計數(shù)，參見圖5。表4Nogo66-CS疫苗滴眼液接種慢性高眼壓大鼠和視神經(jīng)鉗夾傷大鼠后RGCs計數(shù)(個/X400)(士SD，n=6)正常Nogo66-CS(C)Nogo66-CS(D)CS未接種憎j生高眼壓視神經(jīng)鉗夾傷2248.10±36.422176.24±64.551930.00±61.631720.00±57.401875.42±73.451663.00±66.391841.50±65,261606.83±84.721741.50±49.251656.67±67.85結(jié)果顯示慢性高眼壓模型大鼠和視神經(jīng)鉗夾傷模型大鼠接種C、D兩個濃度的Nogo66-CS疫苗滴眼液后RGCs較接種CS均有所增加，C組RGCs顯著多于CS組和未接種組，表明C濃度Nogo66-CS疫苗滴眼液可更好的增加視網(wǎng)膜視神經(jīng)損傷后RGCs的存活率，對視網(wǎng)膜視神經(jīng)具有更佳的保護(hù)作用。2、免疫組化法檢測視網(wǎng)膜GAP43表達(dá)3%戊巴比妥鈉以1.3ml/kg行大鼠腹腔麻醉。左心室-主動脈插管，結(jié)扎固定導(dǎo)管，剪開右心耳。將生理鹽水從導(dǎo)管處注入，使血液從右心排出，直至排除透明的生理鹽水為止。換4X多聚甲醛250ml灌注，致SD大鼠肢體伸直僵硬。取左右眼球，浸入4%多聚甲醛固定48小時。將固定好的標(biāo)本蒸餾水稍洗，修成大約2cmX2cmX0.2cm的組織塊，脫水透明包埋70%乙醇4小時一80%乙醇4小時—95%乙醇2小時一95%乙醇2小時一無水乙醇1小時20分鐘一無水乙醇2小時20分鐘一二甲苯l:l無水乙醇10分鐘一二甲苯30分鐘一二甲苯30分鐘一60度熔點石蠟10分鐘一62度熔點石蠟15分鐘一62度熔點石蠟1小時一包埋，蠟塊自然冷卻后，修掉標(biāo)本周圍多余的蠟，貼上標(biāo)本對應(yīng)的標(biāo)簽于蠟塊正上方。蠟塊稍凍，3-5微米切片，62度烤箱烘烤1小時。脫蠟至水；二甲苯10分鐘，二甲苯10分鐘，100%乙醇2分鐘，95%乙醇2分鐘，80%乙醇2分鐘，自來水洗1分鐘，蒸餾水洗1分鐘。將盛有0.OlM(p朋.0)檸檬鹽溶液加熱至沸騰(98IO(TC)，切片放入進(jìn)行抗原修復(fù)，其中繼續(xù)加熱10min。置室溫下自然冷卻20min。PBS洗5minX3次，每片滴加50yl過氧化酶阻斷劑，以阻斷內(nèi)源性過氧化物酶活性，室溫孵育10min。5%BSA封閉15分鐘，傾掉。滴加50ylGAP43第一抗體，4。C冰箱過夜。PBS洗5minX3次，每片滴加50ii1生物素標(biāo)記的二抗，37t:溫箱孵育10min。PBS洗5minX3次，每片滴加50y1鏈霉菌抗生物素蛋白_過氧化物酶溶液，37。C溫箱孵育10min。PBS洗5minX3次；每片滴加100y1新鮮配制的DAB+H202溶液，顯色5min;流水沖洗，蘇木素復(fù)染3分鐘，自來水洗，O.6%鹽酸酒精分化15秒，自來水沖洗15分鐘。梯度酒精干燥脫水80%乙醇2分鐘，95%乙醇2分鐘，100%乙醇2分鐘，100%乙醇2分鐘。透明二甲苯10分鐘，二甲苯10分鐘。中性樹膠封片。顯微鏡下觀察實驗結(jié)果。參見圖6。圖6結(jié)果顯示慢性高眼壓模型大鼠和視神經(jīng)鉗夾傷模型大鼠接種C濃度的Nogo66-CS疫苗滴眼液后視網(wǎng)膜GAP-43均有大量表達(dá)，D濃度組有少量表達(dá)，CS對照組未見表達(dá)。表明Nogo66-CS疫苗滴眼液可剌激視網(wǎng)膜視神經(jīng)損傷后視網(wǎng)膜神經(jīng)元細(xì)胞再生，C濃度的Nogo66-CS疫苗滴眼液誘導(dǎo)神經(jīng)元再生更明顯。3、免疫組化法檢測視網(wǎng)膜BDNF、GDNF表達(dá)3%戊巴比妥鈉以1.3ml/kg行大鼠腹腔麻醉。左心室-主動脈插管，結(jié)扎固定導(dǎo)管，剪開右心耳。將生理鹽水從導(dǎo)管處注入，使血液從右心排出，直至排除透明的生理鹽水為止。換4X多聚甲醛250ml灌注，致SD大鼠肢體伸直僵硬。取左右眼球，浸入4%多聚甲醛固定48小時。將固定好的標(biāo)本蒸餾水稍洗，修成大約2cmX2cmX0.2cm的組織塊，脫水透明包埋70%乙醇4小時一80%乙醇4小時一95%乙醇2小時一95%乙醇2小時一無水乙醇1小時20分鐘一無水乙醇2小時20分鐘一二甲苯l:1無水乙醇10分鐘一二甲苯30分鐘一二甲苯30分鐘一60度熔點石蠟10分鐘一62度熔點石蠟15分鐘一62度熔點石蠟1小時一包埋，蠟塊自然冷卻后，修掉標(biāo)本周圍多余的蠟，貼上標(biāo)本對應(yīng)的標(biāo)簽于蠟塊正上方。蠟塊稍凍，3-5微米切片，62度烤箱烘烤1小時。脫蠟至水；二甲苯10分鐘，二甲苯10分鐘，100%乙醇2分鐘，95%乙醇2分鐘，80%乙醇2分鐘，自來水洗1分鐘，蒸餾水洗1分鐘。將盛有0.OlM(p朋.0)檸檬鹽溶液加熱至沸騰(9810(TC)，切片放入進(jìn)行抗原修復(fù)，其中繼續(xù)加熱10min。置室溫下自然冷卻20min。PBS洗5minX3次，每片滴加50y1過氧化酶阻斷劑，以阻斷內(nèi)源性過氧化物酶活性，室溫孵育10min。5%BSA封閉15分鐘，傾掉。滴加50iUBDNF、GDNF第一抗體，4"冰箱過夜。PBS洗5minX3次，每片滴加50ii1生物素標(biāo)記的二抗，37。C溫箱孵育10min。PBS洗5minX3次，每片滴加50y1鏈霉菌抗生物素蛋白_過氧化物酶溶液，37。C溫箱孵育10min。PBS洗5minX3次；每片滴加100y1新鮮配制的DAB+H202溶液，顯色5min;流水沖洗，蘇木素復(fù)染3分鐘，自來水洗，O.6%鹽酸酒精分化15秒，自來水沖洗15分鐘。梯度酒精干燥脫水80%乙醇2分鐘，95%乙醇2分鐘，100%乙醇2分鐘，100%乙醇2分鐘。透明二甲苯10分鐘，二甲苯10分鐘。中性樹膠封片。顯微鏡下觀察實驗結(jié)果。參見圖7。圖7結(jié)果顯示慢性高眼壓模型大鼠和視神經(jīng)鉗夾傷模型大鼠接種C濃度Nogo66-CS疫苗滴眼液后視網(wǎng)膜均大量表達(dá)GDNF、BDNF，D濃度Nogo66-CS疫苗滴眼液后視網(wǎng)膜均中等量表達(dá)GDNF、BDNF，CS對照組視網(wǎng)膜僅見少量GDNF、BDNF表達(dá)。表明Nogo66-CS疫苗滴眼液可促進(jìn)視網(wǎng)膜視神經(jīng)損傷后視網(wǎng)膜神經(jīng)營養(yǎng)因子的表達(dá)，改善損傷后視網(wǎng)膜微環(huán)境，促進(jìn)神經(jīng)元再生，C濃度效果最佳。實施例6Nogo66-CS疫苗滴眼液的安全性實驗1，主要臟器的病理組織學(xué)觀察選擇8-10周齡正常健康成年SD大鼠5只。以右眼為實驗組，左眼為空白對照。3%戊巴比妥鈉以1.3ml/kg行大鼠腹腔注射麻醉，待麻醉完全后將動物頭左傾，右眼側(cè)向斜上方，輕輕提起雙瞼，將Nogo66-CS滴于右眼角膜0.05ml，1次/10min，持續(xù)lh共6次；1次/天，持續(xù)7天，共7次；接下來每周行Nogo66-CS點眼一次，持續(xù)8周，共8次。于末次點藥后第5周，3%戊巴比妥鈉溶液(1.3ml/kg)SD大鼠腹腔注射麻醉。開胸行左心室插管，4X多聚甲醛固定液400ml灌注，摘除眼球，取心、肝、腎、肺、腦、睪丸，立即置于4X多聚甲醛/PBS溶液中浸泡24h。脫水透明包埋，蠟塊自然冷卻后，稍凍，4ym切片，62度烤箱烘烤l小時。裱于1%多聚賴氨酸預(yù)處理的載玻片上。二甲苯脫蠟，經(jīng)各級乙醇至水洗，蘇木素染色5min，自來水沖洗。鹽酸乙醇分化30s(提插數(shù)下)。自來水浸泡15min或溫水(約50°C)5min。置伊紅液2min。常規(guī)脫水，透明，封片，中性樹脂封固。倒置相差顯微鏡下觀察結(jié)果，參見圖8、圖9.162，視網(wǎng)膜iN0S，TNFa免疫組化反應(yīng)另取已脫蠟的眼球切片抗原修復(fù)，置室溫下自然冷卻20min。PBS洗5minX3次，每片滴加50yl過氧化酶阻斷劑，以阻斷內(nèi)源性過氧化物酶活性，室溫孵育10min。5%BSA封閉15分鐘，傾掉。分別滴加50yliNOS、TNF-a一抗，4t:冰箱過夜。PBS洗5minX3次，每片滴加50yl生物素標(biāo)記的二抗，37。C溫箱孵育10min。PBS洗5minX3次，每片滴加50yl鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶溶液，37。C溫箱孵育10min。PBS洗5minX3次；每片滴加100y1新鮮配制的DAB+H202溶液，顯色5min;流水沖洗，蘇木素復(fù)染3分鐘，自來水洗，0.6%鹽酸酒精分化15秒，自來水沖洗15分鐘。梯度酒精干燥脫水80%乙醇2分鐘，95%乙醇2分鐘，100%乙醇2分鐘，100%乙醇2分鐘。透明二甲苯10分鐘，二甲苯10分鐘。中性樹膠封片。顯微鏡下觀察實驗結(jié)果，參見圖IO。圖8結(jié)果顯示眼球視網(wǎng)膜病理檢查視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)未見明顯異常，表明Nogo66-CS疫苗滴眼液不會引起視網(wǎng)膜的病理損害，對視網(wǎng)膜是安全的。圖9結(jié)果顯示心、肝、腎、肺、腦、睪丸病理檢查未見明顯異常，表明Nogo66-CS疫苗滴眼液不會引起各主要器官的病理損害，對機體是安全的。圖10結(jié)果顯示Nogo66-CS疫苗滴眼液接種后未見大鼠視網(wǎng)膜小膠質(zhì)細(xì)胞表達(dá)iN0S、TNF-a，表明Nogo66-CS疫苗滴眼液在不會誘導(dǎo)視網(wǎng)膜炎癥細(xì)胞因子的分泌，不會引起視網(wǎng)膜病理性炎癥反應(yīng)。結(jié)論Nogo66-CS疫苗滴眼液用于青光眼或外傷引起的視神經(jīng)損傷，可有效地改善受損神經(jīng)元的微環(huán)境，并促使神經(jīng)元的修復(fù)與再生，有使用安全，接種方便的優(yōu)點。權(quán)利要求一種用于治療和預(yù)防青光眼的疫苗滴眼液，其特征在于所述滴眼液包括Nogo66蛋白和殼聚糖，其中Nogo66蛋白與殼聚糖的體積比為1∶1，Nogo66蛋白的濃度為0.1-1.5mg/ml，殼聚糖的濃度為1-15mg/ml。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于治療和預(yù)防青光眼的疫苗滴眼液，其特征在于所述滴眼液中Nogo66蛋白與殼聚糖的體積比為1:1，Nogo66蛋白的濃度為1-1.5mg/ml，殼聚糖的濃度為10-15mg/ml。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于治療和預(yù)防青光眼的疫苗滴眼液，其特征在于所述滴眼液中Nogo66蛋白與殼聚糖的體積比為1:1，Nogo66蛋白的濃度為lmg/ml，殼聚糖的濃度為10mg/ml。4.根據(jù)權(quán)利要求l-3任一所述的治療和預(yù)防用于青光眼的疫苗滴眼液，其特征在于所述疫苗中殼聚糖包裹Nogo66蛋白。5.制備權(quán)利要求1-4中任一所述的用于治療和預(yù)防青光眼的疫苗滴眼液的方法，其特征在于有以下步驟1)取Nogo66蛋白溶液加入雙蒸水配成0.1-1.5mg/mlNogo66蛋白；2)取殼聚糖，加入雙蒸水，滴加醋酸，使其膠溶，配制l-15mg/ml殼聚糖溶液；3)步驟1)、2)所得溶液分別過濾3-5次，除菌；4)將步驟3)所得的兩溶液等體積混合，充分?jǐn)噭颍?)將步驟4)所得溶液中滴加1.0mol/L氫氧化鈉，調(diào)整其ra值為6.0_8.0，即得用于青光眼視網(wǎng)膜視神經(jīng)損傷的疫苗滴眼液。6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于步驟3)所述的過濾，采用0.22iim無菌微孔濾器過濾。全文摘要本發(fā)明涉及一種用于治療和預(yù)防青光眼的疫苗滴眼液，其特征在于所述滴眼液包括Nogo66蛋白和殼聚糖，其中Nogo66蛋白與殼聚糖的體積比為1∶1，Nogo66蛋白的濃度為0.1-1.5mg/ml，殼聚糖的濃度為1-15mg/ml。本發(fā)明所述疫苗滴眼液用于青光眼所致的視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞凋亡或外傷引起的視神經(jīng)損傷，能有效地改善受損神經(jīng)元的微環(huán)境，促使神經(jīng)元的修復(fù)與再生，使用安全，并且具有價格低廉，接種方便的優(yōu)點。文檔編號A61K47/36GK101711863SQ20091019153公開日2010年5月26日申請日期2009年11月20日優(yōu)先權(quán)日2009年11月20日發(fā)明者岳紅云,程茗,謝琳,賀翔鴿申請人:中國人民解放軍第三軍醫(yī)大學(xué)第三附屬醫(yī)院