專(zhuān)利名稱(chēng)：使用hplc法測(cè)定腎衰寧膠囊中丹參素含量的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種使用HPLC法測(cè)定中成藥含量的方法，具體的是一種使用HPLC法測(cè)定腎衰寧膠囊中丹參素含量的方法。

背景技術(shù)：
腎衰寧膠囊是由丹參、大黃、太子參、牛膝、黃連、茯苓、紅花等組成的中藥復(fù)方制劑，其中丹參是君藥。丹參為唇形科鼠尾草植物的干燥根部，現(xiàn)代中藥藥理學(xué)研究表明，丹參可有效地保護(hù)原位腎熱缺血時(shí)對(duì)腎小管上皮所造成的損害，對(duì)腎熱缺血后血肌酐濃度、肌酐清除率和自由水清除率有效地調(diào)整有一定的保護(hù)和修復(fù)作用可，可增加兔腎動(dòng)脈血流量。能降低血尿素氮、肌酐，使腎小球?yàn)V過(guò)率(GFR)、腎血漿流量(RPF)、腎血流量(RBF)顯著增加，腎臟功能明顯改善，能顯著增加尿中尿素、肌酊、鈉和無(wú)機(jī)磷的排出。能降低血肌酐和尿N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖甙酶(NAG酶)。其機(jī)制與穩(wěn)定溶酶體膜，阻止細(xì)胞鈣離子內(nèi)流，抗凝血、抗血栓形成、抗血小板聚集、擴(kuò)張血管、增加巨噬吞噬細(xì)胞功能等有關(guān)。其中的丹參素可能是丹參治療腎臟病方面的主要有效成分之一。
隨著對(duì)中藥研究的進(jìn)一步深入，人們逐漸認(rèn)識(shí)到對(duì)中藥制劑，簡(jiǎn)單的用西醫(yī)合成藥的質(zhì)量控制模式不能恰當(dāng)反映中藥的內(nèi)在質(zhì)量。HPLC是指中藥指紋圖譜，中藥指紋圖譜借用了法醫(yī)學(xué)指紋鑒定的概念，運(yùn)用現(xiàn)代分析技術(shù)得到某種中藥材、提取物或中成藥中所共有的、具有特征性的成份共同組成的光譜或色譜的圖譜。中藥指紋圖譜是由被測(cè)物的特征信號(hào)組成，具有個(gè)體的惟一性，代表了被測(cè)物的特征。中藥指紋圖譜對(duì)于有效控制中藥材、提取物或中成藥的質(zhì)量具有重要意義，可提供更深層次的質(zhì)量評(píng)價(jià)模式。


發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于，提出一種使用HPLC法測(cè)定腎衰寧膠囊中丹參素含量的方法的新技術(shù)方案，本發(fā)明的技術(shù)方案具有快速、準(zhǔn)確測(cè)定腎衰寧膠囊中丹參素的含量，有效控制腎衰寧膠囊產(chǎn)品質(zhì)量的特點(diǎn)。
本發(fā)明的技術(shù)方案使用HPLC法測(cè)定腎衰寧膠囊中丹參素含量的方法，步驟如下 (1)腎衰寧膠囊供試溶液制備準(zhǔn)確稱(chēng)取腎衰寧膠囊12粒(0.35g/粒)于25mL量瓶中，輕輕壓破，加入甲醇15mL，于40℃水浴中超聲10min，置冰水浴中5分鐘，取出，加甲醇至刻度，離心5min，取上清液為衰寧膠囊供試溶液； (2)對(duì)照品溶液的制備精密稱(chēng)取丹參素鈉對(duì)照品1.66mg，置10mL量瓶中，于40℃水浴中超聲10min，取出，置冰水浴中5分鐘，取出，加甲醇至刻度搖勻，作為對(duì)照品溶液； (3)色譜條件色譜柱為Inertsil ODS-3(4.6X150mm 5μm)；流動(dòng)相為甲醇-水-冰醋酸，體積比為19∶80∶1；流速1.0ml/min；檢測(cè)波長(zhǎng)為281nm；靈敏度0.01AUFS；進(jìn)樣量10μL；柱溫40℃，理論塔板數(shù)按丹參素色譜峰計(jì)不小于5000； (4)測(cè)定法分別精密吸取丹參素鈉對(duì)照品溶液和腎衰寧膠囊供試溶液各10mL，注入液相色譜儀，測(cè)定腎衰寧膠囊供試溶液應(yīng)呈現(xiàn)與丹參素鈉對(duì)照品溶液色譜保留時(shí)間相同的色譜峰。
步驟(2)所述的丹參素鈉對(duì)照品使用前現(xiàn)配制，避光、低溫保存。所采用的甲醇為色譜純，水為純凈水，其它試劑均為分析純。
中藥制劑所采用的各種中藥原料因產(chǎn)地、氣候、季節(jié)等原因，其中所含有效成份不盡相同。生產(chǎn)中經(jīng)常出現(xiàn)采用相同數(shù)量的原料和相同的制備工藝，生產(chǎn)出的產(chǎn)品中有效成份卻不相同，使得中藥制劑質(zhì)量的可控性不好。本發(fā)明是對(duì)腎衰寧膠囊產(chǎn)品中的主要有效成份丹參素化學(xué)組分用高效液相色譜法建立宏觀指紋圖譜，再用丹參素鈉為對(duì)照品建立丹參素鈉指紋圖譜，用丹參素鈉指紋圖譜與腎衰寧膠囊指紋圖譜中的丹參素鈉部份的指紋圖譜相比較，從而準(zhǔn)確測(cè)定腎衰寧膠囊中丹參素的含量，有效控制腎衰寧膠囊產(chǎn)品質(zhì)量。該圖譜代表著腎衰寧膠囊主要藥理活性，能有效地表征腎衰寧膠囊的品質(zhì)和效果。本發(fā)明為準(zhǔn)確評(píng)價(jià)腎衰寧膠囊的質(zhì)量提供了新的對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)。與常規(guī)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)相比較，本發(fā)明是更深層次的質(zhì)量評(píng)價(jià)模式，增強(qiáng)了腎衰寧膠囊產(chǎn)品質(zhì)量的可控性，可實(shí)現(xiàn)對(duì)腎衰寧膠囊最大可能的化學(xué)成份進(jìn)行檢測(cè)，有利于對(duì)腎衰寧膠囊產(chǎn)品質(zhì)量全面監(jiān)控。本發(fā)明是采用科學(xué)方法，通過(guò)大量實(shí)驗(yàn)所得到的切實(shí)可行的方法，具有很好的重復(fù)性和穩(wěn)定性。在生產(chǎn)中具有使用方便，快速、準(zhǔn)確的特點(diǎn)。



圖1為按2.2、2.3項(xiàng)方法制備的對(duì)照品、供試品溶液，在2.1項(xiàng)的色譜條件下，依次進(jìn)樣檢測(cè)，獲得各批次腎衰寧膠囊高效液相色譜疊加圖。圖中R為對(duì)照品中文圖譜；S1-S13為腎衰寧膠囊樣品，8為丹參素，9為鹽酸小糪堿。
圖2為本發(fā)明改變流動(dòng)相中冰醋酸加入量的色譜圖。
圖3為本發(fā)明改變流動(dòng)相中甲醇和水比例的色譜圖。

具體實(shí)施例方式 1、儀器與試藥 儀器大連依利特科學(xué)儀器公司生產(chǎn)的ELIIE-P200II型高效液相色譜儀，包括可變波長(zhǎng)紫外檢測(cè)器、色譜工作站、10μL定量進(jìn)樣環(huán)。
藥品云南理想藥業(yè)有限公司生產(chǎn)的腎衰寧膠囊，批號(hào)20090814，20090921，20090927； 試劑中國(guó)藥品與生物制品研究所生產(chǎn)的丹參素鈉對(duì)照品，甲醇為色譜純，水為純凈水，其它試劑均為分析純。
2、含量測(cè)定 2.1、色譜條件 色譜柱大連依利特科學(xué)儀器公司裝填的Inertsil ODS-3(4.6X150mm 5μm)； 流動(dòng)相甲醇∶水∶冰醋酸的體積配比為19∶80∶1； 檢測(cè)波長(zhǎng)281nm； 流速1.0ml/min； 柱溫40℃； 理論塔板數(shù)按丹參素色譜峰計(jì)不小于5000。
在上述條件下的色譜分離結(jié)果見(jiàn)圖1，圖中B丹參素峰。
由圖1可知，組分得到良好分離。
2.2、對(duì)照品溶液的制備 精密稱(chēng)取丹參素鈉對(duì)照品1.66mg，置10mL量瓶中，于40℃水浴中超聲10min，取出，置冰水浴中5分鐘，取出，加甲醇至刻度搖勻，作為丹參素鈉對(duì)照品液，使用前新鮮配制。
2.3、供試品溶液的制備 準(zhǔn)確稱(chēng)取腎衰寧膠囊12粒(0.35g/粒)于25mL量瓶中，輕輕壓破，加入甲醇15mL，于40℃水浴中超聲10min，置冰水浴中5分鐘，取出，加甲醇至刻度，離心5min，取上清液，為腎衰寧膠囊供試品液。
3、方法考察 3.1測(cè)定條件的選擇 對(duì)顯色有影響的因素有水浴溫度、水浴時(shí)間、濃度。根據(jù)文獻(xiàn)資料確定各自水平，對(duì)各影響因素作了考察。
3.2水浴溫度的考察 吸取對(duì)照品溶液1.2ml于三角瓶中，立即加入99％甲醇溶液1ml，混勻，于不同溫度水浴中保溫20分鐘，取出，置冰水浴中5分鐘，取出，以相應(yīng)試劑為空白，在281nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，結(jié)果表明40℃測(cè)得的吸光度較高，故選擇40℃為水浴溫度。
3.3、甲醇濃度的考察 吸取對(duì)照品溶液1.2ml于三角瓶中，分別精密加入85％、90％、95％、99％甲醇1ml，混勻，于40℃水浴中保溫20分鐘，取出，置冰水浴中5分鐘，取出，以相應(yīng)試劑為空白，在281nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，結(jié)果表明，95％和99％的甲醇溶液測(cè)得的吸光度較好，但95％的甲醇溶解不均勻，取樣量不準(zhǔn)確，故選擇甲醇濃度為99％。
3.4、萃取時(shí)間的考察 取腎衰寧藥80-100目粗粉六份每份各1g，精密稱(chēng)定，置圓底燒瓶中，加水100ml，稱(chēng)重，加熱回流1.5，2.0，2.5小時(shí)，冷卻，稱(chēng)重，用脫脂棉濾過(guò)，取續(xù)濾液50ml。精密量取續(xù)濾液2ml，加乙醇10ml，搖勻，靜置12小時(shí)，離心，取上清液，置50ml量瓶中，精密量取上清液2ml于三角瓶中，立即加入99％甲醇溶液1ml，混勻，于40℃水浴中保溫20分鐘，取出，置冰水浴中5分鐘，取出，以相應(yīng)試劑為空白，在281nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，結(jié)果表明，回流2.0小時(shí)和2.5小時(shí)比回流1.5小時(shí)的含量高，而回流2.0小時(shí)和2.5小時(shí)的含量相差不大，從經(jīng)濟(jì)合理的角度考慮，選取回流時(shí)間為2.0小時(shí)。
3.5、測(cè)定波長(zhǎng)的選擇 按供試品的制備方法，制備丹參素鈉對(duì)照品液和腎衰寧膠囊供試品液，并將樣品和對(duì)照品液在200nm-400nm處進(jìn)行光譜掃描，結(jié)果樣品液和對(duì)照品液在281nm處都有最大吸收，見(jiàn)圖2，故本含量測(cè)定選擇281nm作為測(cè)定波長(zhǎng)。
3.6、重復(fù)性 吸取腎衰寧膠囊供試品液，用20μL定量進(jìn)樣環(huán)重復(fù)進(jìn)樣5次，記錄峰面積，RSD為0.35％。取同一批次腎衰寧制劑，按“2.3”項(xiàng)制備腎衰寧膠囊供試品液5份，用20μL定量進(jìn)樣環(huán)進(jìn)樣，以外標(biāo)法測(cè)定含量，丹參素測(cè)定結(jié)果的RSD為0.58％。
3.6、穩(wěn)定性 取同一批次腎衰寧制劑，按上述測(cè)定方法，每間隔0.5h測(cè)定1次，測(cè)得結(jié)果表明，腎衰寧膠囊供試品液在12h內(nèi)測(cè)得的結(jié)果基本一致。
3.7、線(xiàn)性范圍 精密稱(chēng)取丹參素鈉對(duì)照品16.55mg，置50mL量瓶中，加甲醇定容至刻度，搖勻。分別從中精密量取1.0mL、3.0mL、5.0mL、7.0mL、9.0mL，分別稀釋至10mL后，各取20μL進(jìn)樣，以色譜峰面積為縱坐標(biāo)，以溶液中丹參素的濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，回歸方程為Y＝9320.69X-891.63，r＝0.9992。結(jié)果表明，丹參素在0.0298～0.2681mg/mL范圍內(nèi)與峰面積值呈良好線(xiàn)性關(guān)系。
3.8、加樣回收率試驗(yàn) 與5個(gè)10mL容量瓶中，分別精密加入已知含量的腎衰寧膠囊供試品液4.0mL，再分別加入3.0mL、3.5mL、4.0mL、4.5mL、5.0mL丹參素鈉對(duì)照品液后，用甲醇稀釋至刻度，搖勻。按樣品測(cè)定項(xiàng)下方法測(cè)定含量，計(jì)算回收率。丹參素的平均回收率為101.28％，RSD為0.471％。
3.9、樣品測(cè)定 取3個(gè)批號(hào)的腎衰寧膠囊樣品，每批取4份，按“2.3”項(xiàng)制腎衰寧膠囊供試品液。分別取供試液和丹參素鈉對(duì)照品液10μL進(jìn)樣，以峰面積按外標(biāo)法計(jì)算含量，測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表1。
表1腎衰寧膠囊的含量測(cè)定結(jié)果(n＝3) 4、結(jié)論 4.1腎衰寧膠囊的制備工藝過(guò)程中，丹參藥材的提取主要以水提取物為主，因此，本發(fā)明以丹參中的水溶性成分丹參素在腎衰寧膠囊中的含量作為質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)。實(shí)驗(yàn)中通過(guò)使用復(fù)方腎衰寧膠囊中丹參素的含量測(cè)定方法，其測(cè)定結(jié)果準(zhǔn)確性高，可控性強(qiáng)。是一種能對(duì)腎衰寧膠囊產(chǎn)品質(zhì)量進(jìn)行全面監(jiān)控、能更加快速、高效，并且對(duì)儀器傷害較小的測(cè)定方法。
4.2流動(dòng)相的選擇 4.2.1冰醋酸加入的量 在保持甲醇和水比例不變的前提下，改變流動(dòng)相中冰醋酸的加入量，結(jié)果如圖2。
圖2中A 甲醇-水-冰醋酸methanol-water-acetic acid(7∶91∶2) B 甲醇-水-冰醋酸methanol-water-acetic acid(8∶91∶1) C 甲醇-水-冰醋酸methanol-water-acetic acid(8∶91∶0.1) 在圖2中，丹參素峰的T值依次為0.99、0.96、0.89?？梢园l(fā)現(xiàn)，隨著流動(dòng)相中冰醋酸加入量的減少，丹參素峰的對(duì)稱(chēng)性逐漸降低。由于實(shí)驗(yàn)中使用的是C18柱，隨著流動(dòng)相中冰醋酸加入量的增大，色譜柱的穩(wěn)定性和使用壽命等會(huì)逐漸降低，且對(duì)色譜柱的保養(yǎng)和長(zhǎng)期也使用不利?？紤]以上兩方面的原因，按照使用峰面積進(jìn)行定量計(jì)算時(shí)，T值在0.95～1.05之間均可，所以選擇流動(dòng)相中加入冰醋酸的量為1。
4.2.2甲醇和水的比例 保持冰醋酸的加入量為1，改變流動(dòng)相中甲醇和水的比例，結(jié)果如圖3。
圖3中A 甲醇-水-冰醋酸methanol-water-acetic acid(8∶91∶0.5) B 甲醇-水-冰醋酸methanol-water-acetic acid(19∶80∶1) C 甲醇-水-冰醋酸methanol-water-acetic acid(30∶70∶0.1) 丹參素峰的R值依次為20.13、9.96和1.34，可以發(fā)現(xiàn)。隨著流動(dòng)相中甲醇和水比例的增加，丹參素峰的分離度逐漸降低，而樣品中全部組分流出色譜柱所需時(shí)間逐漸增大。隨著測(cè)定時(shí)間的延長(zhǎng)，色譜峰易發(fā)生漂移，且所需流動(dòng)相增多，實(shí)驗(yàn)的成本增高。按照分離度至少應(yīng)大于1.5的規(guī)定，考慮到分析時(shí)間和分離度等因素，選用了甲醇-水-冰醋酸(19∶80∶1)為流動(dòng)相。
4.3生產(chǎn)提取方法 將腎衰寧膠囊中藥材，裝于聚乙烯管中，內(nèi)徑100cm，樣品長(zhǎng)度150cm。聚乙烯管兩端用脫脂棉塞住，一端連接蠕動(dòng)泵，一端連接樣品接受器。將該聚乙烯管放入微波諧振腔中，使原料位于該諧振腔的3/4波長(zhǎng)處。萃取劑通過(guò)蠕動(dòng)泵進(jìn)入，流經(jīng)物料后進(jìn)入接收器，共接收3000kg萃取液。
表2腎衰寧膠囊圖譜中共有指紋峰的相對(duì)保留時(shí)間
表3腎衰寧膠囊指紋圖譜中共有指紋峰相對(duì)峰面積
表4腎衰寧膠囊HPLC中指紋圖譜相似度
權(quán)利要求
1.使用HPLC法測(cè)定腎衰寧膠囊中丹參素含量的方法，其特征在于，步驟如下
(1)腎衰寧膠囊供試溶液制備準(zhǔn)確稱(chēng)取腎衰寧膠囊12粒(0.35g/粒)于25mL量瓶中，輕輕壓破，加入甲醇15mL，于40℃水浴中超聲10min，置冰水浴中5分鐘，取出，加甲醇至刻度，離心5min，取上清液為衰寧膠囊供試溶液；
(2)對(duì)照品溶液的制備精密稱(chēng)取丹參素鈉對(duì)照品1.66mg，置10mL量瓶中，于40℃水浴中超聲10min，取出，置冰水浴中5分鐘，取出，加甲醇至刻度搖勻，為對(duì)照品溶液；
(3)色譜條件色譜柱為Inertsil ODS-3(4.6X150mm 5μm)；流動(dòng)相為甲醇-水-冰醋酸，體積比為19∶80∶1；流速1.0ml/min；檢測(cè)波長(zhǎng)為281nm；靈敏度0.01AUFS；進(jìn)樣量10μL；柱溫40℃，理論塔板數(shù)按丹參素色譜峰計(jì)不小于5000；
(4)測(cè)定法分別精密吸取丹參素鈉對(duì)照品溶液和腎衰寧膠囊供試溶液各10mL，注入液相色譜儀，測(cè)定腎衰寧膠囊供試溶液應(yīng)呈現(xiàn)與丹參素鈉對(duì)照品溶液色譜保留時(shí)間相同的色譜峰。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的使用HPLC法測(cè)定腎衰寧膠囊中丹參素含量的方法，其特征在于，步驟(2)所述的丹參素鈉對(duì)照品使用前現(xiàn)配制，避光、低溫保存。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的使用HPLC法測(cè)定腎衰寧膠囊中丹參素含量的方法，其特征在于，所采用的甲醇為色譜純，水為純凈水，其它試劑均為分析純。
全文摘要
一種使用HPLC法測(cè)定腎衰寧膠囊中丹參素含量的方法1、稱(chēng)取腎衰寧膠囊于量瓶中，壓破，加甲醇，水浴中超聲，置冰水浴中，取出，加甲醇，離心，取上清液為衰寧膠囊供試溶液；2、稱(chēng)取丹參素鈉對(duì)照品，置量瓶中，水浴中超聲，取出，置冰水浴中，取出，加甲醇搖勻，作為對(duì)照品溶液；3、色譜柱為Inertsil ODS-3(4.6X 150mm 5μm)；流動(dòng)相為甲醇-水-冰醋酸，體積比為19∶80∶1；流速1.0ml/min；檢測(cè)波長(zhǎng)為281nm；靈敏度0.01AUFS；進(jìn)樣量10μL；柱溫40℃，理論塔板數(shù)按丹參素色譜峰計(jì)不小于5000；4、分別取丹參素鈉對(duì)照品溶液和腎衰寧膠囊供試溶液，注入液相色譜儀，測(cè)定腎衰寧膠囊供試溶液應(yīng)呈現(xiàn)與丹參素鈉對(duì)照品溶液色譜保留時(shí)間相同的色譜峰。本發(fā)明為準(zhǔn)確評(píng)價(jià)腎衰寧膠囊的質(zhì)量提供了新的對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)。增強(qiáng)了腎衰寧膠囊產(chǎn)品質(zhì)量的可控性，有利于對(duì)腎衰寧膠囊產(chǎn)品質(zhì)量全面監(jiān)控。
文檔編號(hào)A61P13/12GK101816715SQ200910218240
公開(kāi)日2010年9月1日 申請(qǐng)日期2009年11月24日 優(yōu)先權(quán)日2009年11月24日
發(fā)明者趙紅, 羅實(shí), 陳濤, 李家偉 申請(qǐng)人:云南理想藥業(yè)有限公司, 羅實(shí)