專利名稱：生物可降解聚合物囊泡及其制備和應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種藥物載體及其制備方法，具體涉及含有不對稱膜的生物可降解性
聚合物囊泡的藥物釋放系統(tǒng)。
背景技術：
多嵌段ABC型的聚合物，A和C是親水性嵌段，B是疏水性嵌段，這樣的聚合物 能夠形成囊泡具有不對稱的膜結構，即在囊泡膜的內部和外部表面的化學性質是不同 的(F. T. Liu， J. Am. Chem. Soc. 2003， 125， 15059 ;A. Wittema皿，Langmuir 2007， 23， 2224 ; S. Yu， J. Am. Chem. Soc. 2009， 131， 10557)。例如，Meier等人研究了帶有不同陰離子親水嵌 段的聚合物PE045-PMS17-PM0XA341自組裝形成的囊泡中，較短親水嵌段的PEO和較長親水嵌 段的PMOXA分別分布在囊泡的內表面和外表面(R. Stoenescu， Chem. Commun. 2002,3016)。
上述技術方案中，所述囊泡不可生物降解，并且Meier等人并未公布所得囊泡的 相關應用。 近年來，生物技術高速發(fā)展，多種療效很好的治療性蛋白質及多肽類藥物應運而 生，并應用在治療包括癌癥在內的不同疾病上(R. Kerbel， Nat RevCancer 2002，2，727， Y. Yamada， Int. J. pharm. 2005， 303)。但是，蛋白質藥物一般穩(wěn)定性差、細胞滲透性低，極大 地限制了蛋白質和多肽藥物的應用(V. P. Torchilin，Drug Discov. Today 2003， 8， 259)。蛋 白質釋放技術成為其臨床應用的關鍵一步。在過去的一些年中，為了提高蛋白質的生物利 用度，人們開發(fā)利用聚合物納米粒子，脂質體和水凝膠體系作為載體來包裹蛋白質類藥物， 但存在蛋白質包封率較低和蛋白質易變性的問題(C.Kirby， NatureBiotechnology 1984， 2，979)。具有大的親水性內腔和疏水膜結構的聚合物囊泡能同時裝載蛋白質和疏水小分子 抗癌藥物，將在癌癥的聯合療法中有極大的應用潛力，有望克服耐藥性，使各藥物在體內達 到協(xié)同效應。

發(fā)明內容
本發(fā)明目的是提供一種生物可降解聚合物囊泡及其制備和應用。
為達到上述目的，本發(fā)明具體技術方案是， 一種三嵌段聚合物，所述三嵌段聚合物 可自組裝形成生物可降解聚合物囊泡，所述三嵌段聚合物為A-B-C型嵌段聚合物，其中，嵌 段A為聚乙二醇(PEG)嵌段，分子量為3000 10000Da;嵌段B為疏水的生物可降解聚合 物，分子量為10000 30000Da ;嵌段C為聚電解質，嵌段C的分子量是嵌段A的10-85% 。
上述技術方案中，嵌段B的聚合單體選自己內酯、三亞甲基碳酸酯或對二氧環(huán)己 酮中的一種，相應地，嵌段B選自聚己內酯(PCL)嵌段、聚三亞甲基碳酸酯(PTMC)嵌段或 聚對二氧環(huán)己酮(PDO)嵌段中的一種；嵌段C為聚電解質，嵌段C的聚合單體選自甲基丙 烯酸二甲氨乙酯、甲基丙烯酸二乙氨基乙酯、甲基丙烯酸二異丙氨乙酯、丙烯酸、或甲基丙 烯酸中的一種，相應地，嵌段C選自聚甲基丙烯酸二甲氨乙酯(PDMA)嵌段、聚甲基丙烯酸 二乙氨基乙酯(PDEA)嵌段、聚甲基丙烯酸二異丙氨乙酯(PDPA)嵌段、聚丙烯酸(PAA)嵌段或聚甲基丙烯酸(PMA)嵌段中的一種；其中，聚甲基丙烯酸二甲氨乙酯(PDMA)嵌段、聚 甲基丙烯酸二乙氨基乙酯(PDEA)嵌段、聚甲基丙烯酸二異丙氨乙酯(PDPA)嵌段的pKa為 7. 2-7. 4，在酸性環(huán)境中帶正電荷，聚丙烯酸(PAA)嵌段、聚甲基丙烯酸(PMA)嵌段在生理環(huán) 境中帶負電荷。 上述技術方案中，嵌段A為長度較長的親水性嵌段，嵌段B為疏水的生物可降解嵌 段，嵌段C為長度較短的親水性嵌段，可自組裝形成生物可降解聚合物囊泡。
上述三嵌段聚合物可通過可逆加成-斷裂鏈轉移(Reversible Addition-Fragmentation Chain Transfer, RAFT)聚合方法制備而得，以合成嵌段聚合物 聚乙二醇-聚己內酯-聚甲基丙烯酸二乙氨乙酯(PEG-PCL-PDEA)為例，首先一端甲氧基保 護的聚乙二醇通過開環(huán)聚合方法制備不同分子量的PEG-PCL，然后通過DCC/NHS法制備大 分子RAFT試劑PEG-PCL-CPADN，再以PEG-PCL-CPADN為鏈轉移劑在60。C下，AIBN引發(fā)劑聚 合DEA單體，制備一系列分子量可控的嵌段聚合物PEG-PCL-PDEA，其合成路線如圖1所示。
上述技術方案中，所述三嵌段聚合物中的疏水嵌段除PCL外還可以是PTMC或PDO， 所述三嵌段聚合物中聚電解質鏈段除了 PDEA還可為PDMA、 PDPA、 PAA、 PMA等，其長度可通 過加入單體與大分子RAFT試劑的比例、反應時間、反應溫度等來調節(jié)。所得到的嵌段聚合 物的分子量可控，分子量分布在1. 1-1. 4，單峰分布。 通過上述合成的三嵌段兩親性的聚合物在水溶液中可以自組裝形成聚合物囊泡， 所述囊泡的膜由疏水性嵌段B構成，囊泡膜內壁由嵌段C構成，囊泡膜外壁由嵌段A構成， 所述囊泡的尺寸為60 250nm，尺寸分布為0. 05 0. 45。 制備上述囊泡的方法有兩種，一種是溶劑揮發(fā)法，另一種是薄膜水化法。溶劑揮 發(fā)法制備囊泡的具體步驟是首先將嵌段聚合物溶于四氫呋喃(THF)中，然后攪拌下向其 中逐滴加入適當pH的緩沖溶液(pH的選擇要依據所要包裹的物質的pKa和聚合物囊泡內 部聚電解質的pKa來決定，要使二者的電離程度達到最大，相互吸引力最大)，最后讓THF 揮發(fā)。在這過程中聚合物進行自組裝形成囊泡，疏水性的嵌段B(例如PCL)構成囊泡的 膜，較長的親水嵌段PEG由于分子間的排斥力較大排列在膜的外側，而較短的聚電解質嵌 段C由于分子間的排斥力較小排列在膜的內側，從而形成囊泡的穩(wěn)定結構。囊泡的尺寸在 60-150nm，尺寸分布(PDI)在0. 05-0. 45。 薄膜水化法制備囊泡的具體步驟是首先聚合物溶解在有機溶劑中，然后旋轉蒸 發(fā)緩慢除去有機溶劑，在瓶壁上形成一層均勻的聚合物薄膜，通過抽真空把有機溶劑完全 除去，最后加入適當pH的緩沖溶液(pH的選擇要依據所要包裹的物質的pKa和聚合物囊 泡內部聚電解質的pKa來決定，要使二者的電離程度達到最大，相互吸引力最大)，通過加 熱攪拌就形成如上所述的穩(wěn)定結構的聚合物囊泡。所述有機溶劑選自氯仿、二氯甲烷、 二氯乙烷、四氫呋喃、乙腈或丙酮中的一種或其中兩種溶劑形成的混合溶劑。薄膜水化法 制備囊泡的尺寸為130nm 200nm， PDI在0. 10-0. 30 ;在pH 7. 4的條件下，囊泡表面電勢 在-l士7mV范圍內。 上述聚合物囊泡的結構通過共聚焦顯微鏡(CLSM)和高親水物質包裹法得到驗 證，而聚電解質段在聚合物囊泡的內部的優(yōu)先分布可以通過二維核磁(2D ^ NMR NOESY) 和囊泡表面電勢來確認。用HELA細胞和巨噬細胞RAW264. 7細胞測試該聚合物囊泡的細胞 存活率(MTT assay)在所測定的濃度范圍內(0. 5mg/mL)大于80% ，說明該聚合物囊泡生物
4相容性優(yōu)良。 上述技術方案所得聚合物囊泡能和一些帶相反電荷的藥物包括治療性蛋白質藥
物、多肽類藥物，核酸類藥物如DNA(負電性)、siRNA，或是小分子抗癌藥物如甲氨喋呤、鹽
酸多柔比星、順鉑等可通過靜電作用力、氫鍵相互作用力、和/或范德華力復合。 因此，本發(fā)明的另一目的是保護所述聚合物囊泡包裹親水性藥物的應用，所述親
水性藥物選自蛋白質藥物、多肽類藥物、核酸類藥物或者小分子抗癌藥物。
應用聚合物囊泡包裹親水性藥物的方法，包括以下步驟將所述三嵌段聚合物溶
解在有機溶劑中，旋轉蒸發(fā)緩慢除去有機溶劑，在瓶壁上形成一層均勻的聚合物薄膜，加入
溶解有親水性藥物的緩沖溶液，加熱攪拌，然后透析除去未被包裹的藥物，從而得到高效包
裹親水性藥物的聚合物囊泡。所述有機溶劑選自氯仿、二氯甲烷、二氯乙烷、四氫呋喃、乙
腈或丙酮中的一種或其中兩種溶劑形成的混合溶劑。 具體地，應用薄膜水化法得到的聚合物囊泡包裹藥物如治療性蛋白質的聚合物囊 泡的方案為首先聚合物如前所述形成薄膜形成后，將溶解在適當PH的緩沖溶液中的蛋白 質如牛血清蛋白(BSA)或細胞色素C (Cytochrome c)加入，加熱攪拌，然后透析除去未被包 裹的藥物，從而得到高效包裹藥物的聚合物囊泡。例如聚合物PEG5-PCL18-PDEA3形成的囊泡 裝載FITC-BSA，包封率最高能達到96. 6%，載藥率高達53. 2% ;包裹分子量較小的蛋白質 細胞色素C(FITC-Cc)載藥率可達56.4%，包封率最高可接近100%。而同樣的方法用聚合 物PEG5-PCL18形成的囊泡的載BSA的包封率僅僅為3. 3% 。載有蛋白質的聚合物囊泡尺寸 和表面電位基本保持不變。被包裹的蛋白質在pH7.4的條件下，ll天可釋放85X。更重要 的是經過紫外測試，釋放出來的蛋白質的活性與沒有經過處理的原蛋白質的活性相似。
包封有FITC-Cc的PEG「PC1^-PDEA3聚合物囊泡的攝取細胞實驗表明，在4小時時 就能觀察到進入巨噬細胞RAW246. 7里的熒光性的蛋白質FITC-Cc，呈環(huán)狀，說明蛋白質進 入細胞質中；隨著時間的延長，24小時后細胞內的熒光強度增加，熒光遍布整個細胞，48小 時后，細胞內的熒光強度仍然很強。 上述技術方案所得聚合物囊泡，除了能在囊泡的內部包裹親水性物質，同時由于 疏水性生物可降解聚酯膜的存在，可以包裹疏水性藥物，比如抗腫瘤藥物多柔比星(D0X) 和紫杉醇。 因此，本發(fā)明的另一目的是保護所述聚合物囊泡包裹疏水性藥物的應用，所述疏 水性藥物選自紫杉醇、阿霉素、姜黃素、長春新堿或甲胺喋呤。 應用聚合物囊泡包裹疏水性藥物的方法可以選自下面兩種方法之一，方法一包括 以下步驟將聚合物和疏水性藥物溶解在有機溶劑中，旋轉蒸發(fā)緩慢除去有機溶劑，在瓶壁 上形成一層均勻的聚合物薄膜，加入緩沖溶液，加熱攪拌，然后透析除去未被包裹的藥物和 有機溶劑，從而得到包裹疏水性藥物的聚合物囊泡。 方法二包括以下步驟將溶解有疏水性藥物的溶液加入聚合物囊泡的水溶液中， 在室溫下攪拌，最后將未包裹的疏水性藥物和有機溶劑通過透析法除去，從而得到包裹疏 水性藥物的聚合物囊泡。 上述兩種方法中，所述有機溶劑選自二甲亞砜、N，N-二甲基甲酰胺、N，N-二甲基 乙酰胺、氯仿、二氯甲烷、二氯乙烷、四氫呋喃、乙腈或丙酮中的一種或其中兩種溶劑形成的 混合溶劑。
具體地，應用上述通過薄膜水化法得到的聚合物囊泡包裹疏水性藥物D0X的方法 (方法二)包括首先利用薄膜水化法制備成聚合物囊泡，然后將少量含有DOX的二甲亞 砜溶液，按不同藥與聚合物的比加入聚合物囊泡的溶液中，在室溫下攪拌，最后將未包裹的 D0X通過透析法除去，從而得到包裹疏水性藥物D0X的聚合物囊泡。熒光測試結果可看出， 當藥與聚合物的比為20X時，聚合物囊泡包裹疏水性藥物D0X的包封率可高達72. 2%，相 應的載藥率為14. 4wt. %。 上述兩親性聚合物在緩沖溶液中自組裝形成的聚合物囊泡不僅能夠高效包裹親 水性，也能夠同時把疏水性藥物裝載在生物可降解的疏水性膜中，可用于癌癥的聯合療法 (combination therapy)中，以消除治療中產生的耐藥性。 因此，本發(fā)明的另一目的是保護上述聚合物囊泡同時包裹親水性藥物和疏水性藥 物的應用。 應用上述聚合物囊泡同時包裹親水性藥物和疏水性藥物的方法，包括以下步驟 首先形成聚合物薄膜，然后將含有親水性藥物的緩沖溶液加入，加熱攪拌，得到包有親水性 藥物的聚合物囊泡；接著把疏水性藥物的有機溶液加入，室溫攪拌；最后，將未包裹的親水 性藥物和疏水性藥物透析除去，最終得到同時包裹親水性藥物和疏水性藥物的聚合物囊 泡。 以包裹牛血清蛋白BSA和疏水性藥物DOX為例，首先形成聚合物薄膜，然后將含有 蛋白質的緩沖溶液加入，加熱攪拌，得到包有蛋白質的聚合物囊泡；接著把疏水性藥物D0X 的二甲亞砜溶液加入，室溫攪拌；最后，將未包裹上蛋白質和D0X透析除去，最終把兩種藥 物同時包裹進聚合物囊泡。內部包封有FITC-BSA、膜中載有DOX的PEG5_PCL18_PDEA3聚合 物囊泡在4小時后就能進入巨噬細胞RAW246. 7的細胞里，基本上所有細胞內都有綠色熒光 性的蛋白質FITC-BSA和紅色熒光性的D0X。 上述技術方案中，所述親水性藥物選自但不局限于牛血清白蛋白和細胞色素C，
可以選擇其他蛋白質、多肽類如溶菌酶、干擾素、抗體等，核酸類藥物如DNA、 siRNA，或是水
溶性小分子抗癌藥物如甲氨喋呤、鹽酸多柔比星、順鉑。同樣疏水藥物可以選自其他小分子
藥物的一種或幾種，本領域技術人員可以根據需要選擇所需包封的藥物分子。 由于上述技術方案運用，本發(fā)明與現有技術相比具有下列優(yōu)點 本發(fā)明由于選用了合適的嵌段組合，嵌段長度，形成嵌段共聚物，所述嵌段共聚物
可自組裝形成聚合物囊泡，所述聚合物囊泡具有生物相容性、生物可降解性，并且含有不對
稱膜，能夠裝載治療性蛋白質、核酸或/和抗癌藥物，并能通過細胞的內吞作用進入細胞并
使藥物在細胞內釋放，該體系在蛋白質釋放及癌癥聯合治療方面有著很廣闊的應用前景。


附圖1，實施例一、二中三嵌段聚合物合成的示意圖； 附圖2，實施例六中三嵌段聚合物自組裝形成載藥生物可降解性囊泡及細胞內釋 放的實驗示意圖； 附圖3，實施例一所得聚合物囊泡PEGs-PCLfPDE^的細胞毒性測試結果圖； 附圖4，實施例二所得聚合物囊泡PEG5-PCL18_PDEA4的細胞毒性； 附圖5，實施例二i^一中裝載有FITC-BSA的聚合物囊泡PEG5_PCL18_PDEA3分別在pH7. 4和pH5. 3和37度條件下的釋放； 附圖6，實施例二十二中從聚合物囊泡PEG5-PCL18_PDEA3中釋放的細胞色素C保持 了其生物活性；未經處理的細胞色素C(C，圓點)和囊泡中釋放出來的細胞色素C(B，四方 點)催化ABTS的氧化。
具體實施例方式
下面結合附圖及實施例對本發(fā)明作進一步描述
實施例一，RAFT法合成三嵌段聚合物PEG「PCLfPDEAi 在氮氣的保護下，向10ml的Schlenk真空密封瓶中加入大分子RAFT試劑 PEG5_PCL18-CPADN(0. 5mg，0. 022mmol)，按轉化率70%加入DEA單體(0. 028g，0. 15mmol)和 AIBN(O. 7mg，4. 3iimol)，然后加入3. 5ml的1，4-二氧六環(huán)。在反應瓶通氮氣30min后，將 反應瓶放入預先設定好的7(TC的油浴鍋中，密閉反應24小時。待反應結束后，將反應瓶冷 卻后，過量的乙醚沉淀，然后將樣品過濾，真空干燥，真空干燥48小時，得到三嵌段共聚物， 產率為57X，核磁結果表明其PDEA的分子量為IIOO，其結構標為PEG「PCLfPDEAp
實施例二， RAFT法合成三嵌段聚合物PEG5_PCL18_PDEA4 在氮氣的保護下，向10ml的Schlenk真空密封瓶中加入大分子RAFT試劑 PEG5-PCL18-CPADN(0. 4mg，0. 017mmol)，按轉化率70%加入DEA單體(0. 162g，0. 87mmol)和 AIBN (0. 6mg， 3. 4 ii mol)，然后加入3. 5ml的1 ， 4- 二氧六環(huán)。在反應瓶通氮氣30min后，將反 應瓶放入預先設定好的7(TC的油浴鍋中，密閉反應24小時。待反應結束后，將反應瓶冷卻 后，過量的正己烷沉淀，然后將樣品過濾，真空干燥，真空干燥48小時，得到三嵌段共聚物， 產率為65%，核磁結果表明PDEA的分子量為4100，其結構標為PEG5_PCL18_PDEA4。
實施例三，RAFT法合成三嵌段聚合物PEG5-PCL18_PAA3 在氮氣的保護下，向10ml的Schlenk真空密封瓶中加入大分子RAFT試劑 PEG5_PCL18-CPADN(0. 5mg，0. 022mmol)，加入丙烯酸單體(0. 022g，0. 3mmo1)和AIBN(O. 7mg， 4. 3iimol)，然后加入3ml的1，4-二氧六環(huán)。在反應瓶通氮氣30min后，將反應瓶放入預先 設定好的70°C的油浴鍋中，密閉反應24小時。待反應結束后，將反應瓶冷卻后，過量的正己 烷沉淀，然后將樣品過濾，真空干燥，真空干燥48小時，得到三嵌段共聚物，產率為86%，核 磁結果表明PAA的分子量為2700，其結構標為PEG5-PCL18-PAA3。
實施例四，RAFT法合成三嵌段聚合物PEG5-PCL18_PDMA3 在氮氣的保護下，向10ml的Schlenk真空密封瓶中加入大分子RAFT試劑 PEG5-PCL18-CPDPA(0. 5mg，0. 022mmol)，加入DMA單體(0. 065g，0. 41mmol)和AIBN(O. 7mg， 4. 3iimol)，然后加入1.5ml的1，4-二氧六環(huán)溶液。在反應瓶通氮氣30分鐘后，將反應瓶 放入預先設定好的70°C的油浴鍋中，密閉反應24小時。待反應結束后，將反應瓶冷卻后，過 量的乙醚沉淀，然后將樣品過濾，真空干燥，真空干燥48小時，得到三嵌段共聚物，產率為 71%。核磁結果表明PDMA的分子量為2500，其結構標為PEG5_PCL18_PDMA3。
實施例五，RAFT法合成三嵌段聚合物PEG5_PTMC15_PDEA3 在氮氣的保護下，向10ml的Schlenk真空密封瓶中加入大分子RAFT試劑 PEG5_PTMC15-CPADN(0. 44mg，0. 022,1)，按轉化率70%加入DEA單體(0. 084g，0. 45,1) 和AIBN(O. 7mg，4. 3iimol)，然后加入3. 5ml的1，4-二氧六環(huán)。在反應瓶通氮氣30min后，
7將反應瓶放入預先設定好的7(TC的油浴鍋中，密閉反應24小時。待反應結束后，將反應瓶 冷卻后，過量的乙醚沉淀，然后將樣品過濾，真空干燥，真空干燥48小時，可得到三嵌段共 聚物PEG5-PTMC15-PDEA3。 實施例六，RAFT法合成三嵌段聚合物PEG1Q-PCL35-PDPA8 在氮氣的保護下，向10ml的Schlenk真空密封瓶中加入大分子RAFT試劑 PEG10-PCL35-CPDPA (0. 5mg， 11 ii mol)，加入DPA單體(0. 09g，0. 42,1)和AIBN(O. 33mg， 2ymol)，然后加入2. 5ml的1，4-二氧六環(huán)溶液。在反應瓶通氮氣30min后，將反應瓶放 入預先設定好的7(TC的油浴鍋中，密閉反應24小時。待反應結束后，將反應瓶冷卻后，過 量的乙醚沉淀，然后將樣品過濾，真空干燥，真空干燥48小時，得到三嵌段共聚物結構為 PEG10-PCL35-PDPA8。 如圖2所示，利用三嵌段共聚物同時包裹蛋白質和疏水藥物，可被細胞內吞，然后 釋放出蛋白質和疏水藥物。 實施例七，RAFT法合成三嵌段聚合物PEG5-PCL18_PMA4 在氮氣的保護下，向10ml的真空密封瓶中加入大分子RAFT試劑 PEG5_PCL18-CPADN(0. 4mg，0. 017mmol)，按轉化率70%加入DEA單體(0. 162g，21. 3mmo1)和 AIBN (0. 6mg， 3. 4 ii mol)，然后加入3. 5ml的1 ， 4- 二氧六環(huán)。在反應瓶通氮氣30min后，將反 應瓶放入預先設定好的7(TC的油浴鍋中，密閉反應24小時。待反應結束后，將反應瓶冷卻 后，過量的正己烷沉淀，然后將樣品過濾，真空干燥，真空干燥48小時，得到三嵌段共聚物， 產率為65%，核磁結果表明其結構為PEG5-PCL18-PMA4。
實施例八，揮發(fā)法制備PEGs-PCLfPDEAi囊泡將lmg的三嵌段聚合物PEG「PCL^PDEAi溶解在0. 5mL的THF中，邊攪拌邊向其中 逐滴加入5mL的MES (pH5. 3， 20mM)溶液，然后稍微減小攪拌速度，使THF完全揮發(fā)完后，得 到聚合物囊泡，最終的濃度O. 2mg/mL。用動態(tài)激光光散射測粒徑在82. 5nm，粒徑分布0. 12， 囊泡表面電勢-1. 44毫伏(pH7. 4)。
實施例九，揮發(fā)法制備PEG5-PCL18_PDEA4囊泡 將lmg的三嵌段聚合物PEG5-PCL18-PDEA4溶解在0. 5mL的THF中，邊攪拌邊向其中 逐滴加入5mL的MES (pH5. 3， 20mM)溶液，然后稍微減小攪拌速度，使THF完全揮發(fā)完后得到 聚合物囊泡，最終的濃度0. 2mg/mL，用動態(tài)激光光散射測粒徑在68. 6nm，粒徑分布0. 16，囊 泡表面電勢2. 7毫伏(pH7. 4)。 實施例十，揮發(fā)法制備PEG5-PCL18_PDMA3囊泡將lmg的三嵌段聚合物PEG5-PCL18-PDMA3溶解在0. 5mL的THF中，邊攪拌邊向其 中逐滴加入5mL的MES(pH5. 3，20mM)溶液，然后稍微減小攪拌速度，使THF完全揮發(fā)完后 得到聚合物囊泡，最終的濃度0. 2mg/mL，用動態(tài)激光光散射法測粒徑在111. lnm，粒徑分布 0. 25，囊泡表面電勢+3. 0毫伏(pH7. 4)。
實施例i^一，揮發(fā)法制備PEG5-PCL18_PAA3囊泡 將lmg的三嵌段聚合物PEG5-PCL18-PAA3溶解在0. 5mL的THF中，邊攪拌邊向其中 逐滴加入5mL的PB (pH7. 4， 20mM)溶液，然后稍微減小攪拌速度，使THF完全揮發(fā)完后得到 聚合物囊泡，最終的濃度0. 2mg/mL，用動態(tài)激光光散射法測粒徑為95. 3nm，粒徑分布0. 26， 囊泡表面電勢_6. 0毫伏(pH7. 4)。
實施例十二，薄膜水化法制備PEG5-PTMC15_PDEA3囊泡 首先，將充分溶解在2mL氯仿中的lmg嵌段聚合物PEG5-PTMC15_PDEA3加入到25mL 的梨形瓶中，旋轉緩慢除去氯仿，使聚合物在瓶底形成一層均勻的薄膜，然后抽真空約10 小時完全除去痕量的溶劑。之后向梨形瓶內加入2mL的MES(pH5. 3，20mM)溶液，而后在6(TC 下攪拌12小時左右。囊泡最終濃度為0. 5mg/mL，囊泡粒徑為137nm，分布為0. 15，囊泡表面 電勢-2. 20毫伏(pH7. 4)。 實施例十三，薄膜水化法制備PEG5-PCL18_PDMA3囊泡 首先，將充分溶解在2mL氯仿中的lmg嵌段聚合物PEG5_PCL18_PDMA3加入到25mL 的梨形瓶中，旋轉緩慢除去氯仿，使聚合物在瓶底形成一層均勻的薄膜，然后，將梨形瓶抽 真空約10小時完全除去痕量的溶劑。之后向梨形瓶內加入2mL的MES(pH5. 3)溶液，而后 在6(TC下攪拌12小時左右。囊泡最終濃度為0. 5mg/mL，囊泡粒徑為165nm，分布為0. 12， 囊泡表面電勢-1. 1毫伏(pH7. 4)。 實施例十四，薄膜水化法制備PEG1Q-PCL35_PDPA8囊泡 首先將充分溶解在2mL氯仿中的lmg嵌段聚合物PEG1Q-PCL35-PDPA8加入到25mL 的梨形瓶中，旋轉緩慢除去氯仿，使聚合物在瓶底形成一層均勻的薄膜，然后，將梨形瓶抽 真空約10小時完全除去痕量的溶劑。之后向梨形瓶內加入2mL的MES(pH5. 3，20mM)溶液， 而后在6(TC下攪拌12小時左右。囊泡最終濃度為0. 5mg/mL，囊泡粒徑為193nm，粒徑分布 為0. 25，囊泡表面電勢-0. 7毫伏(pH7. 4)。 實施例十五，PEG5-PCL18_PDEA3囊泡裝載蛋白質BSA-FITC 首先將充分溶解在2mL氯仿中的lmg嵌段聚合物PEG5_PCL18_PDEA3加入到25mL的 梨形瓶中，旋轉緩慢除去氯仿，使聚合物在瓶底形成一層均勻的薄膜，然后，將梨形瓶抽真 空約10小時完全除去痕量的溶劑。之后向梨形瓶內加入2mL含有0. 25mg/mL BSA-FITC的 MES(pH5. 3，20mM)溶液，而后在6(TC下攪拌12小時左右。得到的樣品透析12小時(麗CO 500kDa)中，換5次透析液。得到聚合物囊泡的粒徑170nm，粒徑分布0. 25，囊泡表面的電位 為-4. 51毫伏(pH7. 4)。熒光光譜測定BSA-FITC的包封率為64. 5%，載藥率為32. 2wt. %。
實施例十六，PEG5-PCL18_PDEA4囊泡裝載甲氨喋呤 如實施例十二至十二四制得PEG5-PCL18-PDEA4薄膜，然后加入2mL含有0. 10mg/mL 甲氨喋呤的MES(p朋.1， 10mM)溶液，而后在6(TC下攪拌過夜。得到的樣品在30度下透析 12小時(麗CO 12000Da)，換5次透析液。得到聚合物囊泡的粒徑156. 4nm，粒徑分布0. 22， 囊泡表面的電位為0. 01毫伏(pH7. 4)。紫外光譜測定甲氨喋呤的包封率為31. 0%，載藥率 為6. 2wt. %。 實施例十七，PEG5-PCL18_PDEA4囊泡裝載小牛胸腺DNA 如實施例十二至十二四制得PEG5-PCL18_PDEA4薄膜，然后加入2mL含有DNA 的MES (p朋.1 ， 10mM)溶液，在60°C下攪拌過夜，使N/P比在100/0 (沒加DNA的空囊 泡)，90/10 (相當于藥/聚合物為1. 5wt. % ) ，75/25(4. 5wt. % ) ，50/50(13. 5wt. % )， 25/75 (40. 5wt. % ) ， 0/100 (純DNA在相同的溶液中)。室溫下測定相應的囊泡的粒徑分別 為140、94、101、158、286和1580納米，粒徑分布0. 19、0. 10、0. 18、0. 22、0. 28、和0. 35 ;在 pH7. 4下相應囊泡的表面電位分別為2. 7、 -1. 2、 -1. 6、 -5. 4、 -12. 6和-25. 6毫伏。說明在 N/P比例大于等于50/50時，DNA被包裹得很好。可通過離心除去上清液中未被包裹的DNA來純化負載DNA的囊泡，并用紫外光譜差量法測定DNA的包封率。
實施例十八，PEG5-PCL18_PDEA3囊泡裝載細胞色素C PEG5-PCL18_PDEA3囊泡裝載細胞色素C和實施例十五相同，只是把2mL的含有
0. 25mg/mL細胞色素C的MES(pH 5. 3)溶液加入超聲、加熱攪拌、透析12小時。所得包有細
胞色素C的囊泡粒徑為154nm，粒徑分布0. 19，囊泡表面電勢為-0. 11毫伏(pH7. 4)。熒光
光譜測定細胞色素C的包封率為49. 5%，載藥率為24. 8wt. %。 實施例十九，PEG1Q-PCL35_PDPA8囊泡裝載疏水藥物紫衫醇(PTX) PEG1Q-PCL35_PDPA8囊泡裝載紫衫醇的過程和實施例十四相似，區(qū)別是在形成薄膜
的聚合物溶液中加入一定比例的紫衫醇(相當于藥/聚合物為5wt. %)。囊泡最終濃度為
0. 5mg/mL，囊泡粒徑為125nm，分布為0. 17，囊泡表面電勢-1. 1毫伏(pH7. 4) 。 HPLC測定紫
衫醇的包封率為62%。 實施例二十，PEG5-PCL18_PDEA3囊泡裝載疏水藥物多柔比星(D0X)
如實施例十二至十二四制得PEG5-PCL^PDEA3囊泡，然后向其中加入40iiL DOX的 二甲亞砜溶液(5mg/mL)，室溫攪拌12h后透析12小時(麗C03500)，透析換5次透析液。得 到的囊泡的粒徑為109nm，粒徑分布為0. 19，囊泡表面電勢為-1. 69 (pH7. 4)。熒光光譜測定 DOX的包封率為72%，載藥率為14. 4wt. %。 實施例二十，PEG5-PCL18-PDEA3囊泡同時包裹BSA-FITC和DOX 如實施例十五，得到裝載BSA-FITC的PEG5_PCL18_PDEA3囊泡之后，加入40 y L DOX
的二甲亞砜溶液(5mg/mL)，室溫攪拌12h后透析12小時(500kDa)，透析需換5次透析液。
得到的囊泡的粒徑為165nm，粒徑分布為0. 20，囊泡表面電勢為-2. 2 (pH7. 4)。 如圖2所示，同時包裹有BSA-FITC和DOX的囊泡可被細胞內吞，然后釋放出蛋白
質和疏水藥物。 實施例二i^一，蛋白質BSA-FITC從聚合物囊泡里釋放 如實施例十五中制備的包有BSA-FITC的聚合物囊泡中，取O. 5mL分別放入透析袋 中(500kDa)置于含有60mL磷酸鹽緩沖溶液(PB，pH7. 4)和含有60mL的MES溶液(pH5. 3) 廣口瓶中。在37t:的恒溫振蕩器(200rpm)中，特定時間取6mL的透析液，并加入對應的等量 新鮮透析液。取出的樣品用熒光光譜測定BSA-FITC的含量，計算BSA-FITC的累積釋放率。 在pH7. 4條件下，BSA-FITC 11天釋放了 85%，而在pH5. 3條件下BSA-FITC只釋放40 %左 右。 實施例二十二，細胞色素C(Cc-FITC)從聚合物囊泡里釋放 如實施例十八中制備的包有細胞色素C的聚合物囊泡中，取0. 5mL放入透析袋中 (500kDa)置于含有60mL的PB溶液(pH7. 4)。在37。C的恒溫振蕩器(200rpm)中，特定時間 取6mL的透析液，并加入對應的等量新鮮透析液。取出的樣品用熒光光譜測定Cc-FITC的 含量，計算Cc-FITC的累積釋放率。結果表明，在pH7. 4條件下，細胞色素C的釋放要比BSA 快很多，在4天釋放了約95%。 從圖6可知，利用未經處理的細胞色素C(C，圓點)和囊泡中釋放出來的細胞色素 C(B，四方點)催化ABTS的氧化，效果相似，證明了從聚合物囊泡PEG「PC1^-PDEA3中釋放的 細胞色素C保持了其生物活性。
實施例二十三，DOX從聚合物囊泡里釋放
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如實施例十九中制備的包有DOX的聚合物囊泡中，取O. 5mL放入透析袋中 (3500Da)置于含有60mL的PB溶液(pH7. 4)中。在37°C的恒溫振蕩器中，特定時間取6mL 的透析液，并加入對應的等量新鮮透析液。取出的樣品用熒光光譜測定DOX的含量，計算 DOX的累積釋放率。結果表明，DOX的釋放較慢，11天釋放約55% 。
實施例二十四，聚合物囊泡結構的確認 PEG5-PCL18_PDEA3囊泡的結構由裝載3， 3' ， 3"-次膦基三苯磺酸來確認。具體如 下PEG5-PCL18-PDEA3囊泡裝載高度親水的3， 3' ， 3"-次膦基三苯磺酸和實施例十五相同， 只是把2mL含有5mg/mL的3， 3' ， 3"-次膦基三苯磺酸的MES溶液(pH5. 3)加入，加熱攪拌、 透析12小時。然后，40 ii L的DTNB溶液(25mg/mL)加入，立即開始每隔十分鐘測一次溶液 在412nm的紫外吸收，得到不同時間點所對應的紫外吸收。結果表明，隨著時間的延長，由 于DTNB被3， 3' ， 3"-次膦基三苯磺酸還原產生硫醇在412nm的特征吸收逐漸增加，說明了 原來的3 ， 3' ， 3 "-次膦基三苯磺酸是包裹在囊泡內部的，驗證了其囊泡的結構。
實施例二十五，聚合物囊泡的細胞毒性 首先將細胞鋪板，每個孔上大約有5000個細胞，待80%左右的細胞都貼壁生長 后。隔天加藥析出培養(yǎng)基，分別按10%培養(yǎng)基加入不同含藥量的聚合物溶液。培養(yǎng)24小 時，加入lOii L MTT(5mg/mL)。培養(yǎng)4小時之后，加入100 y L HCL *SDS溶液。在37。C條件 下的培養(yǎng)箱中孵化12小時，取出看熒光酶標儀讀數。與未加聚合物的溶液相比較，無論是 HeLa細胞還是Raw細胞，實驗結果顯示細胞的成活率在80 120% (參見圖3、4)，基本無 毒性。
權利要求
一種三嵌段聚合物，所述三嵌段聚合物可自組裝形成生物可降解聚合物囊泡，所述三嵌段聚合物為A-B-C型嵌段聚合物，其特征在于，其中，嵌段A為聚乙二醇，嵌段A的分子量為3000～10000Da；嵌段B為疏水的生物可降解聚合物，分子量為10000～30000Da；嵌段C為聚電解質，嵌段C的分子量是嵌段A的10-85％。
2. 根據權利要求1所述三嵌段聚合物，其特征在于，嵌段B的聚合單體選自己內酯、 三亞甲基碳酸酯或對二氧環(huán)己酮中的一種；嵌段C的聚合單體選自甲基丙烯酸二甲氨乙 酯、甲基丙烯酸二乙氨基乙酯、甲基丙烯酸二異丙氨乙酯、丙烯酸、或甲基丙烯酸中的一種。
3. 權利要求1所述三嵌段兩親性的聚合物自組裝形成的聚合物囊泡，其特征在于，所 述囊泡的膜由疏水性嵌段B構成，囊泡膜內壁由嵌段C構成，膜外壁由嵌段A構成，所述囊 泡的尺寸為60 250nm，尺寸分布為0. 05 0. 45。
4. 權利要求3所述聚合物囊泡包裹親水性藥物的應用，所述親水性藥物選自蛋白質 藥物、多肽類藥物、核酸類藥物或者小分子抗癌藥物。
5. 權利要求3所述聚合物囊泡包裹疏水性藥物的應用，所述疏水性藥物選自紫杉醇、 阿霉素、姜黃素、長春新堿或甲胺喋呤。
6. 權利要求3所述聚合物囊泡同時包裹親水性藥物和疏水性藥物的應用，所述親水性藥物選自蛋白質藥物、多肽類藥物、核酸類藥物或者小分子抗癌藥物，所述疏水性藥物選 自紫杉醇、阿霉素、姜黃素、長春新堿或甲胺喋呤。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種藥物載體及其制備方法，具體涉及含有不對稱膜的生物可降解性聚合物囊泡的藥物釋放系統(tǒng)。本發(fā)明公開了一種生物可降解聚合物囊泡及其制備和應用，所述聚合物囊泡由A-B-C型嵌段聚合物形成，嵌段A為聚乙二醇(PEG)，分布于囊泡外表面，嵌段B為疏水的生物可降解聚合物，構成囊泡的膜核，嵌段C為聚電解質，分布于囊泡膜內壁，用于高效負載帶有相反電荷的藥物。由于該生物可降解囊泡在水溶液中直接形成，并且能高效負載蛋白質、多肽類藥物，核酸藥物及小分子藥物，有望應用在蛋白質療法和癌癥的聯合療法上。
文檔編號A61K47/34GK101792516SQ20091026424
公開日2010年8月4日 申請日期2009年12月28日 優(yōu)先權日2009年12月28日
發(fā)明者劉桂景, 孟鳳華, 李少科, 鐘志遠 申請人:蘇州大學