專利名稱：一種復(fù)合脂肪顆粒及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于移植材料技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種用于移植的復(fù)合脂肪顆粒及其制備 方法。
背景技術(shù)：
1893年Neuber完成了第一例采用多個自體游離的小脂肪塊充填軟組織缺損的脂 肪移植手術(shù)并取得滿意的療效，此后脂肪移植手術(shù)逐漸流行。尤其是液態(tài)硅膠注射由于眾 多并發(fā)癥被禁止后，人們在移植材料領(lǐng)域又進(jìn)行了大量的探索，到20世紀(jì)80年代初，隨著 脂肪抽吸技術(shù)的成熟和發(fā)展，再次掀起了自體游離脂肪移植的熱潮。因自體脂肪來源豐富、 取材方便、安全可靠、無免疫排斥反應(yīng)等優(yōu)點，極易被患者所接受。并且對于全身脂肪堆積 明顯者，可在自體脂肪移植的同時達(dá)到瘦身豐胸、完美身形、形體雕塑的良好效果。目前廣泛應(yīng)用于臨床的脂肪移植技術(shù)，一般采用單純的脂肪顆粒移植，即通過吸 脂獲取脂肪細(xì)胞，稍微處理去除水分血液油脂等成分后，直接注射到受區(qū)。然而，由于部分 移植脂肪細(xì)胞在移植前已經(jīng)被損壞或者發(fā)生壞死；移植后局部的無菌性炎癥反應(yīng)導(dǎo)致脂肪 細(xì)胞壞死、外漏脂質(zhì)纖維化引起組織收縮；繼發(fā)于脂肪細(xì)胞脂質(zhì)丟失或去分化的非壞死性 容積縮小等等，都可引起移植脂肪細(xì)胞成活率低、吸收率較高，一年內(nèi)吸收率可高達(dá)60 %以 上，并且如果移植的脂肪體積過大，重建的血供難以達(dá)到移植物中心，也將導(dǎo)致移植脂肪顆 粒中心壞死液化，增加吸收率，甚至發(fā)生纖維化，導(dǎo)致受植區(qū)域變硬。目前也有學(xué)者為了提高移植脂肪的成活率，而在移植的單純脂肪顆粒中添加一定 量的脂肪干細(xì)胞，來減少移植的吸收率，取得了一定的效果；但個別卻出現(xiàn)異位纖維化結(jié)節(jié) 形成的情況，導(dǎo)致受植區(qū)出現(xiàn)硬的團(tuán)塊。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的主要目的是針對上述現(xiàn)有技術(shù)單純的脂肪顆粒移植后脂肪成活率低、遠(yuǎn) 期吸收率高，以及直接在移植的單純脂肪顆粒中添加脂肪干細(xì)胞可能出現(xiàn)異位纖維化結(jié)節(jié) 形成等問題，提供一種新的復(fù)合脂肪顆粒，可提高移植后脂肪的成活率、并減少遠(yuǎn)期吸收 率，且不會出現(xiàn)異位纖維化結(jié)節(jié)形成等情況。本發(fā)明的另一個目的是提供一種上述復(fù)合脂肪顆粒的制備方法。為了實現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下一種復(fù)合脂肪顆粒，由富含血小板血漿、人凝血酶溶液、脂肪干細(xì)胞、脂肪顆粒按 照下述比例組成2ml富含血小板血漿Iml人凝血酶溶液0士0.幻X IO7個脂肪干細(xì)胞^il 脂肪顆粒。其中富含血小板血漿(PRP，platelet rich plasma)是將全血經(jīng)過濃集、分離得到的成 分血液制品，其中血小板濃度為(1300. 00士400. 00) X 109/L。目前富含血小板血漿的制備方法已較為成熟，已有專用儀器(如多功能醫(yī)用血成分的自動分離設(shè)備)可以快速、便捷、 有效的制備得到。人凝血酶溶液是采用氯化鈣溶液溶解的人凝血酶，在本發(fā)明中作為激活PRP凝 結(jié)及釋放多量生長因子的催化劑。其制備方法較為固定簡單，其組分比例為1ml蒸餾 水0. Ig氯化鈣800 1200單位人凝血酶凍干粉(人凝血酶的比例參照常規(guī)配比方法， 其小范圍的波動對產(chǎn)品的質(zhì)量及效果無特殊影響)。脂肪干細(xì)胞(ASCs，adipose-derived stem cells)是脂肪組織中含有的大量 具有多向分化潛能的細(xì)胞群，由國際脂肪應(yīng)用技術(shù)協(xié)會(International Fat Applied Technology Society)將其統(tǒng)一命名為脂肪來源的干細(xì)胞(adipose-derived stem cells, ASCs)，簡稱脂肪干細(xì)胞。目前對于脂肪干細(xì)胞的研究已經(jīng)較為普遍，對于其培養(yǎng)主要采用 組織塊培養(yǎng)法和消化培養(yǎng)法。脂肪顆粒是通過吸脂獲取的脂肪細(xì)胞。目前對于脂肪細(xì)胞獲取公認(rèn)的方法是采用 手動針吸法獲取，并采用低于50g的離心力離心2分鐘，去盡上層的油脂和水分，制備好后 可以置于4°C下保存3天。本發(fā)明復(fù)合脂肪顆粒可通過包括下述主要步驟的方法制得(1)、制備富含血小板血漿(PRP)抽取抗凝全血，通過兩次離心法得到富含血小板血漿(PRP)，方法可如下用預(yù)先裝有0.5ml 3. 8%枸櫞酸三鈉抗凝劑的5ml注射器，抽取4.5ml全血，搖勻， 移入離心管中，進(jìn)行兩次離心。第一次離心速度為lOOOr/min，時間為15分鐘。離心后血 液分為三層最上層為血漿層、中間層包括血小板和白細(xì)胞(棕黃層)、最下層為紅細(xì)胞層。 棄去最下層的紅細(xì)胞，吸取上層和中間層至另一離心管，進(jìn)行二次離心，速度為2000r/min， 時間為15分鐘，棄去最上層的大部分血漿，剩余約0. 5ml液體，將其搖勻，即得到PRP。PRP制備全過程應(yīng)嚴(yán)格無菌。(2)、制備人凝血酶溶液按照Iml蒸餾水0. Ig氯化鈣800 1200單位人凝血酶凍干粉的組分比，將 人凝血酶凍干粉置于無菌的10%氯化鈣溶液中配制成人凝血酶溶液，用于激活血漿中血小 板及促進(jìn)血漿凝結(jié)；(3)、分離培養(yǎng)脂肪干細(xì)胞(ASCs)由于人脂肪中成熟脂肪細(xì)胞和油脂較多，不利于組織塊培養(yǎng)，油脂和多余的脂肪 細(xì)胞容易損耗大量培養(yǎng)基，本發(fā)明中優(yōu)選采用消化培養(yǎng)法，通過此法可以盡量去除脂肪細(xì) 胞和油脂對于干細(xì)胞的生長和貼壁的影響。在無菌條件下抽取脂肪，浸于生理鹽水中，于抽取后池內(nèi)在超凈工作臺中，用2倍 體積的PBS緩沖液(PBS-T)沖洗至少3次，以除去血液、油脂，然后將組織剪碎，加入等體積 的1 % I型膠原酶，混勻后于37°C恒溫?fù)u床振蕩消化60分鐘，1000r/min離心8分鐘，吸除 表面漂浮油脂、脂肪組織及液體，將沉積于管底的物質(zhì)接種于25cm2培養(yǎng)瓶中，加入α -MEM 培養(yǎng)基(含10 %胎牛血清，1 %雙抗)，置入37 °C、飽和濕度、5 % (X)2的孵箱中培養(yǎng)，3天后加 2ml液(即培養(yǎng)基，下同)，7天后換液，清除未貼壁的細(xì)胞及組織塊。原代細(xì)胞培養(yǎng)15 20d即可融合。細(xì)胞長滿80% (指培養(yǎng)瓶底面積的80%，下同)時，以0.25%胰酶消化、傳 代。傳代細(xì)胞繼續(xù)加入α -MEM培養(yǎng)基，置入37°C、飽和濕度、5% CO2的孵箱中培養(yǎng)，倒置相CN 102058905 A
說明書
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差顯微鏡下觀察細(xì)胞生長情況，每3天換一次液。待細(xì)胞生長至60%時，以0. 25%胰酶消 化、離心、收集底部沉積的脂肪干細(xì)胞待用。0)、制備脂肪顆粒在無菌條件下抽取脂肪，采用2倍體積的生理鹽水沖洗至少3次，以去除血液、水 分、油脂等，通過1000轉(zhuǎn)/分鐘低速離心2分鐘，進(jìn)一步去除血液、水分、油脂等成分，得到 純凈的脂肪顆粒；(5)、混合、制得復(fù)合脂肪顆粒將上述各步驟制得的富含血小板血漿(PRP)、人凝血酶溶液、脂肪干細(xì)胞(ASCs)、 脂肪顆粒按照anl Iml Q±0.5)X107個的比例充分混合均勻，即得到本發(fā)明 所述的復(fù)合脂肪顆粒。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果是本發(fā)明通過在純凈脂肪顆粒中添加適當(dāng)比例的富含血小板血漿、人凝血酶溶液和 脂肪干細(xì)胞，通過人凝血酶溶液對PRP中血小板的激活，釋放大量生長因子，可以促進(jìn)細(xì)胞 增殖及移植物周邊毛細(xì)血管的增殖，從而保證移植脂肪早期血供，防止脂肪細(xì)胞壞死液化。 同時PRP凝結(jié)后形成豐富的纖維網(wǎng)絡(luò)對促進(jìn)細(xì)胞粘附和防止細(xì)胞流式均具有一定的作用。 而脂肪干細(xì)胞其不僅自身能分化為脂肪細(xì)胞促進(jìn)脂肪組織再生，而且可以分化為血管內(nèi)皮 細(xì)胞促進(jìn)血管生成，并且在移植后的缺氧的急性狀態(tài)下可以改善局部組織缺血的情況。這 些作用都可以促進(jìn)移植物早期迅速建立血供，為移植細(xì)胞的成活提供必要的條件，從而提 高脂肪細(xì)胞成活率，減少遠(yuǎn)期吸收率；并且不會出現(xiàn)異位纖維化結(jié)節(jié)形成等情況。


圖1是在裸鼠的左右肩部和臀部皮下分的AB⑶四組。圖2是采用精確到0. Iml的2. 5ml空針對移植物體積進(jìn)行測量的操作圖。采用此 法可以將移植物體積的測量精確到0. 1ml，估計到0. 01ml。圖3是移植7天后見到A組移植物表面有大量血管生成，B組移植物吸收較多，⑶ 組移植物表面有部分血管生成。圖4是移植7天時本發(fā)明的復(fù)合脂肪顆粒組移植物表面有大量血管(小箭頭所 示)生成，細(xì)胞形態(tài)較好，細(xì)胞間質(zhì)正常(X100)。圖5是移植7天時純凈脂肪顆粒組移植物內(nèi)毛細(xì)血管較少，脂肪細(xì)胞變形，細(xì)胞間 未見明顯纖維增生。圖6是移植90天時本發(fā)明的復(fù)合脂肪顆粒組中脂肪細(xì)胞大部分形態(tài)可，少數(shù)細(xì)胞 變大出現(xiàn)了空泡，大部分區(qū)域細(xì)胞間隙保持較好，少數(shù)區(qū)域出現(xiàn)細(xì)胞間隙變大，纖維增生。圖7是移植90天時純凈脂肪顆粒組移植物內(nèi)大部分脂肪細(xì)胞已經(jīng)完全失去細(xì)胞 形態(tài)，細(xì)胞間隙增大，纖維增生。
具體實施例方式下面結(jié)合具體實施方式
對本發(fā)明的上述發(fā)明內(nèi)容作進(jìn)一步的詳細(xì)描述。但不應(yīng)將此理解為本發(fā)明上述主題的范圍僅限于下述實施例。在不脫離本發(fā)明上 述技術(shù)思想情況下，根據(jù)本領(lǐng)域普通技術(shù)知識和慣用手段，做出各種替換和變更，均應(yīng)包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。實施例1本實施例復(fù)合脂肪顆粒(簡稱PA脂肪)由富含血小板血漿、人凝血酶溶液、脂肪 干細(xì)胞、脂肪顆粒按照下述比例組成2ml富含血小板血漿Iml人凝血酶溶液0士0.幻X IO7個脂肪干細(xì)胞^il 脂肪顆粒；其中富含血小板血漿中的血小板濃度為(1300. 00士400. 00) X 109/L ；人凝血酶溶液的組分比例為1ml蒸餾水0. Ig氯化鈣1000單位人凝血酶凍干粉。本實施例PA脂肪通過包括下述步驟的方法制得(1)、制備富含血小板血漿(PRP)抽取抗凝全血，通過兩次離心法得到富含血小板血漿(PRP)，方法如下用預(yù)先裝有0.5ml 3. 8%枸櫞酸三鈉抗凝劑的5ml注射器，抽取4. 5ml全血，搖勻， 移入離心管中，進(jìn)行兩次離心。第一次離心速度為lOOOr/min，時間為15分鐘。離心后血 液分為三層最上層為血漿層、中間層包括血小板和白細(xì)胞(棕黃層)、最下層為紅細(xì)胞層。 棄去最下層的紅細(xì)胞，吸取上層和中間層至另一離心管，進(jìn)行二次離心，速度為2000r/min， 時間為15分鐘，棄去最上層的大部分血漿，剩余約0. 5ml液體，將其搖勻，即得到PRP。PRP制備全過程嚴(yán)格無菌。O)、制備人凝血酶溶液按照Iml蒸餾水0. Ig氯化鈣1000單位人凝血酶凍干粉的組分比，將人凝血 酶凍干粉置于無菌的10%氯化鈣溶液中配制成人凝血酶溶液；(3)、分離培養(yǎng)脂肪干細(xì)胞(ASCs)在無菌條件下抽取脂肪，浸于生理鹽水中，于抽取后池內(nèi)在超凈工作臺中，用2倍 體積的PBS緩沖液(PBS-T)沖洗3次，以除去血液、油脂，然后將組織剪碎，加入等體積的 1% I型膠原酶，混勻后于37°C恒溫?fù)u床振蕩消化60分鐘，1000r/min離心8分鐘，吸除表 面漂浮油脂、脂肪組織及液體，將沉積于管底的物質(zhì)接種于25cm2培養(yǎng)瓶中，加入α -MEM培 養(yǎng)基(含10%胎牛血清，雙抗)，置入37°C、飽和濕度、5% CO2的孵箱中培養(yǎng)，3天后加 2ml液，7天后換液，清除未貼壁的細(xì)胞及組織塊。原代細(xì)胞培養(yǎng)15 20d即可融合。細(xì)胞 長滿80%時，0. 25%胰酶消化、傳代。傳代細(xì)胞繼續(xù)加入α -MEM培養(yǎng)基，置入37°C、飽和濕 度、5% CO2的孵箱中培養(yǎng)，倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞生長情況，每3天換一次液。待細(xì)胞 生長至60%時，可以0. 25%胰酶消化、離心、收集底部沉積的脂肪干細(xì)胞待用。0)、制備脂肪顆粒在無菌條件下抽取脂肪，采用2倍體積的生理鹽水沖洗3次，以去除血液、水分、油 脂等，通過1000轉(zhuǎn)/分鐘低速離心2分鐘，進(jìn)一步去除血液、油脂等成分，得到純凈的脂肪 顆粒；(5)、混合、制得復(fù)合脂肪顆粒將上述各步驟制得的富含血小板血漿(PRP)、人凝血酶溶液、脂肪干細(xì)胞(ASCs)、 脂肪顆粒按照anl Iml Q±0.5)X107個的比例充分混合均勻，即得所述的復(fù)合脂肪顆粒。實施例2本實施例復(fù)合脂肪顆粒(簡稱PA脂肪)由富含血小板血漿、人凝血酶溶液、脂肪 干細(xì)胞、脂肪顆粒按照下述比例組成2ml富含血小板血漿Iml人凝血酶溶液0士0.幻X IO7個脂肪干細(xì)胞^il 脂肪顆粒；其中富含血小板血漿中的血小板濃度為(1300. 00士400. 00) X 109/L ；人凝血酶溶液的組分比例為1ml蒸餾水0. Ig氯化鈣800單位人凝血酶凍干粉。本實施例PA脂肪通過包括下述步驟的方法制得(1)、制備富含血小板血漿(PRP)抽取抗凝全血，通過兩次離心法得到富含血小板血漿(PRP)，方法如下用預(yù)先裝有0.5ml 3. 8%枸櫞酸三鈉抗凝劑的5ml注射器，抽取4. 5ml全血，搖勻， 移入離心管中，進(jìn)行兩次離心。第一次離心速度為lOOOr/min，時間為15分鐘。離心后血 液分為三層最上層為血漿層、中間層包括血小板和白細(xì)胞(棕黃層)、最下層為紅細(xì)胞層。 棄去最下層的紅細(xì)胞，吸取上層和中間層至另一離心管，進(jìn)行二次離心，速度為2000r/min， 時間為15分鐘，棄去最上層的大部分血漿，剩余約0. 5ml液體，將其搖勻，即得到PRP。PRP制備全過程嚴(yán)格無菌。(2)、制備人凝血酶溶液按照Iml蒸餾水0. Ig氯化鈣800單位人凝血酶凍干粉的組分比，將人凝血酶 凍干粉置于無菌的10%氯化鈣溶液中配制成人凝血酶溶液；(3)、分離培養(yǎng)脂肪干細(xì)胞(ASCs)在無菌條件下抽取脂肪，浸于生理鹽水中，于抽取后池內(nèi)在超凈工作臺中，用2倍 體積的PBS緩沖液(PBS-T)沖洗3次，以除去血液、油脂，然后將組織剪碎，加入等體積的 1% I型膠原酶，混勻后于37°C恒溫?fù)u床振蕩消化60分鐘，1000r/min離心8分鐘，吸除表 面漂浮油脂、脂肪組織及液體，將沉積于管底的物質(zhì)接種于25cm2培養(yǎng)瓶中，加入α -MEM培 養(yǎng)基(含10%胎牛血清，雙抗)，置入37°C、飽和濕度、5% CO2的孵箱中培養(yǎng)，3天后加 2ml液，7天后換液，清除未貼壁的細(xì)胞及組織塊。原代細(xì)胞培養(yǎng)15 20d即可融合。細(xì)胞 長滿80%時，以0. 25%胰酶消化、傳代。傳代細(xì)胞繼續(xù)加入α -MEM培養(yǎng)基，置入37°C、飽和 濕度、5% CO2的孵箱中培養(yǎng)，倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞生長情況，每3天換一次液。待細(xì) 胞生長至60%時，可以0. 25%胰酶消化、離心、收集底部沉積的脂肪干細(xì)胞待用。0)、制備脂肪顆粒在無菌條件下抽取脂肪，采用2倍體積的生理鹽水沖洗3次，以去除血液、水分、油 脂等，通過1000轉(zhuǎn)/分鐘低速離心2分鐘，進(jìn)一步去除血液、油脂等成分，得到純凈的脂肪 顆粒；(5)、混合、制得復(fù)合脂肪顆粒將上述各步驟制得的富含血小板血漿(PRP)、人凝血酶溶液、脂肪干細(xì)胞(ASCs)、 脂肪顆粒按照anl Iml Q±0.5)X107個的比例充分混合均勻，即得所述的復(fù)合脂肪顆粒。實施例3本實施例復(fù)合脂肪顆粒(簡稱PA脂肪)由富含血小板血漿、人凝血酶溶液、脂肪 干細(xì)胞、脂肪顆粒按照下述比例組成2ml富含血小板血漿Iml人凝血酶溶液0士0.幻X IO7個脂肪干細(xì)胞^il 脂肪顆粒；其中富含血小板血漿中的血小板濃度為(1300. 00士400. 00) X 109/L ；人凝血酶溶液的組分比例為1ml蒸餾水0. Ig氯化鈣1200單位人凝血酶凍干粉。本實施例PA脂肪通過包括下述步驟的方法制得(1)、制備富含血小板血漿(PRP)抽取抗凝全血，通過兩次離心法得到富含血小板血漿(PRP)，方法如下用預(yù)先裝有0.5ml 3. 8%枸櫞酸三鈉抗凝劑的5ml注射器，抽取4. 5ml全血，搖勻， 移入離心管中，進(jìn)行兩次離心。第一次離心速度為lOOOr/min，時間為15分鐘。離心后血 液分為三層最上層為血漿層、中間層包括血小板和白細(xì)胞(棕黃層)、最下層為紅細(xì)胞層。 棄去最下層的紅細(xì)胞，吸取上層和中間層至另一離心管，進(jìn)行二次離心，速度為2000r/min， 時間為15分鐘，棄去最上層的大部分血漿，剩余約0. 5ml液體，將其搖勻，即得到PRP。PRP制備全過程嚴(yán)格無菌。(2)、制備人凝血酶溶液按照Iml蒸餾水0. Ig氯化鈣1200單位人凝血酶凍干粉的組分比，將人凝血 酶凍干粉置于無菌的10%氯化鈣溶液中配制成人凝血酶溶液；(3)、分離培養(yǎng)脂肪干細(xì)胞(ASCs)在無菌條件下抽取脂肪，浸于生理鹽水中，于抽取后池內(nèi)在超凈工作臺中，用2倍 體積的PBS緩沖液(PBS)沖洗3次，以除去血液、油脂，然后將組織剪碎，加入等體積的
I型膠原酶，混勻后于37°C恒溫?fù)u床振蕩消化60分鐘，1000r/min離心8分鐘，吸除表面漂 浮油脂、脂肪組織及液體，將沉積于管底的物質(zhì)接種于25cm2培養(yǎng)瓶中，加入α -MEM培養(yǎng)基 (含10%胎牛血清，雙抗)，置入37°C、飽和濕度、5% CO2的孵箱中培養(yǎng)，3天后加2ml 液，7天后換液，清除未貼壁的細(xì)胞及組織塊。原代細(xì)胞培養(yǎng)15 20d即可融合。細(xì)胞長滿 80%時，0. 25%胰酶消化、傳代。傳代細(xì)胞繼續(xù)加入α -MEM培養(yǎng)基，置入37°C、飽和濕度、 5% CO2的孵箱中培養(yǎng)，倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞生長情況，每3天換一次液。待細(xì)胞生 長至60%時，可以0. 25%胰酶消化、離心、收集底部沉積的脂肪干細(xì)胞待用。0)、制備脂肪顆粒在無菌條件下抽取脂肪，采用2倍體積的生理鹽水沖洗3次，以去除血液、水分、油 脂等，通過1000轉(zhuǎn)/分鐘低速離心2分鐘，進(jìn)一步去除血液、油脂等成分，得到純凈的脂肪 顆粒；(5)、混合、制得復(fù)合脂肪顆粒將上述各步驟制得的富含血小板血漿(PRP)、人凝血酶溶液、脂肪干細(xì)胞(ASCs)、 脂肪顆粒按照anl Iml Q±0.5)X107個的比例充分混合均勻，即得所述的復(fù)合脂肪顆粒。實施例4將實施例1制得的復(fù)合脂肪顆粒用于動物脂肪移植試驗，同時設(shè)置對照組，以考 察本發(fā)明復(fù)合脂肪顆粒用于移植后的成活率、吸收率等情況。1.試驗方法設(shè)計1個試驗組(A組-實施例1復(fù)合脂肪顆粒組)、3個對照組(B組-脂肪干細(xì) 胞復(fù)合富含血小板血漿組、C組-脂肪顆粒復(fù)合脂肪干細(xì)胞組、D組-純凈脂肪顆粒組)，按 照下述方法分別將相應(yīng)的移植物移植于動物體內(nèi)，進(jìn)行效果的對比分析動物實驗中，采用10只裸鼠，在其背部劃分出A、B、C、D四個區(qū)域(圖1)，分別植 入本發(fā)明復(fù)合脂肪顆粒(A組)、PRP+ASCs (B組)、脂肪顆粒+ASCs (C組)、純凈脂肪顆粒(D 組)。每只裸鼠每個部位的移植量為0.細(xì)1。將10只裸鼠隨機(jī)分為5組，分別于移植后7、 15、30、60、90天時分別各處死2只，進(jìn)行移植物成活及血管生成的大體觀察(圖幻，并游離 后測量體積(圖幻，最后固定常規(guī)HE切片觀察，對記錄的移植物體積行統(tǒng)計學(xué)分析。2.試驗結(jié)果結(jié)果顯示復(fù)合脂肪顆粒移植后可以在早期迅速建立血供，并在移植后期保持移植 物的一定體積和移植脂肪細(xì)胞及細(xì)胞間質(zhì)的形態(tài)正常。結(jié)果顯示，移植7天時可以在發(fā)明的復(fù)合脂肪顆粒組見到明顯的血管生成(圖 4)。在對照純凈脂肪顆粒組僅能見到較少且纖細(xì)的血管(圖幻。對移植物體積(ml)的記 錄顯示沒有脂肪細(xì)胞的B組吸收接近100%，而發(fā)明的復(fù)合脂肪顆粒組在90天時吸收率為 21.3%，在四組中吸收最少(見下表)。移植物體積的變化表
權(quán)利要求
1.一種復(fù)合脂肪顆粒，由富含血小板血漿、人凝血酶溶液、脂肪干細(xì)胞、脂肪顆粒按照 下述比例組成2ml富含血小板血漿Iml人凝血酶溶液0士0.幻X 107個脂肪干細(xì)胞脂肪顆粒。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的復(fù)合脂肪顆粒，其特征在于所述的富含血小板血中，血小板 濃度為(1300. 00 士400. 00) X 109/L。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的復(fù)合脂肪顆粒，其特征在于所述的人凝血酶溶液的組分比 例為Iml蒸餾水0. Ig氯化鈣800 1200單位人凝血酶凍干粉。
4.權(quán)利要求1-3中任一項所述的復(fù)合脂肪顆粒的制備方法，包括下述主要步驟 (1)、制備富含血小板血漿抽取抗凝全血，通過兩次離心法得到富含血小板血漿； O)、制備人凝血酶溶液按照Iml蒸餾水0. Ig氯化鈣800 1200單位人凝血酶凍干粉的組分比，將人凝 血酶凍干粉置于無菌的10%氯化鈣溶液中配制成人凝血酶溶液； (3)、分離培養(yǎng)脂肪干細(xì)胞在無菌條件下抽取脂肪，采用組織塊培養(yǎng)法或消化培養(yǎng)法分離培養(yǎng)脂肪干細(xì)胞； G)、制備脂肪顆粒在無菌條件下抽取脂肪，去除血液、水分、油脂，得到純凈的脂肪顆粒； (5)、混合、制得復(fù)合脂肪顆粒將上述各步驟制得的富含血小板血漿、人凝血酶溶液、脂肪干細(xì)胞、脂肪顆粒按照 2ml Iml O±0.5)X107個的比例充分混合均勻，即得到本發(fā)明所述的復(fù)合脂肪顆粒。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的制備方法，其特征在于所述的步驟(1)制備富含血小板血 漿的方法如下用預(yù)先裝有0. 5ml 3. 8%枸櫞酸三鈉抗凝劑的5ml注射器，抽取4. 5ml全血，搖勻，移入 離心管中，進(jìn)行兩次離心第一次離心速度為lOOOr/min，時間為15分鐘，離心后血液分為 三層最上層為血漿層、中間層包括血小板和白細(xì)胞、最下層為紅細(xì)胞層；棄去最下層的紅 細(xì)胞，吸取上層和中間層至另一離心管，進(jìn)行二次離心，速度為2000r/min，時間為15分鐘， 棄去最上層的大部分血漿，將剩余液體搖勻，即得。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的制備方法，其特征在于所述的步驟(3)分離培養(yǎng)脂肪干細(xì) 胞的方法如下在無菌條件下抽取脂肪，浸于生理鹽水中，于抽取后池內(nèi)在超凈工作臺中，用2倍體 積的PBS緩沖液沖洗至少3次，以除去血液、油脂，然后將組織剪碎，加入等體積的I型 膠原酶，混勻后于37°C恒溫?fù)u床振蕩消化60分鐘，1000r/min離心8分鐘，吸除表面漂浮 油脂、脂肪組織及液體，將沉積于管底的物質(zhì)接種于25cm2培養(yǎng)瓶中，加入α -MEM培養(yǎng)基， 置入37oC、飽和濕度、5% C02的孵箱中培養(yǎng)，3天后加2ml培養(yǎng)基，7天后換培養(yǎng)基，清除未 貼壁的細(xì)胞及組織塊，原代細(xì)胞培養(yǎng)15 20d即可融合；細(xì)胞長滿80%時，用0. 25%胰酶 消化、傳代；傳代細(xì)胞繼續(xù)加入α -MEM培養(yǎng)基，置入37oC、飽和濕度、5% C02的孵箱中培養(yǎng)，倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞生長情況，每3天換一次培養(yǎng)基。待細(xì)胞生長至60%時，以 0. 25%胰酶消化、離心、收集底部沉積的脂肪干細(xì)胞，即得。
7.根據(jù)權(quán)利要求4所述的制備方法，其特征在于所述的步驟(4)制備脂肪顆粒的方 法如下在無菌條件下抽取脂肪，采用2倍體積的生理鹽水沖洗至少3次，去除血液、水分、油 脂，通過1000轉(zhuǎn)/分鐘低速離心2分鐘，進(jìn)一步去除血液、水分、油脂，即得。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種復(fù)合脂肪顆粒及其制備方法，該復(fù)合脂肪顆粒由富含血小板血漿、人凝血酶溶液、脂肪干細(xì)胞、脂肪顆粒按照下述比例組成2ml富含血小板血漿∶1ml人凝血酶溶液∶(2±0.5)×107個脂肪干細(xì)胞∶4ml脂肪顆粒。該復(fù)合脂肪顆?？商岣咭浦埠笾镜某苫盥省⒉p少遠(yuǎn)期吸收率，且不會出現(xiàn)異位纖維化結(jié)節(jié)形成等情況。
文檔編號A61L27/54GK102058905SQ200910309940
公開日2011年5月18日 申請日期2009年11月18日 優(yōu)先權(quán)日2009年11月18日
發(fā)明者劉磊, 湯煒, 王杭, 田衛(wèi)東, 郭麗娟, 龍潔 申請人:四川大學(xué)