專利名稱：修飾的Cpn10以及PRR信號的制作方法
技術(shù)領域：
本發(fā)明涉及修飾的伴侶蛋白10多肽，并且涉及編碼它的核酸。本發(fā)明進一步涉 及伴侶蛋白10的突變體并且涉及包括此類多肽的組合物。發(fā)明背景 哺乳動物伴侶蛋白IO(CpnlO)，也稱作熱休克蛋白10 (HsplO)以及早孕因子 (EPF),典型的特征為涉及與伴侶蛋白60 (Cpn60)—起進行蛋白折疊的一種線粒體“分子 伴侶”蛋白，伴侶蛋白60 (Cpn60)也稱作熱休克蛋白60 (Hsp60)。CpnlO與Cpn60分別 是細菌蛋白GroES與GroEL的同系物。GroES與CpnlO各自寡聚成為7元環(huán)，它們作為 一個蓋子分別結(jié)合到一個桶樣結(jié)構(gòu)上，該桶樣結(jié)構(gòu)包括14個GroEL或7個Cpn60分子， 這些分子將變性蛋白束成復合物(Bukau andHorwich，1998，Cell 92 351-366 ； Hartl and Hayer-Hartl, 2002，Science295 1852-1858)。CpnlO蛋白在種間是高度保守的。人CpnlO與牛、犬、綿羊以及豬的CpnlO是 100%完全相同的，并且與大鼠的CpnlO僅在一個單獨的氨基酸位置上有差異。人CpnlO 與大腸桿菌的GroES共享38%序列一致性(60%相似性)。CpnlO/GroES蛋白是圓頂形 的7聚環(huán)，其中每個單體基本上包括3個不同的結(jié)構(gòu)區(qū)，一個內(nèi)核的反平行的桶形 區(qū)，側(cè)面為一個“頂部” β-發(fā)夾環(huán)形區(qū)以及一個“移動環(huán)形”區(qū)。每個單體的反平行 的β-桶形區(qū)形成一個圓頂?shù)膬?nèi)核并且當裝配成七聚體時，每個單體的β-發(fā)夾環(huán)形成該 圓頂?shù)捻敳?。在每個單體中，該移動環(huán)區(qū)位于相對于該頂環(huán)的該β-桶形的相對端。該 反平行的桶形區(qū)的一個區(qū)段形成該空腔的一個向內(nèi)的較低的邊緣區(qū)。該較低的邊緣 區(qū)包含多個種系發(fā)育保守的氨基酸，包括在位置75的一個酪氨酸(Υ75)。除了作為一種分子伴侶的它的細胞內(nèi)角色，還經(jīng)常在細胞表面(參見Belleset al.，1999，Infect Immun 67 4191-4200)以及在細胞外流體中(參見 Shin et al.，2003，J Biol Chem 278 7607-7616)發(fā)現(xiàn)CpnlO，并且CpnlO被越來越多地認作具有治療炎性疾 病潛力的一種免疫應答的調(diào)節(jié)劑。因此，近來已經(jīng)在治療患有類風濕性關節(jié)炎(Vanags et al丄ancet2006，368 855-863)和牛皮癬(Williams et al.Arch.Dermatol.2008, 144 683-685)的人類患者中證實了 CpnlO的療效和安全性。然而，仍然不清楚在CpnlO分子中負責介導該免疫調(diào)節(jié)活性的位點。本發(fā)明涉 及這樣的發(fā)現(xiàn)，即CpnlO的修飾影響CpnlO的免疫調(diào)節(jié)活性，特別是在結(jié)合模式識別受 體(PRR)的配體中它的作用，這些模式識別受體(PRR)例如Toll樣受體(TLR)、結(jié)合 核苷酸的結(jié)構(gòu)域含LRR家族(NLR)，RIG-I樣受體(RLR)，IRF的DNA依賴性激活劑 (DAI)，C型凝集素受體(CLR)或IFI20X/IFI16家族的一個成員(例如Ifil6、Aim2、 MNDA 以及 IFIX)。發(fā)明概述根據(jù)本發(fā)明的第一個方面，在此提供了一種分離的CpnlO多肽，與Ala-CpnlO 多肽(SEQ ID No: 3)相比該多肽具有對于一種基于核酸的PRR配體增加的親和性。該PRR可以是一種Toll樣受體(TLR)、結(jié)合核苷酸的結(jié)構(gòu)域含LRR家族(NLR)、RIG-I樣受體(RLR)，IRF的DNA依賴性激活劑(DAI)、C型凝集素受體(CLR) 或 IFI20X/IFI16 家族的一個成員(例如 Ifil6、Aim2、MNDA 以及 IFIX)。該TLR可以選自下組，其構(gòu)成為TLR3、TLR7、TLR8或TLR9中的至少一種。
在一個實施方案中該TLR可以是TLR9。 該配體可以是一種激動劑或拮抗劑。在一個實施方案中，所述多肽與Ala-Cpnio 多肽相比具有更多的凈正電荷。與野生型CpnlO多肽相比，分離的多肽可以進一步包括在N端的甘氨酸(G)處 的一個氨基酸插入。該多肽可以是自然衍生的、重組生產(chǎn)的或合成生產(chǎn)的。該CpnlO可 以來自真核生物。該多肽可以來自哺乳動物。該多肽可以是人CpnlO。在另一個實施方案中，該分離的多肽具有Ala-CpnlO分子的至少一個突變。該 突變可以是一種氨基酸取代、加入或缺失或它們的一種組合。取代可以是用一個或多個 正電荷殘基代替一個或多個氨基酸殘基。在另一個實施方案中，可以用一個中性的或正 電荷的殘基代替一個或多個負電荷殘基。突變加入可以是加入一個或多個正電荷殘基。 突變?nèi)笔Э梢允侨コ粋€或多個負電荷殘基。在另一個實施方案中，可以用一種正電荷殘基代替一種中性殘基。該正電荷殘 基可以是精氨酸(R)，賴氨酸(K)或組氨酸(H)。該中性殘基可以是天冬酰胺(N)、谷 氨酰胺(Q)、絲氨酸(S)、蘇氨酸(T)、甘氨酸(G)、丙氨酸(A)、纈氨酸(V)、亮氨酸 (L)、異亮氨酸⑴、脯氨酸(P)、苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W)、半胱氨酸 (C)、甲硫氨酸(M)或H。注意，組氨酸具有大約6.5的pKa，因此在pH 7.4 (例如細胞 外環(huán)境)下它將大約11%電離，并且在pH6.0(例如包含TLR3、TLR7、TLR8以及TLR9 的溶酶體內(nèi)區(qū)室)下大約76%電離。在另一個實施方案中，至少一個突變位于N端、β-桶、移動環(huán)、頂環(huán)、C端， 或野生型CpnlO分子的這三個連接環(huán)的任何一個或它們的任意組合。在又一個實施方案中，該多肽包括在一個氨基酸位置上的一種突變，該氨基酸 位置選自下組，其構(gòu)成為野生型CpnlO分子的位置1至7、9、12至14、16、18至42、 44、46、50、52 至 63、65 至 69、73 至 79、81、83 至 89、91 至 94、96、98、100 以及 101或它們的任意組合。在另一個實施方案中，所述多肽包括選自下組一種突變，該組的構(gòu)成為 Al (K、R 或 H)、G2(K、R 或 H)、Q3 (K、R 或 H)、A4(K、R 或 H)、F5 (K、R 或 H)、R6(K 或 H)、K7(R 或 H)、L9 (K、R 或 H)、F12(K、R 或 H)、D13(K、R、H、 N、Q、G、A、V、L、I、P、F、Y、W、C、Μ、S 或 Τ)、R14(K 或 H)、L16(K、R 或 H)、E18(K、R、H、N、Q、G、A、V、L、I、P、F、Y、W、C、M、S 或 T)、 R19(K 或 H)、S20(K、R 或 H)、A21(K、R 或 H)、A22 (K、R 或 H)、E23(K、R、 H、N、Q、G、A、V、L、I、P、F、Y、W、C、M、S 或 Τ)、T24(K、R 或 H)、 V25(K、R 或 H)、T26(K、R 或 H)、R27 (K 或 H)、G28(K、R 或 H)、G29(K、R 或 H)、130 (K、R 或 H)、M31(K、R 或 H)、L32 (K、R 或 H)、P33 (K、R 或 H)、E34(K、 R、H、N、Q、G、A、V、L、I、P、F、Y、W、C、M、S 或 Τ)、K35 (R 或 H)、 S36(K、R 或 H)、Q37(K、R 或 H)、G38 (K、R 或 H)、K39 (K、R 或 H)、V40 (K、R 或 H)、L41(K、R 或 H)、Q42(K、R 或 H)、T44(K、、R 或 H)、、V46 (K、R 或 H)、S50(K、R 或 H)、S52(K、R 或 H)、K53 (R 或 H)、G54(K、R 或 H)、K55 (R 或 H)、 G56(K、R 或 H)、G57(K、R 或 H)、E58 (K、R、H、N、Q、G、A、V、L、I、P、
F、Y、W、C、Μ、S或 Τ)、159 (K、R 或 H)、Q60 (K、R 或 H)、P61(K、R 或 H)、 V62(K、R 或 H)、S63(K、R 或 H)、K65 (R 或 H)、V66(K、R 或 H)、G67 (K、R 或 H)、D68(K、R、H、N、Q、G、A、V、L、I、P、F、Y、W、C、Μ、S 或 Τ)、 K69(R 或 H)、P73(K、R 或 H)、E74(K、R、H、N、Q、G、A、V、L、I、P、F、 Y、W、C、M、S 或 T)、Y75(E、GK、K、R 或 H)、G76 (K、R 或 H)、G77 (K、R 或 H)、T78(K、R 或 H)、K79(R 或 H)、V81(K、R 或 H)、D83(K、R、H、N、Q、
G、A、V、L、I、P、F、Y、W、C、M、S或 T)、D84(K、R、H、N、Q、G、A、 V、L、I、P、F、Y、W、C、M、S 或 Τ)、K85 (K、R 或 H)、D86 (K、R、H、N、 Q、G、A、V、L、I、P、F、Y、W、C、M、S 或 Τ)、Y87 (K、R 或 H)、F88(K、 R 或 H)、L89(K、R 或 H)、R91(K 或 H)、D92 (K、R、H、N、Q、G、A、V、L、 I、P、F、Y、W、C、M、S 或 T)、G93(K、R 或 H)、D94(K、R、H、N、Q、G、 A、V、L、I、P、F、Y、W、C、M、S 或 T)、L96 (K、R 或 H)、K98 (R 或 H)、 VlOO (K、R 或 H)、DlOl (K、R、H、N、Q、G、A、V、L、I、P、F、Y、W、C、 M、S 或 T)、MH-CpnlO、MR-CpnlO, MK-CpnlO, MKK-CpnlO, MKKK-CpnlO, Ala-Cpnl0-K21、Ala_CpnlO_KK21、Ala_CpnlO_K39、Ala_CpnlO_KK39、 Ala-Cpnl0-K57、Ala_CpnlO_KK57、Ala_CpnlO_K76、Ala_CpnlO_KK76、 Ala-Cpn 10-K85、Ala_CpnlO_KK85、Ala_Cpnl0-K102、Ala_Cpnl0-KK102、AD13、 ΔΕ18、ΔΕ23、ΔΕ34、ΔΕ58、ΔΕ68、ΔΕ74、AD83、AD84、AD86、AD92、 AD94以及ADlOl或它們的組合。在另一實施方案中，該突變位于N端，如在表2中所定義。該突變可以是一種 插入。例如，在該N端的該插入選自下組，其構(gòu)成為ΜΗ、MK、MKK、MKKK以及 MR,如分別在 SEQ ID Nos 307、313、316、319 以及 310 中所列出。此外，該CpnlO多肽可以包括取代Q3K或K7R，如分別在SEQ IDNos.37或10
中所列出。在另一實施方案中，該突變位于移動環(huán)，如在表2中所定義。該突變可以是一 種缺失。該缺失可以是E23或E34如在SEQ ID Nos 199以及202中所列出。該突變 可以是一種插入。該插入可以是K21或KK21，如在SEQ ID Nos 322以及325中所列 出。該突變可以是一種取代。例如，該取代選自下組，其構(gòu)成為A22K、E23Q、T24K、 K27R、G29K、M31K、E34K、E34Q、Q37K,如在 SEQ ID Nos 16、64、67、70、 73、76、79、265以及268中所列出。在此還提供一種分離的CpnlO寡聚體，該寡聚體包括7個CpnlO單體，其中兩個 或多個單體彼此共價連接。在該CpnlO七聚體中在一個單體的C端與鄰近的單體的N端 之間形成共價鍵。用于形成一種共價鍵的該C端和N端可以通過加入一個或多個氨基酸 (例如Ala-CpnlO或Gly-CpnlO)而加長，或通過去除一個或多個氨基酸而縮短。例如， 該分離的CpnlO多肽是在SEQ ID NO 355中列出的共價的CpnlO。在另一個實施 方案中，該共價鍵七聚體中的每一個單體可以包含選自下組的一 個或多個突變，該組的構(gòu)成為Al (K、R或H)、G2(K、R或H)、Q3 (K、R或H)、A4(K、R 或 H)、F5(K、R 或 H)、R6(K 或 H)、K7(R 或 H)、L9 (K、R 或 H)、F12(K、 R 或 H)、D13(K、R、H、N、Q、G、A、V、L、I、P、F、Y、W、C、Μ、S 或 Τ)、 R14(K 或 H)、L16(K、R 或 H)、E18(K、R、H、N、Q、G、A、V、L、I、P、F、 Y、W、C、M、S 或 T)、R19(K 或 H)、S20 (K、R 或 H)、A21(K、R 或 H)、A22 (K、 R 或 H)、E23(K、R、H、N、Q、G、A、V、L、I、P、F、Y、W、C、M、S 或 Τ)、T24(K、R 或 H)、V25(K、R 或 H)、T26 (K、R 或 H)、R27 (K 或 H)、G28(K、 R 或 H)、G29(K、R 或 H)、130 (K、R 或 H)、M31(K、R 或 H)、L32 (K、R 或 H)、 P33(K、R 或 H)、E34(K、R、H、N、Q、G、A、V、L、I、P、F、Y、W、C、Μ、S 或 Τ)、K35(R 或 H)、S36(K、R 或 H)、Q37 (K、R 或 H)、G38(K、R 或 H)、K39 (K、 R 或 H)、V40(K、R 或 H)、L41(K、R 或 H)、Q42 (K、R 或 H)、T44 (K、R 或 H)、 V46(K、R 或 H)、S50(K、R 或 H)、S52 (K、R 或 H)、K53 (R 或 H)、G54(K、R 或 H)、K55(R 或 H)、G56(K、R 或 H)、G57 (K、R 或 H)、E58 (K、R、H、N、Q、G、 A、V、L、I、P、F、Y、W、C、M、S 或 T)、159 (K、R 或 H)、Q60 (K、R 或 H)、 P61(K、R 或 H)、V62(K、R 或 H)、S63 (K、R 或 H)、K65 (R 或 H)、V66 (K、R 或 H)、G67(K、R 或 H)、D68(K、R、H、N、Q、G、A、V、L、I、P、F、Y、W、 C、Μ、S 或 Τ)、K69(R 或 H)、P73 (K、R 或 H)、E74(K、R、H、N、Q、G、A、 V、L、I、P、F、Y、W、C、M、S 或 T)、Y75(E、GK、K、R 或 H)、G76 (K、R 或 H)、G77(K、R 或 H)、T78(K、R 或 H)、Κ79 (R 或 H)、V81(K、R 或 H)、D83 (K、 R、H、N、Q、G、A、V、L、I、P、F、Y、W、C、Μ、S 或 Τ)、D84(K、R、H、 N、Q、G、A、V、L、I、P、F、Y、W、C、M、S 或 Τ)、K85 (K、R 或 H)、D86 (K、 R、H、N、Q、G、A、V、L、I、P、F、Y、W、C、M、S 或 Τ)、Y87 (K、R 或 H)、 F88(K、R 或 H)、L89(K、R 或 H)、R91(K 或 H)、D92 (K、R、H、N、Q、G、A、 V、L、I、P、F、Y、W、C、M、S 或 T)、G93 (K、R 或 H)、D94(K、R、H、N、 Q、G、A、V、L、I、P、F、Y、W、C、M、S 或 T)、L96 (K、R 或 H)、K98 (R 或 H)、VlOO (K、R 或 H)、DlOl (K、R、H、N、Q、G、A、V、L、I、P、F、Y、W、 C、M、S 或 T)、MH-CpnlO、MR-CpnlO, MK-CpnlO, MKK-CpnlO, MKKK-CpnlO, Ala-Cpn 10-K21、Ala-Cpn 10-KK2 U Ala-Cpn 10-K39, Ala-Cpn 10-KK39, Ala-Cpn 10-K57、Ala-Cpn 10-KK57、Ala-Cpn 10-K76、Ala-Cpn 10-KK76、Ala_CpnlO_K85、 Ala-Cpn 10-KK85、Ala_Cpnl0-K102、Ala_Cpnl0-KK102、AD13、ΔΕ18、ΔΕ23、 ΔΕ34、ΔΕ58、ΔΕ68、ΔΕ74、AD83、AD84、AD86、AD92、AD94 以及 ADlOl 或它們的組合。在另一實施方案中，該突變位于如在表2中所定義的β-桶中。至少一 個突變可以是一種取代。該取代可以是L9K、F12K、D13K、D13N、Ε18Α、Ε18Κ、 Ε18Μ、E18Q, E18S、E18R、R19K、S20K、L41K、Q42K> T44K、S50K、S50R、 V66K、D68K、D68N、K69R、P73K、G77K、T78K、K85R、D86K、D86N、D86R、 Y87K、F88K、L89K、D92K、D92N、G93K、D94A、D94K、D94M、D94N、D94R、 D94S、L96K、K98R 或 V100K，如在 SEQ ID Nosl3、25、28、31、46、49、52、55、 58、 61、 58、 61、 85、 88、 91、 94、 97、 118、 121、 124、 145、 148、 160、 163、 166、 169、 172、 175、 178、 181、 184、 187、 190、 217、 244、 250、 253、 256、 259、 262、 274、286、289、292、295、298、301 中所列出。
在另一實施方案中，該突變位于如在表2中所定義的頂環(huán)中。該突變可以是 一種插入。該插入可以是K57或KK57，如在SEQ ID Nos: 334或337中所列出。該 突變可以是一種缺失。該缺失可以是如SEQ ID Nos 205中列出的E58。該突變可以 是一種取代，例如該分離的 CpnlO 多肽是 X-CpnlO-K53E、Ala_CpnlO_S52K、G54K、 K55R、G56K、E58K、E58Q、Q60K、P61K,如在 SEQ.ID Nos 6、22、100、103、 106、109、112、115、271中所列出。在另一個實施方案中，該分離的CpnlO多肽包括 在頂環(huán)中在野生型CpnlO多肽的氨基酸序列的氨基酸殘基位置53和/或55上的一個或多 個氨基酸取代。例如，分離的CpnlO多肽可以是如由在SEQ.ID No 8中列出的序列編 碼的 Ala-CpnlO-K53M，K55M。在另一實施方案中，該突變位于如在表2中所定義的連接環(huán)Ll中。該突變可以 是一種插入。該插入可以是如在SEQ ID Nos 328或331中所列出的K39或KK39。該 突變可以是一種取代。例如，該取代選自下組，其構(gòu)成為如在SEQ ID Nos: 19或82 中列出的K39R或V40K。在另一實施方案中，該突變位于如在表2中所定義的連接環(huán) 2(較低的邊緣區(qū))中。該突變可以是一種插入。該插入可以是如在SEQ ID Nos: 340 中所列出的K76。該突變可以是一種取代。該取代可以是如在SEQID No: 130中列出 的X-CpnlO-Y75K或如在SEQIDNos: 127、133、136、139、142、238 或 277 中列出的 Ala-Cpn 10-E74K、Y75H、Y75K、Y75R、Y75GK 或 G76K。該突變可以是一種缺失。 該缺失可以是如在SEQ ID Nos 208中列出的E74。在另一實施方案中，該突變位于如在表2中所定義的連接環(huán)3中。該突變可以 是一種插入。該插入可以是如在SEQ ID Nos 343或346中所列出的K85或KK85。該 突變可以是一種取代。該取代可以是如SEQID Nos 151、154、157、280或283中列出 的V81K、D83K、D83N、D84K或D84N。該突變可以是一種缺失。該缺失可以是如 在 SEQ IDNos: 211 中列出的 D84。在另一實施方案中，該突變位于如在表2中所定義的C端。該突變可以是一種 插入。該插入可以是如在SEQ ID Nos 349或352中所列出的K102或KK102。該突變 可以是一種取代。該取代可以是如在SEQ IDNos 193、196或304中列出的D101K、 DlOlN 或 D101R。在另一個實施方案中，該多肽可以在CpnlO的一個或多個區(qū)域內(nèi)的任意一個位 置上包括至少2個突變，其中這些區(qū)域的構(gòu)成為如表2定義的N端、桶、移動環(huán)、 頂環(huán)、C端，或該野生型CpnlO分子的這三個連接環(huán)的任何一個。例如該CpnlO多肽 可以包括 Ala-CpnlO_F12K，D92K、E18K, DlOlK ； E34Q, Y75K ； Q42K, DlOlK ； T44K, DlOlK ； S50K, DlOlK ； Q60K, T78K ； E74K, Y75E ； Y75GK ； Y75G, G76K ； Y75K，D94K ； Y75K，D94N。這些多肽可以包括如在 SEQID Nos.214、217、 220、223、226、229、232、235、238、241、244、247 中列出的氨基酸序列。根據(jù)本發(fā)明的第二個方面，在此提供了編碼根據(jù)第一個方面的一種多肽的一種 分離的核酸。在一個實施方案中，該分離的核酸可以包括選自下組的一個核苷酸序列，該核 苷酸序列的構(gòu)成為SEQ ID Nos.7> 9、11、12、14、15、17、18、20、21、23、24、 26、 27、 29、 30、 32、 33、 35、 36、 38、 39、 41、 42、 44、 45、 47、 48、 50、 51、 53、54、56、 57、 59、60、62、 63、 65、 66、68,69、 71、 72、 74、75、77、 78、 80、 81、83、84, 86, 87、89、90,9 2 、 9 3 、 9 5、 96、98、99,101、102、104、105、107、108、110、111、113、114、116、117、119、120、122、123、125、126、128、129、131、132、134、135、137、138、140、141、143、144、146、147、149、150、152、153、155、156、158、159、161、162、164、165、167、168、170、171、173、174、176、177、179、180、182、183、185、186、188、189、191、192、194、195、197、198、200、201、203、204、206、207、209、210、212、213、215、216、218、219、221、222、224、225、227、228、230、231、233、234、236、237、239、240、242、243、245、246、248、249、251、252、254、255、257、258、260、261、263、264、266、267、269、270、272、273-.275、,276、278、279、281,282, 284, 285287,288、290、291、293、294、296、297、299、300、302、303、305、306、308、309、311、312、314、315、317、318、320、321、323、324、326、327、329、330、332、333、335、336、338、339、341、342、344、345、347、348、350、351、353、354或
356。根據(jù)本發(fā)明的第三個方面，在此提供了一種表達構(gòu)建體，它包括可操作地連接 到一個或多個調(diào)節(jié)序列的根據(jù)第二個方面的一種核酸。該核酸可以是一種密碼子優(yōu)化的CpnlO核酸。該密碼子優(yōu)化的核酸序列可以具有一個或多個核苷酸取代，這些取代增加了轉(zhuǎn) 移RNA池的利用，開發(fā)了更有效的終止密碼子，去除了 RNA二級結(jié)構(gòu)和/或不穩(wěn)定的元 件。根據(jù)本發(fā)明的第四個方面在此提供了一種宿主細胞，該宿主細胞表達了第一個 方面的一種多肽，或包括了第二個方面的一種核酸或第三個方面的一種表達構(gòu)建體。根據(jù)本發(fā)明的第五個方面，在此提供了一種抗體，該抗體選擇性地結(jié)合到第一 個方面的一種多肽上。根據(jù)本發(fā)明的第六個方面，在此提供了與第一個方面的一種多肽復合的一種促 炎性的核酸或免疫抑制的核酸。根據(jù)本發(fā)明的第七個方面在此提供了一種藥物組合物，它包括第一個方面的一 種多肽、第二個方面的一種核酸或第三個方面的一種表達構(gòu)建體或第五個方面的一種抗 體。根據(jù)本發(fā)明的第八個方面，在此提供了治療受試者的一種方法，包括向所述受 試者給予一個治療有效量的第一個方面的一種CpnlO多肽或第二個方面的一種核酸的步 驟。該治療可以調(diào)節(jié)受試者體內(nèi)的免疫應答。該免疫應答可以通過PRR信號的調(diào)整 來調(diào)節(jié)。根據(jù)本發(fā)明的第九個方面，在此提供了治療或預防受試者體內(nèi)的一種疾病、 障礙或病癥的一種方法，該方法包括向該受試者給予一個有效量的第一個方面的一種 CpnlO多肽或第二個方面的一種核酸。該疾病、障礙或病癥可以選自急性或慢性炎性疾病，如胰島素依賴型糖尿 病、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、斯耶格倫病、格雷夫斯病、多發(fā)性硬化癥、類風濕性關節(jié)炎、慢性疲乏綜合征、阿耳茨海默病、哮喘、過敏癥、GVHD、動脈粥樣硬化、炎性疼痛、牛 皮癬、HIV、慢性免疫激活、慢性肌炎、硬皮病；或癌癥如，非小細胞肺癌、腎細胞 癌、黑色素瘤、非何杰金氏淋巴瘤、結(jié)腸直腸癌、基底細胞癌；或一種傳染性疾病。該 傳染性疾病可以是一種細菌性、病毒性或真菌的感染的結(jié)果。在一個實施方案中，慢性免疫激活與細菌性和/或病毒產(chǎn)物從胃腸道漏泄到循 環(huán)系統(tǒng)中相關。例如，可以從口腔，腸或小腸發(fā)生漏泄。細菌性或病毒性產(chǎn)物的漏泄可 以由一種感染或疾病(如細菌感染、病毒感染、炎性腸病以及牙齦疾病)而引起。病毒 感染的一個例子是一種HIV或丙型肝炎感染。細菌性產(chǎn)物可以包括LPS或核酸。病毒 性產(chǎn)物可以包括核酸。在另一個實施方案中，慢性免疫激活涉及通過LPS或核酸結(jié)合到TLR上的TLR 信號的免疫調(diào)節(jié)。LPS結(jié)合到TLR4上，同時核酸可以結(jié)合到LR3、7、8或9上。根據(jù)本發(fā)明的第十個方面，在此提供用于在一位受試者體內(nèi)或在他的至少一個 細胞、組織或器官中調(diào)節(jié)PRR信號的一種方法，該方法包括給予一個治療有效量的第一 個方面的一種CpnlO多肽或第二個方面的一種核酸。根據(jù)本發(fā)明的第十一個方面，在此提供用于在一位受試者體內(nèi)或在他的至少一 個細胞、組織或器官中調(diào)節(jié)一種或多種免疫調(diào)節(jié)劑的生產(chǎn)和/或分泌一種方法，該方法 包括給予一個治療有效量的第一個方面的一種CpnlO多肽或第二個方面的一種核酸。該多肽通過結(jié)合一個PRR配體可以調(diào)節(jié)來自一個PRR的信號。該免疫調(diào)節(jié)劑可以是一種促炎細胞因子或趨化因子或一種抗炎細胞因子或趨 化因子。該細胞因子或趨化因子可以選自TNF-α、IL-U IL_6、RANTES> IL_10、 IL-17、IL-23、TGF-β或一種I型干擾素。該I型干擾素可以是IFNα、IFNβ或 IFNY。根據(jù)本發(fā)明的第十二個方面，在此提供用于在一位受試者體內(nèi)或在他的至少一 個細胞、組織或器官中抑制一種或多種免疫調(diào)節(jié)劑的生產(chǎn)和/或分泌一種方法，該方法 包括給予一個治療有效量的第一個方面的一種CpnlO多肽或第二個方面的一種核酸。該多肽通過結(jié)合一個PRR配體可以調(diào)節(jié)來自一個PRR的信號。該多肽到一個 PRR配體上的結(jié)合可以在具有該PRR的細胞上產(chǎn)生免疫調(diào)節(jié)影響。該細胞可以是一種抗 原呈遞細胞或一種T-細胞或一種B-細胞。該抗原呈遞細胞可以是一種樹突細胞、巨噬 細胞或單核細胞。該免疫調(diào)節(jié)劑可以是一種促炎細胞因子或趨化因子或一種抗炎細胞因子或趨 化因子。該細胞因子或趨化因子可以選自TNF-α、IL-U IL_6、RANTES> IL_10、 IL-17、IL-23、TGF-β或一種I型干擾素。該I型干擾素可以是IFNα、IFNβ或 IFNY。根據(jù)本發(fā)明的第十三個方面，在此提供鑒定一種化合物的一種方法，該化合物 結(jié)合到第一個方面的一種多肽上，該方法包括以下步驟(a)將一種候選化合物與所述多肽進行接觸；并且(b)檢測該候選化合物與所述多肽之間的一種復合物的形成。對于一種復合物的形成的檢測可以是一種競爭性結(jié)合測定、一種雙雜交測定、 凝膠過濾色譜法、AlphaScreen 高通量篩選、一種電泳遷移率(凝膠遷移)檢測和/或一種孑L板捕獲檢測(plate capture assay)。該測試可以是定性的或定量的。根據(jù)本發(fā)明的第十四個方面，在此提供篩選一種化合物的一種方法，該化合物 調(diào)節(jié)第一個方面的一種多肽的活性，該方法包括以下步驟(a)將所述多肽與一種候選化合物在適于能夠使所述候選化合物與所述多肽相互 作用的條件下進行接觸；并且(b)檢測所述多肽的活性。對于該多肽的活性的檢測可以包括加入一種標記底物并且測量該標記底物的變 化的一個步驟。根據(jù)本發(fā)明的第十五個方面，在此提供了篩選一種PRR配體的一種方法，該方 法包括以下步驟(a)將第一個方面的多肽與一種候選PRR配體化合物在適于能夠使所述候選化合 物與所述多肽相互作用的條件下進行接觸；并且(b)檢測與Ala-CpnlO相比所述化合物與所述多肽的增加的親和性；和/或(C)在候選PRR配體化合物以及第一個方面的多肽的存在下檢測減小的或增加的 PRR活化作用。本發(fā)明還考慮了根據(jù)上述方面或?qū)嵤┓桨傅脑摲蛛x的CpnlO多肽以及多核苷酸 的變體、衍生物、同系物、類似物以及片段。根據(jù)上述方面以及實施方案，該CpnlO多肽以及多核苷酸可以從任何動物 得到，可以使用重組DNA技術(shù)生成或可以合成生成。CpnlO可以是一種真核生物的 CpnlO。例如 CpnlO 是人 CpnlO。該野生型CpnlO分子或多肽可以是乙?；?CpnlO或X-CpnlO (SEQID No.l)。根據(jù)上述方面以及實施方案，一種CpnlO多肽的免疫調(diào)節(jié)活性可以涉及生成該 多肽的七聚體。該七聚體可以是以任意組合包括一種突變體或多種未突變的多肽。定義在本說明書的上下文中，術(shù)語“包括”是指“主要包括，但并非必須是僅包 括”。此外，單詞“包括”的各種變體，如“包括”以及“包括了”具有相應的含義。在此使用的與CpnlO分子或多肽相關的術(shù)語“野生型”包括天然的或非天然的 形式。例如，天然的人CpnlO在它的N端是乙酰化的。在術(shù)語野生型CpnlO的范圍內(nèi)， 本發(fā)明考慮如通過SEQ ID No.l表示的乙?；幕蚍且阴；?X-CpnlO)分子。術(shù)語“Ala-CpnlO”是指在大腸桿菌中生成的人CpnlO，其中生成具有一個額外 的N端丙氨酸殘基的CpnlO。Ala-CpnlO的序列作為SEQ IDNo.3而提出。術(shù)語“免疫調(diào)節(jié)劑”是指一種分子調(diào)節(jié)劑，該調(diào)節(jié)劑與免疫系統(tǒng)相互作用并且 它在一種免疫應答的激活、阻止、調(diào)節(jié)、維持、成熟、抑制、或放大中起作用。該免 疫調(diào)節(jié)劑可以是一種促炎細胞因子或趨化因子或一種抗炎細胞因子或趨化因子。該細 胞因子或趨化因子可以選自 TNF-α、IL-U IL-6、RANTES> IL-10、IL-17、IL-23、 TGF- β或一種I型干擾素。該I型干擾素可以是IFN α、IFN β或IFN Y。在此使用的術(shù)語“模式識別受體”或PRR是指幾種種系編碼的蛋白，包括Toll 樣受體(TLR)，結(jié)合核苷酸的結(jié)構(gòu)域含LRR家族(NLR)、RIG-I樣受體(RLR)，IRF的DNA依賴性激活劑(DAI)，C型凝集素受體(CLR)或IFI20X/1FI16家族的一個成員(例 如 Ifil6、Aim2、MNDA 以及 IFIX)(參見例如 Akira et al.，Cell2006, 124 783-801 ； Latz, E.and Fitzgerald, K. Α. (2008) Nat.Rev.Immunol. Vol.8, No.4, Poster)。通常，PRR
可以分成兩組基于核酸的PRR(通常位于細胞內(nèi))以及細胞表面PRR(通常識別疏水配 體)。PRR位于不同細胞類型上，這些細胞類型包括但不限于抗原呈遞細胞(例如樹突 細胞、單核細胞以及巨噬細胞)、T細胞以及B細胞。術(shù)語“Toll樣受體”或TLR是指與病原體相互作用并且啟動對感染的宿主免 疫應答的受體。在哺乳動物中，通過病原體的TLR的激活啟動了一種先天的免疫炎性 過程，該過程阻止了病原體的傳播，并且通過樹突細胞上的TLR指導了獲得性免疫的發(fā) 展。該TLR是由種系中有限數(shù)量的基因編碼的，在人中已知10個基因。這10個受體識 別廣泛多樣的來自病原體的分子特征標志，包括糖脂類如脂多糖，蛋白類如鞭毛蛋白， 以及核酸類如dsRNA。可以將TLR分成兩組通常識別疏水配體的細胞表面TLR以及 通常識別基于核酸的配體的細胞內(nèi)TLR(例如TLR-3、TLR-7、TLR-8以及TLR-9)。如在此使用的術(shù)語“調(diào)節(jié)”，“調(diào)節(jié)了”以及它們的變體是指與在缺少該調(diào)節(jié) 分子或試劑下其活性、生產(chǎn)、分泌或其他功能水平相比在存在一種本發(fā)明的特別的調(diào)節(jié) 分子或試劑下一個分子的活性、生產(chǎn)、分泌或功能水平的增加或降低。這些術(shù)語不隱含 定量的增加或減少。該調(diào)節(jié)可以是足以產(chǎn)生希望的結(jié)果的任何大小并且可以是直接的或 間接的。在此使用的術(shù)語“凈電荷”指一個分子的電荷。包含一個氨基酸序列的分子例 如蛋白、肽以及多肽(例如CpnlO多肽)可以或者是正電荷的或者是負電荷的。在一個 給定的pH下的一個多肽的凈電荷可以基于Henderson-Hasselbalch方程式(Hasselbalch， K.Α., 1917BiochemischeZeitschrift 78 112-144)以及可離子化的氨基酸側(cè)鏈的以及多肽 的N端和C端的已知的pKa值進行計算。在此使用的術(shù)語“更多的凈正電荷”是超過Ala-CpnlO的分子正電荷的增加。術(shù)語“移動環(huán)”是CpnlO分子的一個柔性區(qū)域，它包括18個氨基酸殘基。該 移動環(huán)包括殘基A21至G38(參見

圖1 ；殘基編號是基于如在此描述的或者乙?；幕蛘?非乙酰化的 X-CpnlO (SEQ ID No.l))。術(shù)語“頂環(huán)”是CpnlO分子的一個柔性區(qū)域，它包括14個氨基酸殘基。該頂 環(huán)包括殘基S52至V62(參見圖1 ；殘基編號是基于如在此描述的或者乙?；幕蛘叻且?酰化的 X-CpnlO (SEQ ID No.l))。如在此描述的“β-桶”是該CpnlO分子的一個區(qū)域，它包含5個片段，即第 一、第二、第三、第四以及第五片段。第一片段包括殘基F8至S20，第二片段包括L41 至G51，第三片段包括S63至Ρ73，第四片段包括G77至V80并且第五片段包括殘基Κ85 至V100 (參見圖1)。殘基編號是基于如在此描述的X-CpnlO (SEQ ID No.l)。術(shù)語“連接環(huán)”是指該CpnlO分子的柔性區(qū)域，它將CpnlO分子的不同的環(huán)(如 該移動環(huán)以及頂環(huán))連接到該β-桶上。有三種連接環(huán)，第一、第二以及第三種。第一 種連接環(huán)包括殘基Κ39至V40。第二種連接環(huán)包括Ε74至G76并且第三種環(huán)包括殘基 V81至D84(參見圖1)。殘基編號是基于如在此描述的X-CpnlO (SEQ ID No.l)。術(shù)語“N端”是在該CpnlO分子的N端的一個柔性區(qū)域，它包括殘基Al至K7 (參見圖1)。殘基編號是基于如在此描述的X-CpnlO (SEQ ID No.l)。術(shù)語“C端”包括該CpnlO分子的DlOl (參見圖1 ；殘基編號是基于如在此描 述的 X-CpnlO (SEQ ID No.l))。在此使用的術(shù)語“氨基酸”指含有胺以及羧基官能團兩者的任何分子。在此使用的術(shù)語“帶電荷的殘基”是指具有一種側(cè)鏈的任何氨基酸殘基，該側(cè) 鏈具有攜帶一個正電荷或負電荷的潛力。術(shù)語“多肽”是指通過肽鍵將氨基酸連接到一起構(gòu)成的一種聚合物。術(shù)語“多 肽”可以構(gòu)成一個全長蛋白的一部分。進一步地，術(shù)語“多肽”是指一種多肽，該多 肽與一種野生型CpnlO分子相比其氨基酸序列可以呈現(xiàn)至少一種修飾。該修飾可以包括 這些化學修飾技術(shù)，如泛素化、標記(例如用放射性核素或不同的酶)、共價聚合物連接 (如聚乙二醇化作用(從聚乙二醇衍生))以及通過化學合成氨基酸如鳥氨酸的插入或取 代，它們是自然發(fā)生在人蛋白中的。在此使用的術(shù)語“多核苷酸”是指脫氧核糖核苷酸、核糖核苷酸堿基或自然核 苷酸的已知類似物或它們的混合物的一種單鏈或雙鏈聚合物。除非另外說明，該術(shù)語包 括是指該特異性的序列、以及指與其互補的序列。術(shù)語“多核苷酸”以及“核酸”在 此是可交換地使用的。在此使用的術(shù)語“CpG”是指在DNA的區(qū)域內(nèi)的未甲基化位點，其中在堿基的 線性序列中沿著它的長度一個胞嘧啶核苷酸緊接一個鳥嘌呤核苷酸出現(xiàn)，并且通過一個 磷酸分開，該磷酸在DNA中將這兩個核苷連接在一起?！癈pG”用于將上述含義和與一 個鳥嘌呤配對的胞嘧啶堿基區(qū)別開。已經(jīng)識別了三種不同類型的CpG寡脫氧核苷酸，在 刺激抗原呈遞細胞的能力上它們存在差異CpG-A(人ODN-2216)在漿細胞樣樹突細胞 (PDC)中誘導大量的干擾素-α (IFN-α)以及IFN-β ； CpG_B (人ODN-2006以及小鼠 ODN-1826)誘導PDC成熟并且是B細胞的一種有效的激活劑但僅刺激少量的IFN- α和 IFN- β然而CpG-C (人ODN-M362)誘導B以及NK細胞并且誘導人外周血單核細胞的 IFN-α的生成。術(shù)語“分離的”指所討論的分子已經(jīng)從它的自然環(huán)境或宿主中取出，并且減少 或除去了相關的雜質(zhì)從而使所討論的分子成為存在的主要種類(例如在該組合物/樣品中 以摩爾計它比任何其他單獨的種類更豐富)。典型地，一種基本上純化的組分是一種組合 物，其中目標種類占存在的所有大分子種類的至少約30%。通常，一種基本上純的組合 物將占該組合物中存在的所有大分子種類的約80%-90%以上。最典型地，純化這些目 標種類從而使之基本上是均質(zhì)的(通過常規(guī)的檢測方法在該組合物中不能檢測出污染物 種類)其中該組合物基本上由一種單一的大分子種類構(gòu)成。在此使用的術(shù)語“基本上”指大多數(shù)但不必要是所有，并且因此與一種修飾的 多肽相關，該多肽“基本上”缺少相應的野生型多肽的一種組分區(qū)域，該修飾的多肽可 以保留該組分區(qū)域的一部分。例如，“基本上”缺少相應的野生型多肽的一種組分區(qū)域 的一種修飾的多肽可能保留約該組分區(qū)域的50%或以下的序列，盡管典型地由于缺失該 區(qū)域的序列的比例導致該組分區(qū)域結(jié)構(gòu)性和/或功能性失活。在此使用的術(shù)語“保守氨基酸取代”是指用具有類似結(jié)構(gòu)和/或化學性質(zhì)的另 一種氨基酸代替一種氨基酸?？梢曰谝环N或多種以下的相似性進行保守氨基酸取代
15極性、電荷、溶解度、疏水性、親水性、和/或涉及的殘基的兩親性的本質(zhì)。例如，非 極性(疏水)氨基酸包括丙氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、纈氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、酪氨 酸、色氨酸、半胱氨酸以及甲硫氨酸；極性不帶電荷的氨基酸包括甘氨酸、絲氨酸、蘇 氨酸、天冬酰胺、以及谷氨酰胺；極性帶正電荷(堿性)的氨基酸包括精氨酸、賴氨酸、 以及組氨酸；并且?guī)ж撾姾傻?酸性)氨基酸包括天冬氨酸以及谷氨酸。氨基酸“插 入”或“缺失”優(yōu)選地在約1至20個氨基酸的范圍內(nèi)，更優(yōu)選地在1至10個氨基酸的 范圍內(nèi)。通過使用重組DNA技術(shù)系統(tǒng)地在一種多肽分子中制備氨基酸的插入、缺失、或 取代并且測定得到的重組變體的活性可以實驗性地測定該變體。在此使用的術(shù)語“治療”，“治療了”以及它們的變體，是指任意一種或所有 的用途，它們治療一種疾病狀態(tài)或癥狀，預防疾病的形成，或其他地無論怎樣以任意一 種方式預防、阻止、延緩或逆轉(zhuǎn)疾病或其他不希望的癥狀的進程。在此使用的術(shù)語“有效量”在它的含義中包括一個無毒的但是足夠的量的一種 試劑或化合物以提供希望的治療或預防作用。所需要的確切的量將從受試者到受試者進 行改變，取決于以下因素如有待治療的物種，受試者的年齡以及總體健康情況，有待治 療的病癥的嚴重性，有待給予的具體的試劑以及給予的方式等。因此，不可能限定一個 精確的“有效量”。然而，對于任何給定的情況，本領域中普通技術(shù)人員僅使用常規(guī)的 實驗即可以確定一個適當?shù)摹坝行Я俊?。附圖簡要說明圖I.A.大腸桿菌CpnlO (GroES)的晶體結(jié)構(gòu)，顯示了 CpnlO的不同區(qū)域。CpnlO 包括7個完全相同的IOkDa亞基。B.顯示CpnlO以及GroES的氨基酸序列。從由Xu 等人(Nature 1997，388 741-750)公開的X射線晶體坐標生成GroES帶狀結(jié)構(gòu)，在該結(jié) 構(gòu)中，這些通常無序的移動環(huán)通過與GroEL(在該圖中省去GroEL)的相互作用而完全地 對齊。圖2.人CpnlO與來自多種生物界的CpnlO同系物的序列比對。與人CpnlO不同 的氨基酸被涂上陰影。指出了該移動環(huán)以及該發(fā)夾頂環(huán)的位置。盒子(標記為a到 e)指出該55殘基β-桶核心的預測的邊界(Hunt etal., 1997Cell 90 361-371。示出了相 對于人CpnlO不同的同系物的百分比一致性以及相似性。給出了每一種蛋白的SwissProt 登錄號。用 NCBI blast (Altschul et al.，1997Nucleic Acids Res.25 3389-3402)、NS =沒 有發(fā)現(xiàn)顯著的相似性進行與人CpnlO的序列％ —致性以及％相似性的計算。用ExPASy蛋 白質(zhì)組學月艮務器 ProtParam Tool (www.expasy.org/tools/protparam.html)計算等電點(pi)。圖3.用考馬斯亮藍染色的SDS-PAGE顯示重組的CpnlO蛋白是> 99%純的。圖4.在23°C下將lygTLR3激動劑聚(I:C)(一種合成的dsRNA類似物)與50yg CpnlO變體以及在指出的鹽濃度下在IOmM Tris-HCl (pH 7.6)中進行孵育1小時。將這些 樣品溶于TAE瓊脂糖凝膠并且用溴化乙錠染色。自由的CpnlO向負電極遷移(該凝 膠的頂部)而自由的聚(I:C)向正電極遷移(該凝膠的底部)，CpnlO-聚(I:C)的復合物 延緩了兩個分子兩者的移動。圖5.在 23°C下將 IygA ODN-2216 類別 A(TLR9 激動劑；Invivogen)與 50 μ g CpnlO在IOmM Tris-HCl (pH7.6)中以及在指出的鹽濃度下進行孵育15分鐘。將這些樣 品溶于TAE瓊脂糖凝膠并且用溴化乙錠染色。自由的CpnlO向負電極遷移(該凝膠的頂部)而自由的CpG-ODN向正電極遷移(該凝膠的底部)，CpnlO-CpG-ODN的復合 物延緩了兩個分子兩者的移動。圖 6.在 23 "C 下將 0.5 μ g 大腸桿菌 K12ssRNA (Invivogen Cat#tlri_ecma) (TLR7/8 激動劑)與50 μ g CpnlO變體在IOmM Tris-HCl (pH7.6)中并且在指出的鹽濃度下(O、150
以及500mM NaCl)進行孵育30分鐘。將這些樣品溶于1 % TAE瓊脂糖凝膠并且用溴化 乙錠染色。自由的CpnlO向負電極遷移(該凝膠的頂部)而自由的ssRNA向正電極遷移 (該凝膠的底部)，CpnlO-ssRNA的復合物延緩了兩個分子兩者的移動。圖7.CpnlO結(jié)合到CpG寡核苷酸(ODN)的定量分析在配制緩沖液 pH7.2 (Invitrogen)中以1 μ g/ μ 1配制Ala-CpnlO與CpnlO的突變體，并且在4 °C下將 50 yg吸收于一個96孔板的的三乘孔中16小時。將未結(jié)合的蛋白傾析之后，在23°C下 用在PBS pH 7.2中的BSA以及5%蔗糖封閉該板2小時。將以0.02 μ g/μ 1配制于 PBS pH 7.2中的50 μ 1 3，-生物素標記的人ODN-2216類別Α、人ODN-2006類別B、 或人ODN-M362類別C(TLR9激動劑)(Proligo/Sigma)加入每個孔并且在23°C下孵育2 小時。用PBS (pH 7.2)+0.05%吐溫20沖洗五次以去除未結(jié)合的配體。用抗生蛋白鏈菌 素HRP與TMB檢測系統(tǒng)在A450nm分析結(jié)合的CpG_ODN。結(jié)果是三次重復測試的平 均值并且歸一化為Ala-CpnlO與每一種CpG的結(jié)合的水平。圖8.CpnlO調(diào)節(jié)CpG-B ODN-誘導的NFK B活性。根據(jù)制造廠家的說明 書(Novogen)用Genejuice用pNifty NF κ B-熒光素酶報告基因質(zhì)粒(InvivoGen)轉(zhuǎn)染 RAW264.7(小鼠巨噬細胞)細胞。24小時后將細胞進行胰蛋白酶消化，計數(shù)并且將2.5x IO5細胞鋪于一個24孔板的每個孔中的Iml培養(yǎng)基中，并且保留使粘附過夜。將IOOyg 的一種CpnlO構(gòu)建體或配制緩沖液對照與4 μ g CpG-B ODN-1826 (Invivogen)混合并且通 過一個離心過濾裝置YMlO (Amicon)。將全部流過的體積加入到RAW264-pNIFty_LUC 細胞中并且在37°C下孵育5小時。將細胞沖洗并且隨后用每孔IOOylCCLR IX溶液 (Promega熒光素酶裂解緩沖液)進行裂解，按照生產(chǎn)廠家的說明書與熒光素酶底物進行 混合并且測量該熒光素酶的數(shù)量。圖中顯示以100%歸一化為Ala-CpnlO的NF κ B激活 水平。圖9.CpnlO突變體對聚(I:C)刺激的作用。按照生產(chǎn)廠商的說明書(Novogen) 使用GeneJuice用為TLR3以及pNifty NFkB-熒光素酶編碼質(zhì)粒(InvivoGen)瞬時轉(zhuǎn)染 HEK293細胞。24小時后將轉(zhuǎn)染的細胞進行胰蛋白酶消化，計數(shù)并且將IxlO5細胞鋪于 一個24孔板的每個孔中的Iml培養(yǎng)基中，并且允許粘附24小時。然后向每個孔中加入 lOOugCpnlO、O.lug 聚(I:C) (InvivoGen)以及 IOul SUPERase RNA 酶抑制劑(Ambion)保 持24小時。然后去除上清液，在PBS中沖洗這些細胞并且用Ix裂解緩沖液(Promega) 進行裂解，并且測試熒光素酶。熒光素酶的水平以100%歸一化為單獨的聚(I:C)。這些 值表示三乘孔的平均值。發(fā)明的詳細描述CpnlO是一種圓頂形的、完全相同的IOkDa亞基的七聚環(huán)(圖1)。該圓頂?shù)谋?面是親水性的并且是帶有大量電荷的。每一個CpnlO亞基以5個片段形成一個不規(guī)則的 β-桶形拓撲，這5個片段通過幾個環(huán)形結(jié)構(gòu)進行連接。存在3個小的連接環(huán)以及2個大 的環(huán)延伸，該環(huán)延伸從該桶突出出來。第一個延伸是一個β-發(fā)夾環(huán)(“頂環(huán)”)，該環(huán)向該七聚體的中心延伸并且形成該圓頂樣結(jié)構(gòu)的頂部。有趣的是，然而GroES(大腸桿 菌CpnlO)的頂部在該頂環(huán)的尖端在生理條件下含有一簇負電荷殘基，該哺乳動物CpnlO 的頂部在該頂環(huán)的尖端含有一個正電荷簇的氨基酸；而該頂部的大部分的從該噬菌體 CpnlO (Gp31)完全缺失。該分子還具有另一個延伸，該延伸是一個柔性的18個氨基酸 的移動環(huán)，該環(huán)從該圓頂?shù)牡撞垦由觳⑶医閷cCpn60的相互作用。包括殘基Glu-74、 Tyr-75以及Gly_76的一個這些小的連接環(huán)從該圓頂?shù)牡撞垦由觳⑶蚁騼?nèi)突出從而形成 一個較低的邊緣區(qū)。在該較低邊緣區(qū)內(nèi)的氨基酸殘基在多數(shù)真核生物中是種系發(fā)育保守 的。不受任何機理或途徑的限制，諸位發(fā)明人已經(jīng)主要地通過氨基酸取代、缺失、 加入或它們的組合產(chǎn)生了一系列的突變，這改變了一種CpnlO多肽的電荷，并且在此證 明這些突變在改變CpnlO與一種或多種PRR配體的相互作用中、特別是在增加CpnlO與 該PRR配體的結(jié)合親和性中是有效的，這表明通過PRR信號調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)/應答的能 力。該CpnlO多肽到一個PRR配體上的結(jié)合可以在具有該PRR的特定的免疫細胞上產(chǎn) 生免疫調(diào)節(jié)影響。該細胞可以是一種抗原呈遞細胞、T-細胞或B-細胞。該抗原呈遞細 胞可以是一種樹突細胞、巨噬細胞或單核細胞。包括Toll樣受體(TLR)、結(jié)合核苷酸的結(jié)構(gòu)域含LRR家族(NLR)、RIG-I樣受 體(RLR)，IRF的DNA依賴性激活劑(DAI)、C型凝集素受體(CLR)以及IFI20X/IFI16 家族(Ifil6、Aim2、MNDA以及IFIX)的模式識別受體(PRR)是免疫系統(tǒng)的哨兵，它們
起對抗病原體侵入、識別特異性的病原相關分子模式(PAMPS)、以及啟動一種免疫應答 的的第一道防線的作用?？磥鞵RR還在包括膿毒癥、自身免疫或慢性炎性疾病的許多炎 性綜合征中起作用，其中改變的自身分子活性過高的PRR導致病理學狀態(tài)的發(fā)展。CpnlO多肽的突變體通過加入正電荷殘基或去除負電荷殘基從而加入過量的正電荷產(chǎn)生一種CpnlO 分子，該分子顯著地更強地(與Ala-CpnlO以及X-CpnlO相比)結(jié)合到基于核酸的PRR 配體上?？梢酝ㄟ^(1)用一個正電荷殘基取代一個現(xiàn)有的表面/溶液暴露的中性或負電 荷殘基，(2)用一個中性殘基取代一個現(xiàn)有的表面/溶液暴露的負電荷殘基，(3)引入一 個另外的表面/溶液暴露的正電荷殘基(例如延長一種環(huán)形結(jié)構(gòu)或N端以及C端)或(4) 缺失一個現(xiàn)有的表面/溶液暴露的負電荷殘基(例如縮短一種環(huán)形結(jié)構(gòu)或N端以及C端) 加入過量的正電荷。我們的結(jié)果還顯示出，弓丨入多個正電荷(例如Ala-CpnlO-Y75K， D94K)可以比單一突變顯著地更大地增加結(jié)合潛力。蛋白凈電荷的計算在一個給定pH下的一個多肽的凈電荷是基于Henderson-Hasselbalch方程式 (Hasselbalch, K.A.，1917Biochemische Zeitschrift 78 112-144)以及可離子化的氨基酸 側(cè)鏈的以及多肽的N端和C端的已知的pKa值進行計算。Henderson-Hasselbalch方程式 表明，含有一種弱酸/堿的以及它的共軛堿/酸的一種溶液的pH僅依賴于這兩種溶質(zhì)的 摩爾濃度之間的比率并且保持與稀釋無關，如以下方程式中所示Henderson-Hasselbalch 方禾呈式酸的方程式pH= pKa+log[A_]/[HA](用于 C 端、Asp、Glu、Cys> Tyr)堿的方程式pH= pKa+log[B]/[BH+](用于 N 端、Lys、Arg> His)
其中，[A_]表示一種相關酸的共軛堿的摩爾濃度(C端、Asp、Glu、Cys、 Tyr)，并且[BH+]是一種相關堿的共軛酸的摩爾濃度(N端、Lys、Arg, His)。一種多肽 中可電離基團的pKa值在本領域中是已知的并且可以在許多期刊和教科書中找到。依賴 于使用的這套pKa值，一種蛋白的計算的凈電荷可以稍微變化，但這沒有改變在這項研 究中獲得的結(jié)論。表3中使用的pKa值是N端8.0、C端3.1、Lys 10.0、Arg 12.0、His 6.5、Glu 4.4、Asp 4.4、Tyr 10.0 以及 Cys 8.5 (Stryer，L.，1988 “Biochemistry” textbook 3rd Edition, New York, W.H.Freeman, ISBN0716719207)。所以對于具有多個可電離基團的多肽，可以在給定的pH下如下計算該多肽的凈 電荷1.列出所有可電離的殘基(Cys、Asp、Glu、His、Lys、Arg> Tyr、羧基端、氨
基端)2.如果一個可電離的基團的pKa為遠離該pH值>2單位，無需計算，該電荷可 以指定為1、0、-Io例如，在PH7.3下賴氨酸(pKalO.O)將100%質(zhì)子化，并且將具有 平均電荷+1。另一方面，在pH7.3下谷氨酸(pKa 4.4)以及天冬氨酸(pKa 4.4)兩者將 100%去質(zhì)子化，給出平均電荷-1。3.使用Henderson-Hasselbalch方程式計算在給定的pH下每個可電離基團的百分
比電離。在表3中在pH 7.3以及pH 7.4下進行計算(用作生理pH)。4.每個可電離基團百分比電離(Z1)乘以在給定的多肽中出現(xiàn)的單個可電離基團的 總數(shù)Cn1)從而得到每個可電離基團貢獻的總電荷。然后通過總計每個可電離基團貢獻的 所有電荷Z = ΣηιΖι提供在給定pH下一種多肽的凈電荷(Z)從而得到在給定pH下該多肽 的凈電荷。存在許多免費的可用資源，其中計算多肽上凈電荷的該方法已經(jīng)自動化從而易 于使用。例如ProteinCalculator V3.3 (http://www.scripps.edu/ ~ cdputnam/protcalc.html)是一
種免費可獲得的基于氨基酸序列計算蛋白上的凈電荷的工具。該工具用于計算在生理pH 下(取為7.3到7.4)多種CpnlO多肽的凈電荷，如表3中所示。突變的類型通過加入正電荷殘基或去除負電荷殘基可以生成具有對于促炎性核酸高度親和 性的CpnlO變體。用于生成對于促炎性核酸具有高度親和性的CpnlO變體的突變可以是 氨基酸殘基插入、缺失、取代或加入或它們的一種組合，只要該突變導致CpnlO變體在 pH 7.4下比Ala-CpnlO具有更高的正電荷。在一個實施方案中，一個現(xiàn)有的殘基可以被取代為一個正電荷的殘基，一個負 電荷的殘基可以被一種中性殘基代替，可以加入一個另外的正電荷殘基，或可以缺失負 電荷殘基，例如對于圖Ib中定義的該CpnlO多肽的區(qū)域的任意一個。可以通過本領域中 任何已知的方法進行突變，例如定點誘變、同源重組、轉(zhuǎn)座子誘變或序列標簽誘變。典 型地，定點誘變將被使用。本領域中普通技術(shù)人員將認識到導致一種CpnlO變體在pH 7.4下具有比 Ala-CpnlO更高的正電荷以及對于促炎性核酸具有更高的親和性的任何數(shù)量以及類型的突 變落在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
多月太如在此披露的，本發(fā)明考慮了分離的CpnlO多肽以及與Ala-CpnlO相比它的增 加的對于一種基于核酸的PRR配體的親和性，包括一個或多個氨基酸缺失、加入或取 代。CpnlO可以是天然的、天然衍生的、重組的或合成的CpnlO。該CpnlO分子可 以是來自一種真核生物的任何CpnlO多肽。通過舉例，如圖2中所示，該CpnlO可以從 酵母(例如釀酒酵母)、線蟲(例如，秀麗隱桿線蟲)、蛙(例如，非洲爪蟾)、雞(例 如，原雞)、斑馬魚(例如，斑馬魚)、蠅(例如果蠅例如黃猩猩果蠅)、植物(例如，擬 南芥)或哺乳動物得到。該哺乳動物CpnlO可以是靈長類、鼠類、綿羊、牛、犬、貓、 豬或馬。可替代地，該CpnlO可以是起源于遠古的。在具體的實施方案中，該CpnlO是 人 CpnlO。本發(fā)明還涉及如以上披露的人CpnlO多肽同系物的改變并且包括這些通過加 入、缺失或取代其中一個或多個氨基酸殘基而改變的分子，以及這些改變?nèi)绾文軌蛟黾?這些CpnlO多肽對基于核酸的PRR配體的親和性。此外，氨基酸的加入可能涉及一種 CpnlO多肽或其片段與第二種多肽或肽(如一種聚組氨酸標簽、麥芽糖結(jié)合蛋白融合物、 谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶融合物、綠色熒光蛋白融合物)的融合、或一種表位標簽如FLAG、 c-myc或六組氨酸標簽的加入。該CpnlO多肽可以或不可以在N端包括起始的甲硫氨 酸。例如，人CpnlO可以在N端包括一個另外的GSM三肽(參見例如WO 95/15338， 該披露的內(nèi)容通過引用結(jié)合在此)，或一個另外的丙氨酸(A; SEQ ID Nos.3-5)或一個 另外的甘氨酸。本發(fā)明還考慮了使用編碼這些CpnlO改變形式的多核苷酸。在基于或 基本上從人CpnlO得到的本發(fā)明的CpnlO多肽的情況下，這些多肽可以包括N端序列 AGQAFRKFL> MAGQ> AGQ或AAGQ并且可選擇地包括一種或多種如上所述的改變。如在此使用的術(shù)語“變體”是指基本上相似的序列。通常，多肽序列變體具 有相同的定性的生物學活性。進一步地，這些多肽序列變體可以共享至少50%、55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%或 99%序列一 致性。同樣包括在術(shù)語“變體”的含義中的是本發(fā)明的多肽的同系物。同系物典型地 是來自不同物種但與對應的在此披露的多肽共享基本上相同的生物學功能或活性的一種 多肽。進一步地，術(shù)語“變體”還包括本發(fā)明的多肽的類似物，其中術(shù)語“類似物” 是指一種多肽，該多肽是本發(fā)明的多肽的一種衍生物，它的衍生包括加入、缺失、取代 一個或多個氨基酸，從而使該多肽保持基本上相同的功能。本發(fā)明還考慮了在此披露的多肽的片段。術(shù)語“片段”是指編碼一種組分的一 種多肽分子或是本發(fā)明的多肽或其變體的一種組分。典型地，該片段具有與它是其一種 組分的多肽性質(zhì)上相同的生物學活性。該多肽片段可以是約5到約150個氨基酸長度之 間，約5到約100個氨基酸長度之間，約5到約50個氨基酸長度之間，或約5到約25個 氨基酸長度之間?？商娲兀撾钠慰梢允窃诩s5到約15個氨基酸長度之間。在N端和/或C端通過如上所述加入、缺失或取代一個或多個氨基酸殘基修飾 的CpnlO多肽也落在本發(fā)明的范圍內(nèi)。CpnIOcDNA序列的優(yōu)化
本發(fā)明使用優(yōu)化的CpnlOcDNA序列來增加使用豐富的轉(zhuǎn)移RNA(tRNA)池用于
CpnlO多肽的生產(chǎn)。已知tRNA池提供了特異性的編碼特異性氨基酸的密碼子用于從信使 RNA翻譯蛋白。此外，還已知一些tRNA池比另一些更豐富。當大量的蛋白從某些表達 系統(tǒng)生產(chǎn)時，這可能導致被耗盡的較低的豐度的tRNA庫導致較低的產(chǎn)量和/或tRNA取 代生成突變。與本發(fā)明相關，發(fā)現(xiàn)易于受此影響的特異性的CpnlO變體。例如，在大腸桿菌 中過量表達CpnlO的過程中，用于Gly39的稀有甘氨酸(Gly) GGA tRNA被耗盡并且可以 用非常常用的谷氨酸鹽/谷氨酸(Glu) GAA tRNA取代。相應地，可以構(gòu)建在任意數(shù)量的位置上使用優(yōu)化的密碼子的一種優(yōu)化的序列具 體地，特異性優(yōu)化的甘氨酸以及精氨酸殘基G3、G29、G39、G50、G55、G58、G68、 G77、G98、R8、R16、R21以及R93導致野生型cDNA表達水平但是在保持CpnlO總產(chǎn) 量的同時變體水平顯著地降低。此外，由于核糖體讀過該細胞TGA終止密碼子，可以生成CpnlO變體。在這個 方面，可以通過將它改變成一個TAA終止密碼子而優(yōu)化該TGA終止密碼子從而排除這個 問題。CpnlO 的生產(chǎn)根據(jù)本發(fā)明可以使用對于本領域中普通技術(shù)人員已知的重組DNA以及細胞生 物學的標準的技術(shù)生產(chǎn)CpnlO多肽。例如可以從標準文本如Sambrook et al.，Molecular Cloning A Laboratory Manual, Cold SpringHarbor, New York, 1989 以及 Ausubel et al.， Current Protocols in MolecularBiology，Greene Publ.Assoc.and Wiley-Intersciences，1992 獲 得指導。描述于Morton etal.，2000 (Immunol Cell Biol 78 603-607)、Ryanetal., 1995 (J Biol Chem 270 22037-22043)以及 Johnson et al.，2005 (J Biol Chem280 4037-4047)中 的方法是適合于CpnlO多肽純化方法的實例，盡管了解該技術(shù)的人員應該理解本發(fā)明不 受使用的純化或生產(chǎn)方法的限制并且根據(jù)本發(fā)明的方法以及組合物使用的任何其他方法 可以用于生產(chǎn)CpnlO。使用標準的重組核酸技術(shù)可以得到根據(jù)本發(fā)明使用的CpnlO多肽以及肽片段， 或可以合成它，例如使用常規(guī)的液相或固相合成技術(shù)。通過用一種或多種蛋白酶如 endoLys-C、endoArg-C、endoGlu-C以及葡萄球菌V8-蛋白酶消化一種多肽可以生產(chǎn) CpnlO肽?？梢酝ㄟ^例如高效液相色譜(HPLC)技術(shù)純化消化的肽片段?？梢詫⒈景l(fā)明的CpnlO多肽的純化進行放大用于大規(guī)模生產(chǎn)的目的。例如，如 在此所述，本發(fā)明的諸位發(fā)明人已經(jīng)開發(fā)了一種生物過程用于生產(chǎn)大量(克級)高純度臨 床級的CpnlO多肽。還可以通過對于本領域中普通技術(shù)人員已知的液相或固相化學的標準方法合成 本發(fā)明的CpnlO多肽，連同其片段以及變體。例如，按照Steward與Young (Steward， J.M.&Young, J.D., Solid Phase PeptideSynthesis. (2nd Edn.) Pierce Chemical Co., Illinois,
USA(1984)的固相化學過程可以合成這些分子。總體而言，這樣一種合成方法包括將一種或多種氨基酸或適當?shù)厥鼙Ｗo的氨基 酸順序地加到一個增長的肽鏈上。典型地，第一個氨基酸的氨基或羧基基團由一個適宜 的、保護性基團進行保護。然后將該保護的氨基酸或者連接到一個惰性固體支撐物上或者通過加入序列中的下一個氨基酸用于溶液中，該序列具有適宜地保護的互補基團(氨 基或羧基)并且在適合用于形成該酰胺的條件下。然后從該新加入氨基酸殘基去除保護 基團并且加入下一個(保護的)氨基酸，等等。在所有的所希望的氨基酸已經(jīng)連接之后， 順序地或同時地去除任何殘余的保護基團，并且如果有必要的話去除任何固體支撐物從 而生成最終的多肽。CpnlO多肽中的氨基酸改變可以通過對于相關領域中普通技術(shù)人員已知的技術(shù) 實現(xiàn)。例如氨基酸改變可以通過核苷酸代替技術(shù)來實現(xiàn)，它包括加入、缺失、或取代核 苷酸(保守的和/或非保守的)，只要保持適當?shù)拈喿x框。示例性的技術(shù)包括隨機誘變、 定點誘變、寡核苷酸介導的或多核苷酸_介導的誘變、通過使用現(xiàn)有的或設計的限制酶 位點缺失選擇的一個或多個區(qū)域、以及聚合酶鏈式反應。通過本發(fā)明的CpnlO多肽的免疫調(diào)節(jié)活性的生成可能涉及該CpnlO多肽的七聚 體的形成。為了本發(fā)明的目的可以通過對于本領域中普通技術(shù)人員已知的多種技術(shù)的任 何一種進行免疫調(diào)節(jié)活性的測試。如在此舉例的，通過測量該多肽調(diào)節(jié)來自Toll樣受體 TLR-3的信號能力可以測定CpnlO多肽的免疫調(diào)節(jié)活性，例如使用一種NF- κ B-熒光素 酶報告基因細胞系，并且典型地在一種TLR-3激動劑例如聚(I:C)存在下。如在此所述 還測試了其他的TLR如TLR-7、8以及9。可替代地或此外，可以使用在體外、離體或 體內(nèi)的其他檢測來測定免疫調(diào)節(jié)活性，例如通過測量細胞中(如外周血單核細胞)細胞因 子的產(chǎn)生、競爭性結(jié)合測定、一種雙雜交測定、一種過濾檢測、一種電泳遷移率(凝膠 遷移)檢測、一種孔板捕獲檢測或能夠使人們測量免疫調(diào)節(jié)活性的檢測的任意組合。多核苷酸本發(fā)明的實施方案提供了編碼如上所述的CpnlO多肽的分離的多核苷酸以及這 些多核苷酸的變體以及片段。在本發(fā)明的范圍內(nèi)考慮的多核苷酸的非限制性的例子在此
表示為 SEQ ID No，S:I, 9、11、 12、 14、 15、17、L8、 20、 21、23、24、 26、 27、.29、30、32、 33、 35、36、38、 39、 41、42、44、45、 47、 48、 50、51、53、 54、 56、57、59、60、 62、 63、65、66、 68、 69、 71、72、74、 75、 77、 78、80、81、 83、 84、86、87、89、 90、 92、93、95、 96、 98、99、101、102、104、105、107、108、110、111、113、114、116、117、119、120、122、123、125、126、128、129、131、132、134、135、137、138、140、141、143、144、146、147、149、150、152、153、155、156、158、159、161、162、164、165、167、168、170、171、173、174、176、177、179、180、182、183、185、186、188、189、191，.192、194、195、197、198、200、201、203、204、206、207、209、210、212、213、215、216、218、219、221、222、224、225、227、228、230、231、233、234、236、237、239、240、242、243、245、246、248、249、251、252、254、255、257、258、260、261、263、264、266、267、269、270、272、273、275、276、278、279、281、282、284、285、287、288、290、291、293、294、296、297、299、300、302、303、305、306、308、309、311、312、314、315、317、318、320、321、323、324、326、327、329、330、332、333、335、336、
338、 339、 341、 342、 344、 345、 347、 348、 350、 351、 353、 354 或 356。 對于以上討論的多肽，如在此使用的術(shù)語“變體”是指基本上相似的序列。通
常，多核苷酸序列變體編碼多肽，這些多肽具有性質(zhì)上相同的生物學活性。進一步地，這些多核苷酸序列變體可以共享至少50%、55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%或99%序列一致性。同樣包括在術(shù)語“變體”的 含義中的是本發(fā)明的多核苷酸的同系物。同系物典型地是來自不同物種但共享基本上相 同活性的一種多核苷酸。還考慮了本發(fā)明的多核苷酸的片段。術(shù)語“片段”是指一種核酸分子，該核酸 分子編碼一種組分或是本發(fā)明的多核苷酸的一種組分。多核苷酸的片段不必要需要編碼 保留生物學活性的多肽。然而，例如該片段可以用作一種雜交探針或PCR引物。該片 段可以從本發(fā)明的一種多核苷酸得到或可替代地可以通過一些其他方法例如化學合成方 法合成。本發(fā)明的多核苷酸以及其片段還可以使用本領域中普通技術(shù)人員已知的技術(shù)用 于生產(chǎn)反義分子。相應地，本發(fā)明考慮基于本發(fā)明的多核苷酸序列的寡聚核苷酸以及片段用作引 物以及探針。寡聚核苷酸是核苷酸殘基的短的一段序列適合用于核酸擴增反應如PCR， 典型的是長度至少是約10個核苷酸至約50個核苷酸，更典型的是約15至約30個核苷酸 長度。探針是可變長度的核苷酸序列，例如在約10個核苷酸與幾千個核苷酸之間，用于 檢測同源序列，典型地是通過雜交。序列之間同源性的水平(序列一致性)將主要通過 雜交條件的嚴緊性來測定。特別地，用作探針的核苷酸序列可以在低嚴緊性、中等嚴緊 性或高嚴緊性條件下雜交到在此披露的多核苷酸的同系物或其他變體上。低嚴緊性雜交 條件可以對應于在50°C下在& SSC中進行雜交。存在對于本領域中普通技術(shù)人員已知的 多種條件和因素，它們可以用于改變雜交的嚴緊性。例如，有待雜交到一種特異性的核 酸上的核酸的長度和本性(DNA、RNA,堿基組合物)；鹽以及其他組分的濃度，如甲酰 胺、葡聚糖硫酸鹽、聚乙二醇等的存在或缺少；以及改變雜交和/或沖洗步驟的溫度。 例如，雜交濾膜可以在2X SSC中、0.5%303以及至少551(低嚴緊性)、至少60°C (中 嚴緊性)、至少65°C (中/高嚴緊性)，至少70°C (高嚴緊性)或至少75°C (非常高的嚴 謹性)下沖洗兩次持續(xù)30分鐘。在具體的實施方案中，本發(fā)明的多核苷酸可以克隆到一個載體中。該載體可 以是一種質(zhì)粒載體、一種病毒載體或適合插入外源序列、將它們引入到真核細胞中、并 且將這些引入的序列進行表達的任何其他適合的載體。典型地，該載體是一種真核表達 載體并且可以包括表達控制以及處理序列，如一個啟動子、一個增強子、核糖體結(jié)合位 點、聚腺苷酸化作用信號以及轉(zhuǎn)錄終止序列?？贵w本發(fā)明提供多種抗體，這些抗體選擇性結(jié)合到本發(fā)明的CpnlO多肽以及其片段 和類似物上。適合的抗體包括但不限于多克隆、單克隆、嵌合體、人源化、單鏈、Fab片 段，以及一種Fab表達庫。本發(fā)明的抗體可以作為CpnlO多肽或其片段或類似物的激動 劑或拮抗劑?？梢詮谋景l(fā)明的CpnlO多肽的不同區(qū)域或片段制備抗體，特別是涉及提供免疫 調(diào)節(jié)活性和/或配偶體或底物結(jié)合的那些。抗原性CpnlO多肽包含至少約5個、并且優(yōu) 選地至少約10個氨基酸。用于生成適合的抗體的方法已經(jīng)被本領域中普通技術(shù)人員所了解。例如典型 地包含F(xiàn)ab部分的一種抗CpnlO單克隆抗體可以使用Antibodies-A Laboratory Manual,Harlow and Lane, eds.，Cold SpringHarbor Laboratory, N.Y. (1988)中描述的雜交瘤技術(shù) 制備。在制備針對本發(fā)明的CpnlO多肽、其片段或類似物的單克隆抗體中，可以 使用提供用于在培養(yǎng)中通過連續(xù)細胞系產(chǎn)生抗體分子的任何技術(shù)。這些包括最初 由Kohler等人Nature，256 495-497(1975),開發(fā)的雜交瘤技術(shù)，連同三源雜交瘤 技術(shù)，人 B 細胞雜交瘤技術(shù)[Kozbor et al.，Immunology Today, 4 72 (1983)]，以 及EBV雜交瘤技術(shù)從而生成人單克隆抗體[Cole et al.，in Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, pp.77-96, Alan R.Liss, Inc., (1985)]?？梢酝ㄟ^除了融合之外的技 術(shù)生成不死的生產(chǎn)抗體的細胞系，如用致癌DNA直接轉(zhuǎn)化B淋巴細胞，或用愛潑斯 坦-巴爾病毒轉(zhuǎn)化。參見例如 M.Schreier et al.， 〃 Hybridoma Techniques 〃 (1980)； Hammerling et al.， “ Monoclonal Antibodies and T-cell Hybridomas" (1981) ； Kennett et al., ‘‘ Monoclonal Antibodies 〃 (1980)?？傊?，產(chǎn)生了從中生產(chǎn)單克隆抗體的雜交瘤的一種方法，將骨髓瘤或其他能使 自身永久存在的細胞系與從用其識別因子結(jié)合部分、或識別因子或其起源特異性的DNA 結(jié)合部分超量免疫的哺乳動物的脾臟得到的淋巴細胞進行融合。通過它們的與現(xiàn)有識別 因子免疫反應的能力以及它們的在目標細胞中抑制特異性轉(zhuǎn)錄活性的能力識別生產(chǎn)有用 于實現(xiàn)本發(fā)明的單克隆抗體的雜交瘤?？梢酝ㄟ^啟動一種單克隆雜交瘤培養(yǎng)系生產(chǎn)有用于實現(xiàn)本發(fā)明的單克隆抗體， 該培養(yǎng)系包括含有雜交瘤的一種營養(yǎng)物培養(yǎng)基，該雜交瘤分泌適當?shù)目乖禺愋缘目贵w 分子。在一定條件下保持該培養(yǎng)物并且持續(xù)足以使該雜交瘤向培養(yǎng)基中分泌該抗體分子 的一段時間。然后收集含有培養(yǎng)基的抗體。然后可以通過已知的技術(shù)進一步分離抗體分 子。類似地，存在本領域中已知的多個過程，這些過程可以用于生產(chǎn)對于本發(fā)明的 CpnlO多肽、或其片段或類似物的多克隆抗體。為了生產(chǎn)CpnlO多克隆抗體，可以通過 注射一種CpnlO多肽、或其片段或類似物免疫不同的宿主動物包括但不限于兔、小鼠、 大鼠、綿羊、山羊等。此外，可以將該CpnlO多肽或其片段或類似物連接到一種免疫原 性的載體上，例如牛血清白蛋白(BSA)或鑰孔蟲戚血藍蛋白(KLH)。還可以使用不同 的輔助劑從而增加免疫應答包括但不限于弗氏(完全的和不完全的)、礦物凝膠如氫氧化 鋁、表面活性物質(zhì)如溶血卵磷脂、復合多元醇、聚陰離子、肽類、油性乳液、鑰孔蟲戚 血藍蛋白、二硝基酚以及潛在有用的人類輔助劑如BCG(卡介苗)以及短小棒狀桿菌。通過本領域中已知的多種技術(shù)還可以實現(xiàn)篩選希望的抗體?？贵w的免疫特異性 結(jié)合的檢測包括但不限于放射性免疫測定、ELISA(酶聯(lián)免疫吸附測定)、三明治免疫測 定、免疫放射測定、凝膠擴散沉淀反應、免疫擴散測定、原位免疫測定、蛋白質(zhì)印跡、 沉淀反應、凝集測定、補體固定測定、螢光免疫檢驗、蛋白A測定、以及免疫電泳測 定、等(參見例如，Ausubeletal., eds, 1994, Current Protocols in Molecular Biology, Vol.1, JohnWiley&Sons，Inc., New York)。通過一抗CpnlO抗體上的可檢測的標志物 可以檢測抗體結(jié)合。可替代地，通過它與一種二抗/或適當?shù)貥擞浀脑噭┙Y(jié)合可以檢測 抗CpnlO抗體。用于檢測免疫測定中結(jié)合的多種方法在本領域中是已知的并且在本發(fā)明 的范圍內(nèi)。
本發(fā)明的抗體可以用于診斷方法以及試劑盒從而定性地或定量地檢測體液中或 組織中的CpnlO，這對于本領域中普通技術(shù)人員是已知的，或可替代地抗體可以用于多 種方法和組合物中用于治療不同的疾病、紊亂以及病癥。抗本發(fā)明的CpnlO多肽或其片段或類似物生成的抗體(或其片段)具有對于 CpnlO的結(jié)合親和性。優(yōu)選地，該抗體(或其片段)具有大于約105M_\更優(yōu)選地大于約 IO6M-1,更優(yōu)選地還大于約IO7AT1以及最優(yōu)選地大于約IO8Azr1的結(jié)合親和性或親和力。就根據(jù)本發(fā)明獲得適合的量的抗體而言，人們可以使用用不含培養(yǎng)基的血清的 批量發(fā)酵的方法生產(chǎn)一種或多種抗體。發(fā)酵后，可以通過多步步驟結(jié)合色譜以及病毒失 活/去除步驟純化抗體。例如，可以首先通過蛋白A親和層析分離抗體并且然后用溶劑 /洗滌劑處理從而使任何類脂包膜的病毒失活。進一步純化，典型地通過陰離子和陽離子 交換層析，可以用于去除殘余的蛋白、溶劑/洗滌劑以及核酸?？梢赃M一步純化已純化 的抗體并且使用凝膠過濾柱配制成0.9%鹽水。然后將配制的大量制品進行消毒以及細菌 過濾以及分配。激動劑以及拮抗劑使用以上描述的方法，可以識別一種試劑是本發(fā)明的多肽或其一種變體或片段 的一種激動劑。是激動劑的試劑增強了該多肽的一種或多種生物學活性?？商娲兀?上描述的方法可以識別一種試劑是本發(fā)明的多肽或其一種變體或片段的一種拮抗劑是拮 抗劑的試劑延緩了該多肽的一種或多種生物學活性。激動劑增強了一種分子如在此描述 的CpnlO多肽的一種或多種生物學活性，而拮抗劑延緩了這些多肽的一種或多種生物學 活性。在一個實例中，本發(fā)明的多肽的一種激動劑可以是一種免疫抑制的核酸。該核酸 可以結(jié)合到本發(fā)明的多肽上形成一種復合物。在另一個實例中，本發(fā)明的多肽的一種拮 抗劑可以是一種促炎性的核酸。該核酸還可以結(jié)合到本發(fā)明的一種多肽上形成一種復合 物。可以生成本發(fā)明的這些多肽的活性的這些潛在的調(diào)節(jié)劑用于通過以上方法通過對于 本領域中普通技術(shù)人員已知的多種技術(shù)進行篩選。例如，如X射線晶體學以及核磁共振 譜學的方法可以用于對本發(fā)明的多肽或其變體或片段的結(jié)構(gòu)進行建模，從而有助于使用 基于計算機的建模設計潛在的調(diào)節(jié)試劑。不同形式的組合化學還可以用于生成推測的調(diào) 節(jié)物。使用以下描述的篩選方法，可以識別一種試劑是本發(fā)明的多肽或其一種變體或片 段的一種激動劑或拮抗劑?？贵w、低分子量的肽、核酸以及非蛋白質(zhì)的有機分子是這些 試劑的實例，這些試劑可以作為本發(fā)明的多肽或其一種變體或片段的激動劑或拮抗劑起 作用。篩選可以通過不同的適合的方法識別與本發(fā)明的多肽和多核苷酸結(jié)合或否則相互作 用的化合物以及調(diào)節(jié)它們活性的特異性化合物。非限制性的方法包括雙雜交方法、共免 疫沉淀反應、親和純化、質(zhì)譜、串聯(lián)親和純化、噬菌體展示、標簽轉(zhuǎn)移、DNA微陣列/ 基因共表達以及蛋白質(zhì)微陣列。本發(fā)明的CpnlO多肽以及適當?shù)钠魏妥凅w可以用于高通量篩選以檢測能夠與 CpnlO結(jié)合或否則相互作用的候選化合物。這些候選化合物可以是促炎性核酸或免疫抑 制的核酸，它們與如在此描述的多肽、該多肽的片段或變體形成復合物。候選化合物可 以是蛋白。
可以抗功能CpnlO進一步篩選這些候選化合物從而確定該化合物在CpnlO活性 上的作用。本發(fā)明的多肽以及多核苷酸以及其片段和類似物用于篩選和識別與這些分子 相互作用的化合物和試劑。具體地，希望的化合物是調(diào)節(jié)這些多肽和多核苷酸的活性的 那些。這些化合物可以通過激活、刺激、增加、抑制或阻止該多肽和/或多核苷酸的表 達或活性起調(diào)節(jié)作用。適合的化合物可以通過或者直接(例如結(jié)合)或間接相互作用而起 作用。如在此描述的，存在多種篩選調(diào)節(jié)本發(fā)明的CpnlO多肽的活性或否則與其相互作 用的化合物的方法。可以通過多種適合的方法識別這些化合物。使用標準的競爭結(jié)合測 定如凝膠遷移測定以及或雙雜交測定系統(tǒng)中描述的多孔板結(jié)合測定可以測定相互作用和/ 或結(jié)合。例如，該雙雜交測定是一種基于酵母的遺傳測定系統(tǒng)(Fields andSong，1989) 典型地用于測定蛋白-蛋白相互作用。簡言之，該檢測利用轉(zhuǎn)錄激活劑的多結(jié)構(gòu)域的 本性。例如，可以將一種已知的轉(zhuǎn)錄激活劑的結(jié)合DNA的結(jié)構(gòu)域融合到本發(fā)明的一種 CpnlO多肽或其片段或變體上，并且使該轉(zhuǎn)錄激活劑的活性結(jié)構(gòu)域融化到一種候選蛋白 上。該候選蛋白與該CpnlO多肽或其片段或變體之間的相互作用可以帶來DNA結(jié)合以 及使該轉(zhuǎn)錄激活劑的活性結(jié)構(gòu)域進入緊密的鄰近。因此可以通過轉(zhuǎn)錄通過該轉(zhuǎn)錄激活劑 激活的一種特異性的報告基因檢測相互作用?？商娲兀梢允褂糜H和層析識別CpnlO的結(jié)合配偶體。例如，可以將本發(fā)明 的CpnlO多肽或其片段或變體固定在一種支撐物上(如瓊脂糖凝膠(sepharose))并且使細 胞裂解液流過該柱子。然后可以將結(jié)合到該固定CpnlO多肽、片段或變體的蛋白從該柱 子洗脫并且識別。首先通過例如N端氨基酸測序可以識別這些蛋白。在上述技術(shù)的一種改進中，通過將一種CpnlO多肽、片段或變體融合到一種可 檢測的標簽如堿性磷酸酶上并且使用如由Flanagan and Leder(1990)描述的免疫沉淀反應 的一種改進的形式可以生成一種融合蛋白。用于檢測調(diào)節(jié)CpnlO活性的化合物的方法可 以涉及將一種CpnlO多肽與一種候選化合物以及一種適合的標記的底物結(jié)合并且通過底 物的變化監(jiān)測該化合物在CpnlO上的作用(可以作為時間函數(shù)測定)。適合標記的底物包 括標記用于例如基于色度法的、放射性測量的、熒光測定法或熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET) 方法的那些。例如，共免疫沉淀可以用于檢測是否一種候選試劑或多種候選試劑與本發(fā)明的 多肽或其變體或片段相互作用或結(jié)合。使用這些技術(shù)，可以在適合于保存蛋白-蛋白 相互作用的在非變性條件下裂解氰基毒性生物、藍細菌和/或甲藻。然后可以將得到 的溶液與對于本發(fā)明的多肽或其變體或片段的特異性的一種抗體孵育并且從該總體溶液 中免疫沉淀，例如通過用連接到一種固體支撐物上的一種抗體結(jié)合蛋白捕獲。通過本 方法的本發(fā)明的多肽或其變體或片段的免疫沉淀有助于與該蛋白相關的一種試劑的共 免疫沉淀。識別一種相關試劑可以使用本領域中已知的多種方法實現(xiàn)，包括但不限于 SDS-PAGE、蛋白質(zhì)印跡法以及質(zhì)譜法?？商娲兀删w展示方法以用于檢測是否一種候選試劑或多種候選試劑與本 發(fā)明的多肽或其變體或片段相互作用或結(jié)合。噬菌體展示是通過將來自基因庫的多個基 因整合到噬菌體中用于篩選蛋白質(zhì)相互作用的一種測試。在這種方法中，當與噬菌體的 外殼蛋白融合時使用重組DNA技術(shù)表達多種基因，從而將每個基因的肽或蛋白產(chǎn)物展示于該病毒顆粒的表面上。用這種方式可以生成感興趣的噬菌體展示的肽或蛋白產(chǎn)物的全 部的文庫。然后可以篩選得到的噬菌體展示的肽或蛋白產(chǎn)物的文庫，檢測結(jié)合到本發(fā)明 的多肽或其變體或片段的能力。從相互作用的噬菌體中提取的DNA包含相互作用的蛋白 的序列?？商娲?，親和層析方法以用于檢測是否一種候選試劑或多種候選試劑與本發(fā) 明的多肽或其變體或片段相互作用或結(jié)合。例如，可以將本發(fā)明的多肽或其變體或片段 固定在一種支撐物上(如瓊脂糖凝膠)并且使細胞裂解液流過該柱子。然后可以從該柱 子洗脫結(jié)合到本發(fā)明的固體的多肽或其變體或片段的蛋白并且例如通過N端氨基酸測序 進行識別。本發(fā)明還考慮了可以在本發(fā)明的多肽上通過改變該多肽的表達起到它們的調(diào) 節(jié)作用的化合物。在這個例子中，可以通過比較在存在該候選化合物下該多肽的表達水 平與缺少該候選化合物下表達的水平來識別這些化合物。在抗體的上下文中，通過本領域中已知的多種技術(shù)還可以實現(xiàn)篩選希望的抗 體?？贵w的免疫特異性結(jié)合的檢測包括但不限于放射性免疫測定、ELISA(酶聯(lián)免疫吸 附測定)、三明治免疫測定、免疫放射測定、凝膠擴散沉淀反應、免疫擴散測定、原位免 疫測定、蛋白質(zhì)印跡、沉淀反應、凝集測定、補體固定測定、螢光免疫檢驗、蛋白A測 定、以及免疫電泳測定、等(參見例如，Ausubel et al.，eds，1994，Current Protocolsin Molecular Biology, Vol.1, John Wiley&Sons，Inc., New York (1994))。通過一抗體上的 可檢測的標志物可以檢測抗體結(jié)合?？商娲兀ㄟ^它與一種二抗/或適當?shù)貥擞浀脑?劑結(jié)合可以檢測抗體。用于檢測免疫測定中結(jié)合的多種方法在本領域中是已知的并且包 括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。應當理解的是以上描述的方法僅僅是可以用于識別能夠與本發(fā)明的多肽或其變 體或片段相互作用或調(diào)節(jié)其活性的試劑的方法的類型的實例。其他適合的方法將被本領 域中的普通技術(shù)人員知曉并且在本發(fā)明的范圍內(nèi)。組合物以及給藥途徑本發(fā)明的CpnlO多肽和多核苷酸可以用作治療劑。通過給予受試者一個治療有 效量的這樣的一個分子，這些分子例如在受試者體內(nèi)治療或預防一種疾病或病癥中找到 用途。典型地，通過調(diào)整受試者體內(nèi)的免疫應答，這些疾病或病癥是易于治療的。作為 舉例，這些疾病以及或病癥可以包括急性或慢性炎性疾病，如胰島素依賴型糖尿病、 系統(tǒng)性紅斑狼瘡、斯耶格倫病、格雷夫斯病、多發(fā)性硬化癥、類風濕性關節(jié)炎、慢性疲 乏綜合征、阿耳茨海默病、哮喘、過敏癥、多發(fā)性硬化癥、GVHD、動脈粥樣硬化、炎 性疼痛、牛皮癬、HIV、慢性免疫激活(chronic immune activation)、慢性肌炎、硬皮病。 該疾病還可以是一種癌癥，如非小細胞肺癌、腎細胞癌、黑色素瘤、非何杰金氏淋巴 瘤、結(jié)腸直腸癌、基底細胞癌。該疾病可以是一種傳染性疾病。該傳染性疾病可以因一種細菌性、病毒性的或真菌性感染引起。慢性免疫激活 與細菌性(例如LPS)和/或病毒性產(chǎn)物(例如核酸)從胃腸道滲漏到循環(huán)系統(tǒng)中相關。 例如，可以從口腔、腸或小腸發(fā)生滲漏。細菌性或病毒性產(chǎn)物的滲漏可以由一種感染或 疾病(如細菌感染、病毒感染、炎性腸病以及牙齦疾病)而引起。病毒感染的一個例子 是一種HIV或丙型肝炎感染。慢性免疫激活涉及通過LPS或核酸結(jié)合到TLR上的TLR信號的免疫調(diào)節(jié)。LPS可以結(jié)合到TLR2或TLR4上，同時核酸可以結(jié)合到TLR3、7、8或9上。相應地，在此考慮了用于治療或預防疾病以及病癥的包含CpnlO多肽以及多核 苷酸的藥學上有用的組合物。本發(fā)明的CpnlO多肽的激動劑以及拮抗劑，包括抗CpnlO抗體，也可以用作治 療劑。相應地，本發(fā)明還考慮使用此類激動劑以及拮抗劑以及包含它們的藥物組合物的 治療方法?？傊?，根據(jù)本發(fā)明的方法使用的合適的組合物可以根據(jù)本領域中普通技術(shù)人員 已知的方法以及步驟來制備，并且相應地可以包括一種藥學上可接受的載體、稀釋劑和/ 或輔助劑。組合物可以通過標準途徑來給藥。通常，這些組合物可以通過腸胃外的(例如 靜脈內(nèi)的、脊柱內(nèi)的、皮下的或肌內(nèi)的)、口服的或局部的途徑來給藥。給藥可以是全身 的、區(qū)域性的或局部的。在任何給定情況下，有待使用的具體給藥途徑將取決于多種因 素，這些因素包括有待治療的病癥的性質(zhì)、病癥的嚴重性以及程度、有待遞送的具體 化合物的所需劑量以及該化合物的潛在副作用。通常地，合適的組合物可以根據(jù)本領域中普通技術(shù)人員已知的方法來制備并且 可以包括一種藥學上可接受的稀釋劑、輔助劑和/或賦形劑。這些稀釋劑、輔助劑以 及賦形劑必須在與該組合物的其他成分是相容的，并且對它們的接受者是無害的方面是
“可接受的”。藥學上可接受的載體或稀釋劑的例子是脫礦物的或蒸餾的水；鹽溶液；基于 蔬菜的油類，如花生油、紅花油、橄欖油、棉籽油、玉米油、麻油類，如花生油、紅花 油、橄欖油、棉籽油、玉米油、麻油、花生油、或椰子油；硅油類，包括聚硅氧烷類， 如甲基聚硅氧烷、苯基聚硅氧烷以及甲基苯基聚硅氧烷；揮發(fā)性有機硅類；礦物油類， 如液體石蠟、軟石蠟或角鯊烷；纖維素衍生物類，如甲基纖維素、乙基纖維素、羧甲基 纖維素、羧甲基纖維素鈉或羥丙基甲基纖維素；低級鏈烷醇類，例如乙醇或異丙醇；低 級芳鏈烷醇類(aralkanols)；低級聚亞烷基二醇類或低級亞烷基二醇類，例如聚乙二醇、 聚丙二醇、乙二醇、丙二醇、1，3-丁二醇或甘油；脂肪酸酯類，如棕櫚酸異丙酯、肉 豆蔻酸異丙酯或油酸乙酯；聚乙烯吡咯酮；瓊脂；角叉菜膠；黃蓍樹膠或阿拉伯樹膠、 以及石油膏。典型地，該載體或這些載體將占按重量計組合物的從10%至99.9%。本發(fā)明的組合物可以是一種適合注射給藥的形式、是適合口服攝取的一種配制 品的形式(例如像膠囊、片劑、膠囊形片劑、酏劑)、是適合局部給藥的一種軟膏、乳 劑、或洗液的形式、是一種適合作為一種滴眼液而遞送的形式、是一種適合通過吸入給 藥(如通過鼻內(nèi)吸入或口腔吸入)的氣溶膠形式、是一種適合腸胃外給藥(即皮下的、肌 內(nèi)的或靜脈內(nèi)的注射)的形式。對于作為一種可注射溶液或懸浮液的給藥，無毒的腸胃外可接受的稀釋劑或載 體可以包括林格式溶液、等滲鹽水、磷酸鹽緩沖鹽水、乙醇以及1，2丙二醇。對于口服使用合適的載體、稀釋劑、賦形劑以及輔助劑的一些例子包括花生 油、液體石蠟、羧甲基纖維素鈉、甲基纖維素、海藻酸鈉、阿拉伯樹膠、黃蓍樹膠、右 旋糖、蔗糖、山梨糖醇、甘露醇、明膠以及卵磷脂。此外，這些口服配制品可以包含合 適的調(diào)味料以及著色劑。當以膠囊形式使用時，這些膠囊可以用如單硬脂酸甘油酯或二硬脂酸甘油酯的化合物包被，這些化合物延遲了崩解。輔助劑典型地包括柔潤劑類、乳化劑類、增稠劑類、防腐劑類、殺細菌劑 類、以及緩沖劑類。用于口服給藥的固體形式可以包含人類和獸醫(yī)藥學實踐中可接受的粘合劑類、 增甜劑類、崩解劑類、稀釋劑類、調(diào)味料類、涂層劑類、防腐劑類、潤滑劑類和/或延 時劑。適合的粘合劑包括阿拉伯樹膠、明膠、玉米淀粉、黃蓍樹膠、海藻酸鈉、羧甲基 纖維素或聚乙二醇。適合的增甜劑包括蔗糖、乳糖、葡萄糖、天冬酰苯丙氨酸甲酯或糖 精。適合的崩解劑包括玉米淀粉、甲基纖維素、聚乙烯吡咯酮、瓜爾膠、黃原膠、膨潤 土、海藻酸或瓊脂。適合的稀釋劑包括乳糖、山梨糖醇、甘露醇、右旋糖、高嶺土、纖 維素、碳酸鈣、硅酸鈣或磷酸氫二鈣。適合的調(diào)味劑包括薄荷油、冬青油、櫻桃、桔子 或覆盆子調(diào)味料。適合的涂層劑包括丙烯酸和/或甲基丙烯酸和/或它們的酯類的聚合 物或共聚物、蠟、脂肪醇類、玉米素、蟲膠或面筋。適合的防腐劑包括苯甲酸鈉、維生 素Ε、α-生育酚、抗壞血酸、對羥基苯甲酸甲酯、對羥基苯甲酸丙酯或亞硫酸氫鈉。適 合的潤滑劑包括硬脂酸鎂、硬脂酸、油酸鈉、氯化鈉或滑石。適合的延時劑包括單硬脂 酸甘油酯或二硬脂酸甘油酯。除以上試劑外，用于口服給藥的液體形式還可以包含一種液體載體。適合的 液體載體包括水、油類，如橄欖油、花生油、麻油、向日葵油、紅花油、花生油、椰子 油、液體石蠟、乙二醇、丙二醇、聚乙二醇、乙醇、丙醇、異丙醇、甘油，脂肪醇類、 甘油三酸酯類或它們的混合物。用于口服給藥的懸浮液可以進一步包含分散劑類和/或助懸劑類。適合的助懸 劑包括羧甲基纖維素鈉、甲基纖維素、羥丙基甲基纖維素、聚乙烯吡咯酮、海藻酸鈉或 乙酰醇。適合的分散劑包括卵磷脂、脂肪酸(如硬脂酸)的聚氧乙烯酯類、聚氧乙烯山 梨糖醇單-或二-油酸酯、-硬脂酸酯或-月桂酸酯、聚氧乙烯山梨聚糖單-或二-油酸 酯、_硬脂酸酯或-月桂酸鹽酯，等等。用于口服給藥的乳液可以進一步包括一種或多種乳化劑。適合的乳化劑包括如 以上所列舉的分散劑類或天然樹膠，如瓜爾膠、阿拉伯樹膠或黃蓍樹膠。用于制備可胃腸外給藥的組合物的方法對于本領域中普通技術(shù)人員是清楚的， 并且更詳細地描述于例如 Remington' s Pharmaceutical Science, 15th ed., Mack Publishing Company, Easton, Pa.中，從而通過引用結(jié)合在此。本發(fā)明的局部配制品包含與一種或多種可接受的載體一起的一種活性成分、以 及可任選地任何其他治療性成分。適合局部給藥的配制品包括適于滲透穿過皮膚到達 需要治療的位點的液體或半液體制品，如搽劑、洗液、乳劑、軟膏或糊劑，以及適合對 眼、耳或鼻給藥的滴劑。根據(jù)本發(fā)明的滴劑可以包括無菌的水性或油性溶液或懸浮液。這些可以通過將 活性成分溶解在一種殺菌的和/或殺真菌的試劑和/或任何其他合適的防腐劑的、并且可 任選地包括一種表面活性劑的水溶液中來制備。然后可以將生成的溶液通過過濾澄清、 轉(zhuǎn)移到一個適合的容器中并且滅菌。滅菌可以通過以下方式來完成在高壓滅菌或維持 在90°C-100°C下半小時、或通過過濾，隨后通過一種無菌技術(shù)轉(zhuǎn)移到一個容器中。適合 包含在滴劑中的殺菌的和殺真菌的試劑的例子是苯汞的硝酸鹽或醋酸鹽(0.002%)、氯化芐烷銨(0.01% )以及醋酸氯己定(0.01% )。用于制備一種油性溶液的適合的試劑包括甘 油、稀釋的乙醇以及丙二醇。根據(jù)本發(fā)明的洗液包括適合應用于皮膚或眼睛的那些。一種洗眼液可以包含一 種無菌的水溶液(該水溶液可任選地包含一種殺細菌劑)并且可以通過與以上所述的與 制備滴劑的相關的那些方法類似的方法來制備。應用于皮膚的洗液或搽劑還可以包括一 種用來加速干燥以及用來冷卻皮膚的試劑，例如如乙醇或丙酮、和/或一種保濕劑如甘 油，或油如蓖麻油或花生油。根據(jù)本發(fā)明的乳劑、軟膏或糊劑是用于外部施用的活性成分的半固體配制品。 它們可以通過將活性成分以精細分散的或粉末的形式、單獨地或以一種水性或非水性流 體在溶液或懸浮液中、與一種油脂的或非油脂的基底進行混合來制成。該基底可以包括 烴類，如硬的、軟的或液體石蠟、甘油、蜂蠟、一種金屬皂；一種黏液；一種自然來源 的油，如杏仁、玉米、花生、蓖麻或橄欖的油；羊毛脂或它的衍生物、或一種脂肪酸， 如硬脂酸或油酸與一種醇(如丙二醇或聚乙二醇)一起。該組合物可以摻入任何適合的表面活性劑，如一種陰離子的、陽離子的或非離 子的表面活性劑，如山梨聚糖酯類或它們的聚氧乙烯衍生物。還可以包括助懸劑如天然 樹膠、纖維素衍生物或無機材料(如含硅的硅石)、以及其他成分(如羊毛脂)。這些組合物還可以是以脂質(zhì)體的形式來給藥的。脂質(zhì)體通常是從磷脂或其他脂 類物質(zhì)得到的，并且是通過分散于一種水性介質(zhì)中的單-或多-層水合液體晶體來形成 的?？梢允褂媚軌蛐纬芍|(zhì)體的任何無毒的、生理學上可接受的并且可代謝的脂類。脂 質(zhì)體形式的組合物可以包含穩(wěn)定劑、防腐劑類、賦形劑，等等。優(yōu)選的脂類是磷脂以及 磷脂酰膽堿(卵磷脂)，它們兩個是天然的以及合成的。形成脂質(zhì)體的方法在本領域中 是已知的，并且與此具體參考有關的是Prescott，Ed., Methods inCell Biology, Volume XIV，Academic Press, New York, N.Y.(1976)，p.33 et seq.,其內(nèi)容通過引用結(jié)合在此。這些組合物可以與一系列聚乙二醇(PEG)衍生物相關聯(lián)。向蛋白中的加入 PEG(聚乙二醇化作用)是一種得到充分確認的用于降低蛋白的等離子體清除率的方法， 從而增加了它們的療效(Nucci et al.，1991，Adv.Drag Del.Rev.6 133)。聚乙二醇化作 用的另外的優(yōu)點可以包括蛋白更大穩(wěn)定性、降低免疫原性、提高溶解度以及降低對蛋 白水解作用的敏感性(Sheffield W.2001，Curr Drag Targets Cardiovasc HaematolDisord. 1 1-22)。PEG分子包含-(OCH3CH2)n-OH的基本重復結(jié)構(gòu)并且根據(jù)它們的分子量分成幾 組。將PEG衍生物連接到蛋白上以增加它們的流體動力學半徑，并且通常它們在半衰 期上的增加是直接與所連接的PEG鏈的大小相關的(Sheffield W.2001，Curr Drag Targets CardiovascHaematol Disord. 1 1-22)。這些組合物還可以是以微顆粒的形式來給藥的。從聚丙交酯(PLA)、聚丙交 酯-共聚-乙交酯(PLGA)以及e -己內(nèi)酯(ε-己內(nèi)酯)形成的生物可降解的微顆粒已 經(jīng)廣泛地用作藥物載體以增加等離子體半衰期并且從而延長療效(KKumar，M.，2000，
J Pharm Pharmaceut Sci.3⑵234-258)。已經(jīng)配制了微顆粒用于一系列候選藥物(包括疫 苗、抗生素、以及DNA)的遞送。此外，已經(jīng)開發(fā)了這些配制品用于不同的遞送途徑， 包括腸胃外的皮下注射、靜脈內(nèi)注射和吸入。這些組合物可以摻入一種控制釋放的基質(zhì)，該基質(zhì)是由蔗糖乙酸異丁酸酯(SAIB)以及有機溶劑或多種有機溶劑的混合物組成的。可以將聚合物添加劑作為一種釋 放改性劑加入到運載體中以進一步增加粘度并且延緩釋放速率。SAIB是一種熟知的食品 添加劑。它是一種非常疏水的、完全酯化的蔗糖衍生物，標稱比率為六個異丁酸酯比兩 個乙酸酯基團。作為一種混合的酯，SAIB沒有結(jié)晶而是作為一種澄清的粘稠液體而存 在。SAIB與一種藥學上可接受的有機溶劑(如乙醇或苯甲醇)的混合充分降低了該混合 物的粘度從而允許注射?？梢詫⒁环N活性藥物成分加入到該SAIB遞送運載體中以形成 SAIB溶液或懸浮液配制品。當將該配制品皮下注射時，溶劑從基質(zhì)擴散，允許以一種原 位形成貯藏物質(zhì)(in situ forming depot)形成SAIB-藥物或SAIB-藥物-聚合物混合物。為了本發(fā)明的目的，可以將分子以及試劑作為組合物治療性地或預防性地給予 受試者的。在一個治療性應用中，將組合物以足以治愈或至少部分抑制一種疾病以及其 并發(fā)癥的量給予已經(jīng)患有該疾病的一位患者。該組合物應該提供足以有效治療該患者的 量的分子或試劑。本發(fā)明的實施方案還考慮了一種編碼CpnlO的多核苷酸的給藥。在此類情形 下，該多核苷酸典型地是是可操作地連接到一個啟動子上，從而在給予該患者該多核苷 酸之后，生成了適當?shù)亩嚯男蛄?。該多核苷酸可以在一個載體中給予患者。該載體可 以是一種質(zhì)粒載體、一種病毒載體或適合插入外源序列、將它們引入到真核細胞中、并 且將這些引入的序列進行表達的任何其他適合的載體。典型地，該載體是一種真核的表 達載體并且可以包括表達控制以及處理序列，如一個啟動子、一個增強子，核糖體結(jié)合 位點、聚腺苷酸化作用信號以及轉(zhuǎn)錄終止序列。有待給予的核酸構(gòu)建體可以包括裸露的 DNA或可以是與一種或多種藥學上可接受的載體一起的一種組合物的形式。本領域中普通技術(shù)人員應當理解，根據(jù)本發(fā)明的方法，本發(fā)明的CpnlO多肽可 以單獨給藥或與一種或多種另外的試劑聯(lián)合給藥。例如，一種本發(fā)明的CpnlO多肽可以 與能夠刺激TLR受體(如TLR-3)的一種或多種激動劑一起給予。此外，本發(fā)明考慮了使 用本發(fā)明的CpnlO多肽與用于治療疾病或障礙的其他治療方法聯(lián)合的組合療法。例如， CpnlO多肽可以用于病毒性疾病的治療中，使用I型干擾素(如IFN3或IFNl β )的療法 對這些疾病起作用，并且本發(fā)明的CpnlO多肽可以用于與IFNi^聯(lián)合用于治療自身免疫 病，如多發(fā)性硬化癥。對于此類聯(lián)合治療，聯(lián)合治療的各組分可以同時給藥、或以任何次序順序地給 藥、或在不同的時間給藥，從而提供所希望的效果?？商娲兀@些組分可以以一個單 一劑量單位的形式配制在一起成為一種組合產(chǎn)物。當分開給藥時，優(yōu)選的是這些組分可 以通過相同的給藥途徑來給藥，雖然對于這些組分不是必須要這樣做的。劑量對于任何具體患者的治療有效劑量水平將取決于多種因素，這些因素包括所 治療的障礙以及該障礙的嚴重性；所使用的分子或試劑的活性；所使用的組合物；患者 的年齡、體重、總體健康狀況、性別以及日常飲食；給藥時間；給藥途徑；分子或試劑 的隔離(sequestration)速率；治療的持續(xù)時間；與治療聯(lián)合或同時使用的藥物，與醫(yī)學 中所熟知的其他相關因素一起。本領域中普通技術(shù)人員應該能夠通過常規(guī)實驗確定一個治療可適用的疾病或以 及病癥所需要的有效的、無毒的量的試劑或化合物。
通常地，一個有效劑量預期是在每兩周每千克體重大約O.OOOlmg至大約IOOmg 的范圍內(nèi)；典型地，每兩周每千克體重大約O.OOlmg至大約75mg ；每兩周每千克體重大 約O.Olmg至大約50mg ；每兩周每千克體重大約0.05mg至大約50mg ；每兩周每千克體 重大約O.lmg至大約IOmg ；近似地，每兩周每千克體重大約O.lmg。在此還考慮了每周
一次或每三周一次的基礎上給予該劑量?？商娲?，一個有效劑量可以是每兩周每位患者大約25mg至150mg。通常地， 一個有效劑量預期是在每兩周每位患者大約2.5mg至大約750mg的范圍內(nèi)，優(yōu)選每兩周 每位患者大約IOmg至大約350mg，更優(yōu)選每兩周每位患者大約25mg至大約150mg，甚 至更優(yōu)選每周大約25mg至大約200mg。在典型情況下，在治療性應用中，這種治療是要針對疾病狀態(tài)的持續(xù)期間。此外，本領域中普通技術(shù)人員應當清楚的是，單獨劑量的最佳量和間隔將通過 所治療的疾病狀態(tài)的性質(zhì)和程度、給藥的形式、途徑以及位點、以及所治療的具體個體 的性質(zhì)來確定。同樣地，這些最適宜的條件可以通過常規(guī)技術(shù)來確定。本領域中普通技術(shù)人員還應該清楚的是，最佳的療程(如對于規(guī)定天數(shù)，每天 所給予的組合物的劑量的數(shù)量)可以由本領域中普通技術(shù)人員使用治療確定試驗的常規(guī) 療程來確定。現(xiàn)在將通過引用具體實施例對本發(fā)明進行說明，它們不得以任何方式解釋為限 制本發(fā)明的范圍。
實施例實施例1 CpnlO多肽的生產(chǎn)為了進一步定義本發(fā)明CpnlO多肽的生產(chǎn)方法，提供了以下非限制性實施例。首先，將一個編碼人CpnlO (經(jīng)修飾或未經(jīng)修飾)的熱誘導表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)化進 入大腸桿菌菌株XLl-Blue(Stratagene)中，并且從一個單獨的選出的克隆建立了一個 主細胞庫。然后在大腸桿菌中基本上如由Ryan等人所述(1995，J Biol Chem 270 22037-22043)生產(chǎn)CpnlO。此外，將沒有結(jié)合Macro-Prep High Q (BioRad)的物質(zhì)通過 S-Sepharose并且然后通過凝膠過濾(Superdex200, Amersham Biosciences)進行進一步純 化。將在一個50mM Tris-HCl (pH 7.6)以及150mM NaCl緩沖液中的純化的CpnlO根據(jù) 生產(chǎn)廠家的說明書通過具有 0.2mm Mustang E 膜的 Acrodisc (Pall Corporation, Ann Arbor, MLCat NO.MSTG5E3)進行過濾從而去除殘余的內(nèi)毒素并且在-70°C下保存。通過在 SDS-PAGE上的考馬斯亮藍染色，測定CpnlO (例如，如圖3中所示的不同的CpnlO突變 體多肽)的純度為>99%。在使用之前，立即將等分部分解凍。實施例2 CpnlO蛋白的分子伴侶活性為了檢驗與分子伴侶活性相關的不同氨基酸殘基的重要性、它們的潛在電 荷、以及這些殘基的位置，諸位發(fā)明人測試了包含一個或多個突變并且具有或不具有 一個額外N端丙氨酸(Ala)殘基的CpnlO多肽(參見表1)檢測作為分子伴侶起作用 以及與大腸桿菌GroEL聯(lián)合折疊蛋白的能力。這是使用適合Weber F.和Hayer-Hartl M.K. (ChaperoninProtocols, Ed Schneider C.，Humana Press Inc., 2000，pll7_126)的一種 方法、通過測定硫氰酸酶體外重折疊來確定的。
將天然的牛硫氰酸酶(30μ Μ, SIGMA)在一個 20mM MOPS-KOH (pH 7.5)、 IOOmM KCl以及20mM MgCl2 (緩沖液A)(包含5M鹽酸胍以及8mM DTT)中變性，然后 隨后從變性劑稀釋(75倍)到緩沖液A(包含GrOEL(400nM))中，從而使得硫氰酸酶的最 終濃度是400nM。GroEL快速并穩(wěn)定地結(jié)合到變性的硫氰酸酶(D-Rho)上，然而單獨在 緩沖液中，D-Rho錯折疊并且聚集(即無效的自發(fā)折疊)。加入CpnlO以及ATP(20.1mM) 預先形成GroEL結(jié)合硫氰酸酶的穩(wěn)定復合物允許進行有效折疊。在缺少CpnlO的情況 下，加入ATP引起了 D-Rho以一種不能折疊的方式循環(huán)上下GroEL，最終導致錯折疊并 且聚集(此反應用作一個適合的分析空白試驗)。每個折疊反應具有的總體積為290 μ L， 在特定的時間點(即O、15、30、45、60、75、90分鐘)，取出30 μ L等分部分并且與 70 μ L 的硫氰酸酶活性測定混合物(57.ImM KH2PO4 (pH 7.5)、71.4mM EDTA、71.4mM硫 代硫酸鈉以及71.4mM KCN)合并6分鐘。在用ATP引發(fā)折疊反應之前，在折疊時間點 T = O分鐘，取出30yL等分部分。硫氰酸酶活性測定混合物之內(nèi)的EDTA螯合了 Mg2+ 離子，這阻止了 GroEL結(jié)合ATP，結(jié)果是該折疊反應的立即終止。隨后，在加入50 μ L 的15% (體積/體積)甲醛(終濃度5%體積/體積)6分鐘后硫氰酸酶活性終止。硫氰酸酶催化了從硫代硫酸鹽與氰化物形成硫氰化物(‘硫氰酸鹽’)。通過 在硝酸鐵的存在下形成它的紅色鐵絡合物，硫氰化物是容易用色度法檢測到的(吸光度 450nm)。通過加入150 μ L的硝酸鐵試劑(164.5mM硝酸鐵以及9.2% ν/ν硝酸)開發(fā)了 硫氰酸酶活性測定(150 μ L)。硫氰酸酶活性測定是在96孔板上在A450nm處讀取的。隨著時間進行，一個典型的硫氰酸酶折疊反應在硫氰酸酶活性(即折疊的硫氰 酸酶)方面沿指數(shù)傾斜達到折疊的硫氰酸酶的最大產(chǎn)量。在恒量的GrOEL(400nM)以及 硫氰酸酶(400nM)情況下，隨著CpnlO的量的增加(直到CpnlO (7鏈節(jié))與GroEL (14鏈 節(jié))達到相同的摩爾濃度(即400nM)，觀察到一個線性關系(在硫氰酸酶活性與時間之 間)。在CpnlO的濃度高于400nM的情況下，硫氰酸酶活性的增加快速達到一個最大值。 該測定由五個標準樣品(一式兩份)以及多個測試樣品(一式兩份)組構(gòu)成。CpnlO標 準樣品的濃度是OnM、140nM、250nM、280nM以及350nM。將從30、45、60、75以及 90分鐘時間點測量的硫氰酸酶活性(即CpnlO活性)進行平均。OnM CpnlO標準樣品用 作測定的背景活性的適合的測量；因此將OnM CpnlO標準樣品的吸光度值從所有其他計 算的吸光度值(或活性值)中減去。在背景修正后，將280nMCpnl0標準樣品的吸光度 值指定為100%活性并且將所有其他的吸光度值轉(zhuǎn)換成基于100%標準樣品的一個相對％ 活性。通過比較重復測量結(jié)果，將偏離的數(shù)據(jù)點去除，重復樣品之間>30%偏差則被認 定為不能接受的。使用可接受的數(shù)據(jù)，用五個標準濃度OnM CpnlO (0%活性)、140nM Cpnl0(50% 活性)、250nM CpnlO (89.3% 活性)、280nM CpnlO (100% 活性)以及 350nM CpnlO (125%活性)生成了一個線性的校準曲線。將硫氰酸酶活性(即Ala-CpnlO活性) 對Ala-CpnlO濃度繪圖。為了修正測定偏差，將來自測試樣品的百分比活性值使用從線 性校準曲線生成的方程式進行重新計算。使用這些蛋白的寡聚分子量(MW)計算伴侶蛋白(GroEL以及CpnlO)的濃 度，而使用單體MW計算硫氰酸酶；例如大腸桿菌GroEL 14鏈節(jié)(SwissProt P0A6F5) =800,766.4g/mol，人 Ala_Cpnl07 鏈節(jié)(SwissProt P61604) = 76,100.5g/mol，人 X-CpnlO-Y75K 7 鏈節(jié)=75,358.5g/mol,人 Ala_CpnlO_Y75K 7 鏈節(jié)=75,855.5g/mol 以及牛硫氰酸酶 1 鏈節(jié)(SwisProt POO586) = 33,164.6g/moL如以下表1中所示，從一個Ala-CpnlO標準曲線線性方程式測定多種CpnlO蛋白 的活性。所有的反應都是一式兩份地完成的。表1:伴侶蛋白10活性
權(quán)利要求
1.一種分離的CpnlO多肽，與Ala-CpnlO多肽相比該多肽具有對一種PRR配體的增 加的親和性。
2.如權(quán)利要求1所述的多肽，其中所述PRR配體調(diào)節(jié)PRR信號，此類PRR選自下 組，其構(gòu)成為Toll樣受體(TLR)、結(jié)合核苷酸的結(jié)構(gòu)域含LRR家族(NLR)、RIG_I樣 受體(RLR)、IRF的DNA依賴性激活劑(DAI)、C型凝集素受體(CLR)、或IFI20X/IFI16 家族的一個成員(例如Ifil6、Aim2、MNDA以及IFIX)。
3.如權(quán)利要求2所述的多肽，其中所述TLR是選自下組，其構(gòu)成為TLR3、TLR7、 TLR8或TLR9中的至少一種。
4.如權(quán)利要求1至3中任一項所述的多肽，其中所述多肽與Ala-CpnlO多肽相比具有 更多的凈正電荷。
5.如權(quán)利要求4所述的多肽，其中所述多肽具有Ala-CpnlO分子的至少一個突變，其 中所述突變是一種氨基酸取代、加入或缺失。
6.如權(quán)利要求5所述的多肽，其中所述突變是用一個或多個帶正電荷的殘基或中性殘 基代替一個或多個氨基酸殘基。
7.如權(quán)利要求5所述的多肽，其中所述突變是用一個或多個中性殘基代替一個或多個 氨基酸殘基。
8.如權(quán)利要求6所述的多肽，其中所述帶正電荷的殘基是選自下組，該組包括一 個精氨酸(R)、賴氨酸(K)、以及組氨酸(H)。
9.如權(quán)利要求7所述的多肽，其中所述中性殘基是選自下組，該組包括天冬酰胺 (N)、谷氨酰胺(Q)、絲氨酸(S)、蘇氨酸(T)、甘氨酸(G)、丙氨酸(A)、纈氨酸(V)、 亮氨酸(L)、異亮氨酸⑴、脯氨酸(P)、苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W)、半胱 氨酸(C)、甲硫氨酸(M)以及組氨酸(H)。
10.如權(quán)利要求6至9中任一項所述的多肽，其中所述突變是或者在移動環(huán)或者在頂 環(huán)中的、或者在一個位置上，該位置中一個殘基具有在該CpnlO分子的或者內(nèi)表面或者 外表面中的一個暴露的自由側(cè)鏈，或它們的組合上的一種突變。
11.如權(quán)利要求5至10中任一項所述的多肽，其中所述多肽包括在一個氨基酸位置上 的一種突變，該氨基酸位置選自下組，其構(gòu)成為所述野生型CpnlO分子的位置1-7、 9、 12-14、 16、 18-42、 44、 46、 50、 52-63、 65-69、 73-79、 81、 83-89、 91 至 94、以 及96、98、100、101，或它們的組合。
12.如權(quán)利要求1至11中任一項所述的多肽，其中所述多肽包括選自下組的一種突 變，該組的構(gòu)成為Al (K、R 或 H)、G2(K、R 或 H)、Q3 (K、R 或 H)、A4(K、R 或 H)、F5(K、R 或 H)、R6(K 或 H)、K7 (R 或 H)、L9 (K、R 或 H)、F12(K、R 或 H)、 D13(K、R、H、N、Q、G、A、V、L、I、P、F、Y、W、C、Μ、S 或 Τ)、R14(K 或 H)、L16(K、R 或 H)、E18(K、R、H、N、Q、G、A、V、L、I、P、F、Y、W、C、 M、S 或 T)、R19(K 或 H)、S20(K、R 或 H)、A21(K、R 或 H)、A22 (K、R 或 H)、 E23(K、R、H、N、Q、G、A、V、L、I、P、F、Y、W、C、M、S 或 Τ)、T24(K、R 或 H)、V25(K、R 或 H)、T26(K、R 或 H)、R27 (K 或 H)、G28 (K、R 或 H)、G29 (K、 R 或 H)、130 (K、R 或 H)、M31(K、R 或 H)、L32 (K、R 或 H)、P33 (K、R 或 H)、 E34(K、R、H、N、Q、G、A、V、L、I、P、F、Y、W、C、Μ、S 或 Τ)、Κ35 (R 或H)、S36(K、R 或 H)、Q37(K、R 或 H)、G38(K、R 或 H)、K39 (K、R 或 H)、V40 (K、 R 或 H)、L41(K、R 或 H)、Q42 (K、R 或 H)、T44(K、R 或 H)、V46 (K、R 或 H)、 S50(K、R 或 H)、S52(K、R 或 H)、K53 (R 或 H)、G54(K、R 或 H)、K55 (R 或 H)、 G56(K、R 或 H)、G57(K、R 或 H)、E58 (K、R、H、N、Q、G、A、V、L、I、P、 F、Y、W、C、M、S 或 T)、159 (K、R 或 H)、Q60 (K、R 或 H)、P61(K、R 或 H)、 V62(K、R 或 H)、S63(K、R 或 H)、K65(R 或 H)、V66(K、R 或 H)、G67 (K、R 或 H)、 D68(K、R、H、N、Q、G、A、V、L、I、P、F、Y、W、C、Μ、S 或 Τ)、Κ69 (R 或 H)、Ρ73(Κ、R 或 H)、Ε74(Κ、R、H、N、Q、G、A、V、L、I、P、F、Y、W、C、 M、S 或 T)、Y75(GK、K、R、H、E)、G76 (K、R 或 H)、G77 (K、R 或 H)、T78 (K、 R 或 H)、K79(R 或 H)、V81(K、R 或 H)、D83 (K、R、H、N、Q、G、A、V、L、I、 P、F、Y、W、C、M、S 或 T)、D84(K、R、H、N、Q、G、A、V、L、I、P、F、 Y、W、C、M、S 或 T)、K85(K、R 或 H)、D86 (K、R、H、N、Q、G、A、V、L、 I、P、F、Y、W、C、M、S 或 T)、Y87(K、R 或 H)、F88 (K、R 或 H)、L89 (K、R 或 H)、R91(K 或 H)、D92(K、R、H、N、Q、G、A、V、L、I、P、F、Y、W、C、M、 S 或 T)、G93(K、R 或 H)、D94(K、R、H、N、Q、G、A、V、L、I、P、F、Y、W、 C、M、S 或 T)、L96(K、R 或 H)、K98(R 或 H)、VlOO (K > R 或 H)、DlOl (K > R、H、 N、Q、G、A、V、L、I、P、F、Y、W、C、M、S 或 T)、MH-CpnlO, MR-CpnlO, MK-CpnlO, MKK-CpnlO, MKKK-Cpnl 0, Ala_CpnlO_K21、Ala_CpnlO_KK21、 Ala-Cpnl0-K39、Ala_CpnlO_KK39、Ala_CpnlO_K57、Ala_CpnlO_KK57、 Ala-Cpn 10-K76、Ala_CpnlO_KK76、Ala_CpnlO_K85、Ala_CpnlO_KK85、Ala-CpnlO-K 102、Ala-Cpnl0-KK102、AD13、ΔΕ18、ΔΕ23、ΔΕ34、ΔΕ58、ΔΕ68、ΔΕ74、 AD83、AD84、AD86、AD92、ΔD94 以及 ΔD101、或它們的組合。
13.如權(quán)利要求1至12中任一項所述的多肽，其中所述多肽包括兩種或多種所述突變 的組合。
14.如權(quán)利要求13所述的多肽，其中所述多肽包括選自下組的多種突變，該組的構(gòu)成 為F12K、D92K ； E18K、DlOlK ； E34Q、Y75K ； Q42K、DlOlK ； T44K、DlOlK ； S50K、DlOlK ； Q60K> T78K ； E74K、Y75E ； Y75GK ； Y75G、G76K ； Y75K、D94K 以及 Y75K、D94N。
15.如權(quán)利要求1至14中任一項所述的多肽，其中所述多肽缺少、或基本上缺少N末 端、移動環(huán)、發(fā)夾結(jié)構(gòu)頂環(huán)，或它們的組合。
16.如權(quán)利要求1至15中任一項所述的多肽，其中所述多肽包括選自下組的一個氨基酸序列，該組的構(gòu)成為SEQ ID Nos.34、37、40、43、46|、49、52、55、 58、 61、64、(67、70、 73、 76、79、82,85, 88, 91、94、97、100、103、106、109、112、115、(118、121、 124、127、130、133、 136、139、142、145、148、151、154、157、160、(163、166、 169、172、175、178、 181、184、187、190、193、196、199、202、205、(208、211、 217、220、223、226、 229、232、235、238、241、244、247、250、253、(256、259、 262、271、274、277、 280、283、286、289、292、295、298、301、304、(307、310、 313、316、319、322、 325、328、331、334、337、340、343、346、349、(352 或 355。
17.如權(quán)利要求1至15中任一項所述的多肽，其中所述多肽是人CpnlO。
18.一種分離的核酸，該核酸編碼根據(jù)權(quán)利要求1至17中任一項所述的一種多肽。
19.一種表達構(gòu)建體，包括根據(jù)權(quán)利要求18所述的一種核酸，其中所述構(gòu)建體可操作 地連接到一個或多個調(diào)節(jié)序列上。
20.一種宿主細胞，該宿主細胞表達了根據(jù)權(quán)利要求1至17中任一項所述的一種多 肽、或包括根據(jù)權(quán)利要求18所述的一種核酸或根據(jù)權(quán)利要求19所述的一種表達構(gòu)建體。
21.一種抗體，該抗體選擇性地結(jié)合到根據(jù)權(quán)利要求1至17中任一項所述的一種多肽上。
22.—種藥物組合物，包括根據(jù)權(quán)利要求1至17中任一項所述的一種多肽，該多肽或 是單獨地或是與至少一種基于核酸的PRR配體組合，根據(jù)權(quán)利要求18所述的一種核酸， 根據(jù)權(quán)利要求19所述的一種表達構(gòu)建體或根據(jù)權(quán)利要求21所述的一種抗體或它們的任意組合。
23.—種治療一位受試者的方法，包括以下步驟對所述受試者給予一個治療有效量 的根據(jù)權(quán)利要求1至17中任一項所述的一種多肽，該多肽或是單獨地或是與至少一種基 于PRR核酸的配體組合、或根據(jù)權(quán)利要求18所述的一種核酸、或它們的任意組合。
24.如權(quán)利要求23所述的方法，其中所述治療調(diào)節(jié)了受試者體內(nèi)的免疫應答，其中所 述免疫應答是通過PRR信號的調(diào)整來調(diào)節(jié)的。
25.用于在一位受試者體內(nèi)治療或預防一種疾病、障礙或病癥的一種方法，該方法包 括對該受試者給予一個有效量的根據(jù)權(quán)利要求1至17中任一項所述的一種多肽，該多肽 或是單獨地或是與至少一種基于核酸的PRR配體組合，或根據(jù)權(quán)利要求18所述的一種核 酸、或它們的任意組合。
26.根據(jù)權(quán)利要求25所述的方法，其中所述疾病、障礙或病癥是選自急性或慢 性炎性疾病，如胰島素依賴型糖尿病、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、斯耶格倫病、格雷夫斯病、 多發(fā)性硬化癥、類風濕性關節(jié)炎、慢性疲乏綜合征、阿耳茨海默病、哮喘、過敏癥、 GVHD、動脈粥樣硬化、炎性疼痛、牛皮癬、HIV、慢性免疫激活、慢性肌炎、硬皮?。?或癌癥，如非小細胞肺癌、腎細胞癌、黑色素瘤、非何杰金氏淋巴瘤、結(jié)腸直腸癌、基 底細胞癌；或一種傳染性疾病，該傳染性疾病可以是一種細菌性、病毒性或真菌的感染 的結(jié)果。
27.用于在一位受試者體內(nèi)或在他的至少一個細胞、組織或器官中調(diào)節(jié)PRR信號的一 種方法，該方法包括給予一個治療有效量的根據(jù)權(quán)利要求1至17中任一項所述的一種多 肽或根據(jù)權(quán)利要求18所述的一種核酸或它們的任意組合。
28.用于在一位受試者體內(nèi)或在他的至少一個細胞、組織或器官中調(diào)節(jié)一種或多種免 疫調(diào)節(jié)劑的產(chǎn)生和/或分泌的一種方法，該方法包括給予一個治療有效量的根據(jù)權(quán)利要 求1至17中任一項所述的一種多肽或根據(jù)權(quán)利要求18所述的一種核酸或它們的任意組合。
29.用于在一位受試者體內(nèi)或在他的至少一個細胞、組織或器官中抑制一種或多種免 疫調(diào)節(jié)劑的產(chǎn)生和/或分泌的一種方法，該方法包括給予一個有效量的根據(jù)權(quán)利要求1至 17中任一項所述的一種多肽或根據(jù)權(quán)利要求18所述的一種核酸或它們的任意組合。
30.如權(quán)利要求28或29所述的方法，其中所述免疫調(diào)節(jié)劑是一種促炎細胞因子或趨化因子或一種抗炎細胞因子或趨化因子，其中所述細胞因子或趨化因子是選自TNF-α、 IL-I α/β、IL-6、IL-10、IL-12、IL-17、IL-18、IL-23、RANTES > TGF-β 或一種 I 型干擾素，該I型干擾素可以是IFN- α、IFN- β或IFN_ Y。
31.一種鑒定一種化合物的方法，該化合物結(jié)合到根據(jù)權(quán)利要求1至17中任一項所述 的一種多肽上，該方法包括以下步驟(a)將一種候選化合物與所述多肽進行接觸；并且(b)檢測該候選化合物與所述多肽之間的一種復合物的形成。
32.如權(quán)利要求31所述的方法，其中所述檢測是選自下組，該組包括競爭性結(jié)合 測定、凝膠過濾色譜法、AlphaScreen 高通量篩選、一種雙雜交測定、一種電泳遷移 率(凝膠遷移)檢測、以及一種孔板捕獲檢測(plate capture assay)。
33.篩選一種化合物的一種方法，該化合物調(diào)節(jié)根據(jù)權(quán)利要求1至17中任一項所述的 一種多肽的活性，該方法包括以下步驟(a)將所述多肽與一種候選化合物在適于能夠使所述候選化合物與所述多肽相互作用 的條件下進行接觸；并且(b)檢測所述多肽的活性。
34.篩選一種PRR配體的一種方法，該方法包括以下步驟(a)將根據(jù)權(quán)利要求1至17中任一項所述的一種多肽與一種候選PRR配體化合物在 適于能夠使所述候選化合物與所述多肽相互作用的條件下進行接觸；并且(b)檢測與野生型CpnlO相比所述化合物與所述多肽的增加的親和性；和/或(C)在候選PRR配體化合物以及所述多肽的存在下檢測減小的或增加的PRR活化作用。
35.如權(quán)利要求1至17中任一項所述的多肽，其中所述多肽是一種功能性變異體、衍 生物、同系物、類似物或片段。
全文摘要
本發(fā)明涉及分離的Cpn10多肽，與AlaCpn10多肽相比該多肽具有對一種PRR配體增加的的親和性。在一個進一步的實施方案中，本發(fā)明還涉及修飾的伴侶蛋白10多肽，并且涉及編碼該多肽的核酸，并且涉及包括此類多肽的組合物，以及它們的用途。
文檔編號A61K38/17GK102015757SQ200980112775
公開日2011年4月13日 申請日期2009年4月9日 優(yōu)先權(quán)日2008年4月11日
發(fā)明者丹尼爾·斯科特·蘭伯特, 克里斯托弗·布魯斯·霍華德, 克里斯托弗·約翰·德貝克爾, 凱利·簡·拉爾斯頓, 安德魯·李·詹姆士, 沃爾特·勒內(nèi)·安東尼斯·萬胡姆恩, 珍妮特·伊麗莎白·斯托克, 理查德·詹姆士·布朗, 琳達·艾利森·沃德, 迪安·詹森·內(nèi)勒 申請人:悉生物有限公司