專(zhuān)利名稱(chēng)：類(lèi)囊體的大規(guī)模制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及從光合成生物，諸如綠色植物葉原料(leaf material)中生產(chǎn)類(lèi)囊體 的大的工業(yè)規(guī)模方法，所述類(lèi)囊體用做食品中的成分、食品添加劑(additions to food)、 食品添加物，或用于在人類(lèi)和動(dòng)物中預(yù)防超重、促進(jìn)飽滿感(promoting satiety)、減少食 物攝取、減輕體重、降低血胰島素濃度、降低血脂和體脂肪百分比的目的的藥物。
背景技術(shù)：
超重和肥胖已經(jīng)成為世界范圍的問(wèn)題。作為代謝綜合癥的一部分，肥胖可以導(dǎo)致 多種疾病，諸如糖尿病、動(dòng)脈硬化和高血壓。肥胖和超重是能量攝入和能量消耗之間不平衡 的結(jié)果，通常是由缺乏食欲控制造成的。單獨(dú)的高脂飲食或其與蔗糖和其它甜味碳水化合 物的共同攝取是引起肥胖的最重要的因素之一，因?yàn)檫@些飲食容易促進(jìn)暴食。在本發(fā)明中， 我們還發(fā)現(xiàn)如在此描述的類(lèi)囊體的制備在人類(lèi)中有相似的效果。對(duì)于人類(lèi)的應(yīng)用，需要大 規(guī)模的制備。迄今為止，類(lèi)囊體的小規(guī)模實(shí)驗(yàn)室制備與在光合作用研究中使用的方式基本相 同，后者使用含有可保持類(lèi)囊體功能完整性，即在生物電子傳遞中有活性的組合物和保存 的氧化還原系統(tǒng)的培養(yǎng)基。然而，要能以大規(guī)模生產(chǎn)類(lèi)囊體將面臨大量問(wèn)題，包括維持蛋白質(zhì)的完整性，即它 們不應(yīng)該降解。此外，葉細(xì)胞中不需要的組分需要被有效除去，從而從最終產(chǎn)品中清除或基 本除去不需要的組分。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明涉及適合含有類(lèi)囊體的膜級(jí)分(fraction)制備的工業(yè)生產(chǎn)的大規(guī)模方 法。給予人類(lèi)和動(dòng)物類(lèi)囊體需要該方法。在本發(fā)明中描述了類(lèi)囊體對(duì)人類(lèi)在促進(jìn)飽滿感和 預(yù)防超重方面的多種影響。當(dāng)按比例放大方法(其中該方法涉及植物原料)時(shí)，存在若干問(wèn) 題。對(duì)于植物原料而言，植物細(xì)胞由于覆蓋所述細(xì)胞的堅(jiān)硬細(xì)胞壁而難以破壞。并且已經(jīng) 生長(zhǎng)于室外曠野中的植物原料已經(jīng)暴露于不同種類(lèi)的微生物以及不同的氣候條件(這些 是無(wú)法控制的)。此外，不需要的化合物，諸如，例如重金屬被植物的根攝取，可能影響方法 和最終產(chǎn)品。當(dāng)植物原料在溫室中于受控條件下生長(zhǎng)時(shí)問(wèn)題永遠(yuǎn)不會(huì)出現(xiàn)。在收獲植物原 料時(shí)，非常重要的是，植物內(nèi)部的所有過(guò)程均停止以及微生物不知何故被滅活。如果植物中 的代謝不停止，將出現(xiàn)植物原料的降解，從而使類(lèi)囊體的分離方法無(wú)法實(shí)現(xiàn)。本發(fā)明的目的 是快速有效的分離類(lèi)囊體以及維持類(lèi)囊體的結(jié)構(gòu)，其中蛋白質(zhì)是完整的，并且用類(lèi)囊體作 為食品中的成分、食品添加劑、食品添加物、或在人類(lèi)和動(dòng)物中促進(jìn)飽滿感、延緩脂肪消化、 降低血胰島素、減少諸如甘油三酯的血脂肪酸和體脂肪的藥物。在第一個(gè)方面，本發(fā)明涉及一種用于生產(chǎn)至少一種類(lèi)囊體膜級(jí)分的大規(guī)模方法， 包括下述步驟收集超過(guò)500kg的量的至少含有類(lèi)囊體的植物或藻類(lèi)，用溶液將所述植物 或藻類(lèi)均質(zhì)化為勻漿液(homogenate)，從勻漿液中除去植物殘?jiān)诩?jí)分中收集類(lèi)囊體，濃縮級(jí)分并且將濃縮的級(jí)分干燥成粉末或顆粒?？蛇x地，可以和類(lèi)囊體一起獲得/純化核酮 糖二磷酸羧化酶-加氧酶。在第二個(gè)方面，本發(fā)明涉及一種用于生產(chǎn)膜級(jí)分的大規(guī)模方法，包括下述步驟收 集超過(guò)500kg的量的含有類(lèi)囊體的植物或藻類(lèi)，用含有例如EDTA的溶液將所述植物或藻類(lèi) 均質(zhì)化為勻漿液，從勻漿液中除去植物殘?jiān)?，在?jí)分中收集類(lèi)囊體，濃縮級(jí)分，用乙醇洗滌 級(jí)分，可選地將濃縮的級(jí)分干燥成粉末或顆粒。在第三個(gè)方面，本發(fā)明涉及一種可用如上所述和在詳細(xì)說(shuō)明中所述的方法獲得的產(chǎn)品。在第四個(gè)方面，本發(fā)明涉及所述的產(chǎn)品在治療中的應(yīng)用。在第五個(gè)方面，本發(fā)明的涉及所述產(chǎn)品在制備用于在人類(lèi)和動(dòng)物中治療超重、促 進(jìn)飽滿感、減少食物攝取、減輕體重、降低血胰島素濃度、減少諸如甘油三酯的血脂肪酸、和 降低體脂肪百分比或減少炎癥的藥物中的應(yīng)用。


圖1.類(lèi)囊體的沉淀作為PH的函數(shù)。使?jié)舛认嗤玃H不同的類(lèi)囊體懸浮液于 容器中靜置一小時(shí)。液體的高度為20cm?？v坐標(biāo)顯示有多少類(lèi)囊體保留在上清液中(如 680nm(其中類(lèi)囊體具有最大吸光度的波長(zhǎng))處的吸光度所測(cè)量)。這證明沉淀在pH 4-5 的范圍內(nèi)是有效的。通過(guò)向PH為7的懸浮液中加入HCl調(diào)節(jié)pH。圖2.將綠葉加工成類(lèi)囊體。第I部分.1.植物原料的洗滌、冷凍和保存；2.混合、 均質(zhì)化和螯合步驟；3.植物殘?jiān)南♂尯头蛛x。1 ；1. 1.洗滌、1.2.冷凍、1.3切割器、1.4包裝保存、1.5保存2 ；2. 1混合、2. 2均質(zhì)化、2. 3螯合劑3 ； 3. 1稀釋、3. 2用傾析器分離圖3.將綠葉加工成類(lèi)囊體。第II部分.4. A.通過(guò)分離器分離類(lèi)囊體；B.通過(guò)pH 沉淀分離類(lèi)囊體；5. A+B.用乙醇處理；6.干燥。4A ；4. 1.分離器、4. 2 沉淀、4. 3 過(guò)濾。4B ；4. 1. pH 沉淀、4. 2. 1.冷凍、4. 2. 2.傾析器、4. 3 過(guò)濾。5Α、Β;5·1·乙醇處理。6.干燥程序。圖4.給予含有或不含有類(lèi)囊體的飲食后人類(lèi)胰島素和葡萄糖水平。如圖所示，類(lèi) 囊體使胰島素分泌顯著減少(左)，和葡萄糖水平?jīng)]有變化(右)。圖5.用高脂飲食(對(duì)照)或富含類(lèi)囊體(類(lèi)囊體)的高脂飲食喂養(yǎng)100天的小 鼠中類(lèi)囊體對(duì)食物攝取(A)、體重(B)和體脂肪(C)的影響。在類(lèi)囊體處理的小鼠中食物攝 取(A)、體重(B)和體脂肪(C)顯著減少。發(fā)明詳述定義在本申請(qǐng)和發(fā)明的上下文中使用下述定義術(shù)語(yǔ)“類(lèi)囊體或類(lèi)囊體膜”意旨任何光合成生物，諸如植物中的光合作用膜。術(shù)語(yǔ)“葉”意旨任何源于植物的綠葉(green leaves) 。
術(shù)語(yǔ)“均質(zhì)化”意旨任何類(lèi)型的混合、研磨、切割，其減小原料(諸如葉)的尺寸以 及將光合成原料分裂、破裂、溶解成更小部分，甚至將原料(諸如植物原料)的細(xì)胞破壞。術(shù)語(yǔ)“切割器”意旨可以將新鮮的或冷凍的光合成原料切割(研磨)成更小碎片 的裝置。術(shù)語(yǔ)“粉碎機(jī)”意旨可以將原料細(xì)胞，諸如葉細(xì)胞破裂或溶解的裝置。術(shù)語(yǔ)“漿液”意旨將光合成原料粉碎并將其與溶劑介質(zhì)混合后的產(chǎn)物。術(shù)語(yǔ)“傾析器”意旨可以在連續(xù)方法中從破裂光合成原料后獲得的含有類(lèi)囊體的 懸浮液中除去大的殘?jiān)T如細(xì)胞壁、細(xì)胞壁碎片、未破碎的細(xì)胞、淀粉粒的裝置。術(shù)語(yǔ)“分離器”意旨在連續(xù)方法中可以通過(guò)離心從其周?chē)后w中大規(guī)模分離并收 集類(lèi)囊體的裝置。術(shù)語(yǔ)“螯合劑”意旨可以通過(guò)與重金屬結(jié)合將其從類(lèi)囊體中除去的試劑。術(shù)語(yǔ)“試劑”意為包含上述術(shù)語(yǔ)螯合劑?！霸噭边€可以指蛋白酶抑制劑。術(shù)語(yǔ)“大規(guī)?！币庵急葘?shí)驗(yàn)室規(guī)模大得多的規(guī)模，例如使用100kg、500kg、IOOOkg 或更多光合成原料作為制備類(lèi)囊體的起始原料。光合成原料可以是植物原料。大規(guī)模方法本發(fā)明涉及從任何光合成生物，諸如葉原料中釋放類(lèi)囊體的大規(guī)模方法。該葉 原料可以從任何綠葉來(lái)源獲得，諸如菠菜、三葉草、油菜、甜菜、羽衣甘藍(lán)(kale)、昆諾阿藜 (quinoa)、草、耶路撒冷洋薊(Jerusalem artichoke)、蒲公英、藜屬(Chenopodium)、濱藜屬 (Atriplex)。原料可以從生長(zhǎng)于自由地帶或溫室中的農(nóng)作物獲得。該方法包括多個(gè)如下所述的步驟(圖2、圖3)。并非所有步驟都是必須的，可以依 據(jù)起始原料，諸如使用何種植物、分離的類(lèi)囊體的用途以及植物已經(jīng)生長(zhǎng)的地點(diǎn)來(lái)納入所 述步驟。葉原料的收獲/收集以及快速冷凍葉原料可以以新鮮原料的形式被處理，或通過(guò)使葉內(nèi)部存在的蛋白質(zhì)降解最小化 以及抑制微生物諸如細(xì)菌和霉菌生長(zhǎng)的方法迅速冷凍。可以在通有由常規(guī)冷凍單元(unit) 產(chǎn)生的冷空氣(_40°C )的冷凍通道內(nèi)或通過(guò)使用液氮(_196°C )進(jìn)行冷凍步驟。作為下一個(gè)步驟，可以使用切割器，諸如常規(guī)混合器將葉原料均質(zhì)化為更小的碎 片(圖2)。實(shí)例是諸如錘磨機(jī)的研磨機(jī)。在保存之前將葉原料進(jìn)行分份以減小冷凍原料的 體積。更進(jìn)一步通過(guò)使用第一冷凍步驟使在冷凍過(guò)程中形成的冰晶刺穿葉細(xì)胞，這可以簡(jiǎn) 化處理步驟。然后可以將葉原料以冷凍穩(wěn)定的形式保存以供進(jìn)一步使用或立即處理。粉碎勻漿液/漿液并用螯合劑處理在均質(zhì)化方法中，用液體，諸如水例如飲用水混合葉原料，諸如將1份葉原料與 1-5份水混合為漿液/勻漿液。其它實(shí)例包括1份葉原料和1、2、3、4或5份水。然后將 漿液/勻漿液轉(zhuǎn)移至粉碎機(jī)，諸如泵入式研磨機(jī)中，進(jìn)行諸如機(jī)械擠壓、諸如超聲的處理， 從而將植物細(xì)胞破碎、溶解或破壞。還可以將葉和葉細(xì)胞暴露于添加的酶浸漬物(enzyme macerases)，諸如單獨(dú)的纖維素酶、半纖維素酶和果膠酶或其組合來(lái)溶解或弱化細(xì)胞壁，以 利于粉碎方法。粉碎步驟將類(lèi)囊體釋放入漿液/勻漿液的溶液中。然后可以用0.5_50mM，諸如 0. 5-40mM、0. 5_30mM、0. l_20mM、0. 5-10mM 或 8-12mM 的金屬螯合劑，諸如 EDTA、EGTA, DTPA,檸檬酸和NTA處理漿液/勻漿液。該螯合劑除去或減少結(jié)合至類(lèi)囊體的重金屬。加入金屬螯合劑抑制類(lèi)囊體膜的聚集。這有利于方法中隨后的步驟，特別是分離 器的使用，并最終導(dǎo)致獲得更純的產(chǎn)品。加入金屬螯合劑還抑制金屬-依賴(lài)型脂肪加氧酶， 其保護(hù)產(chǎn)物免受不需要的脂肪酸降解和氧化。此外，加入金屬螯合劑抑制金屬-依賴(lài)型蛋 白酶，其保護(hù)產(chǎn)品免受不需要的蛋白降解。本發(fā)明還包括能達(dá)到上述某些或全部益處的其它螯合劑、試劑或試劑的組合。例 如，可以包括蛋白酶抑制劑、螯合劑或其組合?？蛇x地，可以在大規(guī)模方法的隨后步驟中，將諸如鈣和/或鎂離子的二價(jià)離子加 回至產(chǎn)物。表1. EDTA對(duì)類(lèi)囊體中重金屬含量的影響(微克/克干重)。在粉碎葉細(xì)胞的過(guò)程中向提取介質(zhì)中加入濃度為IOmM的EDTA。用原子吸收光譜測(cè)定重金屬。在微波爐中將0. 5克干類(lèi)囊體溶解在硝酸和去離 子水(7-3mL)中。用 ICP MS (來(lái)自 Perkin Elmer 的 model Elan 6000)和 ICP AES (來(lái)自 Perkin-Elmer 的 model 0PTIMA3000DV)進(jìn)行分析。Thyl EDTA =用EDTA處理的類(lèi)囊體；對(duì)照=未用EDTA處理的類(lèi)囊體。AlCdCuFePbSnZn
Thyl EDTA 3960，173,44170，230，275，
對(duì)照 38 2，1915，938345，032. 054下述步驟是分離類(lèi)囊體膜的不同步驟，其可以單獨(dú)或組合使用。稀釋漿液/勻漿液并除去植物殘?jiān)谏鲜龆x的步驟之后，漿液/勻漿液中含有植物殘?jiān)图?xì)胞質(zhì)。細(xì)胞質(zhì)含有不 同的細(xì)胞器。進(jìn)一步用諸如飲用水的含水溶液稀釋漿液。例如，可以將漿液稀釋至植物原 料和水(諸如飲用水)的比例為1 5、1 6、1 7、1 9或1 10甚至更高的最終比 例以完成洗滌步驟。通過(guò)例如傾析器或過(guò)濾從漿液中除去植物殘?jiān)?。傾析器從溶液中分離 細(xì)胞部分。類(lèi)囊體的分離、濃縮和洗滌只要結(jié)果是濃縮或分離類(lèi)囊體，可以用多種方式進(jìn)行分離步驟，諸如使用分離器 或PH-沉淀。在一種實(shí)施方式中(圖3. 4A)，使用具有適當(dāng)高的G-數(shù)的分離器從漿液中分離類(lèi) 囊體膜。分離到的類(lèi)囊體級(jí)分的體積將被減少約5、10、15、20或甚至更多倍。為了能夠甚 至進(jìn)一步濃縮類(lèi)囊體級(jí)分，可能將PH降低至4-5之間，優(yōu)選約4.7(圖1)。在該pH，類(lèi)囊體 形成厚的流動(dòng)液相，其易于通過(guò)過(guò)濾、沉降或離心收集。由于可溶性蛋白質(zhì)已經(jīng)被除去，因 此通過(guò)該實(shí)施方式可能產(chǎn)生具有高純度的類(lèi)囊體級(jí)分。在另一種實(shí)施方式中(圖3的4B)，可能在例如使用傾析器除去植物殘?jiān)笸ㄟ^(guò) PH-沉淀分離類(lèi)囊體?？梢匀缟纤鐾ㄟ^(guò)將pH降至4-5之間，優(yōu)選約4. 7進(jìn)行這一步驟(圖 1)，然后不使用分離器從漿液中分離出類(lèi)囊體級(jí)分。在第三種實(shí)施方式中，可以在使用分離器步驟后立即通過(guò)過(guò)濾濃縮類(lèi)囊體，其中 使用例如具有5μπι孔徑的篩網(wǎng)，其能夠收集類(lèi)囊體膜。通過(guò)這一步驟，可能得到具有過(guò)濾 后約25%干重的蛋白質(zhì)級(jí)分。
如果需要，可以通過(guò)凍融步驟進(jìn)一步濃縮類(lèi)囊體，借此從剩余的類(lèi)囊體中分離液 體。取決于分離類(lèi)囊體膜的植物原料或產(chǎn)物將來(lái)的用途可能需要額外的洗滌類(lèi)囊體 級(jí)分的步驟。該洗滌步驟可以包括在飲用水中稀釋類(lèi)囊體膜。5.類(lèi)囊體膜的額外處理可以用任何有機(jī)溶劑處理類(lèi)囊體以防止微生物生長(zhǎng)，諸如用20% -30%的乙醇處 理，諸如至少22%的乙醇，例如22% -25%的乙醇，例如22%的乙醇。使用低百分比以防 止微生物生長(zhǎng)，使用高百分比用于類(lèi)囊體的去脂作用以得到純的蛋白質(zhì)級(jí)分(圖3)。其它 處理可以加入增味組分，或芳香劑或其它適宜的試劑，通過(guò)諸如除去脂類(lèi)(lipids)濃縮產(chǎn) 物。6.干燥類(lèi)囊體膜可以包括額外的干燥類(lèi)囊體膜的步驟作為分離類(lèi)囊體膜的步驟。只要類(lèi)囊體膜保 持其結(jié)構(gòu)，可以使用不同的干燥方式。干燥的例子包括噴霧干燥、空氣干燥、冷凍干燥、二氧 化碳干燥以及真空干燥。用上述方法/過(guò)程獲得的分離的類(lèi)囊體級(jí)分可用作添加劑，并且可以與其它組 分，諸如脂肪、黃油、人造黃油、油、奶油、牛奶、乳酪、干酪、面粉、果汁、軟飲料、茶或任何其 它合適的產(chǎn)品混合。產(chǎn)品的其它例子包括冰淇淋、酸乳酪、蛋糕、面包、谷類(lèi)、生面團(tuán)和調(diào)味 品。類(lèi)囊體膜可以在小藥囊中出售，以便于使用前加入任何產(chǎn)品中。其它產(chǎn)品的例子在PCT/ SE2006/00676 中提及。本發(fā)明的組合物可以用作食物添加劑，并且可以與其它組分，諸如脂肪、黃油、人 造黃油、油、奶油、牛奶、乳酪、干酪、面粉、果汁、軟飲料、茶混合，可以在加入食物產(chǎn)品之前 混合或在加入食物產(chǎn)品的過(guò)程中混合。所述食物添加劑或含有所述組合物的食物組合物可 以是固體、半固體或液體形式。更進(jìn)一步的，其可以冷凍干燥、噴霧干燥或低壓凍干。本發(fā) 明的食物添加劑可以用于任何類(lèi)型的食物產(chǎn)品，也可以單獨(dú)使用。食物產(chǎn)品的例子是脂肪、 黃油、人造黃油、油、奶油、牛奶、乳酪、干酪、面粉、果汁、軟飲料、茶。其它例子是酸乳酪、冰 淇淋、蛋糕、面包和調(diào)味品。本發(fā)明的組合物還可以用作藥物組合物，并且本發(fā)明還涉及可以通過(guò)上述方法或 產(chǎn)生同樣產(chǎn)物的方法獲得的產(chǎn)物的應(yīng)用，所述產(chǎn)物用于制備在人類(lèi)和動(dòng)物中治療超重、促 進(jìn)飽滿感、減少食物攝取、減輕體重、降低血胰島素濃度和降低體脂肪百分比的藥物。藥物組合物含有本發(fā)明的組合物和藥學(xué)上可接受的緩沖劑、賦形劑、載體或稀釋 劑。待治療的疾病的例子為作為疾病或病癥的代謝綜合癥，諸如高血壓、動(dòng)脈硬化、痛風(fēng)、 I型和II型糖尿病、癌癥和血脂障礙。“藥學(xué)上可接受的”指不降低活性成分，即抗微生物 肽的生物活性的有效性的無(wú)毒物質(zhì)。該藥學(xué)上可接受的緩沖劑、載體或賦形劑是本領(lǐng)域 熟知的(見(jiàn)Remington' s Pharmaceutical Sciences，18thedition，A. R Gennaro, Ed.， Mack Publishing Company (1990)以及 handbook of Pharmaceutical Excipients，3rd edition，A. Kibbe，Ed.，Pharmaceutical Press (2000))。術(shù)語(yǔ)“緩沖液”意旨含有酸-堿混合物用于穩(wěn)定PH的含水溶液。緩沖液的實(shí)例 為 Trizma、Bicine、Tricine、MOPS、M0PS0, MOBS、Tris、H印es、HEPBS, MES、磷酸鹽、碳酸鹽、 醋酸鹽、檸檬酸鹽、羥乙酸鹽、乳酸鹽、硼酸鹽、ACES、ADA、酒石酸鹽、AMP、AMPD, AMPSO, BES、CABS、卡可基酸鹽、CHES、DIPSO、EPPS、乙醇胺、甘氨酸、HEPPS0、咪唑、咪唑乳酸、PIPES、SSC、 SSPE、POPSO、TAPS、TABS、TAPSO 禾P TES0術(shù)語(yǔ)“稀釋劑”意旨用于稀釋藥物制劑中肽的含水或非水溶液。稀釋劑可以是一 種或多種鹽水、水、聚乙二醇、丙二醇、乙醇或油(諸如紅花油、玉米油、花生油、棉花籽油或 麻油)。術(shù)語(yǔ)“佐劑”意旨任何加入制劑中以增加肽的生物學(xué)效應(yīng)的化合物。佐劑可以是一 種或多種具有不同陰離子的鋅、銅或銀鹽，所述陰離子例如但不限于氟化物、氯化物、溴化 物、碘化物、硫氰酸鹽、亞硫酸鹽、氫氧化物、磷酸鹽、碳酸鹽、乳酸鹽、羥乙酸鹽、檸檬酸鹽、 硼酸鹽、酒石酸鹽、以及不同?；M成的醋酸鹽。賦形劑可以是一種或多種碳水化合物、聚 合物、脂類(lèi)和礦物質(zhì)。碳水化合物的例子包括乳糖、蔗糖、甘露醇和環(huán)糊精，將其加入組合物 中，例如便于冷凍干燥。聚合物的例子為淀粉、纖維素醚、纖維素羧甲基纖維素、羥丙基甲基 纖維素、羥乙基纖維素、乙基羥乙基纖維素、藻酸鹽、鹿角菜膠、透明質(zhì)酸及其衍生物、聚丙 烯酸、多磺酸鹽(polysulphonate)、聚乙二醇/聚氧化乙烯、聚氧化乙烯/聚氧化丙烯共聚 物、不同水解程度的聚乙烯醇/聚乙烯乙酸酯、和聚乙烯吡咯烷酮，它們均為不同分子量， 加入組合物中例如用于控制粘度、實(shí)現(xiàn)生物粘附、防止脂類(lèi)的化學(xué)和蛋白水解降解。脂類(lèi)的 例子為不同酰基鏈長(zhǎng)和飽和度的脂肪酸、磷脂、單、二和三甘油酯、神經(jīng)酰胺，鞘脂和糖脂; 卵磷脂、大豆卵磷脂、氫化卵磷脂和大豆卵磷脂，其加入組合物的原因與聚合物相同。礦物 質(zhì)的例子為滑石、氧化鎂、氧化鋅和氧化鈦，其加入組合物以獲得諸如減少脂類(lèi)蓄積或更好 的色素性質(zhì)的益處。本發(fā)明的組合物還可以是聚合物凝膠的形式，其中所述聚合物諸如淀粉、纖維素 醚、纖維素羧甲基纖維素、羥丙基甲基纖維素、羥乙基纖維素、乙基羥乙基纖維素、藻酸鹽、 鹿角菜膠、透明質(zhì)酸及其衍生物、聚丙烯酸、多磺酸鹽、聚乙二醇/聚氧化乙烯、聚氧化乙烯 /聚氧化丙烯共聚物、不同水解程度的聚乙烯醇/聚乙烯乙酸酯、和聚乙烯吡咯烷酮，其用 于含肽溶液的增稠。藥物組合物可以經(jīng)歷常規(guī)的藥學(xué)操作，諸如滅菌和/或可以含有常規(guī)佐劑，例如 防腐劑、穩(wěn)定劑、潤(rùn)濕劑、乳化劑、緩沖劑、填充劑等等，例如在本文中別處所公開(kāi)的。合適的制劑形式為，例如顆粒劑、粉劑、片劑、包衣片劑、(微)囊、糖漿劑、乳劑、微 乳劑，其被定義為由水、油、表面活性劑和液體結(jié)晶相組成的光學(xué)各向同性的熱力學(xué)穩(wěn)定的 體系，所述體系被定義為特征在于長(zhǎng)程有序但短程無(wú)序(例子包括水或油連續(xù)的層狀、六 角形和立方體相(cubic phase))，或它們的分散對(duì)應(yīng)物、凝膠、軟膏劑、分散劑、懸浮劑、乳 膏劑、氣霧劑、滴劑或安瓿形式的可注射溶液，以及具有延長(zhǎng)活性化合物釋放的制劑，在所 述制劑中賦形劑、稀釋劑、佐劑或載體如上所述按常規(guī)使用。以藥學(xué)有效劑量將藥物組合物給予患者。“藥學(xué)有效劑量”指足以產(chǎn)生與給藥治療 的病癥有關(guān)的預(yù)期效果的劑量。確切劑量取決于化合物的活性、給藥方式、病癥的性質(zhì)和嚴(yán) 重程度、患者的年齡和體重，可能需要不同的劑量?？梢酝ㄟ^(guò)單個(gè)劑量單位或其它若干更小 的劑量單位的形式的單次給藥給予所述劑量，或還可以通過(guò)特定間隔多次給予亞分份劑量 給予所述劑量。本發(fā)明涉及人類(lèi)以及其它哺乳動(dòng)物，諸如馬、狗、貓、母牛、豬、駱駝、以及其它。因 此所述方法適于人類(lèi)治療也適于獸醫(yī)應(yīng)用?？梢杂靡呀?jīng)完善的標(biāo)志來(lái)鑒別適于該治療的對(duì)象。下面是作為本發(fā)明實(shí)施例的葉綠體膜(類(lèi)囊體)分離及其在抑制胰脂肪酶活性和減少 食物攝取方面應(yīng)用的描述，所述葉綠體膜是從菠菜中分離的。下述實(shí)施例意為解釋而非以 任何方式、形狀、形式明確或隱含的限制本發(fā)明。
實(shí)施例實(shí)施例1從菠菜中生產(chǎn)類(lèi)囊體從菠菜中生產(chǎn)30kg干燥的類(lèi)囊體膜需要約IOOOkg的起始原料。無(wú)水量(drycontent)的菠菜8_9%從菠菜鮮重中獲得約0. 01 % -0. 03% (w/w)的干燥類(lèi)囊體膜級(jí)分。1.使用螺旋壓榨機(jī)和混合器將IOOOkg冷凍的菠菜與飲用水按1 1混合。干物 質(zhì)的量約為85kg。2.加入EDTA至濃度為10mM。3.將勻漿液/漿液稀釋至菠菜與飲用水的終比例為1 10，體積為10m3。使?jié){液 通過(guò)傾析器，從而從液體中除去細(xì)胞殘?jiān)?.用alfa Iaval分離器分離類(lèi)囊體級(jí)分。獲得約600升的干物質(zhì)約5%的濃稠 液體。5.冷凍M小時(shí)、融化、通過(guò)5 μ m濾器過(guò)濾后，將類(lèi)囊體級(jí)分濃縮5倍以成為干物 質(zhì)含量約為25%的糊。從IOOOkg菠菜中獲得120kg糊。6.用冷凍干燥器將糊干燥，得到約30kg干燥的類(lèi)囊體膜。實(shí)施例2產(chǎn)品對(duì)胰島素的效果胰島素具有重要的合成代謝作用，引起暴食和肥胖。因此在多種飲食療法中實(shí)現(xiàn) 降低胰島素水平是重要的。為研究類(lèi)囊體是否影響胰島素分泌，在攝入對(duì)照飲食和含有類(lèi) 囊體飲食的過(guò)程中測(cè)定胰島素分泌。在人類(lèi)中進(jìn)行該研究。11位健康者禁食過(guò)夜，然后給 予對(duì)照飲食或富含類(lèi)囊體的飲食，各飲食之間間隔一周確保清除效果。對(duì)照飲食包含面包、 番茄、含有菜籽油的青醬和添有羅勒(basil)的腰果，而類(lèi)囊體飲食G種不同的實(shí)驗(yàn)飲食) 含有同樣的組分，添加不同劑量的類(lèi)囊體粉(50克、25克、10克或5克)。在0、30分鐘、1 小時(shí)、2小時(shí)、4小時(shí)和6小時(shí)的各時(shí)間點(diǎn)取血樣。測(cè)定葡萄糖和胰島素水平。類(lèi)囊體對(duì)血 漿葡萄糖水平無(wú)影響，但所有劑量都顯著降低胰島素分泌。胰島素分泌的顯著降低表明類(lèi) 囊體粉增加了胰島素的敏感性。該效應(yīng)對(duì)于建立能量平衡極其重要。類(lèi)囊體對(duì)胰島素分泌 的作用經(jīng)50g類(lèi)囊體證實(shí)(圖4)。實(shí)施例3產(chǎn)品對(duì)體脂肪的影響為研究類(lèi)囊體對(duì)體脂肪的影響，喂給小鼠高脂飲食或富含類(lèi)囊體的高脂飲食共 100 天。從 Taconic (Taconic Europe, Lille Skensved, Denmark)獲得 30 只雌性 apoE-缺 陷小鼠并分為兩組(每組n= 1 ；—組接受含有0.15% (按能量計(jì))膽固醇和43% (按 能量計(jì))飽和脂肪的高脂飲食(對(duì)照組；R638，Lactamin, Kimsta, Sweden)，另一組接受富 含類(lèi)囊體的高脂飲食(R638)，使用劑量為6mg葉綠素/g的飲食。對(duì)照飲食和富含類(lèi)囊體的飲食是等熱量的，且在常量營(yíng)養(yǎng)物之間具有相同的熱量組成。于具有1 光照/黑暗循 環(huán)(上午6點(diǎn)開(kāi)燈)的溫控環(huán)境(21°C )下，每籠飼養(yǎng)3只小鼠。小鼠在所有時(shí)間都自由 進(jìn)食各自的飲食并飲用自來(lái)水。每隔一天測(cè)量一次食物攝取量，每周測(cè)量?jī)纱误w重。研究 持續(xù)100天。最后，禁食四小時(shí)后收集血液，并用Sigma(Sigmadiagnostics，Steinheim, Gernany)的GPO-Trinder試劑盒測(cè)定血清中甘油三酯含量。結(jié)果見(jiàn)下表。如表所示，與對(duì) 照動(dòng)物相比，接受類(lèi)囊體的動(dòng)物中甘油三酯含量顯著減少。然后處死動(dòng)物，用雙能χ-射線 分析法(DEXA)分析體脂肪如圖5所示，與對(duì)照動(dòng)物相比，接受類(lèi)囊體的動(dòng)物中食物攝取、 體重和體脂肪顯著減少(圖5)。甘油三醒I (mmol/L)
對(duì)照類(lèi)囊體
平均值1，210，93
SD0，330，23
⑶=標(biāo)準(zhǔn)偏差
權(quán)利要求
1.一種用于生產(chǎn)至少一種類(lèi)囊體膜級(jí)分的大規(guī)模方法，包括下述步驟a)收集超過(guò)500kg的量的至少含有類(lèi)囊體的植物或藻類(lèi)b)用溶液將所述植物或藻類(lèi)均質(zhì)化為勻漿液c)從b)的勻漿液中除去植物殘?jiān)黡)在級(jí)分中收集類(lèi)囊體e)濃縮d)的級(jí)分并且f)將濃縮e)的級(jí)分干燥成粉末或顆粒。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述均質(zhì)化步驟b)通過(guò)使用至少一個(gè)混合步驟、研磨 步驟或粉碎步驟完成。
3.根據(jù)權(quán)利要求1至2的方法，其中在所述b)中的溶液含有選自由EDTA、EGTA、DTPA、 檸檬酸鹽和NTA組成的組的試劑。
4.根據(jù)權(quán)利要求1至3中任一項(xiàng)的方法，其中所述步驟d)包括使用分離器。
5.根據(jù)權(quán)利要求1至3中任一項(xiàng)的方法，其中所述步驟d)包括使用pH約為4-5的沉 淀步驟。
6.根據(jù)權(quán)利要求1到5中任一項(xiàng)的方法，其中所述e)的濃縮步驟通過(guò)離心或過(guò)濾進(jìn)行。
7.根據(jù)權(quán)利要求1至6中任一項(xiàng)的方法，其中在所述步驟d)和步驟e)之間使用冷凍 步驟，從而機(jī)械地和/或酶促地粉碎葉。
8.根據(jù)權(quán)利要求1至7中任一項(xiàng)的方法，其中所述方法包括至少一個(gè)洗滌步驟。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其中所述洗滌步驟在步驟e)之后進(jìn)行。
10.根據(jù)權(quán)利要求8至9中任一項(xiàng)的方法，其中所述洗滌步驟包括用乙醇洗滌。
11.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，其中所述光合成生物是選自由藻類(lèi)、菠菜、三 葉草、油菜、甜菜、羽衣甘藍(lán)、昆諾阿藜、草或耶路撒冷洋薊、蒲公英、藜屬、濱藜屬組成的組 的植物。
12.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述方法包括將所述類(lèi)囊體膜級(jí)分 加入到食品、食品添加物或藥物產(chǎn)品中的額外步驟。
13.一種可用根據(jù)權(quán)利要求1至12中任一項(xiàng)的方法獲得的產(chǎn)品。
14.根據(jù)權(quán)利要求13的產(chǎn)品在治療中的應(yīng)用。
15.根據(jù)權(quán)利要求13所述的產(chǎn)品在制備用于在人類(lèi)和動(dòng)物中治療超重、促進(jìn)飽滿感、 減少食物攝取、減輕體重、降低血胰島素濃度、降低血脂或甘油三酯水平、或降低體脂肪百 分比或減少炎癥的藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及從光合成生物，諸如綠色植物葉原料中生產(chǎn)類(lèi)囊體的大的工業(yè)規(guī)模方法，所述類(lèi)囊體用做食品中的成份、食品添加劑、食品添加物或用于在人類(lèi)和動(dòng)物中預(yù)防超重、促進(jìn)飽滿感、減少食物攝取、減輕體重、降低血胰島素濃度、降低血脂和體脂肪百分比的目的的藥物。
文檔編號(hào)A61P3/04GK102088986SQ200980127457
公開(kāi)日2011年6月8日 申請(qǐng)日期2009年6月24日 優(yōu)先權(quán)日2008年7月14日
發(fā)明者C·厄蘭森-阿爾伯特森, G·里留斯, M·奧爾貝, P-A·阿爾伯特森 申請(qǐng)人:斯拉畢思科股份公司