專利名稱：抗igf抗體的制作方法
抗IGF抗體本發(fā)明涉及過度增殖疾病之療法，特定言之，涉及癌癥之療法。
背景技術：
胰島素樣生長因子-KIGF-I ；70個氨基酸之多肽)和胰島素樣生長因子-2(IGF-2 ；67個氨基酸之多肽)為存在于血清中的7. 5kD可溶性因子，其可強烈刺激多種哺乳動物細胞之生長(回顧于Pollack等人，2004)。IGF在分泌進入血流中后即與IGFBP 形成復合物，從而防止其在去往靶組織之途中、在血清中發(fā)生蛋白水解性降解且防止其與 IGF受體結合。亦已知IGF可在靶組織自身中以自分泌或旁分泌方式分泌。已知此過程可在正常胎兒發(fā)育期間發(fā)生，其中IGF對組織、骨和器官的生長起重要作用。其亦發(fā)現(xiàn)于許多癌組織中，其中成信存在腫瘤細胞與基質細胞之間的旁分泌信號傳導或腫瘤細胞自身的自分泌IGF產(chǎn)生(回顧于LeRoith D, 2003)。IGF-I和IGF-2能夠結合許多正常組織上所表達的IGF-I受體(IGF-IR)，其在功能上為由具有相似親和力之二聚合α-亞基和β-亞基組成的460kD異四聚體(Rubin等人，1995)。IGF-2亦可結合IGF-2受體，成信此可防止IGF-2結合IGF-IR和經(jīng)由IGF-IR進行信號傳導。就此而言，IGF-2R已證明為腫瘤抑制蛋白。IGF-IR在結構上類似于呈兩種形式即IR-A和IR-B存在的胰島素受體，不同之處在于IR-A胞外域缺失可變剪接之12個氨基酸的外顯子。IR-B為表達于大多數(shù)正常成人組織中的主要頂同功異型物，其作用為介導胰島素對代謝之影響。另一方面，已知IR-A高度表達于正發(fā)育的胎兒組織中，而非成人正常組織中。最近研究亦已顯示IR-A(而非IR-B)高度表達于某些癌癥中。IR-A中外顯子缺失不影響胰島素結合，但引起小的構象變化，致使IGF-2結合其的親和力比結合IR-B的親和力高得多(Frasca等人，1999 ；Pandini等人，2002)。由于IR-A在癌組織中表達且更易與IGF-2結合，因此IR-A在癌癥中介導IGF-2之促有絲分裂效應可同IGFl-R —樣重要。IGF結合IGF-IR可觸發(fā)復雜的胞內信號傳導級聯(lián)，導致刺激增殖和存活之蛋白質的活化(回顧于Pollack等人，2004)。不同于EGFR和Her2neu受體，知癌癥中不存在IGFl-R或頂-A受體之擴增，表明受體活化由活性配體的存在控制。大量的科學、流行病學和臨床文獻顯示IGF在許多不同癌癥類型之形成、進展和轉移中之作用(回顧于Jerome等人，2003及Pollack等人，2004)。舉例而言，在結腸直腸癌中，IGF_2mRNA和蛋白質在臨床結腸直腸腫瘤樣品中之表達高于在相鄰正常組織中之表達(Freier等人，1999 ；Li等人，2004)。在患有結腸直腸瘤之患者中，升高的IGF血清水平亦與增殖細胞指數(shù)正相關Ghao等人，2005)。另外，升高的 IGF-2循環(huán)水平與形成結腸直腸癌和腺瘤之升高的風險相關(Renehan等人，2000a)及b)； Hassan等人，2000)。IGF-2基因之親本印記喪失(LOI)(導致IGF-2高表達之后生變異)為最近已在結腸直腸瘤和其它腫瘤類型之患者中鑒定的可遺傳分子性狀。IGF-2印記喪失已顯示與結腸直腸瘤(Cui等人，2003 ；Cruz-Correa等人，2004)和腺瘤(Woodson等人，2004) 之五倍風險相關?？贵w靶向IGF-IR α-亞基、從而阻斷IGF結合且使受體內化已顯示可延緩異種移植之來源于結腸癌之細胞系(諸如C0L0 205)的生長(Burtrum等人，2003)。高IGF含量與人類肺腺癌的不良預后有關(Takanami等人，1996)且許多來源于SCLC和NSCLC之細胞系可表達和分泌IGF (Quinn等人，1996)。IGF-2之轉基因過度表達在鼠類模型中誘發(fā)自發(fā)性肺腫瘤(Moorhead等人，200 。就肝細胞癌(HCC)而言，HCC之人類臨床樣品和動物模型表達IGF mRNA和蛋白質的水平高于相應正常組織且此與腫瘤生長增強相關(Wang等人，2003 ；Ng等人，1998)。亦已顯示IGF-2為HCC之血清學標記，與對照者相比，IGF-2在HCC患者血清中的水平更高CTsai等人，2005)。許多幼年期實體腫瘤(諸如尤因(Ewing)氏肉瘤和橫紋肌肉瘤)之生長似乎特別依賴于IGF信號傳導路徑(Scotlandi等人，1996)。已顯示IGF-2基因之LOI為胚胎橫紋肌肉瘤形成中之初期遺傳事件(Fukuzawa等人，1999)。在1型EWS-FLIl嵌合轉錄因子經(jīng)由染色體轉位加以表達(導致靶基因(包括IGF配體和IGF-1R)之表達升高和IGFBP-3之表達降低)的情況下，亦認為自分泌IGF信號傳導可強烈影響尤因氏肉瘤生長。已顯示靶向IGF-IR之抗體和小分子化合物可降低異種移植之來源于小兒實體腫瘤之細胞系的生長 (Kolb 等人，2008 ；Manara 等人，2007)。已證明使用IGF配體特異性抗體可抑制植入SCID小鼠中之成人骨中之人類前列腺癌細胞的生長(Goya等人，2004)。另外，已證明相同IGF配體抗體可在鼠類異種移植系統(tǒng)中阻斷IGF之旁分泌補給且抑制人類結腸直腸癌細胞之肝轉移(Miyamoto等人，2005)。亦有大量證據(jù)表明IGF信號傳導系統(tǒng)降低癌癥對化學治療劑和輻射之敏感性。在此方面最早的發(fā)現(xiàn)之一為證實IGF-IR敲除小鼠胚胎難以藉由病毒、致癌基因和過度表達之生長因子受體轉化Gell等人，1993 ；Sell等人，1994)和IGF-IR之過度表達可保護細胞防止紫外線照射和Y輻射誘發(fā)之凋亡(Kulik等人，1997)。此外，使用分泌大量IGF-2之肝腫瘤細胞系，發(fā)現(xiàn)體外中和IGF-2可明顯增強對化學治療劑(諸如順鉬(cisplatin)和依托泊苷(etoposide))的反應，尤其在較低抑制細胞的劑量，表明IGF-2可降低對化學治療劑的敏感性(Limd等人，2004)。與此等發(fā)現(xiàn)一致，已證明靶向IGF-IR之抗體可使腫瘤異種移植物對化學治療藥物和輻射之生長抑制作用的敏感性增強(Goetsch等人，2005)。已報導許多抗體顯示與人類IGF-I和人類IGF-2交叉反應性結合?？贵wsml. 2 系針對人類IGF-I產(chǎn)生，顯示與人類IGF-2之40%交叉反應性，且顯示可抑制以20ng/mL 人類IGF-I刺激之小鼠成纖維細胞細胞系BALB/c3T3之增殖(Russell等人，1984)。在一項設計藉由產(chǎn)生針對完整IGF-I蛋白質和該蛋白質之一部分的單克隆抗體而在功能上對 IGF-I表位定位的研究中，已鑒定出許多可與IGF-2交叉反應的抗體(Manes等人，1997)。 與IGF-2交叉反應百分率范圍為0至800%，已鑒定出幾種與IGF-I和IGF-2相等反應的抗體。KM1486為可與人類IGF-I和IGF-2交叉反應之大鼠單克隆抗體，且已證實KM1486可抑制植入非肥胖糖尿病/嚴重復合型免疫缺陷小鼠中之成人骨中的人類前列腺癌細胞的生長(Goya等人，2004)。另外，已證實KM1486可抑制人類結腸直腸癌之肝轉移(Miyamoto 等人，2005)。KM1486 亦已描述于 WO 03/093317、JP 2003-310275、WO 2005/018671、WO 2005/028515 及 WO 2005/027970 中。就治療人類疾病而言，非常需要具有完全人類序列之抗體以使產(chǎn)生人類抗抗體反應和中和抗體之風險減至最低程度，產(chǎn)生人類抗抗體反應和中和抗體會快速消除體內所施用之抗體且因此降低治療作用。因此(及鑒于IGF-I和IGF-2依賴性信號傳導在癌癥形成和進展中起作用)，需要獲得完全人類抗體。WO 2007/070432描述共中和兩種配體之促有絲分裂效應的完全人類抗體。
本發(fā)明之一目標系提供具有高親和力之替代性人類抗IGF抗體。本發(fā)明之另一目標系提供對IGF-I具有高親和力之人類抗IGF抗體。本發(fā)明之另一目標系提供對IGF-I和對IGF-2具有高親和力之人類抗IGF抗體。本發(fā)明之另一目標系提供對IGF-I和對IGF-2具有適當相對親和力之人類抗IGF 抗體。本發(fā)明之另一目標系提供對IGF-I的親和力比對IGF-2的親和力要高的人類抗 IGF抗體。本發(fā)明之另一目標系提供具有高IGF-I中和效力之人類抗IGF抗體。本發(fā)明之另一目標系提供具有高IGF-I和IGF-2中和效力之人類抗IGF抗體。本發(fā)明之另一目標系提供具有高溶解度和穩(wěn)定性之人類抗IGF抗體。本發(fā)明之另一目標系獲得不影響胰島素與其受體結合之抗體。藉由藥物活性之藥效學生物標記可有助于臨床開發(fā)治療劑。使用靶向IGF-IR 之抗體的臨床研究已證明總血清IGF-I水平之增加可為此等藥劑之適用藥效學標記 (Pollack等人，2007)。總血清IGF-I水平增加的原因可能系由于涉及垂體生長激素(GH) 分泌的反饋機制，該反饋機制促使IGF-I與IGFBP自肝臟釋放。事實上，已在人類中證明占總IGF-I水平僅約之游離或生物活性IGF-I決定該反饋反應(Chen等人，2005)。因此本發(fā)明之另一目標系提供一種伴有生物標記之療法(該生物標記容許對該療法之有效性進行藥理學監(jiān)測)，用于治療疾病形成和/或進展在病因上與IGF相關的疾病。在本發(fā)明實驗中，可證明總血清IGF-I水平隨本發(fā)明抗IGF抗體之應用而升高。因此，總IGF-I水平為抗IGF抗體療法之有效性的適用藥效學標記。因此非常有利的是本發(fā)明之抗體與適合動物物種(例如小鼠或大鼠)之IGF發(fā)生交叉反應，使得藥效學效應已可在臨床前進行測試?！翱侷GF-I水平”系指血漿或血清中IGF-I之相加量，包含結合血清結合蛋白之 IGF-I加上游離(未結合)IGF-I之量。因此，在另一個方面，本發(fā)明涉及一種測定可結合IGF-I和IGF-2之抗體分子治療癌癥患者之有效性的方法。在該方法第一步驟中，測量患者生物樣品(例如血清或血漿) 中總IGF-I水平。接著施用抗體分子且隨后經(jīng)過一段足以使治療性抗體發(fā)揮其效應的時間后，再次測定總IGF-I水平?？侷GF-I水平比第一步驟中所測得之總IGF-I水平相增加之量指示患者對該抗IGF抗體分子發(fā)生反應的程度。此方法優(yōu)選用于監(jiān)測施用本發(fā)明抗體之療法。附圖簡述

圖1A-1G顯示命名為60814、60819和60833之IgGl抗體針對人類IGF-1 (圖 1A)、小鼠 IGF-I (圖 1B)、大鼠 IGF-I (圖 1C)、人類 IGF-2 (圖 1D)、小鼠 IGF-2 (圖 1E)、大鼠 IGF-2(圖1F)和人類胰島素(圖1G)之ELISA結合滴定。圖2顯示使用基于細胞之ELISA，抗體60833中和IGF-1 QOng/mL)(圖2A)和 IGF-2 (lOOng/mL)(圖2B)誘發(fā)之IGF-IR磷酸化的典型滴定。圖3A顯示抗體60833中和IGF-2 (100ng/mL)誘發(fā)之IR-A磷酸化之典型滴定。圖 3B顯示抗體60833中和人類血清(20% )誘發(fā)之IGF-IR磷酸化之典型滴定。兩檢定均使用基于細胞之ELISA來進行。圖 4A-2D 顯示抗體 60814 和 60819 對 IGF-I (圖 4A 禾口 4C)和 IGF-2 (圖 4B 禾口 4D) 刺激之MCF-7 (圖4A和4B)和COLO 205 (圖4C和4D)細胞增殖的影響。圖5顯示在10%生長培養(yǎng)基中，抗體60819和60833對來源于尤因氏肉瘤之細胞系TC-71增殖的影響。圖6 顯示施用 25mg/kg、12. 5mg/kg、6. 25mg/kg、3. 13mg/kg 單次劑量后 M 小時，抗體60819對鼠類總血清IGF-I水平的影響；Omg/kg代表抗體處理前的總血清IGF-I水平；圖7顯示藉由10分鐘靜脈內輸注施用30mg/kg、100mg/kg、200mg/kg單次劑量后 24小時，抗體60819對大鼠總血漿IGF-I水平的影響。Omg/kg代表抗體處理前的總血清 IGF-I水平。圖8說明在含有10% FCS之生長培養(yǎng)基中，抗體60819和雷帕霉素(rapamycin) (單獨或組合)對來源于尤因氏肉瘤之細胞系SK-ES-I之增殖的影響。圖9顯示抗體60819和雷帕霉素(單獨或組合)對AKT磷酸化和PTEN水平的影響。圖10說明在含有10% FCS之生長培養(yǎng)基中抗體60819和埃羅替尼(erlotinib)/ 得舒緩(Tarceva)(單獨或組合)對來源于NSCLC之細胞系A-549之增殖的影響。圖11顯示人類IGF-I之3D結構，其中突出顯示(深灰色)了被抗體60833結合之氨基酸。在下面顯示了人類IGF-I之線性氨基酸序列，其中與抗體60833相互作用之氨基酸標有下劃線。圖12顯示抗體60814 (A) ,60819⑶和60833 (C)之可變鏈之氨基酸和DNA序列； ⑶R呈粗體字。發(fā)明概述一方面，本發(fā)明涉及一種分離之人類抗體分子，其a)可結合人類IGF-I和IGF-2，以便i)防止IGF-I和IGF-2與IGF-1受體結合，及ii)抑制IGF-I受體介導之信號傳導，b)可結合小鼠和大鼠IGF-I和IGF-2，c)不結合人類胰島素；其中該抗體分子系選自包含以下之組i)重鏈 CDR包含 SEQ ID NO 1 (CDRl)、SEQ ID NO :2 (CDR2)和 SEQ ID NO :3(CDR3) 之氨基酸序列且輕鏈 CDR 包含 SEQ ID NO :4 (CDRl)、SEQ ID NO :5 (CDR2)和 SEQ ID N0: 6(⑶之氨基酸序列的抗體分子；ii)重鏈 CDR 包含 SEQ ID NO :11 (CDRl)、SEQ ID NO 12 (CDR2)和 SEQ ID N0: 13(CDR3)之氨基酸序列且輕鏈 CDR 包含 SEQ ID NO 14 (CDRl)、SEQ ID N0:15(CDR2)和 SEQ ID NO :16(OTR3)之氨基酸序列的抗體分子；iii)重鏈 CDR 包含 SEQ ID NO :21 (CDRl)、SEQ ID NO :22 (CDR2)和 SEQ ID N0: 23 (CDR3)之氨基酸序列且輕鏈 CDR 包含 SEQ ID NO 24 (CDRl) ,SEQ ID NO :25(CDR2)和 SEQ ID NO :26(⑶R3)之氨基酸序列的抗體分子。另一方面，本發(fā)明涉及一種抗IGF抗體分子，其中該抗體分子具有包含SEQ ID N0I(CDRl)，SEQ ID N0:2(CDR2)和 SEQ ID N0:3(CDR3)之氨基酸序列的重鏈 CDR 及包含 SEQ ID NO 4 (CDRl), SEQ ID NO :5(CDR2)和 SEQ ID NO :6(CDR3)之氨基酸序列的輕鏈 CDR。另一方面，本發(fā)明涉及一種抗IGF抗體分子，其中該抗體分子具有包含SEQ ID NO
II(CDRl)，SEQ ID N0:12(CDR2)和 SEQ ID N0:13(CDR3)之氨基酸序列的重鏈 CDR 及包含 SEQ ID NO 14 (CDRl), SEQ ID NO :15(CDR2)和 SEQ ID NO :16(CDR3)之氨基酸序列的輕鏈 CDR。另一方面，本發(fā)明涉及一種抗IGF抗體分子，其中該抗體分子具有包含SEQ ID NO 21 (CDRl)，SEQ ID N0:22(CDR2)和 SEQ ID N0:23(CDR3)之氨基酸序列的重鏈 CDR 及具有包含 SEQ ID NO 24 (CDRl)，SEQ ID NO :25(CDR2)和 SEQ ID NO :26(CDR3)之氨基酸序列的輕鏈CDR。另一方面，本發(fā)明涉及抗IGF抗體分子，其具有重鏈和輕鏈或CDR，它們具有如圖 12A-C所繪之氨基酸序列。另一方面，本發(fā)明涉及一種抗IGF抗體分子，其中該抗體分子結合IGF-I內之非線性表位，其包含人類IGF-1(SEQ ID NO :43)之氨基酸序列LCGAELVDALQFVCGDR(SEQ ID NO 41)和CCFRS⑶LRRLEM(SEQ ID NO 42)。在一個優(yōu)選實施方案中，該抗體分子接觸人類 IGF-I (SEQ ID NO 43)之氨基酸序列LCGAELVDALQFVC⑶R(SEQ ID NO 41)內之至少 8 個氨基酸和氨基酸序列CCFRS⑶LRRLEM(SEQ ID NO 42)內之至少10個氨基酸。在另一個優(yōu)選實施方案中，此類抗IGF抗體分子接觸人類IGF-I (SEQ ID NO :43)之Leu (5)，Cys (6)，Glu (9)， Leu(IO)，Asp (12)，Ala (13)，Phe (16)，Val (17)，Arg (21)，Cys (47)，Cys (48)，Phe (49)， Ser (51)，Cys (52)，Asp (53)，Leu (54)，Arg (55)，Leu (57)和 Glu (58)，如藉由 X-射線晶體學測定的。一種相應方法披露于本文實施例9中。優(yōu)選地，該抗體分子具有包含SEQ ID NO 21 (CDRl)，SEQ ID N0:22(CDR2)和 SEQ ID N0:23(CDR3)之氨基酸序列的重鏈 CDR 及具有包含 SEQ ID NO :24 (CDRl)，SEQ ID NO :25(CDR2)和 SEQ ID NO :26(CDR3)之氨基酸序列的輕鏈CDR。抗體之結合系定義為經(jīng)由非共價鍵發(fā)生的相互作用，該等非共價鍵使抗原(或結構上相似之蛋白質或其片段)占據(jù)抗體結合位點，亦即與適當抗原(或結構上相似的蛋白質)之決定子結合之免疫球蛋白區(qū)域。親和力(亦即抗體上之單個抗原結合位點與單個表位之間的相互作用)系藉由結
合常數(shù)Ka = kass/kdiss或解離常數(shù)Kd = kdiss/kass表示。一方面，根據(jù)a)，抗體以0. 02nM至20nm，例如0. 2nM至約2nM范圍內之Kd值之親和力，例如以 0. 05,0. 1,0. 2,0. 3,0. 4,0. 5,0. 6,0. 7,0. 8,0. 9 或 1. OnM 之親和力結合各種 IGF
蛋白，如藉由表面等離振子共振分析所測定。基于此性質實現(xiàn)IGF功能信號傳導之中和。一方面，根據(jù)c)，在為結合人類IGF-I或IGF-2所需之最小濃度之至少100倍的濃度，抗體不結合人類胰島素。另一方面，c)中定義之抗IGF抗體分子之性質可如下表征抗IGF抗體分子對 IGF-I和IGF-2之親和力分別為其對胰島素之親和力的至少100倍及甚至1000倍以上。若不能完全排除弱結合，則抗IGF抗體分子在治療性劑量不結合胰島素，即使在極高劑量(例如超過 100mg/kg)。在一個實施方案中，本發(fā)明之抗體分子不影響人類胰島素藉由與胰島素受體結合所介導之促有絲分裂性質。(一般而言，促有絲分裂性質系定義為化合物能夠促進細胞開始細胞分裂、從而觸發(fā)有絲分裂，例如就胰島素而言，其能夠促進細胞生長)。在另一個實施方案中，本發(fā)明之抗體除能夠抑制經(jīng)由IGF-I受體介導之IGF信號傳導之外，亦能夠抑制經(jīng)由胰島素受體IR-A介導之IGF-2信號傳導。本發(fā)明之抗體具有高得驚人的對IGF-I和IGF-2的中和效力。此外，它們對IGF-I 的效力和結合親和力出乎意料地比對IGF-2的效力和結合親和力要高。它們具有高溶解度和穩(wěn)定性，它們在可變域中沒有不想要的糖基化或水解基序，而且具有長循環(huán)半衰期。發(fā)明詳述在下文中，可結合人類IGF-I和IGF-2之本發(fā)明抗體分子系稱為“抗IGF抗體分子”。術語“抗IGF抗體分子”涵蓋人類抗IGF抗體、抗IGF抗體片段、抗IGF抗體樣分子和任何上述抗體分子之綴合物?？贵w在本發(fā)明中之含義中包括(但不限于)單克隆抗體、 嵌合單克隆抗體和雙特異性或多特異性抗體。術語“抗體”涵蓋由淋巴細胞產(chǎn)生且例如存在于血清中之完整免疫球蛋白、由雜交瘤細胞系分泌之單克隆抗體、由宿主細胞中重組表達產(chǎn)生的具有免疫球蛋白或單克隆抗體之結合特異性之多肽，和來源于該等免疫球蛋白、 單克隆抗體或多肽、經(jīng)進一步加工且同時保持其結合特異性之分子。詳言之，術語“抗體分子”優(yōu)選包括包含兩個重鏈和兩個輕鏈之完全人類完整免疫球蛋白。在另一個方面，抗體分子為具有抗原結合區(qū)之抗IGF抗體片段。為獲得抗體片段 (例如Fab片段)，可藉助于常規(guī)技術(例如使用木瓜蛋白酶或胃蛋白酶)進行消化。木瓜蛋白酶消化之實例系描述于WO 94/29348及US 4，342，566中。木瓜蛋白酶消化抗體通常產(chǎn)生兩個各自具有單個抗原結合位點的相同抗原結合片段(所謂Fab片段)，和殘余Fc片段。胃蛋白酶處理產(chǎn)生具有兩個抗原結合位點且仍然能使抗原交聯(lián)之F(ab' )2片段?？贵w片段亦可由產(chǎn)生相應編碼DNA片段之分子生物學方法生成。Fab片段亦含有輕鏈之恒定域和重鏈之第一恒定域(CH1)。Fab'片段不同于Fab 片段之處在于，其在重鏈CH1域之羧基末端含有其它殘基，包括一或多個來自抗體鉸鏈區(qū)之半胱氨酸。Fab' -SH在本文中系指其中恒定域之半胱氨酸殘基帶有游離硫醇基之Fab'。 F(ab' )2抗體片段最初呈其間具有鉸鏈半胱氨酸的Fab'片段對之形式產(chǎn)生。結合抗原之抗體片段或抗體樣分子(包括單鏈抗體和線性抗體，如Zapata等人， 1995中所述)可在單一多肽上包含單獨之可變區(qū)或與以下之整體或一部分組合之可變區(qū) 輕鏈之恒定域、CH1、鉸鏈區(qū)、CH2和CH3域，例如所謂“SMIP” ( “小模塊免疫藥物(Small Modular Immunopharmaceutical) ”)，其為采用單一多肽鏈作為其結合域Fv之抗體樣分子， 該單一多肽鏈連接至單鏈鉸鏈和缺少恒定域CHl之效應域(W0 02/056910)。SMIP可呈單體或二聚體形式制備，但其并不呈現(xiàn)傳統(tǒng)抗體之二聚體之二聚體結構。本發(fā)明亦包括包含可變區(qū)與輕鏈之恒定域區(qū)、VH1、CH1、鉸鏈區(qū)、CH2和CH3域之任何組合的抗原結合片段。只要抗體片段或抗體樣分子顯示與IGF-1/IGF-2抗原之相關部分特異性結合，則該等抗體片段或抗體樣分子可含有恒定區(qū)之全部或僅一部分。若不需要諸如補體結合或抗體依賴性細胞毒性之效應功能，則選擇恒定區(qū)類型和長度主要視抗體蛋白之所需藥理學性質而定?？贵w分子通常為由兩個輕鏈/重鏈對組成之四聚體，但亦可為二聚體，亦即由一個
11輕鏈/重鏈對組成之二聚體，例如Fab或Fv片段，或其可為單體單鏈抗體(scFv)?？笽GF抗體樣分子亦可為單域抗體(例如所謂“納米抗體”)，其在單Ig樣域中包含抗原結合位點(描述于例如W003/050531及Revets等人，2005中)。抗體樣分子之其它實例為免疫球蛋白超家族抗體(IgSF ;Srinivasan和Roeske，2005)或含有CDR或CDR移植之分子或“域抗體”(dAb)。dAB為抗體之功能結合單位，相當于人類抗體重鏈可變區(qū)(VH) 或輕鏈可變區(qū)(VL)。域抗體具有約13kDa之分子量或小于完整抗體尺寸之十分之一。已開發(fā)出一系列大型且功能齊全的完全人類VH和VL dAb文庫。dAB亦可用于“雙重靶向”， 亦即除IGF-1/IGF-2外，dAb亦可結合一個分子中之另一標靶。dAb文庫、選擇和篩檢方法、 用于雙重靶向和延長血清半衰期之dAb形式描述于例如US 6，696，245, WO 04/058821、WO 04/003019 及 WO 03/002609 中。一般而言，抗體片段和抗體樣分子較好地表達于細菌、酵母和哺乳動物細胞系統(tǒng)中。在一個優(yōu)選實施方案中，如上文i)中所定義之本發(fā)明抗體分子具有包含SEQ ID NO 8之氨基酸序列的可變重鏈和包含SEQ ID NO 10之氨基酸序列(此序列可在其C末端含有額外的Gin。根據(jù)Kabat編號方案，此氨基酸位置可視為可變區(qū)之C末端，或者，根據(jù)序列表中之序列，其可表示恒定輕鏈的第一個氨基酸，參見SEQ ID NO 34)的可變輕鏈?？勺冎劓湴琒EQ ID NO 8之氨基酸序列且可變輕鏈包含SEQ ID NO 10之氨基酸序列的抗體優(yōu)選具有IgGl恒定重鏈區(qū)。該抗體優(yōu)選具有Ig λ恒定輕鏈區(qū)。該抗體優(yōu)選為命名為60814之抗體，其具有包含SEQ ID NO :32之氨基酸序列的重鏈恒定區(qū)和包含SEQ ID NO :34之氨基酸序列的輕鏈恒定區(qū)。命名為60814之抗體的完整氨基酸序列描述于SEQ ID NO 35(重鏈)禾口 SEQ ID NO 36 (輕鏈)中。在另一個優(yōu)選實施方案中，如上文ii)中所定義之本發(fā)明抗體分子具有包含SEQ ID NO: 18之氨基酸序列的可變重鏈和包含SEQ ID NO :20之氨基酸序列(此序列可在其C 末端含有額外的Gin。根據(jù)Kabat編號方案，此氨基酸位置可視為可變區(qū)之C末端，或者，根據(jù)序列表中之序列，其可表示恒定輕鏈的第一個氨基酸，參見SEQ ID NO 34)的可變輕鏈。可變重鏈包含SEQ ID NO 18之氨基酸序列且可變輕鏈包含SEQ ID NO 20之氨基酸序列的抗體優(yōu)選具有IgGl恒定重鏈區(qū)。該抗體優(yōu)選具有Ig λ恒定輕鏈區(qū)。該抗體優(yōu)選為命名為60819之抗體，其具有包含SEQ ID NO 32之氨基酸序列的重鏈恒定區(qū)和包含SEQ ID NO :34之氨基酸序列的輕鏈恒定區(qū)。命名為60819之抗體的完整氨基酸序列描述于SEQ ID NO 37(重鏈)禾口 SEQ ID NO 38 (輕鏈)中。在另一個優(yōu)選實施方案中，如上文iii)中所定義之本發(fā)明抗體具有包含SEQ ID NO 28之氨基酸序列的可變重鏈和包含SEQ ID NO 30之氨基酸序列(此序列可在其C末端含有額外的Gin。根據(jù)Kabat編號方案，此氨基酸位置可視為可變區(qū)之C末端，或者，根據(jù)序列表中之序列，其可表示恒定輕鏈的第一個氨基酸，參見SEQ ID NO 34)的可變輕鏈。可變重鏈包含SEQ ID NO 之氨基酸序列且可變輕鏈包含SEQ ID NO 30之氨基酸序列的抗體優(yōu)選具有IgGl恒定重鏈區(qū)。該抗體優(yōu)選具有Ig λ恒定輕鏈區(qū)。該抗體優(yōu)選為命名為60833之抗體，其具有包含SEQ ID NO 32之氨基酸序列的重鏈恒定區(qū)和包含SEQ ID NO :34之氨基酸序列的輕鏈恒定區(qū)。命名為60833之抗體的完整氨基酸序列描述于SEQ ID NO 39(重鏈)禾口 SEQ ID NO 40 (輕鏈)中。
本發(fā)明抗體與小鼠和大鼠IGF-I交叉反應可容許檢查其在此等物種中的內分泌影響，例如對生長激素路徑的影響。由于大鼠為優(yōu)選用于藥物開發(fā)以研究毒理學效應的優(yōu)良動物模型，因此可與大鼠IGF交叉反應尤其有利。可能由于移除游離IGF-I引起經(jīng)由生長激素路徑的反饋調節(jié)、導致肝臟分泌 IGF-I增加，因此所觀察到的抗體對總IGF-I水平之藥效學效應為適用之藥效學標記。在動物物種中利用該標記(容許在藥物開發(fā)早期判定劑量/效應關系)有助于準備I期臨床研究，其中除I3K分析之外，亦監(jiān)測患者對總IGF-I水平的藥效學反應。本發(fā)明之抗IGF抗體分子亦可為序列表中所示之氨基酸序列所定義之抗體的變異體。因此，本發(fā)明亦包含作為具有上文a)至c)所定義之特征之此等多肽變異體的抗體。 熟習此項技術者使用常用技術將可制備、測試和使用抗體60814、60819和60833之功能性變異體。實例為CDR和/或框架中至少一個位置改變之變異抗體；框架區(qū)中存在與種系序列不符之單氨基酸取代之變異抗體；具有保守氨基(酸)取代之抗體；由在嚴格條件下與序列表中所述之編碼60814、60819或60833抗體可變鏈之DNA分子雜交之DNA分子所編碼之抗體；60814、60819和60833之功能上等效之密碼子最優(yōu)化變異體。亦可藉由使用本發(fā)明之抗體作為最優(yōu)化之起始點且多樣化一或多個氨基酸殘基， 優(yōu)選多樣化一或多個CDR中之氨基酸殘基并針對性質改良之變異體篩檢所得抗體變異體群來獲得變異體。尤其優(yōu)選為多樣化可變輕鏈之CDR3、可變重鏈之CDR3、可變輕鏈之CDRl 和/或可變重鏈之CDR2中的一或多個氨基酸殘基?？山逵纱隧椉夹g中已知之方法進行多樣化，例如WO 2007/042309中提及之所謂TRIM技術。在給定個別氨基酸性質的情況下，可進行合理取代以獲得保留抗體60814、60819 或60833整體分子結構之抗體變異體。氨基酸取代(意即“保守取代”)可例如基于各氨基酸之極性、電荷、溶解度、疏水性、親水性和/或兩性性質之相似性進行。熟習此項技術者熟知通常實施之氨基酸取代(例如WO 2007/042309中所描述)和獲得如此經(jīng)修飾之抗體的方法。在給定遺傳密碼與重組和合成DNA技術的情況下，可常規(guī)地設計編碼具有一或多處保守氨基酸交換之變異抗體的DNA分子且容易獲得各抗體。優(yōu)選抗體變異體在可變區(qū)中具有至少60%，更優(yōu)選至少70%或80%，仍更優(yōu)選至少90%且最優(yōu)選至少95%之序列同一性。優(yōu)選抗體在可變區(qū)中亦具有至少80%，更優(yōu)選為 90%且最優(yōu)選為95%之序列相似性。(兩個多肽序列間之“序列同一性，，表示兩個序列間相同氨基酸的百分比?！靶蛄邢嗨菩浴北硎鞠嗤被岬陌俜直然蝻@示保守氨基酸取代之氨基酸的百分比。)在另一個實施方案中，本發(fā)明之抗IGF抗體分子為“親和力成熟”抗體?！坝H和力成熟”抗IGF抗體為來源于親本抗IGF抗體(例如60814、60819或60833) 的抗IGF抗體，其在一或多個⑶R中具有一或多個變異或其中一或多個完整⑶R已置換，引起對抗原之親和力改良(與各親本抗體相比)。產(chǎn)生該等抗體突變體之程序之一包括噬菌體展示(Hawkins等人，1992及Lowman等人，1991)。簡言之，使多個高變區(qū)位點(例如6_7 個位點)發(fā)生突變以在各位點產(chǎn)生所有可能之氨基酸取代。如此所產(chǎn)生之抗體突變體以單價方式、以與封裝于各粒子中之M13之基因III產(chǎn)物之融合體形式自絲狀噬菌體粒子中展示。接著如本文所揭示，針對突變體之生物活性(例如結合親和力)篩檢噬菌體展示之突變體。
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亦可藉由以下文獻中所述之方法產(chǎn)生親和力成熟抗體例如Marks等人，1992 (藉由可變重鏈(VH)和可變輕鏈(VL)域改組進行親和力成熟)；或Barbas等人，1994 ;Shier 等人，1995 ；Yelton 等人，1995 Jackson 等人，1995 及 Hawkins 等人，1992 (CDR 和 / 或框架殘基之隨機誘變)。優(yōu)選親和力成熟抗體將具有針對靶抗原之極高親和力，例如低皮摩爾濃度。本發(fā)明亦關于編碼本發(fā)明抗IGF抗體分子之DNA分子。此等序列包括(但不限于) 如序列表中所示之編碼抗體60814、60819和60833之彼等DNA分子分別編碼抗體60814 可變重鏈和輕鏈之SEQ ID NO :7和SEQ ID NO :9 ；分別編碼抗體60819可變重鏈和輕鏈之 SEQ ID N0:17和SEQ ID NO 19 ；分別編碼抗體60833可變重鏈和輕鏈之SEQ ID N0:27和 SEQ ID NO :29。編碼可變輕鏈之SEQ ID NO :9、SEQ ID NO :19和四中所示之序列可在其3'端含有額外的Gln密碼子。因此，本發(fā)明亦關于可在高嚴格度之結合和洗滌條件(如WO 2007/042309中所定義)下與序列表中所述之DNA分子雜交的核酸分子，其中該等核酸分子編碼具有等效于或優(yōu)于抗體60814、60819或60833之性質的抗體或其功能片段。優(yōu)選分子(自mRNA角度) 為與本文所述之DNA分子之一具有至少75%或80% (優(yōu)選至少85%，更優(yōu)選至少90%且最優(yōu)選至少95%)同源性或序列同一性之彼等分子。屬于本發(fā)明范疇內之又一類DNA變異體可參照其編碼之多肽來定義。此等DNA分子就其序列而言有別于序列表中所述之彼等序列(分別為SEQ ID而7、17和27，或9、19、 四)，但由于遺傳密碼之簡并，此等DNA分子分別編碼之抗體具有抗體60814、60819或60833 之相同氨基酸序列。舉例而言，由于在真核細胞中表達抗體60814、60819或60833，編碼可變輕鏈之最后三個氨基酸的最后九個核苷酸可分別設計成匹配真核細胞密碼子選擇。若需要在大腸桿菌中表達抗體，則可改變此等序列以匹配大腸桿菌密碼子選擇。本發(fā)明之DNA分子變異體可以WO 2007/042309中所述之多種不同方法建構。產(chǎn)生本發(fā)明之重組抗IGF抗體分子時，將編碼全長輕鏈(在抗體60814的情況下， 序列包含SEQ ID NO :9和SEQ ID NO 33)和重鏈(在抗體60814的情況下，序列包含SEQ ID NO 7和SEQ ID NO 31)之DNA分子(cDNA和/或基因組DNA)或其片段插入表達載體內以使得序列可操作地連接至轉錄和/或翻譯控制序列。在抗體60819的情況下，序列分別為 SEQ ID NO 19 與 SEQ ID NO 33 以及 SEQ ID NO 17 與 SEQ ID NO 31 之彼等序列；在抗體60833的情況下，序列分別為SEQ ID NO 29與SEQ ID NO 33以及SEQ ID NO 27與 SEQ ID NO 31之彼等序列。制造本發(fā)明之抗體時，熟習此項技術者可自此項技術中熟知之多種表達系統(tǒng)(例如Kipriyanow和Le Gall，2004所評述之彼等表達系統(tǒng))中選擇。在另一個方面，本發(fā)明涉及一種表達載體，其含有一種DNA分子，該DNA分子包含如上所述之抗體分子之可變重鏈和/或可變輕鏈的編碼核苷酸序列。優(yōu)選地，此類表達載體含有一種DNA分子，該DNA分子包含SEQ ID NO :7和/或SEQ ID NO :9之核苷酸序列， 或包含SEQ ID NO 17禾口 /或SEQ ID NO 19之序列，或包含SEQ ID NO 27和/或SEQ ID NO 29之序列。優(yōu)選地，此類表達載體另外包含一種分別編碼恒定重鏈和/或恒定輕鏈的 DNA分子，該DNA分子連接至分別編碼可變重鏈和/或可變輕鏈之DNA分子。
表達載體包括質粒、反轉錄病毒、粘粒、來源于EBV之附加體等等。表達載體和表達控制序列經(jīng)選擇可與宿主細胞相容?？蓪⒖贵w輕鏈基因和抗體重鏈基因插入獨立載體中。在某些實施方案中，將兩種DNA序列插入同一表達載體中。適宜之載體為編碼功能完整之人類CH(重鏈恒定區(qū))或CL(輕鏈恒定區(qū))免疫球蛋白序列之彼等載體，其中適當限制性位點經(jīng)工程改造以使任何VH(重鏈可變區(qū))或VL (輕鏈可變區(qū))序列可如上所述容易插入和表達。在抗體具有60814、60819和60833之可變區(qū)的情況下，對于抗體輕鏈而言，恒定鏈通常為κ或λ，對于抗體重鏈而言，其可為(不限于)任何IgG同種型(IgGl、IgG2、 IgG3、IgG4)或其它免疫球蛋白(包括等位基因變異體)。重組表達載體亦可編碼促進宿主細胞分泌抗體鏈之信號肽。編碼抗體鏈之DNA可克隆于載體中以使信號肽同框連接至成熟抗體鏈DNA之氨基端。信號肽可為免疫球蛋白信號肽或非免疫球蛋白之異源肽?；蛘?，編碼抗體鏈之DNA序列可已含有信號肽序列。除抗體鏈DNA序列外，重組表達載體含有調控序列，包括啟動子、增強子、終止和聚腺苷酸化信號和其它控制宿主細胞中抗體鏈表達之表達控制組件。啟動子序列之實例 (針對在哺乳動物細胞中表達來例示)為來源于CMV (諸如CMV猿病毒40 (SV40)啟動子/ 增強子)、腺病毒(例如腺病毒主要晚期啟動子(AdMLP))、多瘤(病毒)之啟動子和/或增強子和強哺乳動物啟動子(諸如天然免疫球蛋白和肌動蛋白啟動子)。聚腺苷酸化信號之實例為BGH polyA、SV40晚期或早期polyA ；或者，可使用免疫球蛋白基因等之3' UTR0重組表達載體亦可含有調控宿主細胞中載體復制之序列(例如復制起點)和可選擇之標記基因。編碼抗IGF抗體重鏈或其抗原結合部分和/或抗IGF抗體輕鏈或其抗原結合部分之核酸分子和包含此等DNA分子之載體可根據(jù)此項技術中熟知之轉染方法(包括脂質粒介導之轉染、聚陽離子介導之轉染、原生質粒融合、顯微注射、磷酸鈣沉淀、電穿孔或藉由病毒載體的轉移)引入宿主細胞(例如細菌細胞或高等真核細胞，例如哺乳動物細胞) 中。編碼重鏈和輕鏈之DNA分子優(yōu)選存在于兩個共轉染至宿主細胞(優(yōu)選為哺乳動物細胞)中之載體中。在另一個方面，本發(fā)明涉及一種攜帶一或多個如上所述之表達載體的宿主細胞， 優(yōu)選為哺乳動物細胞。可用作表達宿主之哺乳動物細胞系在此項技術中已熟知且尤其包括中國倉鼠卵巢(CHO)細胞、NS0、SP2/0細胞、HeLa細胞、幼倉鼠腎(BHK)細胞、猴腎細胞(COS)、人類癌細胞(例如H印G2和A-549細胞)、3T3細胞或任何該類細胞系之衍生物/后代?？墒褂闷渌溉閯游锛毎?，包括(但不限于)人類、小鼠、大鼠、猴和嚙齒動物細胞系，或其它真核細胞，包括(但不限于)酵母、昆蟲和植物細胞，或諸如細菌之原核細胞。藉由將宿主細胞培養(yǎng)足以使抗體分子在宿主細胞中表達之時間來產(chǎn)生本發(fā)明之抗IGF抗體分子。如此，在另一個方面，本發(fā)明涉及一種產(chǎn)生如上所述之抗體分子的方法，其包含用一或多個如上所述之載體轉染哺乳動物宿主細胞，培育該宿主細胞，及回收并純化該抗體。 在另一個實施方案中，本發(fā)明涉及一種產(chǎn)生如上所述之抗體的方法，其包含獲得包含一或多個如上所述之載體的哺乳動物宿主細胞，及培育該宿主細胞。在另一個實施方案中，該方法進一步包含回收并純化該抗體?？贵w分子優(yōu)選作為分泌型多肽自培養(yǎng)基中回收，或若例如表達時無分泌信號，則其可自宿主細胞溶胞物中回收。必須使用重組蛋白和宿主細胞蛋白所用之標準蛋白質純化方法、以獲得實質上均質之抗體制劑的方式純化抗體分子。舉例而言，適用于獲得本發(fā)明抗 IGF抗體分子之最新純化方法包括自培養(yǎng)基或溶胞物中移除細胞和/或微粒細胞碎片作為第一步驟。接著自污染之可溶蛋白質、多肽和核酸中純化抗體，例如在免疫親和或離子交換柱上分級、乙醇沉淀、逆相HPLC、kphadex層析、在硅土或陽離子交換樹脂上層析。在獲得抗IGF抗體分子制劑之過程中，作為最后步驟，可如下所述干燥(例如凍干)純化之抗體分子以用于治療應用。在一個實施方案中，本發(fā)明之抗IGF抗體分子可藉由一系列現(xiàn)有技術純化步驟來純化，包括親和層析(重組蛋白A)、低pH病毒滅活、深度過濾(cbpth filtration)、陽離子交換層析、陰離子交換層析、納米過濾、和30kD超濾/滲濾(Shukla等人，2007)。在另一個方面，本發(fā)明涉及供醫(yī)藥中使用的一種如上所述之抗體分子。在另一個方面，本發(fā)明涉及一種藥物組合物，其含有本發(fā)明之抗IGF抗體分子、優(yōu)選完全抗體作為活性成份。為在治療中使用，將抗IGF抗體分子包括于適當藥物組合物中以便于施用于動物或人類。典型之抗IGF抗體分子調配物可藉由使抗IGF抗體分子與生理學可接受載劑、賦形劑或穩(wěn)定劑混合而制備為凍干或其它干燥調配物或水溶液或水性或非水性懸浮液之形式。在所用劑量和濃度，載劑、賦形劑、調節(jié)劑或穩(wěn)定劑系無毒的。其包括緩沖系統(tǒng)，諸如磷酸鹽、檸檬酸鹽、乙酸鹽和其它無機或有機酸及其鹽；抗氧化劑，包括抗壞血酸和甲硫氨酸； 防腐劑，諸如氯化十八烷基二甲基芐基銨、氯己雙胺(hexamethonium chloride)、苯扎氯銨、芐索氯銨、苯酚、丁醇或芐醇、對羥基苯甲酸烷基酯(諸如對羥基苯甲酸甲酯或對羥基苯甲酸丙酯)、鄰苯二酚、間苯二酚、環(huán)己醇、3-戊醇和間甲酚；蛋白質，諸如血清清蛋白、明膠或免疫球蛋白；親水聚合物，諸如聚乙烯吡咯烷酮或聚乙二醇(PEG)；氨基酸，諸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、組氨酸、精氨酸或賴氨酸；單糖、雙糖、寡糖或多糖和其它碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖、蔗糖、海藻糖、糊精或葡聚糖；螯合劑，諸如EDTA ；糖醇，諸如甘露醇或山梨醇；成鹽反荷離子，諸如鈉；金屬復合物(例如Si-蛋白質復合物)；和/或離子或非離子表面活性劑，諸如TWEEN (聚山梨酯)、PLUR0NICS 或脂肪酸酯、脂肪酸醚或糖酯。 抗體調配物亦可含有諸如乙醇或異丙醇之有機溶劑。賦形劑亦可具有釋放調節(jié)或吸收調節(jié)功能?？笽GF抗體分子亦可干燥(冷凍干燥、噴霧干燥、噴霧冷凍干燥、藉由近臨界或超臨界氣體干燥、真空干燥、風干)、沉淀或結晶，或截留于微膠囊(分別使用例如羥基甲基纖維素或明膠和聚(甲基丙烯酸甲酯)、例如藉由凝聚技術或界面聚合而制得)中、于膠狀藥物傳遞系統(tǒng)(例如脂質體、清蛋白微球體、微乳液、納米粒子和納米膠囊)中、于粗滴乳液中，或沉淀或固定化于載劑或表面上，例如pcmc技術(蛋白質包被微晶(protein coated microcrystal)) 。Remington, 2005 ψ。用于體內施用之調配物當然必須為無菌的；可藉由習知技術(例如經(jīng)由無菌過濾膜過濾)實現(xiàn)滅菌。增大抗IGF抗體之濃度可用于達成所謂的高濃度液體調配物(HCLF)；各種產(chǎn)生該等HCLF之方法已有描述。抗IGF抗體分子亦可含于持續(xù)釋放型制劑中。該等制劑包括疏水或親水聚合物之固體、半固體或液體基質，且可呈成形制品之形式(例如膜、藥卷(stick)或微膠囊)且可經(jīng)施藥裝置施加。持續(xù)釋放型基質之實例包括聚酯、水凝膠(例如聚(甲基丙烯酸2-羥基乙酯或蔗糖乙酸丁酸酯)或聚(乙烯醇))、聚丙交酯(US 3，773，919)、L-谷氨酸與、 乙基-L-谷氨酸酯之共聚物、不可降解之乙烯-乙酸乙烯酯、可降解之乳酸-乙醇酸共聚物(諸如LUPRON DEPOT (由乳酸-乙醇酸共聚物和乙酸亮丙瑞林構成的可注射微球體)) 和聚-D-(-)-3-羥基丁酸。盡管諸如乙烯-乙酸乙烯酯和乳酸-乙醇酸之聚合物能夠釋放分子超過100天，但某些水凝膠在更短時期內釋放蛋白質。當囊封抗體長時間留于體內時，其因在37°C暴露于水分而會變性或聚集，導致生物活性損失和可能之免疫原性變化。 視所涉及機制而定，可設計合理策略來實現(xiàn)穩(wěn)定化。舉例而言，若發(fā)現(xiàn)聚集機制為經(jīng)由硫基-二硫化物互換形成分子間S-S鍵，則可藉由修飾硫氫基殘基、由酸性溶液凍干(例如 W089/011297中所述)、控制水分含量、使用適當添加劑和形成特定聚合物基質組合物來達成穩(wěn)定。US 7，060，268及US 6，991，790中描述的調配物亦可用于本發(fā)明抗IGF抗體分子。IGF抗體分子亦可并入其它施藥形式，諸如分散體、懸浮液或脂質體、片劑、膠囊劑、粉劑、噴霧劑、有或無滲透增強裝置之經(jīng)皮或皮內貼片或乳膏、糯米紙囊劑(wafer)、鼻、 頰或肺部調配物，或可藉由植入之細胞產(chǎn)生，或在基因治療后藉由個體自身細胞產(chǎn)生?？笽GF抗體分子亦可用化學基團(諸如聚乙二醇(PEG)、甲基或乙基或碳水化合物基團)衍生化。該等基團可適用于改進抗體之生物學特征，例如延長血清半衰期或增加組
幺口社A
云/、纟口口 O優(yōu)選施藥模式為胃腸外(靜脈內、肌內、皮下、腹膜內、皮內)輸注或注射，但其它施藥模式(諸如吸入、經(jīng)皮、鼻內、含服、口服)亦可適用。在一個優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明之藥物組合物含有10mg/ml濃度之抗IGF抗體 (例如抗體60814、60819或60833)且進一步包含25mM檸檬酸鈉pH 6、115mMNaCl、0. 02% Tween (聚山梨醇2O)。在另一個實施方案中，本發(fā)明之藥物組合物系一種水溶液，其含有10mg/ml濃度之抗IGF抗體(例如抗體60814、60819或6083；3)，且進一步包含25mM組氨酸HCl pH 6、 38. 8g/L 甘露醇、9. 70g/L 蔗糖、和 0. 02%Tween (聚山梨酯 20)。靜脈內輸注時，本發(fā)明之藥物組合物可以用生理溶液例如用0. 9%氯化鈉或G5溶液稀釋。藥物組合物可冷凍-干燥并在使用前用注射用水(WFI)重建。預防或治療疾病時，抗體之適當劑量將視以下因素而定欲治療之疾病類型、疾病之嚴重程度和病程、抗體施用系出于預防或治療目的、先前療法、患者臨床病史和對抗體之反應及主治醫(yī)師之判斷。抗體宜一次性或經(jīng)一系列治療而施用于患者。視疾病之類型和嚴重程度而定，無論例如經(jīng)一或多次分開施用或連續(xù)輸注(1小時的輸注)，約1 μ g/kg至20mg/kg(例如0. lmg/kg至15mg/kg)抗體為向患者施用之最初候選劑量。視上述因素而定，典型治療進度通常包括以約0. lyg/kg至約20mg/kg或20mg/ kg以上范圍內之劑量每周施用抗體一次至每三周施用一次。例如，每周劑量可以為5、10、 或15mg/kg。該療法之進程易由習知技術和檢定監(jiān)測。欲施用之抗體之“治療有效量”為預防、改善或治療疾病或病癥所需之最低量。
本發(fā)明之抗IGF抗體分子及含有其之藥物組合物適用于治療過度增殖病癥。在某些實施方案中，過度增殖病癥為癌癥。癌癥系依兩種方式分類癌癥發(fā)起之組織之類型(組織類型)和癌癥首先發(fā)生之原發(fā)部位或體內位置。癌癥發(fā)生之最常見部位包括皮膚、肺、乳房/乳腺、前列腺、結腸和直腸、子宮頸和子宮。本發(fā)明之抗IGF抗體分子適用于治療各種癌癥，包括(但不限于)以下各種癌癥· AIDS相關之癌癥，諸如卡波西(Kaposi)氏肉瘤； 骨相關癌癥，諸如尤因氏家族之腫瘤和骨肉瘤； 腦相關癌癥，諸如成人腦瘤、幼年期腦干神經(jīng)膠質瘤、幼年期小腦星形細胞瘤、 幼年期大腦星形細胞瘤/惡性神經(jīng)膠質瘤、幼年期室管膜瘤、幼年期成神經(jīng)管細胞瘤、幼年期幕上原始神經(jīng)外胚層瘤、幼年期視路和下丘腦神經(jīng)膠質瘤和其它幼年期腦瘤； 乳腺癌； 消化道/胃腸相關癌癥，諸如肛門癌、肝外膽管癌、胃腸類癌瘤、胃腸基質瘤 (GIST)、膽管癌、結腸癌、食管癌、膽囊癌、成人原發(fā)性肝癌(肝細胞癌、肝母細胞瘤)、幼年期肝癌、胰腺癌、直腸癌、小腸癌和胃癌； 內分泌相關癌癥，諸如腎上腺皮質癌、胃腸類癌瘤、胰島細胞癌(內分泌胰)、甲狀旁腺癌、嗜鉻細胞瘤、垂體瘤和甲狀腺癌； 眼睛相關癌癥，諸如眼內黑色素瘤和視網(wǎng)膜母細胞瘤； 生殖泌尿相關癌癥，諸如膀胱癌、腎(腎細胞)癌、陰莖癌、前列腺癌、移行細胞腎盂和輸尿管癌、睪丸癌、尿道癌、威爾姆斯氏(Wilms)腫瘤和其它幼年期腎腫瘤； 生殖細胞相關癌癥，諸如幼年期顱外生殖細胞瘤、性腺外生殖細胞瘤、卵巢生殖細胞瘤和睪丸癌； 婦科癌癥，諸如子宮頸癌、子宮內膜癌、妊娠滋養(yǎng)層瘤(gestational trophoblastic tumour)、卵巢上皮癌、卵巢生殖細胞瘤、低惡性潛在卵巢瘤(ovarian low malignant potential tumour)、子宮肉瘤、陰道癌禾口陰門癌； 頭頸相關癌癥，諸如下咽癌、喉癌、唇和口腔癌、原發(fā)隱匿之轉移性鱗狀頸癌、鼻咽癌、口咽癌、鼻旁竇和鼻腔癌、甲狀旁腺癌和唾液腺癌； 血液學/血液相關癌癥，諸如白血病，諸如成人急性淋巴母細胞白血病、幼年期急性淋巴母細胞白血病、成人急性髓樣白血病、幼年期急性髓樣白血病、慢性淋巴細胞白血病、慢性骨髓性白血病和毛細胞白血??；和淋巴瘤，諸如AIDS相關淋巴瘤、皮膚T-細胞淋巴瘤、成人何杰金氏淋巴瘤(Hodgkin' s lymphoma)、幼年期何杰金氏淋巴瘤、妊娠期間何杰金氏淋巴瘤、蕈樣真菌病、成人非何杰金氏淋巴瘤、幼年期非何杰金氏淋巴瘤、妊娠期間非何杰金氏淋巴瘤、原發(fā)性中樞神經(jīng)系統(tǒng)淋巴瘤、塞扎里(Sezary)綜合征、皮膚T-細胞淋巴瘤和瓦爾登斯特倫(Waldenstr0m)氏巨球蛋白血癥和其它血液學/血液相關癌癥，諸如慢性骨髓增殖病癥、多發(fā)性骨髓瘤/漿細胞瘤、骨髓發(fā)育不良綜合征和骨髓發(fā)育不良/骨髓增殖??； 肌肉骨骼相關癌癥，諸如尤因氏家族之腫瘤、骨肉瘤、骨惡性纖維組織細胞瘤、幼年期橫紋肌肉瘤、成人軟組織肉瘤、幼年期軟組織肉瘤和子宮肉瘤；血管肉瘤 (hemangiosarcoma)禾口管肉瘤(angiosarcoma)；
神經(jīng)相關癌癥，諸如成人腦瘤、幼年期腦瘤、腦干神經(jīng)膠質瘤、小腦星形細胞瘤、 大腦星形細胞瘤/惡性神經(jīng)膠質瘤、室管膜瘤、成神經(jīng)管細胞瘤、幕上原始神經(jīng)外胚層瘤、 視路和下丘腦神經(jīng)膠質瘤和其它腦瘤，諸如成神經(jīng)細胞瘤、垂體瘤和原發(fā)性中樞神經(jīng)系統(tǒng)淋巴瘤； 呼吸/胸相關癌癥，諸如非小細胞肺癌、小細胞肺癌、惡性間皮瘤、胸腺瘤和胸腺癌； 皮膚相關癌癥，諸如皮膚T-細胞淋巴瘤、卡波西氏肉瘤、黑色素瘤、梅克爾 (Merkel)細胞癌和皮膚癌； 小藍圓細胞瘤(small blue round cell tumour)。詳言之，本發(fā)明之抗IGF抗體分子及含彼等之藥物組合物有利于治療以下癌癥 造血系統(tǒng)之癌癥，包括白血病、淋巴瘤和骨髓瘤；胃腸道之癌癥，包括食管癌、胃癌、結腸直腸癌、胰腺癌、肝癌和膽囊癌和膽管癌；腎癌、前列腺癌和膀胱癌；婦科癌，包括乳腺癌、卵巢癌、子宮頸癌和子宮內膜癌；皮膚癌和頭頸癌，包括惡性黑色素瘤；兒科癌癥，諸如威爾姆斯氏腫瘤、成神經(jīng)細胞瘤和尤因氏肉瘤；腦癌，諸如成膠質細胞瘤；肉瘤，諸如骨肉瘤、軟組織肉瘤、橫紋肌肉瘤、血管肉瘤；肺癌、間皮瘤和甲狀腺癌。在本發(fā)明的一個優(yōu)選方面，本發(fā)明之抗IGF抗體分子及含彼等之藥物組合物有益于治療非小細胞肺癌(NSCLC)，特別是局部晚期的或轉移性的NSCLC(IIIB/IV期)。在此語境中，本發(fā)明之抗IGF抗體分子可以與基于鉬的化療，特別是帕利他賽(paclitaxel)/卡鉬 (carboplatin)或吉西他濱(gemcitabine)/ 順鉬(cisplatin)之鉬雙聯(lián)療法(platinum doublet therapy)組合。在本發(fā)明的另一個優(yōu)選方面，本發(fā)明之抗IGF抗體分子及含彼等之藥物組合物有益于治療肝細胞癌，特別是局部晚期的或肝細胞癌(III/IV期)。在此語境中，本發(fā)明之抗 IGF抗體分子可以與索拉非尼(Sorafenib) (Strumberg D.，2005)組合。在另一個實施方案中，抗IGF抗體分子及含彼等之藥物組合物適用于非癌性過度增殖病癥，諸如(但不限于)銀屑病和血管成形術后再狹窄。另外，根據(jù)最近的觀察結果 (Reinberg,2008)減小IGF-I活性之基因突變對于壽命具有正效應，本發(fā)明抗體當在治療中應用于成人時具有適用于減緩衰老和預防年齡相關疾病的潛能。如此，在另一個方面，本發(fā)明涉及如上所述之抗體分子在制備用于治療上文所述之癌性疾病的藥物中的用途。在另一個方面，本發(fā)明涉及用于治療如上所述之癌性疾病的如上所述之藥物組合物。在另一個方面，本發(fā)明涉及一種用于治療罹患如上所述之癌性疾病之患者的方法，其包括向該患者施用有效量的如本文所述之藥物組合物。視欲治療之病癥而定，本發(fā)明之抗IGF抗體分子可單獨或與一或多種其它治療劑 (尤其選自DNA損傷劑或抑制癌細胞中血管生成、信號轉導路徑或有絲分裂檢查點之治療活性化合物)組合使用。其它治療劑可在施用抗IGF抗體分子同時(視情況作為相同醫(yī)藥制劑之組份)或之前或之后施用。在某些實施方案中，其它治療劑可為(但不限于)一或多種選自以下群組之抑制
19劑EGFR、VEGFR、HER2_neu、AuroraA, AuroraB, PLK 和 PI3 激酶、FGFR、PDGFR、Raf、KSP 或 PDKl之抑制劑。其它治療劑之其它實例為CDK、Akt、src/bcr-abl、cKit、cMet/HGF、c_Myc、Flt3、 HSP90之抑制劑，刺猬(hedgehog)拮抗劑，JAK/STAT抑制劑，Mek、mTor、NF κ B、蛋白酶體、 Rho.wnt信號傳導抑制劑或泛素化路徑抑制劑。Aurora 抑制劑之實例為(但不限于)PHA_739;358、AZD-1152、AT-9283, CYC-116, R-763、VX-667、MLN-8045、PF-3814735、SNS-314、VX-689、GSK-1070916、TTP-607、 PHA-680626、MLN-8237 和 ENMD-2076。PLK抑制劑之實例為GSK-461364。raf 抑制劑之實例為 BAY-73-4506 (亦為 VEGFR 抑制劑)、PLX-4032、RAF-265 (亦為VEGFR抑制劑)、索拉非尼(亦為VEGFR抑制劑)、XL-281和Nevavar (亦為VEGFR抑制劑)。KSP 抑制劑之實例為伊斯平斯(ispinesib)、ARRY-520、AZD-4877、CK-1122697、 GSK-246053A、GSK-923295、MK-0731、SB-743921、LY-2523355 和 EMD-534085。src和/或bcr-abl抑制劑之實例為達沙替尼(dasatinib)、AZD-0530、伯舒替尼 (bosutinib)、XL-228 (亦為 IGF-IR 抑制劑)、尼羅替尼(nilotinib)(亦為 PDGFR 和 cKit 抑制劑)、伊馬替尼(imatinib)(亦為 cKit 抑制劑)、NS_187、KX2-391、AP_24534 (亦為 EGFR、 FGFR、Tie2、Flt3 之抑制劑)、KM-80 和 LS-104 (亦為 Flt3、Jak2 之抑制劑)。PDKl抑制劑之實例為AR-12。Rho抑制劑之實例為BA-210。PI3 激酶抑制劑之實例為 PX-866、PX-867、BEZ-235(亦為 mTor 抑制劑)、XL_147、 XL-765 (亦為 HiI1Or 抑制劑)、BGT-226、CDC-0941、GSK-1059615。cMet或HGF抑制劑之實例為XL-184 (亦為VEGFR、cKit、Flt3之抑制劑)、 PF-2341066、MK-2461、XL-880(亦為 VEGFR 抑制劑)、MGCD465(亦為 VEGFR、Ron、Tie2 之抑制劑)、SU-11274、PHA-665752、AMG-102、AV-299、ARQ-197、MetMAb、CGEN-241、BMS-777607、 JNJ-38877605、PF-4217903、SGX-126, CEP-17940、AMG-458、INCB-028060 和 E-7050。c-Myc抑制劑之實例為CX-3M3。Flt3抑制劑之實例為AC-220 (亦為cKit和PDGFR之抑制劑)、KW-2449、LS_104 (亦為 bcr-abl 和 Jak2 之抑制劑)、MC_2002、SB_1317、來他替尼(Iestaurtinib)(亦為 VEGFR、 PDGFR JKC 之抑制劑)、TG-101348 (亦為 JAK2 抑制劑)、XL_9"(亦為 cKit、FGFR、PDGFR 和 VEGFR之抑制劑)、舒尼替尼(sunitinib)(亦為PDGFR、VEGFR和cKit之抑制劑)和坦度替尼(tandutinib)(亦為PDGFR和cKit之抑制劑)。HSP90抑制劑之實例為坦螺旋霉素(tanespimycin)、阿螺旋霉素 (alvespimycin)、IPI-504、STA-9090、MEDI-561、AUY-922、CNF-2024 和 SNX-5422。JAK/STAT抑制劑之實例為CYT-997(亦與微管蛋白相互作用)、TG-101348(亦為 Flt3抑制劑)和XL-019οMek 抑制劑之實例為 ARRY-142886、AS-703026、PD-325901、AZD-8330、ARRY-704、 RDEA-I19 和 XL-518。mTor抑制劑之實例為雷帕霉素(rapamycin)、西羅莫司(temsirolimus)、德羅莫司(deforolimus)(亦充當VEGF抑制劑)、依維莫司(everolimus)(亦為VEGF抑制劑)、 XL-765 (亦為PI3激酶抑制劑)和BEZ-235 (亦為PI3激酶抑制劑)。Akt抑制劑之實例為哌立福新(perifosine)、GSK-690693、RX-0201和曲西立濱 (triciribine)。cKit抑制劑之實例為馬賽替尼(masitinib)、0SI_930(亦充當VEGFR抑制劑)、 AC-220 (亦為Flt3和PDGFR之抑制劑)、坦度替尼(亦為Flt3和PDGFR之抑制劑)、阿西替尼(axitinib)(亦為VEGFR和PDGFR之抑制劑)、舒尼替尼(亦為Flt3、PDGFR、VEGFR之抑制劑)和XL-820 (亦充當VEGFR和PDGFR之抑制劑)、伊馬替尼(亦為bcr-abl抑制劑)、 尼羅替尼(nilotinib)(亦為bcr-abl和PDGFR之抑制劑)。刺猬拮抗劑之實例為IPI-609、CUR-61414、GDC-0449、IPI-926 和 XL-139。CDK 抑制劑之實例為賽立西尼(seliciclib)、AT-7519、P-276、ZK_CDK(亦抑制 VEGFR2 和 PDGFI )、PD-332991、R-547、SNS-032、PHA-690509、PHA-848125 和 SCH-727965。蛋白酶體抑制劑/NFk B路徑抑制劑之實例為硼替佐米(bortezomib)、卡非佐米 (carfilzomib)、NPI-0052、CEP-18770、MLN-2238、PR-047、PR-957、AVE-8680 和 SPC-839。泛素化路徑抑制劑之實例為HBX-41108?？寡苌蓜┲畬嵗秊镕GFR、PDGFR和VEGF(R)之抑制劑和沙力度胺(thalidomide)，該等藥劑選自(不限于)BIBF 1120 (Vargatef )、貝伐株單抗 (bevacizumab)、莫特沙尼(motesanib)、CDP-791、SU-14813、替拉替尼(telatinib)、 KRN-951、ZKCDK (亦為 CDK 抑制劑)、ABT-869、BMS-690514、RAF-265、IMC-KDR、IMC-18F1、 IMiDs、沙力度胺、CC-4047、來那度胺(Ienalidomide)、ENMD-0995、IMC-Dll、Ki_23057、博瑞拉尼(brivanib)、西地尼布(cediranib)、1B3、CP_868596、IMC_3G3、R_1530 (亦為 Flt3 抑制劑)、舒尼替尼(亦為cKit和Flt3之抑制劑)、阿西替尼(亦為cKit抑制劑)、來他替尼(亦為Flt3和PKC之抑制劑)、瓦他拉尼(vatalanib)、坦度替尼(亦為Flt3和cKit之抑制劑)、 帕唑帕尼(pazopanib)、PF-337210、阿非博賽(afIiberc印t)、E-7080、CHIR-258、索拉非尼甲苯磺酸鹽(亦為Raf抑制劑)、凡德他尼(vandetanib)、CP-547632、0SI-930、AEE_788 (亦為EGFR和Her2之抑制劑)、BAY_57_9352 (亦為Raf抑制劑)、BAY_73_4506 (亦為Raf抑制劑)、XL-880 (亦為cMet抑制劑)、XL-647 (亦為EGFR和EphB4之抑制劑)、XL-820 (亦為 cKit 抑制劑)、尼羅替尼(亦為 cKit 和 brc-abl 之抑制劑)>CYT-116、PTC_299、BMS_584622、 CEP-11981、多韋替尼(dovitinib)、CY-2401401 和 ENMD-2976。其它治療劑亦可選自EGFR抑制劑，其可為小分子EGFR抑制劑或抗EGFR抗體。抗 EGFR抗體之實例為(不限于)西妥昔單抗(cetuximab)、盤尼圖單抗(panitumumab)、尼妥珠單抗(nimotuzumab)、扎魯突木單抗(zalutumumab)；小分子EGFR抑制劑之實例為吉非替尼(gefitinib)、埃羅替尼(erlotinib)和凡德他尼(亦為VEGFR抑制劑)。EGFR調節(jié)劑之另一實例為EGF融合毒素。適合與本發(fā)明之抗IGF抗體分子組合使用之其它EGFR和/或Her2抑制劑為 BIBW 2992 (Tovok )、拉帕替尼(Iapatinib)、曲妥珠單抗(trastuzumab)、帕妥珠單抗(pertuzumab)、XL-647,來那替尼(neratinib)、BMS-599626、ARRY-334543、AV-412、 mAB-806、BMS-690514、JNJ-26483327、AEE-788(亦為 VEGFR 抑制劑)、AZD-8931、ARRY_380、 ARRY-333786、IMC-11F8、Zemab,TAK-285、AZD-4769。
宜與本發(fā)明之抗IGF抗體分子組合治療之其它藥劑為托西莫單抗(tositumumab) 和替坦異貝莫單抗(ibritumomabtiuxetan)(兩種放射性標記之抗⑶20抗體)、奧伏托默單抗(ofatumumab)、利妥昔單抗(rituximab)、LY_M69^8、歐瑞立單抗(ocrelizumab)、 TRU-015, PR0-131921、FBTA05、維爾托佐單抗(veltuzumab)、R-7159(CD20 抑制劑)、阿倫單抗(alemtuzumab)(抗CD52抗體)、德諾單抗(denosumab)(破骨細胞分化因子配體抑制劑)、加利昔單抗(galiximab) (CD80拮抗劑)、扎木單抗(zanolimumab) (CD4拮抗劑)、 SGN40 (CD40 配體受體調節(jié)劑)、XmAb_5485、Chi Lob 7/4、路卡木單抗(Iucatumumab)、 CP-870893 (CD40抑制劑)、CAT-8015、依帕珠單抗(印ratuzumab)、Y90-依帕珠單抗、吉妥珠單抗奧唑米星(inotuzumab ozogamicin) (CD22 抑制劑)、魯昔單抗(Iumiliximab) (CD23 抑制劑)、TRU-016 (CD37 抑制劑)、MDX-1342, SAR-3419, MT-103 (CD 19 抑制劑)或邁帕突 ^Jtl (mapBtumumab)、|f ^0 ^ (tigatuzumab) ^jft^^K-^-iil (Iexatumumab) > Apomab> AMG-951 和 AMG-655 (TRAIL 受體調節(jié)劑)。可與本發(fā)明之抗IGF抗體分子組合使用之其它化學治療藥物系選自(但不限于)激素、激素類似物和抗激素(例如他莫昔芬(tamoxifen)、托瑞米芬(toremifene)、 雷洛昔芬(raloxifene)、氟維司群(fulvestrant)、乙酸甲地孕酮(megestrol acetate)、 氟他胺(f lutamide)、尼魯米特(nilutamide)、比卡魯胺(bicalutamide)、醋酸環(huán)丙氯地孕酮(cyproterone acetate)、柔沛(finasteride) > 醋酸丁瑞林(buserelin acetate)、氟氧可的松(f ludrocortinsone)、氟甲睪酮(f luoxymesterone)、甲輕孕 if (medroxyprogesterone)、奧曲月太(octreotide)、阿佐普芬(arzoxifene)、中白瑞月太 (pasireotide)、伐普肽(vapreotide))、芳香酶抑制劑(例如阿納托唑(anastrozole)、來曲唑(Ietrozole)、利阿唑(Iiarozole)、依西美坦(exemestane)、阿他美坦(atamestane)、 福美司坦(formestane))、LHRH激動劑和拮抗劑(例如乙酸戈舍瑞林(goserelin acetate)、亮丙立德(Ieuprolide)、阿巴瑞克(abarelix)、西曲瑞克(cetrorelix)、 地洛瑞林(deslorelin)、組胺瑞林(histrelin)、曲普瑞林(triptorelin))、抗代謝物(例如抗葉酸物，諸如甲氨喋呤(methotrexate)、培美曲唑(pemetrexed)；嘧啶類似物，諸如5-氟尿嘧啶、卡培他濱(capecitabine)、地西他濱(decitabine)、 奈拉濱(nelarabine)和吉西他濱(gemcitabine)；嘌呤和腺苷類似物，諸如巰嘌呤 (mercaptopurine)、硫鳥嘌呤(thioguanine)、克拉屈濱(cladribine)禾口噴司他丁 (pentostatin)、阿糖胞苷(cytarabine)、氟達拉濱(fludarabine))、抗腫瘤抗生素(例如惠環(huán)霄素(anthracycline), i者如多柔比星(doxorubicin)、道諾霄素(daunorubicin) > 表柔比星(印irubicin)和伊達比星(idarubicin)、絲裂霉素-C (mitomycin-C)、博 ^tMM (bleomycin)、方文線菌素 D(dactinomycin)、普卡霄素(plicamycin)、米托惠酉昆 (mitoxantrone)、匹克生瓊(pixantrone)、鏈佐星(str印tozocin))、鉬衍生物(例如順 白(cisplatin)、奧賽力 白(oxaliplatin)、卡 白(carboplatin)、洛 白(Iobaplatin)、 撒塔鉬(satraplatin))、烷基化劑(例如雌莫司汀(estramustine)、甲二氯二乙月安(meclorethamine)、美法倉(melphalan) > ￥ T Sl M ^f (chlorambucil)、白夕肖 $ (busulphan)、達卡巴嗪(dacarbazine)、環(huán)磷酰胺(cyclophosphamide)、異環(huán)磷酰胺 (ifosfamide)、羥基尿素(hydroxyurea)、替莫唑胺(temozolomide)、亞硝基脲諸如卡莫司汀(carmustine)和洛莫司汀(Iomustine)、塞替派(thiotepa))、抗有絲分裂劑(例如長春花生物堿(vinca alkaloid)，諸如長春堿(vinblastine)、長春地辛(vindesine)、長春瑞賓(vinorelbine)、長春氟寧(vinflunine)和長春新堿(vincristine)；和紫杉烷，諸如帕利他賽(paclitaxel)、多西他賽(docetaxel)及其調配物、拉洛他賽(Iarotaxel)；司莫紫杉醇(simotaxel)和埃坡霉素(印othilone)，諸如伊沙匹隆(ixab印ilone)、帕妥匹隆(patupilone)、I-EP0)、拓撲異構酶抑制劑(例如表鬼臼毒素(印ipodophyllotoxin)， 諸如依托泊苷(etoposide)和凡畢復(etopophos)、替尼泊苷(teniposide)、安吖啶 (amsacrine)、拓樸替康(topotecan)、伊立替康(irinotecan))和各種化學治療藥物(諸如氨磷汀(amifostine)、阿那格雷(anagrelide)、干擾素α、丙卡巴胼(procartazine)、米托坦(mitotane)和普非莫(porfimer)、貝瑟羅汀(bexarotene)、賽利克西(celecoxib))。在一個方面，本發(fā)明之抗IGF抗體分子與基于鉬的化療組合，例如與帕利他賽/卡鉬或吉西他濱/順鉬之鉬雙聯(lián)療法組合使用。在一個實施方案中，此類組合療法可重復多次，例如6個循環(huán)(q3周)。此治療可繼以用單獨抗IGF抗體分子進行之別的重復治療(例如6個循環(huán)q3周)。此方案可用于例如治療NSCLC。在另一個方面，本發(fā)明之抗IGF抗體分子與索拉非尼組合使用。在一個實施方案中，抗IGF抗體分子可以以1-3周之間隔重復施用，例如12個循環(huán)，與索拉非尼之連續(xù)施用組合。此方案可用于例如治療肝細胞癌。本發(fā)明之抗IGF抗體分子例如當在較低濃度下使用時，亦可與靶向IGF-IR之藥劑組合。該等藥劑包括可結合IGF-IR之抗體(例如CP-751871、AMG-479、IMC-A12、MK-0646、 AVE-1642、R-1507、BIIB-022、SCH-717454、rhuMab IGFR)和靶向 IGFl-R 激酶域之新穎化學體(例如 OSI-9O6 或 BMS-M4417、XL-228、BMS-754807)。本發(fā)明之抗IGF抗體分子亦可與其它療法(包括手術、放射療法、內分泌療法、生物反應調節(jié)劑、過熱和冷凍療法)和減弱任何副作用之藥劑(例如止吐藥，及在一個優(yōu)選實施方案中為糖尿病藥，例如二甲雙胍(metformin))組合使用。本發(fā)明之抗IGF抗體分子亦適用于診斷癌癥，其中升高的IGF-I和/或IGF-2血清水平與疾病之形成或進展相關，例如測定因印記損失(LOI)(影響胰島素樣生長因子II 基因(IGM)之后生變異)所致之升高的IGF-2水平。在某些實施方案中，用于診斷應用 (例如藉由免疫組織染色檢測人類組織切片中之IGF-1)之抗體為來源于人類抗體之嵌合抗體。在該抗體中，恒定區(qū)或其一部分已由另一物種(例如小鼠)抗體之各別序列置換。使用該嵌合抗體作為一抗，二抗(例如與鼠類Fc部分發(fā)生特異性反應之山羊抗體)將特異性識別嵌合一抗之鼠類序列且不與存在于人類組織樣品中之其它人類免疫球蛋白分子之Fc 部分結合。從而可避免不希望有的背景染色。藉由阻斷IGF-I和IGF-2介導之信號轉導，本發(fā)明抗體亦可用于控制體重和脂肪組織形成。為此目的，本發(fā)明之抗體可單獨或與其它減肥藥物組合施用。材料與方法選擇可結合IGF-I之高親和力完全人類抗體用三輪淘選自人類組合抗體文庫(HuCAL Gold) (Knappik等人，2000)中選擇可以低納摩爾濃度親和力結合人類IGF-I之特異性Fab片段克隆，基本上如Rauchenberger等人，2003所述。為鑒定對人類IGF-I之親和力改良之Fab片段，使多種此等“親本”Fab克隆進行“體外親和力成熟”，基本上如Nagy等人，2002所述。各克隆之L-⑶R3 (輕鏈⑶R3) 和H-CDR2 (重鏈CDR2)序列分別以約IO8個選自HuCAL (Knappik等人，2000)之L-CDR3和
23H-CDR2盒取代親本序列來多樣化。自所得“成熟文庫”制備噬菌體且針對人類IGF-I對各文庫進行溶液淘選。為選擇最大親和力之人類IGF-I結合劑，根據(jù)此項技術中已知之方法， 在一般和升高的嚴格度之洗滌條件下，在抗原減少以及在人類胰島素封閉和不封閉的情況下進行溶液淘選。將三輪噬菌體淘選后的淘選產(chǎn)物亞克隆于Fab表達載體中且藉由Bio Veris (Witney, Oxfordshire, UK)開發(fā)之基于電化學發(fā)光之平衡滴定技術測定各Fab對人類IGF-I之親和力，基本上如Haenel等人，2005所述。對具有最佳IGF-I親和力之Fab克隆測序，接著如Krebs等人，2001所述轉型為人類IgGl抗體，其對人類IGF-I具有亞納摩爾濃度親和力且與親本抗體相比，特異性沒有任何改變?？寺『椭亟M表達IgGl抗體藉由限制酶消化自Fab表達載體中切取可變重鏈區(qū)(VH)和可變輕鏈區(qū)(VL)且接合至分別含有人類IgGl重鏈和人類IgX輕鏈恒定區(qū)之基于pcDNA3. 1之質粒的兼容限制酶位點。制備EndoFree質粒制劑^jiagen)且根據(jù)供貨商之方案，在各質粒lmg/L的濃度下將重鏈和輕鏈質粒共轉染至HEK293Freestyle細胞(Invitrogen)中。72小時后，收集上清液且藉由ELISA測定IgG濃度。在經(jīng)修飾之蛋白A柱(GE Healthcare)上純化抗體，洗脫至檸檬酸鹽緩沖液中且隨后于PBS中透析直至2. 5mg/ml之濃度?；蛘?，產(chǎn)生穩(wěn)定整合有抗體表達質粒之CHO細胞系且用于生產(chǎn)抗體。表面等離振子共振分析以測定親和常數(shù)a)抗體捕捉方法使用胺偶聯(lián)試劑盒中之偶聯(lián)試劑將傳感器芯片在流動室1中包被約1000RU之參考抗體及在流動室2中包被約1000RU之家兔抗人類Fc- γ特異性抗體。利用Biacore 3000軟件之表面制備向導，將1000RU之標靶以5 μ Ι/min之流速設立。所用運行緩沖液為HBS-EP。使用以下參數(shù)進行親和力測量20 μ 1/min流動(HCB運行緩沖液)；25°C檢測溫度；Fcl、Fc2流動路徑；Fcl、Fc2檢測；抗IGF_huMAb捕捉1 μ g/ml溶液3分鐘；5分鐘IGF-Ag結合；5分鐘IGF-Ag解離；再生以50mM HCl進行30秒脈沖。IGF抗原于運行緩沖液(HCB)中稀釋至500nM、250nM、125nM、62. 5nM和31. 3nM且以隨機次序在Fcl和Fc2 上單獨運行不同抗原稀釋液。其間運行僅使用運行緩沖液之空白運行。在親和力分析前， 自各結合曲線減去空白運行曲線。使用BIAevaluation軟件(4. 1版，Biacore, Freiburg, Germany)進行數(shù)據(jù)評估。單獨擬合解離和結合階段之動力學。單獨擬合kdiss值時，使用解離階段初始200-300秒之時間范圍(信號穩(wěn)定減弱之范圍)。單獨擬合kass值時，使用約 100秒之初始時間范圍(信號穩(wěn)定增強之范圍)且計算時以1 1朗繆爾(Langmuir)結合模型使用個別kdiss值。計算動力學數(shù)據(jù)之平均值和標準偏差以及相應解離常數(shù)(Kd)和結合常數(shù)(Ka)。b) IGF包被方法當以IGF配體包被傳感器芯片時，基本如上所述測定IGF抗體對IGF配體之結合常數(shù)，例外之處為分別以35. lpg/mm2和38. 5pg/mm2IGF-l和IGF-2包被傳感器芯片。接著抗體以下列濃度流過芯片50nM、25nM、12. 5nM、6. 25nM、3. 12nM。在免疫吸附檢定中測量與人類IGF、鼠類IGF和大鼠IGF及與人類胰島素之結合在直接免疫吸附檢定(ELISA)中，亦測試以高親和力結合IGF-I之完全人類IgGl 抗體與人類IGF-I之結合。藉由在4°C以0.5 μ g/mL濃度之人類IGF-I (R&D Systems，編號291-G1)包被96孔Maxisorb板(100微升/孔)過夜進行檢定。單獨包被緩沖液用作非特異性結合之對照。接著用洗滌緩沖液(Ix TBS-T)洗孔一次，且在室溫在軌道震蕩器上用 200 μ 1封閉緩沖液封閉殘余結合位點1小時，接著進行另一輪洗滌。在包被板上直接制備各測試抗體于封閉緩沖液中之一系列三倍稀釋液。所用典型濃度為50ng/mL、16. 6ng/mL、 5. 6ng/mL、l. 8ng/mL、0. 6ng/mL、0. aig/mL和 0. 07ng/mL。單獨封閉緩沖液用作陽性對照。接著板在搖動下在室溫培育2小時。三輪洗滌后，向所有孔中各孔添加100 μ 1于封閉緩沖液中稀釋之HRPO綴合的抗人類IgG 二次試劑(Jackson ImmunoResearch Inc.) 在室溫搖動下培育2小時后，洗板三次，TMB底物溶液(等量溶液A與B)以100微升/孔吸移至所有孔中。板在室溫搖動下培育10-20分鐘，隨后藉由每孔添加100 μ 1之IM磷酸停止反應。 以450nm之波長測量吸光度(參考波長650nm)。亦如上針對人類IGF-I所述，測試完全人類IGF-I結合IgGl抗體與小鼠 IGF-I (R&D Systems，編號 791-MG)、大鼠 IGF-I (IBT，編號 RU100)、人類 IGF-2 (GroP印，編號 FMOO1)、小鼠 IGF-2(R&D Systems，編號 792-MG)、大鼠 IGF-2 (IBT，編號 AAU100)和人類胰島素(Roche)之結合，例外之處為用于包被之人類胰島素濃度為3 μ g/mL。測定中和效能之體外細胞增殖檢定將來源于MCF-7乳腺癌之細胞系(ATCC，HTB-22)和來源于COLO 205結腸癌之細胞系(ATCC#CCL-22》于無血清RPMI培養(yǎng)基中以每孔1000個細胞之細胞密度接種于96孔板中。在 iaig/mL、37ng/mL、lllng/mL、333ng/mL、1000ng/mL 和 3000ng/mL 濃度之不結合 IGF-I或IGF-2的人源化同種型對照抗體或抗體60814、60819和60833存在或不存在下，添加lOng/mL IGF-I或IGF-2。培養(yǎng)細胞5天，接著使用CellTiter-Glo發(fā)光細胞存活率檢定 (Promega)測定各孔中相對細胞數(shù)目。使用XFluor GENios Pro 4記錄發(fā)光度(LU =發(fā)光單位)。來源于尤因氏肉瘤之細胞系的生長檢定來源于尤因氏肉瘤之細胞系TC-71 (ATCC#ACC516)和SK-ES-I (ATCC#HTB86)于含有Ix NEAA、lx丙酮酸鈉、Ix glutamax和10%胎牛血清(FCS)之DMEM培養(yǎng)基中以每孔 1000個細胞之密度接種于96孔板中且在37°C和5% C02之增濕氛圍下培育過夜。次日向細胞中添加測試抗體、不結合IGF-I或IGF-2之人源化同種型對照抗體(靶向CD44-V6之人源化IgGl抗體)、雷帕霉素或雷帕霉素與測試抗體組合之連續(xù)稀釋液。所用典型濃度為 30μ g/ml、10y g/ml、3. 3μ g/ml、l. 1μ g/ml、0. 37 μ g/ml 和 0. 12 μ g/ml (或就組合研究而言，IOOnM, IOnM, 1ηΜ、0. 1ηΜ、0. ΟΙηΜ,Ο. OOlnM雷帕霉素與測試抗體)且各稀釋于三重復孔中進行。接著將細胞與抗體一起培育120小時，之后使用CellTiter-Glo發(fā)光細胞存活率檢定(ftOmega)測定各孔中相對細胞數(shù)目。使用XFluor GENios Pro 4記錄發(fā)光度(LU =發(fā)光單位)且獲取三重復孔之平均值用于數(shù)據(jù)分析且使用具有可變希耳斜率(Hill slope) 之S形曲線分析程序(Graph Pad Prism)藉由迭代計算來擬合。Western印跡分析磷酸化AKT和PTEN水平SK-ES-I細胞于含有10%胎牛血清之培養(yǎng)基中接種于6孔板中且在過夜培育后， 用IOOnM不結合IGF-I或IGF-2之同種型對照抗體(靶向⑶44_v6之人源化IgGl抗體)、 IOOnM 60819、IOOnM雷帕霉素或IOOnM 60819與IOOnM雷帕霉素組合對其進行處理。24小時后，細胞溶解且在以Bradford檢定測定蛋白質濃度后冷凍細胞溶胞物。藉由將30μ g蛋
25白質溶胞物施加至SDS PAGE凝膠(BioRad)上且將凝膠于Citerian凝膠印跡夾層上印跡來進行Wfestern印跡分析。將^iestern印跡與家兔抗β肌動蛋白(對照)抗體、家兔抗 PTEN抗體(Cell Signaling#9559)或家兔抗磷酸化pAKT抗體(Cell Signaling#4060)(于乳粉中1 5000(抗β肌動蛋白)、1 1000 (抗ΡΤΕΝ)或1 2000 (抗磷酸化AKT) 稀釋)一起培育過夜。在TBS中洗滌后，施加抗家兔IgG HRPO綴合的二抗(Amersham) 1小時且在TBS中再洗滌后，藉由ECL檢測抗體反應性且捕捉于Hyperfilm(Amersham)上。抗IGF抗體與EGFR抑制劑體外組合于來源于NSCLC之細胞系中將來源于NSCLC之細胞系A-549 (ATCC#CCL-185)于含有2mM L-谷氨酰胺和10% 胎牛血清之RPMI 1640培養(yǎng)基中以每孔1000個細胞之密度接種于96孔板中且在37°C和 5% CO2之增濕氛圍下培育過夜。次日向細胞中添加測試IGF抗體、埃羅替尼/得舒緩或測試IGF抗體與埃羅替尼組合之連續(xù)稀釋液。所用測試IGF抗體之典型濃度為30000ng/mL、 10000ng/mL、3333ng/mL、llllng/mL、370ng/mL、123ng/mL、41ng/mL、Hng/mL，且所用埃羅替尼之典型濃度為 20000nM、6667nM、2222nM、741nM、247nM、82nM、27nM、9nM，且各稀釋于三重復孔中進行。接著將細胞培育120小時，之后使用CellTiter-Glo發(fā)光細胞存活率檢定 (Promega)測定各孔中相對細胞數(shù)目。使用XFluor GENios Pro 4記錄發(fā)光度(LU =發(fā)光單位)且獲取三重復孔之平均值用于數(shù)據(jù)分析且使用具有可變希耳斜率之S形曲線分析程序(Graph Pad Prism)藉由迭代計算來擬合。測定對鼠類血清中總IGF-I水平和大鼠血清中總IGF-I水平之影響向6-8周齡雌性無胸腺NMRI裸小鼠(n = 5)中靜脈內單次施用(快速注射)25mg/ kg、12. 5mg/kg、6. 25mg/kg 和 3. 13mg/kg 之測試 IGF 抗體。向 6-8 周齡雄性和雌性 Wistar Han大鼠(n = 4只雄性，4只雌性)中單次10分鐘靜脈內施用30mg/kg、100mg/kg、200mg/ kg之抗體60819。抗體治療前和在施用后M小時獲取血液樣品，收集血清且使用OCTEIA 大鼠/小鼠總IGF-I免疫細胞檢定測定鼠類或大鼠總IGF-I水平。根據(jù)制造商說明書進行檢定，在450nm測量吸光度且使用SoftMax Pro軟件進行評估。使用標準曲線測定血清中總IGF-I濃度(ng/mL)。使用GraphPad Prism軟件進行統(tǒng)計分析?；诩毎腎GF-IR磷酸化ELISA重組表達人類IGF-IR或人類IR-A的小鼠成纖維細胞細胞系維持于補充有10%熱滅活的 FCS、lmM 丙酮酸鈉(sodium pyrovate)、0. 075%碳酸氫鈉、MEM NEAAjP 0. 3 μ g/ml 嘌呤霉素的DMEM，在37°C和5% CO2的加濕培養(yǎng)箱中。將細胞用胰蛋白酶/EDTA解附，在生長培養(yǎng)基中重懸浮，并稀釋至100，000個細胞/mL。將100 μ L (10，000個細胞)接種入無菌 96孔板的孔中，并在37°C和5% CO2的加濕培養(yǎng)箱中溫育過夜。然后將細胞用100 μ L/孔測定培養(yǎng)基(補充有0. 5%熱滅活的FCSUmM丙酮酸鈉、0. 075%碳酸氫鈉、和MEM NEAA的 DMEM)饑餓，并如上溫育過夜。將在測定培養(yǎng)基中制備的一系列測試抗體濃度添加至細胞， 所有樣品制備三份以測定每種測定條件的標準偏差。還在這些實驗中測試一種IGF-IR抗體，α IR-3 (Calbiochem, No. GRl 1L)。然后添加 IGF-I (20ng/mL 終濃度)、IGF-2 (100ng/mL 終濃度)、或人類血清(20%終濃度)，并將板在加濕培養(yǎng)箱中溫育30分鐘。通過用含4%甲醛的PBS替換生長培養(yǎng)基，室溫20分鐘來固定細胞。在搖動中用300 μ L/孔清洗緩沖液(含 0. 1% Triton X-100的PBQ 5分鐘清洗兩輪后，將細胞用100 μ L/孔含1. 2wt%過氧化氫的清洗緩沖液于室溫淬滅30分鐘。將細胞再次用300 μ L/孔清洗緩沖液清洗，并用100 μ L/孔封閉緩沖液(含5% BSA的清洗緩沖液)在搖動中于室溫封閉60分鐘。除去封閉緩沖液， 并添加50 μ 1/孔在封閉緩沖液中1 1000稀釋的磷酸化IGF-I受體β (tyrll35/1136) / 胰島素受體 β (tyrll50/1151) 一抗(Cell Signaling, No. 3024)。將板在搖動中于 4°C溫育過夜，然后如上清洗三次，并添加50 μ L/孔在封閉緩沖液中1 500稀釋的綴合有辣根過氧化物酶的抗家兔IgG山羊免疫球蛋白(Dako，No. Ρ0448)。在搖動中于室溫溫育60分鐘后，將孔如上用清洗緩沖液清洗兩次，并用300 μ L PBS清洗一次。將100 μ L/孔TMB底物溶液(Bender MedSystems, No. BMS406. 1000)添加至孔，并在搖動中溫育10分鐘，在此之后通過添加100 μ L/孔IM磷酸來終止反應，并使用分光計讀取吸光度(0D 450nm, OD 650nm 作為參考)。通過圖形分析來確定IGF-IR或IR-A磷酸化抑制IC5tl值。Fab-IGF-I共結晶和結構測定單克隆抗體在IOOmM磷酸鈉(Na-phosphate) (pH 7. 0)的緩沖液中制備，之后進行木瓜蛋白酶消化。木瓜蛋白酶(SigmaAldrich，P#3125)遵循制造商的指令在消化緩沖液 (含有IOmM鹽酸半胱氨酸、4mM EDTA的磷酸鹽緩沖液，pH 7.0)中活化。IgG抗體與活化的木瓜蛋白酶混合(比例酶IgG=I 100)，并將反應在旋轉搖床上于37°C溫育過夜。 通過添加碘乙酰胺(iodacetamid)至終濃度30mM來終止消化。為了分開Fab片段與Fc片段、Fc切割產(chǎn)物和完整Mab，將消化混合物加載到經(jīng)磷酸鹽緩沖液平衡的蛋白A MabSelect 柱上。用5個柱體積的PBS清洗柱，并在流出和清洗級分中收集Fab片段。Fc片段和完整 Mab用IOOmM檸檬酸鹽緩沖液(pH 3.0)自柱洗脫，隨后使用HiLoad Superdex 75柱實施 Fab片段的大小排阻層析。用20mM三乙醇胺、130mM NaCl，pH 8. 0以0. 5mL/min運行柱。 通過測量280nm處的吸光度來測定Fab片段的蛋白質濃度。通過^iestern印跡和ELISA來分析Fab片段的質量。如下生成Fab-IGF-I復合物，即將2倍摩爾過量的重組IGF-1 (Gropep ；Receptor Grade)添加至純化的Fab，然后在旋轉搖床上于4°C溫育過夜。濃縮復合物至(15mg/mL)和除去未結合的IGF-I使用Amicon-Ultra裝置來實施。Fab: IGF-I復合物的結晶使用各種技術來進行，諸如懸滴(hanging drop)、坐滴(sitting drop)、和撒種(seeding)。在一個實施方案中，通過使溶液接觸如下儲液來沉淀晶體，該儲液由于存在沉淀劑即誘導沉淀的試劑而降低蛋白質的溶解度。篩選各種條件獲得合適緩沖系統(tǒng)，其通過添加沉淀劑和添加劑來操作。沉淀劑的濃度優(yōu)選介于5-50% w/v之間。緩沖液的pH優(yōu)選為約3至約6。溶液中蛋白質濃度優(yōu)選為過飽和以容許沉淀。結晶期間的溫度優(yōu)選介于4和25°C之間。自晶體的X射線衍射圖樣及其衍生的電子密度圖獲得以原子坐標定義的 Fab: IGF-I復合物的三維結構。晶體的衍射好于2A分辨率。晶體優(yōu)選具有空間群P3221 (數(shù)目I54)和大約=70A, b = 70A, C = 195A的晶胞尺寸；及γ = 120°。用于確定三維結構的方法是分子置換，其涉及使用密切相關分子或受體配體復合物的結構。模型建立和細化以數(shù)個迭代步驟進行，至最終R-因子0 * )分別為21和23%。大鼠中藥動學參數(shù)的測定每72小時給予Wistar大鼠五次靜脈內推注施用18mg/kg、52mg/kg、和M8mg/kg 抗體。在各個時間點，采集血液樣品，并通過三明治式ELISA測定血漿中的人類抗體濃度。 這容許計算服藥第一天抗體的均值藥動學參數(shù)及計算服藥最后一天之后的半衰期(t(n) =1008 小時)。
實施例1 選擇可結合IGF-I之高親和力抗體為鑒定對人類IGF-I之親和力改良的Fab片段，使經(jīng)鑒定可以低納摩爾濃度親和力結合IGF-I的多個“親本” Fab克隆進行“體外親和力成熟”，其中各克隆之L-CDR3和 H-⑶R2序列分別由新L-⑶R3和H-⑶R2序列之文庫取代親本序列來多樣化。所得“成熟文庫”進行針對人類IGF-I之溶液淘選且選擇具有最佳親和力之克隆轉型為IgGl抗體并進一步測試。具有最佳人類IGF-I親和力之三種抗體為分別具有180pM、190pM和130pM之親和力(Kd)的60814、60819和60833(表1中所示)，如藉由基于電化學發(fā)光之平衡滴定方法所測定。表1:IGF-1結合總結
抗體親和力(PM)608141806081919060833130還在免疫吸附檢定中對抗體測試它們對人類、鼠類、和大鼠IGF-I和IGF-2，以及人類胰島素的結合。這證明了 60814、60819、和60833顯示出與小鼠和大鼠IGF-1，以及人類、鼠類和大鼠IGF-2的相當?shù)慕徊娣磻越Y合，但是對人類胰島素沒有反應性(在測試的最高濃度，50ng/ml)(圖 1A-1G)。還藉由表面等離振子共振(Biacore)分析來測定抗體結合人類、小鼠、和大鼠 IGF-I和IGF-2的親和常數(shù)。該方法涉及在傳感器上捕捉抗體，并使IGF抗原流過被捕捉的抗體，如此克服將IGF抗原包被到傳感器上并添加抗體時可發(fā)生的任何親合效應。使用此方法為抗體60833得到的親和常數(shù)顯示于表2，其中可見對人類IGF-I和人類IGF-2的KD 測量值分別為0. 07nM和0. 9nM。表2 抗體60833對人類、小鼠、和大鼠IGF-1和IGF-2的親和常數(shù)，通過表面等離振子共振(抗體捕捉法)測定
權利要求
1.一種分離之人類抗體分子，其a)結合人類IGF-I和IGF-2，以i)防止IGF-I和IGF-2結合IGF-I受體，及 )抑制IGF-I受體介導之信號傳導，b)結合小鼠和大鼠IGF-I和IGF-2，c)不結合人類胰島素；其中該抗體分子系選自包含以下之組i)重鏈CDR包含SEQ ID NO 1 (CDRl)、SEQ ID NO :2 (CDM)和 SEQ ID NO :3 (CDR!3)之氨基酸序列且輕鏈 CDR 包含 SEQ ID NO :4 (CDRl)、SEQ ID NO :5(CDR2)和 SEQ ID NO :6(CDR3) 之氨基酸序列的抗體分子；ii)重鏈CDR包含SEQ ID NO 11 (CDRl)、SEQ ID NO 12 (CDR2)和 SEQ ID NO :13(CDR3) 之氨基酸序列且輕鏈 CDR 包含 SEQ ID NO 14 (CDRl)、SEQ ID NO :15(CDR2)和 SEQ ID NO: 16(⑶舊)之氨基酸序列的抗體分子；iii)重鏈CDR包含SEQ ID NO 21 (CDRl) ,SEQ ID NO :22 (CDR2)和 SEQ ID NO :23(CDR3) 之氨基酸序列且輕鏈 CDR 包含 SEQ ID NO 24 (CDRl)、SEQ ID NO :25(CDR2)和 SEQ ID NO: 沈(⑶舊)之氨基酸序列的抗體分子。
2.一種抗IGF抗體分子，其中該抗體分子具有包含SEQ ID NO 1 (⑶Rl)，SEQ ID NO: 2(CDR2)和 SEQ ID NO :3(CDR3)之氨基酸序列的重鏈 CDR 及包含 SEQ ID NO :4 (CDRl)，SEQ ID NO :5(CDR2)和 SEQ ID NO :6(CDR3)之氨基酸序列的輕鏈 CDR。
3.一種抗IGF抗體分子，其中該抗體分子具有包含SEQ ID NO :11 (⑶Rl)，SEQ ID NO: 12(CDR2)和 SEQ ID NO :13(CDR3)之氨基酸序列的重鏈 CDR 及包含 SEQ ID NO 14 (CDRl)， SEQ ID N0:15(CDR2)和 SEQ ID N0:16(CDR3)之氨基酸序列的輕鏈 CDR。
4.一種抗IGF抗體分子，其中該抗體分子具有包含SEQ ID NO :21 (⑶Rl)，SEQ ID NO :22(CDR2)和SEQ ID NO :23(CDR3)之氨基酸序列的重鏈CDR及具有包含SEQ ID NO 24 (CDRl), SEQ ID NO :25(CDR2)和 SEQ ID NO :26(CDR3)之氨基酸序列的輕鏈 CDR。
5.如權利要求li)或2之抗體分子，其具有包含SEQID NO :8之氨基酸序列的可變重鏈。
6.如權利要求Ii)、2或5之抗體分子，其具有包含SEQID NO :10之氨基酸序列的可變輕鏈。
7.如權利要求Iii)或3之抗體分子，其具有包含SEQID NO: 18之氨基酸序列的可變重鏈。
8.如權利要求Iii)、3或7之抗體分子，其具有包含SEQID NO :20之氨基酸序列的可變輕鏈。
9.如權利要求Iiii)或4之抗體分子，其具有包含SEQID NO 之氨基酸序列的可變重鏈。
10.如權利要求Iiii)、4或9之抗體分子，其具有包含SEQID N0:30之氨基酸序列的可變輕鏈。
11.如權利要求1至10中任一項之抗體分子，其包含選自由IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、 IgM、IgA和IgE恒定區(qū)組成之組的重鏈恒定區(qū)。
12.如權利要求11之抗體分子，其中該重鏈恒定區(qū)是包含SEQID N0:32之氨基酸序列的IgGl。
13.如權利要求1至10中任一項之抗體分子，其中該輕鏈恒定區(qū)為IgA。
14.如權利要求13之抗體分子，其中該輕鏈恒定區(qū)包含SEQID NO :34之氨基酸序列。
15.權利要求5或6之抗體分子，其具有a)包含SEQID NO 35之氨基酸序列的重鏈，及b)包含SEQID NO 36之氨基酸序列的輕鏈。
16.權利要求7或8之抗體分子，其具有a)包含SEQID NO 37之氨基酸序列的重鏈，及b)包含SEQID NO 38之氨基酸序列的輕鏈。
17.權利要求9或10之抗體分子，其具有a)包含SEQID NO 39之氨基酸序列的重鏈，及b)包含SEQID NO 40之氨基酸序列的輕鏈。
18.如權利要求1至10中任一項之抗體分子，其為Fab片段、F(ab')2片段、或單鏈 Fv片段。
19.一種編碼如權利要求1至18中任一項之抗體分子之可變重鏈或可變輕鏈的DNA分子，或其片段或變異體。
20.如權利要求19之DNA分子，其分別具有SEQID NO :7、17或27之核苷酸序列，分別編碼如權利要求5、7或9中所定義之抗體之可變重鏈。
21.如權利要求19之DNA分子，其分別具有SEQID NO :9、19或四之核苷酸序列，分別編碼如權利要求6、8或10中所定義之抗體之可變輕鏈。
22.一種表達載體，其含有一種DNA分子，該DNA分子包含權利要求1至18中任一項之抗體分子之可變重鏈和/或可變輕鏈的編碼核苷酸序列。
23.權利要求22之表達載體，其含有一種DNA分子，該DNA分子包含SEQID NO 7和 /或SEQ ID NO :9之核苷酸序列，或包含SEQ ID NO: 17和/或SEQ ID NO: 19之序列，或包含 SEQ ID NO 27 禾口 / 或 SEQ ID NO 29 之序列。
24.如權利要求22或23之表達載體，其另外包含一種分別編碼恒定重鏈和/或恒定輕鏈的DNA分子，該DNA分子連接至分別編碼可變重鏈和/或可變輕鏈之DNA分子。
25.一種宿主細胞，其攜帶一或多個如權利要求22、23或24之表達載體。
26.如權利要求25之宿主細胞，其為哺乳動物細胞。
27.一種產(chǎn)生如權利要求1至18中任一項之抗體的方法，其包含用一或多個如權利要求22、23或M之載體轉染哺乳動物宿主細胞，培育該宿主細胞，及回收并純化該抗體。
28.—種產(chǎn)生如權利要求1至18中任一項之抗體的方法，其包含獲得包含一或多個如權利要求22、23或M之載體的哺乳動物宿主細胞，及培育該宿主細胞。
29.如權利要求觀之方法，其進一步包含回收并純化該抗體。
30.供醫(yī)藥中使用的如權利要求1至18中任一項之抗體分子。
31.如權利要求1至18中任一項之抗體分子用于制備藥物的用途，該藥物系用于治療選自以下之癌性疾病造血系統(tǒng)之癌癥，包括白血病、淋巴瘤和骨髓瘤；胃腸道之癌癥，包括食管癌、胃癌、結腸直腸癌、胰腺癌、肝癌和膽囊癌和膽管癌，特別是肝細胞癌；腎癌、前列腺癌和膀胱癌；婦科癌，包括乳腺癌、卵巢癌、子宮頸癌和子宮內膜癌；皮膚癌和頭頸癌，包括惡性黑色素瘤；兒科癌癥，諸如威爾姆斯氏腫瘤、成神經(jīng)細胞瘤和尤因氏肉瘤；腦癌，諸如成膠質細胞瘤；肉瘤，諸如骨肉瘤、軟組織肉瘤、橫紋肌肉瘤、血管肉瘤；肺癌，特別是非小細胞肺癌；間皮瘤和甲狀腺癌。
32.如權利要求31之用途，其中該藥物系與以下各項組合使用基于鉬的化療，特別是帕利他賽/卡鉬或吉西他濱/順鉬之鉬雙聯(lián)療法、索拉非尼、或選自EGFR，VEGF，HER2-neu， AuroraB, Plkl，PI3激酶或mTor之抑制劑之組的化合物。
33.一種藥物組合物，其包含如權利要求1至18中任一項之抗體分子及藥學可接受載劑。
34.如權利要求33之藥物組合物，其進一步包含一或多種選自以下之其它治療劑a)DNA損傷劑，b)抑制癌細胞中信號轉導路徑或有絲分裂檢查點之治療活性化合物，c)糖尿病藥。
35.如權利要求34之藥物組合物，其中該一或多種化合物b)系選自EGFR、VEGF、 HER2-neu、AuroraB, Plkl、PI3 激酶或 mTor 之抑制劑之組。
36.如權利要求33至35中任一項之藥物組合物，其系用于治療選自以下之癌性疾病 造血系統(tǒng)之癌癥，包括白血病、淋巴瘤和骨髓瘤；胃腸道之癌癥，包括食管癌、胃癌、結腸直腸癌、胰腺癌、肝癌和膽囊癌和膽管癌，特別是肝細胞癌；腎癌、前列腺癌和膀胱癌；婦科癌，包括乳腺癌、卵巢癌、子宮頸癌和子宮內膜癌；皮膚癌和頭頸癌，包括惡性黑色素瘤；兒科癌癥，諸如威爾姆斯氏腫瘤、成神經(jīng)細胞瘤和尤因氏肉瘤；腦癌，諸如成膠質細胞瘤；肉瘤，諸如骨肉瘤、軟組織肉瘤、橫紋肌肉瘤、血管肉瘤；肺癌，特別是非小細胞肺癌；間皮瘤和甲狀腺癌。
37.如權利要求36之藥物組合物，其系進一步與以下各項組合使用基于鉬的化療， 特別是帕利他賽/卡鉬或吉西他濱/順鉬之鉬雙聯(lián)療法、索拉非尼、或選自EGFR，VEGF, HER2-neu，AuroraB, Plkl，PI3激酶或mTor之抑制劑之組的化合物。
38.一種治療罹患選自以下之癌性疾病之患者的方法造血系統(tǒng)之癌癥，包括白血病、 淋巴瘤和骨髓瘤；胃腸道之癌癥，包括食管癌、胃癌、結腸直腸癌、胰腺癌、肝癌和膽囊癌和膽管癌，特別是肝細胞癌；腎癌、前列腺癌和膀胱癌；婦科癌，包括乳腺癌、卵巢癌、子宮頸癌和子宮內膜癌；皮膚癌和頭頸癌，包括惡性黑色素瘤；兒科癌癥，諸如威爾姆斯氏腫瘤、 成神經(jīng)細胞瘤和尤因氏肉瘤；腦癌，諸如成膠質細胞瘤；肉瘤，諸如骨肉瘤、軟組織肉瘤、橫紋肌肉瘤、血管肉瘤；肺癌，特別是非小細胞肺癌；間皮瘤和甲狀腺癌，該方法包括向該患者施用有效量的如權利要求33至35中任一項之藥物組合物。
39.如權利要求38之方法，其中另外向該患者施用有效量的帕利他賽/卡鉬或吉西他濱/順鉬、索拉非尼、或選自EGFR，VEGF, HER2_neu，AuroraB, Plkl，PI3激酶或mTor之抑制劑之組的化合物。
40.一種抑制哺乳動物細胞中IGF-I和IGF-2結合IGF-I受體之方法，其包含向該細胞施用如權利要求1至18中任一項之抗體分子，藉此抑制由IGF-I受體介導之信號傳導和由 IGF-I和IGF-2介導之增殖和抗凋亡。
41.一種抑制哺乳動物細胞中IGF-2結合胰島素受體IR-A之方法，其包含向該細胞施用如權利要求1至18中任一項之抗體分子，藉此抑制由胰島素受體IR-A介導之信號傳導及藉此抑制由IGF-2介導之增殖和抗凋亡。
42.如權利要求40或41之方法，其中該施用系在體外進行。
43.一種監(jiān)測結合IGF-I和IGF-2之抗體分子治療癌癥患者之有效性的方法，其中該方法包含(a)測量該患者生物樣品中之總IGF-I水平，(b)向該患者中施用該抗IGF抗體分子，(c)測量該患者生物樣品中之總IGF-I水平，其中該總IGF-I水平比步驟(a)中測得之總IGF-I水平增大之量指示該患者對該抗IGF抗體分子治療發(fā)生反應之程度。
44.如權利要求43之方法，其中該抗體分子為如權利要求1至18中任一項之抗體分子。
45.一種抗IGF抗體分子，其中該抗體分子結合IGF-I內之非線性表位，其包含人類 IGF-1(SEQ ID NO 43)之氨基酸序列 LCGAELVDALQFVC⑶R(SEQ ID NO 41)和 CCFRSCDLRRLEM(SEQ ID NO :42)。
46.如權利要求45之抗IGF抗體分子，其中該抗體分子接觸人類IGF-I(SEQ ID NO 43)之氨基酸序列LCGAELVDALQFVCGDR(SEQ ID NO :41)內之至少8個氨基酸和氨基酸序列 CCFRSCDLRRLEM(SEQ ID NO 42)內之至少 10 個氨基酸。
47.如權利要求45或權利要求46之抗IGF抗體分子，其中該抗體分子接觸人類 IGF-I (SEQ ID NO 43)之 Leu (5)，Cys (6)，Glu (9)，Leu (10)，Asp (12)，Ala (13)，Phe (16)， Val (17)，Arg (21)，Cys(47)，Cys(48)，Phe(49)，Ser (51)，Cys (52)，Asp(53)，Leu(54)， Arg(55)，Leu(57)和Glu(58)，如藉由X-射線晶體學測定的。
48.如權利要求45至47中任一項之抗IGF抗體分子，其系如權利要求4、9、10或17中任一項之抗體分子。
全文摘要
本發(fā)明涉及抗體分子，特別是完全人類抗體，其結合人類IGF-1且與IGF-2交叉反應以防止IGF-1和IGF-2結合IGF-1受體且抑制IGF-1受體介導之信號傳導。該等抗體不與胰島素結合，因此不會影響胰島素藉由與胰島素受體結合所介導之促有絲分裂性質。該等抗體適用于治療過度增殖疾病，尤其癌癥。
文檔編號A61P35/00GK102227226SQ200980148017
公開日2011年10月26日 申請日期2009年12月11日 優(yōu)先權日2008年12月12日
發(fā)明者保羅·亞當, 埃里克·伯吉斯 申請人:貝林格爾.英格海姆國際有限公司