專利名稱：含有突變型h因子結(jié)合蛋白的疫苗組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于引發(fā)對(duì)病原生物的免疫應(yīng)答的免疫原性組合物，具體的，涉及能引發(fā)保護(hù)性免疫應(yīng)答的免疫原性組合物。
背景技術(shù)：
腦膜炎奈瑟球菌(Neisseria meningitidis)(腦膜炎球菌)是寄居于人鼻咽中的一種莢膜革蘭氏陰性雙球菌。普通人群中的攜帶率通常為約10%。復(fù)雜的宿主-病原體關(guān)系通常是共生性的。但是，攜帶腦膜炎球菌有時(shí)能引起侵入性疾病。這一現(xiàn)象通常與屬于少數(shù)的超毒力克隆譜系的菌株有關(guān)(Caugant，D. A.等(1987) J Bacteriol 169 :2781-2792)。 腦膜炎球菌(N. meningitidis)是全球化膿性腦膜炎的主要原因，并且是唯一一種能造成腦膜炎和敗血癥爆發(fā)的細(xì)菌。根據(jù)疾病在任何一個(gè)地理位置的地方性或流行性的普遍性， 發(fā)病率在每IO5人群中為1-3之間。因此，需要開發(fā)預(yù)防性和治療性方案來降低侵入性腦膜炎球菌疾病的發(fā)生率、致死率和發(fā)病率。腦膜炎奈瑟球菌對(duì)多種一線抗生素敏感，但是盡管如此，大量被診斷為腦膜炎球菌感染的患者死于重癥或承受嚴(yán)重的并發(fā)癥。致死率從沒有并發(fā)癥的腦膜炎病例中的2-3 %到發(fā)生感染性休克的病例中的50 %或更高(Cartwright，K. Α.和 D.A.Ala' Aldeen(1997)J Infect 34:15-19)。當(dāng)前批準(zhǔn)的疫苗是基于包裹住細(xì)菌外膜的多糖莢膜，因此僅提供了針對(duì)表達(dá)相應(yīng)莢膜的一部分菌株的保護(hù)。此外，還沒有針對(duì)血清組B腦膜炎奈瑟球菌廣譜有效的疫苗，而這種菌株是發(fā)達(dá)國家中腦膜炎球菌疾病的最常見病因。這是因?yàn)檠褰MB莢膜由唾液酸的聚合物組成，該聚合物在結(jié)構(gòu)上與嬰兒期和胚胎發(fā)育期表達(dá)的人神經(jīng)細(xì)胞粘著分子的一種修飾相關(guān)。人們擔(dān)心用這一抗原進(jìn)行免疫會(huì)造成自身免疫應(yīng)答。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明涉及新型的組合物，具體地，涉及新型的包含修飾的H因子結(jié)合蛋白的免疫原性組合物，以及這些組合物在引發(fā)針對(duì)腦膜炎奈瑟球菌的免疫應(yīng)答中的應(yīng)用。本發(fā)明的目的之一是提供一種或多種能用來引發(fā)針對(duì)腦膜炎奈瑟球菌的保護(hù)性免疫應(yīng)答的組合物。本發(fā)明的第一方面提供了包含至少一種修飾的H因子結(jié)合蛋白的免疫原性組合物，其中該組合物給予人或非人動(dòng)物時(shí)能引發(fā)免疫應(yīng)答。優(yōu)選地，本文所述H因子結(jié)合蛋白是指來自腦膜炎奈瑟球菌(Neisseria meningitidis)或淋病奈瑟球菌(Neisseria gonorrhoeae)的H因子結(jié)合蛋白。腦膜炎奈瑟球菌通過模擬宿主而破壞宿主生物的免疫應(yīng)答。腦膜炎奈瑟球菌使用H因子結(jié)合蛋白形式的蛋白質(zhì)替代帶電碳水化合物化學(xué)特性來征集宿主的補(bǔ)體調(diào)節(jié)子， H因子。在健康個(gè)體中，補(bǔ)體的激活通過包括H因子(fH)在內(nèi)的膜結(jié)合和水溶性血漿調(diào)節(jié)蛋白被精確調(diào)控。H因子是155kDa的蛋白質(zhì)，由二十個(gè)域(稱為補(bǔ)體控制蛋白重復(fù)，或CCP) 組成。多種病原體已經(jīng)適應(yīng)為通過在它們的表面螯合H因子來避免補(bǔ)體介導(dǎo)的殺傷。如上所述，腦膜炎奈瑟球菌作為造成細(xì)菌性腦膜炎和感染性休克的主要原因，是一種具有全球重要性的適應(yīng)人體的病原體( 印hens等(2007) Lancet 369，2196-210)。由于奈瑟球菌菌株的差異，現(xiàn)有的腦膜炎球菌疾病疫苗不提供廣譜基礎(chǔ)的保護(hù)，因此其應(yīng)用很有限。一種方法是使用H因子結(jié)合蛋白(稱為fHbp、GNA 1870、或R2086)作為疫苗組合物中的抗原。H因子結(jié)合蛋白是27kDa的表面脂蛋白，普遍存在于腦膜炎奈瑟球菌的表面， 能引發(fā)保護(hù)性的殺菌抗體(Fletcher 等(2004) Infect Immun 72，2088-100 ;Masignani 等 (2003) J Exp Med 197，789-99)。H因子結(jié)合蛋白起到把補(bǔ)體的負(fù)調(diào)節(jié)物，H因子征集到細(xì)菌表面的作用，并通過抑制人血漿中補(bǔ)體介導(dǎo)的裂解而對(duì)腦膜炎球菌避免先天免疫應(yīng)答的能力有貢獻(xiàn)(Madico 等 Q006) J Immunol 177，501-10 ;Schneider 等 Q006) J Immunol 176， 7566-75)。在本發(fā)明中，使用了至少一種修飾的H因子結(jié)合蛋白作為抗原。該蛋白質(zhì)被修飾以避免、或減少H因子與蛋白質(zhì)的結(jié)合。在疫苗制劑中的H因子結(jié)合蛋白被給予到對(duì)象后， H因子與H因子結(jié)合蛋白的結(jié)合被認(rèn)為會(huì)降低疫苗的成功。首先，H因子結(jié)合蛋白上H因子的存在可能限制宿主免疫系統(tǒng)對(duì)H因子結(jié)合蛋白上關(guān)鍵表位的識(shí)別。所產(chǎn)生的針對(duì)這些表位的抗體可以是殺菌的，并且抑制H因子與細(xì)菌結(jié)合使得細(xì)菌對(duì)補(bǔ)體介導(dǎo)的裂解敏感。其次，針對(duì)H因子結(jié)合蛋白的免疫應(yīng)答還能以和半抗原類似的方式引發(fā)針對(duì)已結(jié)合的H因子的應(yīng)答。這可能引起潛在的不希望發(fā)生的自身免疫應(yīng)答。最后，由于補(bǔ)體蛋白質(zhì)具有佐劑活性，免疫應(yīng)答中涉及補(bǔ)體激活。通過征集H因子來降低免疫位點(diǎn)的補(bǔ)體激活會(huì)降低疫苗接種后得到的免疫水平。優(yōu)選地，本發(fā)明中使用的修飾的H因子結(jié)合蛋白在蛋白質(zhì)的一個(gè)或多個(gè)位點(diǎn)上被改變。優(yōu)選地，與野生型蛋白質(zhì)的氨基酸相比，修飾的H因子結(jié)合蛋白至少有一個(gè)氨基酸被改動(dòng)。優(yōu)選地，所述一個(gè)或多個(gè)被改變的氨基酸殘基使H因子結(jié)合蛋白在和H因子形成復(fù)合物時(shí)與分離的H因子結(jié)合蛋白相比表面暴露減少。H因子結(jié)合蛋白中所述一個(gè)或多個(gè)被改變的氨基酸可以是圖6 (SEQ ID NO :1)所示序列中選自下列位置編號(hào)的氨基酸103、 106、107、108、109、145、147、149、150、154、156、157、180、181、182、183、184、185、191、193、
194、195、196、199、262、264、266、267、268、272、274、283、285、286、288、289、302、304、306、 311 和 313。在H因子結(jié)合蛋白中被改變的一個(gè)或多個(gè)氨基酸可以是在野生型蛋白質(zhì)中與H因子形成氫鍵結(jié)合的一個(gè)或多個(gè)氨基酸。在H因子結(jié)合蛋白中被改變的一個(gè)或多個(gè)氨基酸可以是圖6(SEQ ID NO 1)所示序列中選自下列位置編號(hào)的氨基酸:103、106、107、108、180、181、183、184、185、191、193、
195、262、264、266、272、274、283、286、304和 306。本發(fā)明中使用的修飾的H因子結(jié)合蛋白中，上述氨基酸中的兩個(gè)或更多個(gè)、三個(gè)或更多個(gè)、四個(gè)或更多個(gè)、或者五個(gè)或更多個(gè)可以被改變。優(yōu)選通過改變H因子結(jié)合蛋白中的一個(gè)或多個(gè)氨基酸，防止或顯著降低與H因子的結(jié)合。
在一種實(shí)施方式中，氨基酸編號(hào)283和204中的至少一個(gè)被突變/改變成丙氨酸， 而不是谷氨酸。優(yōu)選地，這一突變導(dǎo)致H因子的結(jié)合幾乎完全消除。和H因子與野生型H因子結(jié)合蛋白間的結(jié)合相比，H因子與修飾的H因子結(jié)合蛋白間的結(jié)合優(yōu)選至少降低5倍，優(yōu)選至少降低10倍，優(yōu)選至少降低2個(gè)數(shù)量級(jí)。結(jié)合力的降低優(yōu)選在分析物濃度為約50nM下測(cè)得。這樣的結(jié)合力降低幅度被認(rèn)為是顯著的降低。除了對(duì)H因子結(jié)合蛋白進(jìn)行修改來避免或抑制與H因子的結(jié)合之外，該蛋白質(zhì)還可以包括對(duì)蛋白質(zhì)作為針對(duì)腦膜炎奈瑟球菌感染的免疫原的能力沒有影響的其它突變。例如，可以對(duì)蛋白質(zhì)做出其它保守性氨基酸改變。類似地，可以對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行不改變蛋白質(zhì)免疫原性的插入或缺失操作。優(yōu)選地，修飾的H因子結(jié)合蛋白與圖6所示序列具有至少60 %、70 %、80 %、85 %、 90%、95%或更高的序列相同性，但是經(jīng)過修飾，優(yōu)選至少在一個(gè)位置上有一個(gè)不同的氨基酸，這一修飾導(dǎo)致H因子的結(jié)合力喪失或者顯著降低。序列相同性的百分值被定義為經(jīng)過序列比對(duì)和在必要時(shí)引入缺口以最大程度提高序列相同性百分?jǐn)?shù)后，序列中與所提供的氨基酸序列中的氨基酸相同的氨基酸的百分?jǐn)?shù)。為確定序列相同性百分?jǐn)?shù)進(jìn)行的比對(duì)可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的多種方式實(shí)現(xiàn)， 例如包括利用BLAST(國家生物技術(shù)信息中心基礎(chǔ)本地比對(duì)搜索工具，National Center for Biotechnology Information Basic Local Alignment Search Tool)。例如，相同性百分?jǐn)?shù)的變化可能是由于氨基酸的取代、插入或缺失。氨基酸取代可以是保守性的，其中所取代的氨基酸具有相似的結(jié)構(gòu)和/或化學(xué)特性，例如用異亮氨酸取代亮氨酸就是保守性取代。免疫原性組合物是一種當(dāng)被給予對(duì)象后能引發(fā)針對(duì)至少一種修飾的H因子結(jié)合蛋白的免疫應(yīng)答的組合物。優(yōu)選地，對(duì)象是人或者非人動(dòng)物，更優(yōu)選是人或者非人哺乳動(dòng)物。優(yōu)選地，本發(fā)明的組合物引發(fā)的免疫應(yīng)答影響到腦膜炎奈瑟球菌感染已免疫的人的能力。優(yōu)選地，腦膜炎奈瑟球菌對(duì)經(jīng)本發(fā)明組合物免疫的人的感染能力被阻止或預(yù)防。 這可以通過多種方式實(shí)現(xiàn)。被引發(fā)的免疫應(yīng)答可以識(shí)別并破壞腦膜炎奈瑟球菌?；蛘呋虼送?，被引發(fā)的免疫應(yīng)答可以阻止或預(yù)防腦膜炎奈瑟球菌的復(fù)制?；蛘呋虼送猓灰l(fā)的免疫應(yīng)答可以阻止或預(yù)防腦膜炎奈瑟球菌在人或非人動(dòng)物內(nèi)弓丨起疾病。修飾的H因子結(jié)合蛋白可以是重組生產(chǎn)的(例如從基因工程表達(dá)系統(tǒng)中)，或者是合成產(chǎn)物，例如通過體外肽合成或體外翻譯制得。除了一個(gè)或多個(gè)修飾的H因子結(jié)合蛋白以外，本發(fā)明的組合物還可以進(jìn)一步的包含一個(gè)或多個(gè)抗原。進(jìn)一步包含的抗原也可以來自腦膜炎奈瑟球菌，并且可能引發(fā)針對(duì)腦膜炎奈瑟球菌的免疫應(yīng)答。在被給予對(duì)象時(shí)，組合物可以用來引發(fā)/引起保護(hù)性的免疫應(yīng)答。保護(hù)性的免疫應(yīng)答可以造成腦膜炎奈瑟球菌在感染對(duì)象時(shí)被殺傷，或者可以預(yù)防或抑制腦膜炎奈瑟球菌復(fù)制和/或引起疾病。組合物可被用作針對(duì)腦膜炎奈瑟球菌的預(yù)防性或治療性疫苗。本發(fā)明的另一方面提供了一種包含至少一種修飾的H因子結(jié)合蛋白和藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑的藥物組合物。
優(yōu)選地，該藥物組合物包含按本發(fā)明的第一方面所述的組合物。優(yōu)選地，該藥物組合物能引起針對(duì)腦膜炎奈瑟球菌的保護(hù)性免疫應(yīng)答。本文所用的短語“引起保護(hù)性的免疫應(yīng)答”是指，組合物能在被給予組合物的宿主生物如人或者非人哺乳動(dòng)物中引起一種保護(hù)性的反應(yīng)。優(yōu)選地，保護(hù)性的免疫應(yīng)答能保護(hù)免受腦膜炎奈瑟球菌的后續(xù)感染。保護(hù)性的免疫應(yīng)答可以通過減少腦膜炎奈瑟球菌的復(fù)制或通過影響腦膜炎奈瑟球菌的作用模式來消除或降低感染程度從而減輕疾病。合適的可接受的賦形劑和載體是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的。它們可以包括固體或液體載體。合適的液體載體包括水和鹽水。組合物中的蛋白質(zhì)被配制成乳液或者它們可被配制成生物可降解的微球體或者脂質(zhì)體。組合物還可以包含佐劑。合適的佐劑是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的，可以包括不完全弗氏佐劑(Freund' s Incomplete Adjuvant，用于動(dòng)物中的應(yīng)用)、以及金屬鹽如鋁或鈣
Τττ . ο組合物還可以包含用來控制組合物稠度和/或控制抗原/分泌型蛋白質(zhì)從組合物中釋放的聚合物或其它試劑。組合物還可以包含其它試劑，例如稀釋劑，可包括水、鹽水、甘油或其它合適的醇等；潤濕劑或乳化劑；緩沖劑；增稠劑例如纖維素或纖維素衍生物；防腐劑；去污劑、抗微生物劑；等等。優(yōu)選地，組合物中的活性成分純度超過50 %，通常純度超過80 %，經(jīng)常純度超過 90%，更優(yōu)選純度超過95%、98%或99%。最經(jīng)常使用的是活性成分純度接近100%，例如純度約99. 5%或99. 9%。本發(fā)明的組合物可以用作針對(duì)由腦膜炎奈瑟球菌引起的感染的疫苗。該組合物可以用作針對(duì)腦膜炎或其它侵入性腦膜炎球菌疾病包括敗血癥或感染性休克的疫苗。該疫苗可以預(yù)防性地給予具有腦膜炎奈瑟球菌接觸風(fēng)險(xiǎn)的人群和/或治療性地給予已經(jīng)接觸腦膜炎奈瑟球菌的人。優(yōu)選地，若組合物用作疫苗，那么組合物包含免疫有效量的抗原，其中組合物包含至少一種修飾的H因子結(jié)合蛋白。抗原的“免疫有效量”指在一次劑量或一系列劑量中給予個(gè)體時(shí)能有效治療或預(yù)防腦膜炎奈瑟球菌感染的量。這個(gè)量會(huì)因待治療個(gè)體的健康和身體狀況以及抗原而變。確定給予生物體的免疫原性或疫苗組合物的有效量是本領(lǐng)域技術(shù)人員能力范圍內(nèi)的。本發(fā)明的組合物可以經(jīng)口服、全身、胃腸外、外用、粘膜、肌肉內(nèi)、靜脈內(nèi)、腹膜內(nèi)、 皮內(nèi)、皮下、鼻內(nèi)、陰道內(nèi)、直腸內(nèi)、透皮、舌下、吸入或氣霧劑給藥。該組合物可以被安排為作為一次劑量或者多次劑量方案中的一部分進(jìn)行給藥。多次劑量可以以初次免疫之后進(jìn)行一次或多次加強(qiáng)免疫進(jìn)行給藥。初次免疫和加強(qiáng)免疫之間合適的時(shí)間可以常規(guī)確定。本發(fā)明的組合物可以單獨(dú)使用，或可以與一種或多種其它免疫原性或疫苗組合物，和/或一種或多種其它治療方案聯(lián)合使用。在被給予對(duì)象后，本發(fā)明的組合物可以誘發(fā)血清殺菌抗體應(yīng)答并引發(fā)介導(dǎo)調(diào)理素調(diào)節(jié)的吞噬作用的抗體。這些應(yīng)答可以在小鼠中方便的測(cè)得，并且結(jié)果是疫苗效力的標(biāo)準(zhǔn)指標(biāo)。
或者替代地，本發(fā)明的組合物還可以引發(fā)免疫應(yīng)答來中和細(xì)菌蛋白或其它分子， 從而預(yù)防它們具有它們的正常功能并且預(yù)防或減輕疾病進(jìn)展，而無需破壞病原性生物/細(xì)菌，在本申請(qǐng)中為腦膜炎奈瑟球菌。本發(fā)明的另一方面提供了一種或多種修飾的H因子結(jié)合蛋白在制備用于引發(fā)免疫應(yīng)答的藥物中的應(yīng)用。該藥物可用于對(duì)對(duì)象進(jìn)行針對(duì)腦膜炎奈瑟球菌的預(yù)防性或治療性疫苗接種。該藥物可以是預(yù)防性或治療性疫苗。該疫苗可以針對(duì)腦膜炎奈瑟球菌引起的腦膜炎、敗血癥和/或感染性休克。本發(fā)明的另一方面提供了一種包含用于產(chǎn)生針對(duì)腦膜炎奈瑟球菌的免疫應(yīng)答的一種或多種修飾的H因子結(jié)合蛋白的組合物。該免疫應(yīng)答可以是預(yù)防性或治療性的。該組合物可以用作疫苗。本發(fā)明的另一方面提供了一種保護(hù)人或非人動(dòng)物免受腦膜炎奈瑟球菌感染影響的方法，包括把本發(fā)明的任一其它方面所述的組合物給予人或者非人動(dòng)物。該組合物可以
是疫苗。本發(fā)明的另一方面提供了一種提高人或非人動(dòng)物的免疫應(yīng)答的方法，包括把本發(fā)明所述的藥物組合物給予人或非人動(dòng)物。該免疫應(yīng)答優(yōu)選為保護(hù)性的。在已接受初免的患者中該方法可產(chǎn)生加強(qiáng)應(yīng)答。所述免疫應(yīng)答可以是預(yù)防性或治療性的。一種檢測(cè)包括給予本發(fā)明組合物的治療性治療的功效的方式包括在給予該組合物后監(jiān)測(cè)腦膜炎奈瑟球菌感染。一種檢測(cè)包括給予本發(fā)明組合物的預(yù)防性治療的功效的方式包括在給予該組合物后監(jiān)測(cè)針對(duì)腦膜炎奈瑟球菌的免疫應(yīng)答。本發(fā)明的另一方面提供了一種或多種修飾的H因子結(jié)合蛋白在制備用于免疫人或非人哺乳動(dòng)物使其免受腦膜炎奈瑟球菌感染的藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明的另一方面提供了用于誘導(dǎo)生物體中免疫應(yīng)答的藥盒，包含本發(fā)明所述的免疫原性或疫苗組合物以及與給藥相關(guān)的說明書。除了它們的疫苗潛在應(yīng)用外，本發(fā)明的組合物還可用作診斷試劑和對(duì)接種者免疫能力的測(cè)量方式。盡管本發(fā)明的所有內(nèi)容和上面討論的優(yōu)選特征都針對(duì)腦膜炎奈瑟球菌，但技術(shù)人員能夠理解它們同樣可用于淋病奈瑟球菌(N. gonorrhoeae)。技術(shù)人員能夠理解上述討論的任何優(yōu)選特征可以用于本發(fā)明的任何方面。下面參照以下附圖和實(shí)施例，僅以舉例的方式描述本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式。


圖Ia到If-圖Ia到If顯示H因子結(jié)合蛋白結(jié)合位點(diǎn)位于H因子的CCP6處并需要H因子結(jié)合蛋白的全部胞外部分。圖Ia為H因子與完整的H因子結(jié)合蛋白及其截短形式(如圖示)結(jié)合的Far Western分析。膜用純化的H因子培育并用α-fH pAb檢測(cè)。只有在完整的27kDa的H因子結(jié)合蛋白(箭頭所示)處觀察到結(jié)合。圖Ib顯示了用α -fH PAb獲得的FACS分析結(jié)果，該抗體檢測(cè)腦膜炎奈瑟球菌和H因子之間的結(jié)合。圖Ic利用 SPR結(jié)果顯示H因子結(jié)合蛋白只能與含有CCP6的H因子構(gòu)建體結(jié)合。小插圖顯示了注射到H因子結(jié)合蛋白表面的不同稀釋度的fH67的1 1朗格繆爾(Langmuir)擬合曲線，以確定動(dòng)力學(xué)參數(shù)。圖Id顯示了 FACS競(jìng)爭(zhēng)研究(使用針對(duì)CCP5的α -fH mAb,因此不能識(shí)別fH67構(gòu)建體)的結(jié)果，說明短的fH67構(gòu)建體(在約0. 3到30 μ M之間)能夠競(jìng)爭(zhēng)掉全長H因子的結(jié)合，證明該構(gòu)建體包含了完整的H因子結(jié)合蛋白結(jié)合位點(diǎn)。所示數(shù)值為三次實(shí)驗(yàn)熒光強(qiáng)度的平均值士標(biāo)準(zhǔn)差(s. d.)。圖Ie所示Sra定量證實(shí)了 CCP6的存在對(duì)于與 H因子結(jié)合蛋白的高親和力結(jié)合是必要和充分的，并且常見的H因子CCP7多態(tài)性G02His/ Tyr)不顯著改變fHbp結(jié)合的親和性。圖If列表說明了通過表面等離振子共振(Surface Plasmon Resonance)實(shí)驗(yàn)用芯片表面的H因子結(jié)合蛋白和液相中的H因子構(gòu)建體獲得的結(jié)合常數(shù)。使用 BiaEvaluation 2. O軟件和1 1朗格繆爾模型進(jìn)行擬合。所示數(shù)值是均值士標(biāo)準(zhǔn)差，Chi2 是BiaEvaluation 2. O給出的擬合質(zhì)量的指標(biāo)。圖加到2c-顯示了 H因子結(jié)合蛋白及其與fH67的復(fù)合物的結(jié)構(gòu)。圖加顯示了 H 因子結(jié)合蛋白(殘基80至320)的動(dòng)畫圖示的兩個(gè)視圖。標(biāo)明了 A、B和C區(qū)域。圖2b顯示了在H因子結(jié)合蛋白和H因子的CCP 6與7之間形成的fHbp:fH67復(fù)合物的動(dòng)畫圖。兩種蛋白中參與了相互作用表面之間的鹽橋形成的側(cè)鏈以球-棍模式標(biāo)示(小圖中被放大并重新定向)。圖2c顯示了 H因子結(jié)合蛋白和fh67的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)，指示出了參與蛋白質(zhì)之間氫鍵或鹽橋相互作用的殘基。實(shí)心圓點(diǎn)表示與其伙伴形成氫鍵的殘基。實(shí)心星形表示與其伙伴形成鹽橋的殘基。星號(hào)表示該相互作用僅在一些獨(dú)立的復(fù)合物結(jié)構(gòu)拷貝中被發(fā)現(xiàn)。圖3-涉及H因子結(jié)合蛋白與H因子之間的界面，表明在H因子和H因子結(jié)合蛋白中將帶電側(cè)鏈取代為丙氨酸的定位誘變導(dǎo)致它們?cè)跐舛燃s為野生型的KD時(shí)與各自的野生型伙伴間的結(jié)合力消滅。黑色柱表示H因子分析物注射到(SOnMJOyLmirr1)H因子結(jié)合蛋白表面上的時(shí)間段。圖4-使用了兩種晶形的七個(gè)晶體學(xué)獨(dú)立的fH67/fHbp復(fù)合物拷貝G個(gè)復(fù)合物拷貝為Pl形式，3個(gè)拷貝為C2形式)的重疊圖考慮到fH67/fHbp復(fù)合物的撓性。盡管包裝環(huán)境非常不同，晶體間的高度相似性表明復(fù)合物是生物學(xué)相關(guān)的。復(fù)合物內(nèi)蛋白質(zhì)的重排僅限于fH67的CCP7相對(duì)于CCP6和H因子結(jié)合蛋白的位置發(fā)生少量移動(dòng)。包裝在最接近CCP7的H因子結(jié)合蛋白的環(huán)也相對(duì)可移動(dòng)，這由它們較高的溫度因子所顯示(在此圖中用“更稠厚”的色調(diào)標(biāo)示)。圖5-顯示H因子結(jié)合蛋白表面上的抗體表位的位置。在12，20，21處保護(hù)性表位 deCCPibed中的殘基用CPK圖示法(CPK representations)按元件著色(C為綠色，N為藍(lán)色，0 為紅色)(Glu 211、Arg 214 和 Arg 269)。阻斷H因子結(jié)合的抗體的表位用CPK圖示法，按H因子結(jié)合蛋白的著色標(biāo)示(區(qū)域〃 A"為黃色，區(qū)域"B"為綠色，區(qū)域"C"為青色)。盡管這些表位中沒有一個(gè)被直接定位在H因子識(shí)別位點(diǎn)，但它們都離識(shí)別位點(diǎn)很近，使得與大抗體的結(jié)合可能阻礙H因子的識(shí)別。H因子的多態(tài)性殘基402的組氨酸側(cè)鏈也在CPK圖示中顯示。盡管這一殘基靠近H 因子結(jié)合蛋白的次要觸點(diǎn)(參見圖2，殘基103到108附近)，但sra得到的兩種多態(tài)性形式的證據(jù)表明，該殘基并非關(guān)鍵觸點(diǎn)。晶體學(xué)獨(dú)立的復(fù)合物拷貝之間(圖4)，兩個(gè)蛋白在這一點(diǎn)上的相互接觸方式有顯著變化，由此可見復(fù)合物的這一區(qū)域(GNA環(huán)和H因子域)是最具可移動(dòng)性的區(qū)域，這個(gè)事實(shí)也支持了上文的結(jié)論。圖6-H因子結(jié)合蛋白的氨基酸序列(SEQ ID NO 6)。該蛋白質(zhì)的GenBank登錄號(hào)為 AAF42204。
圖7_fHbp:fH67復(fù)合物的結(jié)構(gòu)。圖7A-動(dòng)畫圖顯示的fHbp (綠色表示家族間保守的殘基，紅色為非保守的殘基)和表面模型顯示的fH67。圖7B-小鼠和人fH之間不同的殘基顯示為紅色，我們的研究顯示黃色殘基影響fH的結(jié)合。圖8-Sra確定的fHbp變體1、2和3與fH678的結(jié)合。還檢查了與淋球菌同源物 NG00033的相互作用。圖9A，等溫滴定量熱法證實(shí)fHbp/fH相互作用在溶液中表現(xiàn)為nM水平的KD。圖 9B，包含兩個(gè)Glu至Ala突變的fHbp結(jié)構(gòu)證實(shí)只在突變的側(cè)鏈有結(jié)構(gòu)改變(由α C, FO-FC 圖中紅色電子密度差異所示)。圖9C，5nM H因子的結(jié)構(gòu)域5、6和7流過野生型和突變型 fHbp的響應(yīng)(上方數(shù)據(jù)線為fHbp變體1，下方數(shù)據(jù)線為fHbp變體1DM)。圖9D，20nM完整的H因子流過野生型和突變型fHbp的響應(yīng)(上方數(shù)據(jù)線為fHbp變體1，下方數(shù)據(jù)線為fHbp 變體1DM)。
具體實(shí)施例方式H因子結(jié)合蛋白(其序列由圖1給出)的功能以前已通過將蛋白質(zhì)分割成覆蓋全部胞外區(qū)域的一系列區(qū)域，稱為“A”、“B”和“C”進(jìn)行過研究(Giuliani等^)05nnfect Immun 73，1151-60)。Western印跡分析顯示，所有三個(gè)區(qū)域?qū)τ贖因子和H因子結(jié)合蛋白之間高親和力的相互作用都是必需的(圖la)，表明H因子結(jié)合蛋白在其整個(gè)表面上具有較長的H因子識(shí)別位點(diǎn)。為了鑒定H因子20個(gè)CCP結(jié)構(gòu)域中的哪一個(gè)介導(dǎo)與H因子結(jié)合蛋白的相互作用， 使用了以下技術(shù)far Western分析；FACS分析(圖lb)；表面等離振子共振(圖Ic)。所得結(jié)果顯示，H因子被H因子結(jié)合蛋白識(shí)別的關(guān)鍵區(qū)域是第六結(jié)構(gòu)域CCP6和含有CCP6的構(gòu)建體能抑制依賴H因子結(jié)合蛋白的H因子和腦膜炎奈瑟球菌間的相互作用(圖Id)。相互作用的定量分析顯示，任何含有CCP6的構(gòu)建體的解離常數(shù)為約5nM(圖lc、le和If)。這一相互作用在高鹽(1M NaCl，未顯示)或pH為4到8(未顯示)的條件下不解離，這補(bǔ)充支持了結(jié)合事件的高親和性性質(zhì)。參見圖9A-D，表面等離振子共振顯示fHbp的雙突變體以高出兩個(gè)數(shù)量級(jí)的KD結(jié)合H因子的結(jié)構(gòu)域6和7。該突變體也結(jié)合更長的構(gòu)建體(由結(jié)構(gòu)域5、6和7組成)和全長H因子(提純自血清)，其結(jié)合力比野生型fHbp弱得多。獲得了 H因子的CCP 67(下文中稱為fH67)和包含H因子結(jié)合蛋白區(qū)域A、B和C 的胞外部分形成的復(fù)合物的晶體結(jié)構(gòu)，建立了 H因子結(jié)合蛋白和fH67的模型并總共用七個(gè)獨(dú)立的復(fù)合物拷貝(圖h、b和c)把兩種晶形的模型改進(jìn)到2.35 A。如圖加所示，H因子結(jié)合蛋白的胞外區(qū)域折疊形成兩個(gè)β桶(β-barrels)，N-端的桶由“Α”和一部分“B”區(qū)域組成，而C-端的桶由其余的“B”區(qū)和“C”區(qū)域組成。用N-端的桶在結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫中搜索未發(fā)現(xiàn)接近的結(jié)構(gòu)同源物，β桶的獨(dú)特拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)(圖2c)表明它們不是從基因重復(fù)事件中產(chǎn)生的。fH67:fHBP復(fù)合物(H因子H因子結(jié)合蛋白)通過H因子結(jié)合蛋白的兩個(gè)β桶和H因子CCP6之間廣泛的相互作用而連接在一起(圖2b)，這與結(jié)合研究相一致。具體的， 插入在CCP6的第二個(gè)β鏈(該CCP域的一個(gè)不尋常的特征)內(nèi)的螺旋位于復(fù)合物中心。 PISA服務(wù)器進(jìn)行的分析對(duì)所有七個(gè)獨(dú)立復(fù)合物給出了 1.0的顯著性值(即，極有可能是生物學(xué)顯著的)，H因子結(jié)合蛋白埋入復(fù)合物的平均表面積(2860 ± 177A2)比多數(shù)抗體抗原復(fù)合物中的埋入面積都大。此外，基于結(jié)構(gòu)所預(yù)測(cè)的復(fù)合物形成的AG(-6kCal/mol)與結(jié)合研究得出的親和性(-llkcal/mol，從圖Ie所示的KD計(jì)算得到)相一致，進(jìn)一步支持了結(jié)晶復(fù)合物的生理相關(guān)性。相互作用表面顯示了良好的形狀互補(bǔ)性(圖2c)，具有大量靜電相互作用，包括多個(gè)氫鍵和鹽橋。與fHbp:fH相互作用研究相一致，該研究未檢測(cè)到與衰老相關(guān)黃斑變性有關(guān)的H因子402His/Tyr同種型之間結(jié)合的差異(圖le、4和5)。His402僅外圍參與了與 H因子結(jié)合蛋白相互作用，它與H因子結(jié)合蛋白N-端β桶的鏈1和2之間的撓性環(huán)接觸 (圖 4)。為進(jìn)一步查明相互作用表面，形成了兩種蛋白質(zhì)的雙突變/取代型，其中的帶電側(cè)鏈被取代為小的疏水殘基丙氨酸㈧。在fH67中進(jìn)行了 R341A和H337A突變，而H因子結(jié)合蛋白中的突變?yōu)楹虴304A。利用SI3R對(duì)突變蛋白和它們的野生型伙伴之間相互作用的研究顯示，兩種突變型的親和性都降低了兩個(gè)數(shù)量級(jí)以上，以致在分析物濃度為野生型KD的10倍左右(約50nM)時(shí)幾乎觀察不到相互作用(圖3a)。在高數(shù)千倍的分析物濃度(μΜ范圍)下，兩種蛋白質(zhì)的突變型與野生型伙伴發(fā)生相互作用與野生型相比， fHbpE283A, E304A保持了定性意義上相似的結(jié)合速率但解離速率有提高，而fH67R341A， H337A在解離速率上與野生型相互作用更相似但結(jié)合速率大大降低(圖le)。來自不同家族的fHbp具有相同的結(jié)合特性腦膜炎奈瑟球菌菌株表達(dá)單一的fHbp，各屬于三種變體家族中的一種變體1、變體2和變體3。我們的研究集中在變體1的fHbp，因?yàn)檫@是疾病分離物中最常見的家族。圖 7顯示了繪制在復(fù)合物結(jié)構(gòu)上的三個(gè)家族間序列的差異，并表明，盡管序列保守度較高(> 60%相同)，但在fH結(jié)合位點(diǎn)周圍存在顯著的差異。因此，我們測(cè)定在不同的fHbp家族之間fH識(shí)別模式是否保守，以及相同的fHbp和fH殘基是否是結(jié)合的關(guān)鍵。這對(duì)于形成結(jié)合力減弱的fHbp變體來作為疫苗進(jìn)行評(píng)價(jià)是關(guān)鍵的信息。為此，我們克隆、表達(dá)并純化了來自變體2和變體3的fHbp，并開始鑒定它們與fH 的相互作用(圖8)。迄今為止，我們的SI^R研究顯示識(shí)別模式是類似的，親和性在同一數(shù)量級(jí)，并且fH中相同殘基的突變對(duì)所有家族fHbp的結(jié)合都有顯著影響(未顯示)。值得注意的是，盡管淋病奈瑟球菌fHbp同源物(NG00033)與變體3密切相關(guān)(91 %氨基酸相同)，但沒有檢測(cè)到純化蛋白與fH發(fā)生相互作用(圖8)。fHbpE283A, E304A突變型保持了原子結(jié)構(gòu)對(duì)fHbpE283A，E304A突變型(雙突變，DM)不能與fH67以納摩爾(nM)范圍的解離常數(shù)(KD)結(jié)合的一個(gè)可能解釋是，氨基酸變化破壞了蛋白質(zhì)的整體結(jié)構(gòu)。為解決這一問題，確定了與fH67復(fù)合的fHbpE283A，E304A突變型的晶體結(jié)構(gòu)。結(jié)果證實(shí)fHbp唯一的結(jié)構(gòu)變化是突變的側(cè)鏈(圖9B)。此外，我們確定了這些突變?cè)谂cfH5、6、7和全長fH結(jié)合中的相關(guān)性(圖9C和D)?？梢杂^察到fH在濃度為IOnM范圍時(shí)與野生型蛋白質(zhì)相互作用，表明全長fH的親和性與較小的片段(如fH5、6、7)在相同范圍內(nèi)。然而，fHbpE^3A，E304A蛋白的結(jié)合親和性與野生型蛋白相比顯著降低。將已發(fā)表的能引發(fā)殺菌抗體的H因子結(jié)合蛋白的表位(Giuliani等O005nnfect Immun 73，1151—60 ;Cantini 等(2006) J Biol Chem 281,7220-7)繪制到結(jié)構(gòu)圖上，顯示目前已鑒定的位點(diǎn)都不直接位于H因子識(shí)別位點(diǎn)內(nèi)。然而，抗體識(shí)別的影響因子結(jié)合的表位位于識(shí)別位點(diǎn)周圍，因此可能通過位阻來抑制H因子結(jié)合(圖5)。fHbp單突變體和雙突變體保持了免疫原性為檢查氨基酸變化E283A和E304A的影響，表達(dá)并純化了具有這些取代的單個(gè)(即fHbpE283A、和fHbpE304A)或組合(fHbpE283A， E304A)的fHbp變體1。用野生型fHbp和這些蛋白質(zhì)來免疫各組小鼠(每組5個(gè))，并測(cè)定免疫血清中的殺菌抗體。結(jié)果(表1)用能造成50%或更高的野生型血清組B腦膜炎奈瑟球菌(菌株H44/76)殺傷率的血清的最高稀釋度的倒數(shù)表示。免疫前的血清沒有殺傷作用。表1用野生型或突變型fHbp免疫動(dòng)物得到的血清殺菌抗體(SBA)效價(jià)
權(quán)利要求
1.一種免疫原性組合物，包含至少一種修飾的H因子結(jié)合蛋白，其中該組合物給予人或非人動(dòng)物時(shí)能引發(fā)免疫應(yīng)答。
2.如權(quán)利要求1所述的組合物，其特征在于，所述H因子結(jié)合蛋白來自腦膜炎奈瑟球菌或淋病奈瑟球菌。
3.如權(quán)利要求1或權(quán)利要求2所述的組合物，其特征在于，所述組合物引發(fā)針對(duì)腦膜炎奈瑟球菌和淋病奈瑟球菌中任一個(gè)或兩者的免疫應(yīng)答。
4.如權(quán)利要求3所述的組合物，其特征在于，所述免疫應(yīng)答足以阻止或預(yù)防腦膜炎奈瑟球菌或淋病奈瑟球菌的感染。
5.如上述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的組合物，其特征在于，所述H因子結(jié)合蛋白經(jīng)過修飾以避免或減少H因子與所述H因子結(jié)合蛋白的結(jié)合。
6.如上述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的組合物，其特征在于，所述修飾的H因子結(jié)合蛋白與野生型蛋白質(zhì)相比，在蛋白質(zhì)的一個(gè)或多個(gè)位置上被改變。
7.如上述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的組合物，其特征在于，所述修飾的H因子結(jié)合蛋白與野生型蛋白質(zhì)相比，至少有一個(gè)氨基酸被改變。
8.如權(quán)利要求7所述的組合物，其特征在于，所述被改變的一個(gè)或多個(gè)氨基酸是使所述H因子結(jié)合蛋白與H因子形成復(fù)合物時(shí)，與分離的野生型H因子結(jié)合蛋白相比表面暴露減少的氨基酸殘基。
9.如權(quán)利要求7或8所述的組合物，其特征在于，所述H因子結(jié)合蛋白中被改變的一個(gè)或多個(gè)氨基酸選自圖6所示序列中下列位置編號(hào)的氨基酸殘基103、106、107、108、109、 145、147、149、150、154、156、157、180、181、182、183、184、185、191、193、194、195、196、199、 262、264、266、267、268、272、274、283、285、286、288、289、302、304、306、311和 313。
10.如上述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的組合物，其特征在于，所述修飾的H因子結(jié)合蛋白與圖6所示序列具有至少60%的序列相同性，并且在至少一個(gè)位置具有被改變的氨基酸， 造成H因子結(jié)合力消失或顯著降低。
11.如上述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的組合物，其特征在于，所述組合物能引發(fā)/產(chǎn)生的免疫應(yīng)答是保護(hù)性免疫應(yīng)答。
12.用作針對(duì)腦膜炎奈瑟球菌或淋病奈瑟球菌的預(yù)防性或治療性疫苗的上述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的組合物。
13.一種藥物組合物，其包含至少一種修飾的H因子結(jié)合蛋白和藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑。
14.如權(quán)利要求13所述的藥物組合物，其特征在于，包含權(quán)利要求1到12中任一項(xiàng)所述的組合物。
15.一種或多種修飾的H因子結(jié)合蛋白在制備引發(fā)免疫應(yīng)答的藥物中的應(yīng)用。
16.如權(quán)利要求15所述的應(yīng)用，其特征在于，所述藥物用作針對(duì)腦膜炎奈瑟球菌或淋病奈瑟球菌的預(yù)防性或治療性疫苗接種。
17.如權(quán)利要求16所述的應(yīng)用，其特征在于，所述疫苗用于預(yù)防或阻止腦膜炎奈瑟球菌引起的腦膜炎、敗血癥和/或感染性休克。
18.用于產(chǎn)生針對(duì)腦膜炎奈瑟球菌或淋病奈瑟球菌的免疫應(yīng)答的包含一種或多種修飾的H因子結(jié)合蛋白的組合物。
19.一種保護(hù)人或非人動(dòng)物免受腦膜炎奈瑟球菌或淋病奈瑟球菌感染的影響的方法， 包括把權(quán)利要求1到12中任一項(xiàng)所述的組合物給予人或者非人動(dòng)物。
20.一種提高人或非人動(dòng)物的免疫應(yīng)答的方法，包括把權(quán)利要求13或14所述的藥物組合物給予人或非人動(dòng)物。
21.如權(quán)利要求12所述的方法，其特征在于，所述免疫應(yīng)答是保護(hù)性的。
22.—種或多種修飾的H因子結(jié)合蛋白在制備用于免疫人或非人哺乳動(dòng)物使其免受腦膜炎奈瑟球菌或淋病奈瑟球菌感染的藥物中的應(yīng)用。
23.一種用于在生物體中誘發(fā)免疫應(yīng)答的藥盒，包含如上述任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的組合物和給藥相關(guān)的說明書。
全文摘要
本發(fā)明涉及包含至少一種修飾的H因子結(jié)合蛋白的免疫原性組合物，其中該組合物給予人或非人動(dòng)物時(shí)能引發(fā)免疫應(yīng)答；以及相關(guān)的組合物、用途和藥盒。
文檔編號(hào)A61K39/095GK102245202SQ200980148000
公開日2011年11月16日 申請(qǐng)日期2009年10月26日 優(yōu)先權(quán)日2008年10月25日
發(fā)明者C·唐, R·?？怂估? S·M·利亞 申請(qǐng)人:帝國創(chuàng)新技術(shù)有限公司