專利名稱：Apl肽用于治療炎癥性腸病和1型糖尿病的用途的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及醫(yī)藥領域，具體是涉及APL肽(改變的肽配體，Altered Peptide Ligand，簡寫為APL)或其類似物用于治療炎癥性腸病(例如克羅恩病和潰瘍性結腸炎)和 1型糖尿病的用途。
現(xiàn)有技術炎癥性腸病，例如克羅恩病和潰瘍性結腸炎，起源于具有針對共生菌的強烈效應子功能的腸固有層T細胞的激活。然而，導致這些淋巴細胞的慢性激活的確切機理仍然不明(Balfour R(2006)Mechanismof Disease !pathogenesis of Crohn' s disease and ulcerative colitis. Nature clinical practice. Gastroenterology and Hepatology 3(7) :390-407)。大約AlO4個細菌駐留在胃腸道內(nèi)，這種免疫壓力代表著對免疫系統(tǒng)的巨大剌激， 需要在針對致病性生物體的適當應答與無害生物體的耐受之間進行平衡。粘膜免疫系統(tǒng)具有數(shù)種機理來避免不必要的和不受控的炎性應答，例如通過凋亡來減少激活的T細胞 (Peppelenbosch MP and van Deventer SJH(2004)T cell apoptosis andinflammatory bowel disease. Gut 53 :1556-1558)0在正常狀況下，免疫系統(tǒng)迅速清除入侵的腸細菌的感染，下調先天免疫應答并治愈受損的粘膜，而不刺激效應子T細胞應答。與此相反，遺傳上易感的宿主的免疫系統(tǒng)不能引發(fā)針對共生微生物的適當?shù)南忍鞈鸷?或產(chǎn)生耐受形成性免疫應答，隨后激活針對共生細菌、繼而針對慢性腸炎癥的致病性T細胞應答(Podolsky DK(2002) Inflammatory bowel disease. N Engl J Med 347:417-29)。因此，由于未能適當控制由環(huán)境激發(fā)劑例如急性腸感染啟動的炎性過程而導致產(chǎn)生炎癥性腸病。對T細胞凋亡的抗性、對下調性信號的應答的缺乏和持續(xù)暴露于內(nèi)腔抗原和佐劑會輔助使該炎性應答持續(xù)(Mudter J and Neurath MF(2007)Apoptosis of T cells and the controlof inflammatory bowel disease :therapeutic implications. Gut56 293-303)?？肆_恩病的特征在于巨噬細胞、嗜中性粒細胞和T細胞向腸的增強的募集，這導致共刺激和粘附分子以及與THl (T輔助細胞1，簡寫為THl)細胞應答相關的促炎性細胞因子(例如白介素(IL)-6(IL_6)和腫瘤壞死因子-α (TNF-α))和與TH17 (Τ輔助細胞17， 簡寫為ΤΗ17)細胞應答相關的促炎性細胞因子(例如IL-12、IL-23和IL-27)的表達的增力口(Balfour R(2006)Mechanism of Disease !pathogenesis ofCrohn' s disease and ulcerative colitis. Nature clinical practice. Gastroenterology and Hepatology 3(7) :390-407)。腸內(nèi)的炎性細胞的數(shù)目是由細胞的募集、增殖和通過壞死或凋亡方式發(fā)生的死亡而決定的。來自正常腸粘膜的固有層T細胞易于發(fā)生激活誘導的細胞死亡(通過i^s/i^asL系統(tǒng))，其能夠控制淋巴細胞的增殖(Bu P等人Q001) Apoptosis :oneof the mechanisms thatmaintains unresponsiveness of the intestinal mucosal immune system. J Immunol 166:6399-6403)。然而，有數(shù)據(jù)表明克羅恩病患者中的固有層T細胞對于細胞凋亡具有抗性，這會導致激活的效應子THl細胞的群體的擴增，這可能引起疾病永續(xù)和慢性炎癥(Boirivant M等人(1999)Lamina propria T cells in Crohn ' s disease and othergastrointestinal inflammation show defective CD2 pathroute-inducedapoptosis. Gastroenterology 116 :557-565)?？肆_恩病患者的粘膜T細胞中的凋亡缺陷歸因于抗凋亡分子(例如Bcl-2)與促凋亡分子(例如Bax)之間的不平衡，這延長了這些細胞的生存并導致對凋亡信號的抗性 Gna K 等人(1999)Resistence ofCrohn ‘ s disease T cells of multiple apoptotic signals is associated withBcl2/Bax mucosal imbalance. J Immunol 163 1081-90 ；Itoh J 等人(2001)Decreased Bax expression by mucosal Tcells favours resistanceto apoptosis in Crohn' s disease. Gut 49:35-41)。另一方面，Sturm 禾口同事研究了來自患有克羅恩病、潰瘍性結腸炎的患者和健康對照的粘膜T細胞的細胞周期特征。他們證明克羅恩病患者中的粘膜T細胞具有強大的細胞擴增能力，因為相對于患有潰瘍性結腸炎的患者或健康對照的粘膜細胞具有較快的細胞周期，這可能是由于激活依賴性凋亡的缺乏造成的。這些可以解釋為何克羅恩病患者的粘膜含有過量的T細胞，這表示高反應性狀態(tài)并且也表示缺失對共生細菌的耐受(Sturm A等人OO(M)Divergent cell cycle kinetics underlies thedistinct functional capacity of mucosal T cells in Crohn' s disease andulcerative colitis.Gut 53:1624-1631)。這些實驗證據(jù)支持以下事實克羅恩病是這樣的病癥，其中細胞增殖事件超過了通過凋亡方式發(fā)生的死亡，這導致活性T細胞在炎癥位點的積累，這可能是該疾病的發(fā)病中的重要因素。從這個意義上講，用于治療該疾病的最有力的生物試劑可能是那些誘導單核細胞和T細胞凋亡的試劑，例如，針對TNFa、IL-12或IL-6受體的抗體(LUgering等人(2001)Infliximab induces apoptosis in monocytes from patientswith chronic Crohn ' s disease by using it activates to caspasedependent pathroute. Gastroenterology 121 :1145-57)，Gtallmach 等人 O004)An interleukin 12p40_IgG2b coalition protein abrogates Tcell mediated inflammation anti-inflammatory activity in Crohn' sdisease and experimental colitis in alive. Gut 53:339-45)， (Atreya R 等人(2000)Blockade of interleukin 6trans_signaling suppresses T~cellresistance against apoptosis in chronic intestinal inflammation -evidence in Crohn' s disease and experimental colitis in alive. Nat Med6 :583-588)。特別地，針對TNF α的抗體是在類固醇頑固性克羅恩病患者中誘導長期緩和的重要選擇。英夫利昔單抗是嵌合單克隆抗體(AcM)，其包含鼠的可變區(qū)和人類免疫球蛋白 Gl(IgGl)分子的恒定區(qū)，該抗體以巨大的親和性和特異性結合并中和游離的和結合的 TNFa 的效應(Knight DMK 等人(1993) Construction and initial characterization of a mouse-humanchimeric anti-TNF antibody. Mol Immunol 30:1443—1453)。依那西普^tanerapt)是重組蛋白，其包含融合于人類IgGl的Fc部分的人類腫瘤壞死因子受體2(TNFR2)的可溶性部分的兩個單體鏈(Mohler KM等人(1993) Soluble tumor necrosis factor(TNF)receptors are effective therapeutic agentsin lethal endotoxemia andfunction simultaneously as both TNF carriers and TNF antagonists. JImmunol 151 :1548-1561) 該分子已經(jīng)成功用于治療其它炎癥性疾病，例如類風濕性關節(jié)炎(RA) (Moreland LW 等人(1999)Etanerc^pttherapy in rheumatoid arthritis. To randomized, controlled trial. AnnIntern Med 130:478—486)。然而，與英夫利昔單抗不同，依那西普對于克羅恩病沒有臨床上的益處。Van den Brande和同事證明這兩種藥物在治療克羅恩病時的有效性的差異是由于英夫利昔單抗誘導單核細胞和激活的固有層T細胞發(fā)生凋亡的能力(Van de Brande JMH等人(2003) Infliximab but not Etanercept induces apoptosis in laminapropria T-Lymphocytes from patients with Crohn' s disease. Gastroenterology 124:1774-1785)。依那西普不能像英夫利昔單抗一樣誘導細胞凋亡，英夫利昔單抗在克羅恩病中是有效的，這是由于其促已經(jīng)被證明的促凋亡效應。使用英夫利昔單抗和其它誘導T細胞凋亡的藥物治療克羅恩病患者時獲得的臨床結果提示在粘膜T細胞腔室中恢復凋亡可能是成功治療克羅恩病的關鍵因素。到目前為止，英夫利昔單抗是用于治療克羅恩病患者的最成功的治療法。該治療法在治療具有潰瘍性結腸炎的患者中也取得了令人鼓舞的效果。然而，使用該治療法產(chǎn)生了一些副作用，例如在這些患者中，肺結核和支原體病的發(fā)病率增加，這是因為發(fā)生了廣 δ^^^ Φ ^ Ι (Kooloos WM. (2007) Potential role of pharmacogenetics inanti-TNF treatment of rheumatoid arthritis and Crohn' s disease. Drug Discovery Today 12 :125-31)。結果是，目前主要的挑戰(zhàn)是開發(fā)能夠特異性消除致病細胞而不引起廣泛的免疫抑制的治療策略。應此目的，為了調節(jié)免疫應答而非抑制免疫應答，過去數(shù)年已經(jīng)應用了抗原特異性策略。從這個意義上，已經(jīng)使用了天然自身抗原性或APL肽，在誘導外周耐受機制的條件下施用(Prakken B 等人(2004)Epitope-specific immunotheraphy induces immune deviation ofproinflammatory T cells in RA. PNAS 12(101) :4228-33 ；Ben-David H 等人(2005)Down-regulation of myasthenogenic T cell response by todual altered peptide ligand via CD4+CD25+-regulated events leadingto apoptosis. PNAS 102 (6) 2028-33 ；Paas-Rozner M 等人(2001)Thenature of the active suppression of responses associated withexperimental autoimmune myasthenia gravis by a dual alteredpeptide ligand administered by different routes. PNAS 98 (22) :12642_7)。APL是免疫原性肽的類似物，其在與干擾或修飾完成T細胞激活的必要事件的級聯(lián)的T細胞受體或主要組織相容性復合物接觸的必不可少的位置處具有一個或數(shù)個置換 (Bielekova B and Martin R(2001)Antigen-specific immunomodulation via altered peptide ligands. J MolMed 79 :552-6 。在實驗上操作肽配體的內(nèi)在性質的能力允許適當?shù)馗淖兠庖呒毎麘鸬男再|、進程和力度。在國際專利申請?zhí)朩O 2006/032216中，要求保護了源自60kDa的人類熱擊蛋白 (簡寫為Hsp60)的APL肽，以及此類肽的藥物組合物用于治療RA的用途。1型糖尿病是自身免疫器官特異性疾病，其由破壞胰腺(產(chǎn)生胰島素)的β 細胞的T細胞介導，導致葡萄糖代謝的失調(Brown L andEisenbarth GS(1990)Type !diabetes :A chronic autoimmune diseaseof human,mouse,and rat. Annu Rev Immunol8 :647-79)。該疾病的臨床癥狀在免疫系統(tǒng)使接近80% -90%的胰腺細胞失活以后出現(xiàn)。 目前的治療法旨在找到安全的、特異性的和有效的方法以在胰腺細胞發(fā)生永久性損傷之前關閉自身免疫過程，以保持胰島素的內(nèi)源性產(chǎn)生?！澳褪苄缘恼T導”的概念已經(jīng)延伸到了 1 型糖尿病的治療。Irun Cohen和同事已經(jīng)要求保護了人類Hsp60肽用于診斷和治療該疾病的用途(美國專利號6682897)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明通過提供用于治療炎癥性腸病(例如克羅恩病和潰瘍性結腸炎)和1型糖尿病的新的治療選擇而解決了之前提出的問題。本發(fā)明的要義在于使用源自人類Hsp60的免疫調節(jié)性APL肽或其類似物來制備用于治療炎癥性腸病和1型糖尿病的藥物組合物。該肽的序列為SIDLKDKINIGAKLVQLVANNTNEEA，在序列表中表示為SEQ ID NO :1。該肽促進具有克羅恩病的患者的激活的腸固有層和外周血T細胞的凋亡的誘導， 引起參與疾病的發(fā)病的T細胞克隆的抑制，而不引起使用TNFa抗體時發(fā)生的非特異性免疫抑制。使用這種免疫調節(jié)性APL肽或其類似物來治療炎癥性腸病，旨在中和引起該疾病的特征性炎性過程的T細胞的克隆。本發(fā)明的藥物組合物的特征在于其高度特異性，因為中和了致病性的激活的T細胞。這極大地促成了該制備物的安全性，因為其使副作用例如引起肺結核和支原體病的機會性感染最小化，肺結核和支原體病與由于使用藥物例如英夫利昔單抗而引起的廣泛的免疫抑制相關，或者與瘤性過程例如由于使用氨甲蝶呤而引起的淋巴瘤的產(chǎn)生相關。使用之前提及的免疫調節(jié)肽生產(chǎn)用于治療炎癥性腸病的藥物還具有下列優(yōu)點不依賴于其通過非腸道途徑(例如真皮內(nèi)、皮下或靜脈內(nèi))的施用，其活性物質基本上生物分布進入胃腸道胃、小腸和結腸。另外，肽在這些器官中保持足夠發(fā)揮其生物學作用的時間。 如前所述，在腸疾病中，針對共生菌的效應子T細胞的不受控的激活發(fā)生于胃腸道中。該肽的生物分布和誘導致病性內(nèi)腔T細胞凋亡的能力證明了使用這種APL肽來治療克羅恩病和潰瘍性結腸病的合理性。本發(fā)明的藥物組合物的用途可以延伸至其它的特征在于復發(fā)-緩解發(fā)作的炎癥性疾病，其中自我反應性T細胞也具有重要作用，例如1型糖尿病。在國際專利申請WO 2006/032216中要求保護序列表中的SEQ IDNO 1的APL肽的藥物制劑用于治療RA的用途。然而，該專利申請沒有要求保護也沒有啟示該肽可用于治療炎癥性腸病和1型糖尿病。炎癥性腸病不被認為是自身免疫疾病，因為針對自身抗原的免疫應答不負責炎癥的起始和維持，并且至少到目前為止，誘因上相關的自身抗原是未知的，這與自身免疫疾病是不同的。這些疾病的起源依賴于共生菌的存在和針對共生生物體的免疫應答。支持該事實的實驗證據(jù)之一是在無菌條件下，不能誘導實驗性IBD疾病，除非使腸道菌群復原(Chandran ^ A (2003) Inflammatory bowel disease :dysfunction of GALT and gut bacterial flora (I I). Surgeon 1 :125-136 ；Strober ^A (2002) The immunology of mucosal models of inflammation. Annu. Rev. Immunol 20 :495-549) 。@]ft，—_llj，^0 原激發(fā)該疾病的誘導。在美國專利號6682897中，Irun Cohen和同事揭示了人類Hsp60肽用于診斷和治療1型糖尿病的用途。SEQ ID NO :1的序列未包括在該專利中，并且SEQ ID NO :1的肽的類似的生物活性也未被考慮到。與這些作者不同，在本發(fā)明中，我們公開了 SEQ ID NO 1的肽——源自人類Hsp60的APL肽，用于誘導參與該病癥的發(fā)生的致病性T細胞的凋亡的用途。本發(fā)明的實施例首次證明了 SEQ ID NO 1的肽的性質，該性質與其生物分布進入胃腸道及其誘導T細胞的致病克隆的凋亡的能力相關，這使得該肽可用于治療克羅恩病， 潰瘍性結腸炎和ι型糖尿病。本領域技術人員不可能基于國際專利申請?zhí)朩O 2006/032216 給出的要素預測本發(fā)明中要求保護的肽的新的用途?？梢酝ㄟ^肽合成的常規(guī)方法來產(chǎn)生序列為SEQ ID NO 1的肽或其類似物，并且可以通過如下文的實施例中描述的實驗中誘導的免疫應答的水平和質量來評價所述肽或其類似物。在本發(fā)明的上下文中，術語“類似物”是指包括所描述的序列(SEQID N0:1)的一個或多個衍生物但仍然保持與所描述的肽相同的生物活性的APL肽。修飾可以是置換、刪除或插入單一的氨基酸，優(yōu)選為置換。類似物優(yōu)選將包括所描述的肽的小于9個修飾，更優(yōu)選小于6個修飾，再更優(yōu)選小于2個修飾。本發(fā)明的目標還在于用于治療炎癥性腸病和1型糖尿病的藥物組合物，其包含序列為SEQ ID N0:1的源自人類Hsp60的APL肽或其類似物。本發(fā)明的藥物組合物中的肽的量是在宿主中產(chǎn)生有效免疫應答的量。有效的量是所施用的引起誘導T細胞凋亡的數(shù)量， 所述T細胞凋亡顯著消除克羅恩病的炎癥跡象并關閉胃腸道的炎性病灶，胃腸道的炎性病灶是這些疾病的進程的特征。在治療進程中，向患者施用的藥物組合物的量可以根據(jù)一些因素變化，例如，年齡、性別、一般健康狀況以及一般性的免疫應答水平。本發(fā)明還涉及治療炎癥性腸病(例如克羅恩病和潰瘍性結腸炎)和1型糖尿病的方法，包括向患者施用有效量的包含序列為SEQ IDNO 1的肽或其類似物的藥物組合物。根據(jù)本發(fā)明，在治療炎癥性腸病(例如克羅恩病和潰瘍性結腸炎)和1型糖尿病的過程中，通過非腸道或粘膜途徑施用藥物組合物。根據(jù)本發(fā)明，通過選自下列的非腸道途徑施用藥物組合物真皮內(nèi)途徑、皮下途徑、肌內(nèi)途徑和靜脈內(nèi)途徑。在另一個實施方式中， 通過選自下列的粘膜途徑施用藥物組合物直腸途徑和經(jīng)口途徑。由于這些疾病的性質， APL肽或其類似物可以是以灌腸劑施用的制劑的一部分或適合于通過經(jīng)口途徑施用的藥物形式。


圖1. SEQ ID NO 1的肽對于來自具有活性克羅恩病的患者㈧和健康供體⑶的外周血單核細胞存活性的效應。不同的字母代表陰性對照(Oug/mL)與該組中評價的每個劑量的肽之間的顯著性的統(tǒng)計上的差異。圖2是透射電子顯微鏡照片，其顯示了在來自克羅恩病患者的外周血單核細胞中，由SEQ ID NO 1的肽誘導的凋亡。圖板A和B 未經(jīng)處理的細胞(陰性對照)。圖板 C-H 以SEQ ID NO 1的肽(40 μ g/mL)處理的細胞。AV 大量的空泡形成；NF 細胞核片段化；CMC 核周濃縮和染色質遷移；ICO 完整的細胞質的細胞器；AB 凋亡小體；P AB 凋亡小體的吞噬。圖3是透射電子顯微鏡照片，其顯示了在來自克羅恩病患者的腸固有層的單核細胞中，由SEQ ID NO 1的肽誘導的凋亡。圖板A和B 未經(jīng)處理的細胞(陰性對照)。圖板 C和D 以SEQ ID NO 1的肽(40 μ g/mL)處理的細胞。NF 細胞核片段化；CMC 核周濃縮和染色質遷移；AB 凋亡小體。圖4. SEQ ID NO :1的肽對于來自失活的克羅恩病患者的單核細胞的存活性的效應。在X軸上A 未以抗-CD3抗體激活的細胞；B:以抗-CD3抗體激活的細胞。不同的字母代表陰性對照(Oug/mL)與該組中評價的每個劑量的肽之間的顯著性的統(tǒng)計上的差異。圖5是透射電子顯微鏡照片，其顯示了在來自1型糖尿病患者的外周血單核細胞中，由SEQ ID NO 1的肽誘導的凋亡。圖板A和B 未經(jīng)處理的細胞(陰性對照)。圖板C 和D 以SEQ ID NO 1的肽00 μ g/mL)處理的細胞。NF 細胞核片段化；CMC 核周濃縮和染色質遷移；AB 凋亡小體；P AB 凋亡小體的吞噬。圖6.SEQ ID NO :1的肽在Lewis大鼠中的生物分布的研究。A:靜脈內(nèi)途徑， 0. 25mg/kg體重。B 靜脈內(nèi)途徑，lmg/kg體重。C 真皮內(nèi)途徑，0. 25mg/kg體重。D 真皮內(nèi)途徑，lmg/kg體重。所分析的組織是1 肝臟；2 脾；3 腎；4 心臟；5 肺；6 頸神經(jīng)節(jié)；7 腋肱神經(jīng)節(jié)；8 腸系膜神經(jīng)節(jié)鏈；9 骨盆神經(jīng)節(jié)；10 甲狀腺；11 胃；12 小腸；13 大腸。實施例實施例1. APL肽對于來自具有活性克羅恩病的患者和健康供體的外周血單核細胞的存活性的效應通過靜脈穿刺從具有克羅恩病的患者和健康供體提取血液并收集于含有抗凝溶液(檸檬酸鈉123mM，磷酸二氫鈉18. 5mM，檸檬酸17mM和葡萄糖141. 5mM)的無菌管中。將來自每位患者的血液按1 2稀釋于IX的磷酸鹽緩沖的鹽溶液(簡寫為PBS1X)中，將5mL 的此溶液加入到 15mL 的離心管中的;3mL Ficol 1-Paque Plus (Amersham，Biosciences AB, Sweden)中，并在1200rpm離心30分鐘。提取對應于單核細胞的環(huán)。然后，以15mL PBS IX 將細胞洗滌2次，每次洗滌之后，將細胞在900rpm離心。最后，將細胞沉淀懸浮于含有10% 胎牛血清并補充了青霉素(100U/mL)，鏈霉素(100μ g/mL)，25mM/L HEPES和2mM L-谷氨酰胺(均獲自Gibco BRL)的RPMI 1640中。使用Neubauer計數(shù)室計數(shù)來自稀釋的細胞懸浮液(1 20 稀釋于補充的 RPMI，1 2 在臺盼藍(Boehringer Mannheim, Germany)中)的細胞。將單核細胞以IO5個細胞/孔的密度接種于平底的96孔板(Costar，USA)中，終體積為100 μ L，一式三份地以不同濃度的APL肽(SEQ IDNO 1) (10，40和160ug/mL)處理 72小時。未經(jīng)處理的細胞用作基本生長對照。使用3-(4，5-二甲基二唑-2-基)_2，5 二苯基溴化四唑(MTT，Sigma，USA)方法， 按照提供商描述的程序，測定APL肽對于細胞存活性的效應。MTT被存在于代謝活性細胞中的線粒體脫氫酶還原為在組織培養(yǎng)基中不溶的甲臜產(chǎn)物。通過在562nm的吸光度測定的甲臜產(chǎn)物的量與培養(yǎng)物中的活細胞的數(shù)目直接成比例。在37°C在潮濕的5% CO2空氣中培養(yǎng)細胞72小時后，向每個孔中加入20uL MTT(5mg/mL)。然后，將平板在相同的培養(yǎng)條件下溫育4小時。然后，加入IOOuL 2- 丁醇溶液(20%的十二烷基硫酸鈉(SDQ，50%的2- 丁醇和5mL 2N的鹽酸)，通過輕輕的吸液使每個孔中混合均勻。然后，將平板維持在37C持續(xù)振蕩30分鐘，以使甲臜產(chǎn)物完全溶解。最后，使用96孔酶標儀記錄562nm處的吸光度。使用GraphPad Prism軟件程序進行統(tǒng)計分析。數(shù)據(jù)表示為平均值+/_SE。所用的統(tǒng)計學檢驗是Kruskal-Wallis，其是用于多重比較的非參數(shù)檢驗。然后，使用Durm檢驗來鑒定中位數(shù)有顯著性差異的組。ρ < 0. 05的值被認為是顯著性的。如圖1所示，相對于未經(jīng)處理的細胞，在所有的肽的劑量，APL肽處理都顯著降低了來自具有活性克羅恩病的患者的外周血單核細胞的存活性(P < 0.001)。然而，使用該肽進行處理未對來自健康供體的單核細胞的存活性產(chǎn)生影響(在實驗中評價的APL肽的任何劑量都沒有)。該結果說明該肽在克羅恩病患者的細胞中誘導的細胞死亡機制的特異性。 這些結果是5位具有活性克羅恩病和5位健康供體的代表性結果。實施例2.通過透射電子顯微鏡檢查鑒定APL肽在來自克羅恩病的患者的外周血單核細胞中誘導的細胞死亡的機理為了鑒定APL肽(在本發(fā)明中表示為SEQ ID NO 1)在來自具有活性克羅恩病的患者的外周血單核細胞中誘導的細胞死亡是否是由凋亡介導的，通過透射電子顯微鏡檢查(TEM)分析了樣品。該技術允許顯示凋亡細胞的形態(tài)上的特征，這是無可反駁的發(fā)生凋亡的標準。這些特征是電子密集的細胞核(早期染色質的核周遷移)，細胞核片段化，紊亂的和完整的細胞質細胞器，巨大且可以區(qū)分的液泡，細胞表面的變化和凋亡小體中的細胞的瓦解。通過該技術也可以觀察到凋亡小體被周圍細胞的吞噬(White M等人(2004)A morphologicapproach to detect apoptosis based on electron microscopy. MethodsMol Biol 285 :105-11)。在存在和不存在濃度為40ug/mL的APL肽的情況下培養(yǎng)從具有克羅恩病的患者的外周血分離的單核細胞(IOxlO6個細胞)72小時。未經(jīng)處理的細胞用作該測定的對照。溫育72小時后，使用的戊二醛溶液和4%多聚甲醛(在0. IM的磷酸鹽緩沖液中)將樣品固定1小時。然后，以PBS IX洗滌細胞，并以2%的四氧化鋨處理1小時。然后，以0. IM的 cocodilate緩沖液將細胞洗滌2次，將樣品在濃度漸增的醇(30%-100% )中脫水。然后， 使用環(huán)氧樹月旨 Spurr (Spurr AR(1969) A low-viscosity epoxy resin embedding medium for electronmicroscopy. J Ultrastruct Head 26(1) :31-43)滲透細胞，在 70°C聚合 24 小時。使用超微切片機(Nova，LKB)切取超細切片GOnm)，并在鎳架上封片。然后，使用在甲醇中過飽和的乙酸鈾酰溶液將樣品染色5分鐘。在Electronic Microscope JE0L/JEM 2000EX(JE0L, Japan)上進行分析。在圖2中顯示了來自具有活性克羅恩病的患者的單核細胞的TEM結果。如所觀察到的那樣，未經(jīng)處理的細胞具有正常的形態(tài)(A和B)。然而，在經(jīng)APL肽(SEQ ID N0:1)處理的細胞中，可以觀察到凋亡過程的特征性形態(tài)變化(C-H)。特別地，可以觀察到染色質的濃縮和向核周的遷移(CMC)，這是凋亡過程中發(fā)生于細胞核(N)中的最早的形態(tài)變化之一。 另外，在這些樣品中也觀察到了細胞核片段化(NF)和凋亡小體(AB)。通過細胞碎片的存在可以知道，發(fā)生了凋亡小體的吞噬(P AB) 0在圖2F中觀察到了細胞質細胞器保持完整 (ICO)，其是通過凋亡發(fā)生細胞死亡的特征。這些結果證明這種APL肽在具有活性克羅恩病的患者的單核細胞中誘導的細胞死亡是通過凋亡介導的。通過TEM對這些患者細胞的分析還允許鑒定單核的細胞中發(fā)生凋亡的細胞群體。 該結果是可能的，因為血液的不同類型的白細胞(單核細胞(monocyte)、淋巴細胞和多形核)具有不同的形態(tài)。在單核的細胞(mononuclear cell)中，我們鑒定出淋巴細胞是發(fā)生凋亡的群體。從形態(tài)的角度來看，淋巴細胞比單核細胞(monocyte)小，也具有圓的細胞核和較少的細胞質。此外，淋巴細胞不呈現(xiàn)具有松散染色質或具有馬蹄形的細胞核(單核細胞(monocyte) 白勺特 征)(Junqueira LC and Carneiro J(2005)Basic Histology. Sixth edition. Editorial Masson, Barcelona, Spain).實施例3. APL肽在來自克羅恩病患者的腸固有層單核細胞中誘導的細胞死亡機理的鑒定在知情同意的情況下獲得對應于發(fā)炎的斑的腸組織的樣品。將樣品保持在冷的不含鎂和鈣的Hank平衡鹽溶液(HBSS)中。使用Bull和Bookman (Bull DMK and Bookman MA(1977)Isolation andfunctional characterization of human intestinal mucosal lymphoidcells. J Clin Invest 59:966-974)描述的二硫蘇糖醇/乙二胺四乙酸/膠原酶方法，按照 Van Tol 和同事(Van Tol EA 等人(1992)The CD56adhesion molecule is the major determinant for detecting non-majorhistocompatibiIity complex-restricted cytotoxic mononuclear cellsfrom the intestinal lamina propria. Eur J Immunol 22: 23-29)作出的修改，從這些組織中分離固有層單核細胞。在存在和不存在APL肽(SEQ ID NO 1) (40ug/mL)的情況下，培養(yǎng)來自克羅恩病患者的固有層單核細胞(IOxlO6個細胞)72小時。通過TEM進行的分析(圖3)揭示該肽通過凋亡誘導該群體中的一大部分細胞的死亡，因為在經(jīng)APL肽處理的細胞中可以觀察到這種類型的細胞死亡的一些形態(tài)特征(C-E)，例如染色質向核周遷移(CMC)，細胞核片段化 (NF)和凋亡小體(AB)。未經(jīng)處理的細胞具有正常的形態(tài)(A-B)。實施例4.來自具有失活的克羅恩病的患者的外周血單核細胞在以抗⑶3抗體激活后的存活性的降低在37°C，在5% (X)2的潮濕空氣中，以抗-CD3抗體(e-Biosciences)激活來自具有失活的克羅恩病的患者的外周血單核細胞72小時。加入抗-CD3抗體引起了細胞群體中T細胞的多克隆激活。以PBS IX溶液洗滌激活的淋巴細胞，然后以不同濃度(10，40和 160ug/mL)的APL肽(SEQ ID NO 1)溫育(IxlO5個細胞)1小時。在不存在抗-⑶3抗體的情況下培養(yǎng)72小時的外周血單核細胞用作激活測定的對照(未激活的細胞)。此后，以相同濃度的APL肽培養(yǎng)這些細胞。使用如實施例1描述的MTT方法測定細胞存活性。如圖4A中可以觀察到的那樣， APL肽不降低來自具有失活的克羅恩病患者的單核細胞的存活性。然而，該肽顯著降低之前經(jīng)過抗-CD3抗體激活的那些細胞的存活性(B)。該結果聯(lián)同實施例1和2中所示的結果 (其中該肽不影響來自健康供體的單核細胞的存活性(實施例1)和淋巴細胞被鑒定為來自具有活性克羅恩病的患者的單核細胞中發(fā)生凋亡的主要群體(實施例2))表明這種APL肽 (SEQ ID NO 1)能夠以高度特異性誘導致病性的激活的T細胞的凋亡。實施例5. APL肽對于來自具有1型糖尿病的患者的外周血單核細胞的存活性的影響的評價按照實施例1的描述，通過在Ficoll-Paque PLUS上離心分離來自具有1型糖尿病患者的外周血單核細胞。以APL肽G0ug/mL)處理IOxlO6個細胞72小時。未經(jīng)處理的細胞用作該測定的對照。如圖5所示，以該肽處理的細胞具有之前描述的(見實施例2)發(fā)生凋亡的細胞的形態(tài)(圖板C-D)。另一方面，未經(jīng)處理的細胞(圖板A-B)具有正常形態(tài)。該結果證明這種APL肽誘導來自具有1型糖尿病的患者的單核細胞的凋亡。實施例6. APL肽(SEQ ID NO :1)在Lewis大鼠中的生物分布研究以I125同位素標記APL肽(SEQ ID NO 1),并將其以0. 25mg和lmg/Kg體重的劑量通過靜脈內(nèi)和真皮內(nèi)途徑施用至Lewis大鼠。在接種肽之后4和M小時，從每個實驗組處死6只動物。測定不同器官中的放射活性水平。結果表示為％放射活性劑量/克組織。該研究表明這種肽生物分布進入胃腸道胃、小腸和結腸，在這些器官中保持足以發(fā)揮其生物學機制的時間。該結果支持該肽用于治療炎癥性腸病，例如克羅恩病和潰瘍性結腸炎的用途。此外，該肽可用于治療其它自身免疫病，例如1型糖尿病，因為胃腸道是誘導外周耐受的良好位點。
權利要求
1.序列為SEQID NO :1的源自人類hsp60的APL肽或其類似物在制備用于治療炎癥性腸病和1型糖尿病的藥物組合物中的用途。
2.根據(jù)權利要求1的APL肽的用途，其中所述炎癥性腸病選自克羅恩病和潰瘍性結腸炎。
3.根據(jù)權利要求1的APL肽的用途，其中所述藥物組合物包含載體或藥學上可接受的賦形劑。
4.序列為SEQID NO :1的源自人類hsp60的APL肽或其類似物用于誘導具有炎癥性腸病和1型糖尿病的患者中的T細胞的致病性克隆的凋亡的用途。
5.根據(jù)權利要求4的APL肽的用途，其中所述炎癥性腸病選自克羅恩病和潰瘍性結腸炎。
6.根據(jù)權利要求1的APL肽的用途，其中所述藥物組合物通過非腸道或粘膜途徑施用。
7.根據(jù)權利要求6的APL肽的用途，其中所述藥物組合物通過選自真皮內(nèi)途徑、皮下途徑、肌內(nèi)途徑和靜脈內(nèi)途徑的非腸道途徑施用。
8.根據(jù)權利要求6的APL肽的用途，其中所述藥物組合物通過選自直腸途徑和經(jīng)口途徑的粘膜途徑施用。
9.治療炎癥性腸病和1型糖尿病的方法，包括向患者施用治療上有效量的包含序列為SEQ ID NO 1的源自人類hsp60的APL肽或其類似物的藥物組合物。
10.權利要求9的治療方法，其中所述炎癥性腸病選自克羅恩病和潰瘍性結腸炎。
11.權利要求9的治療方法，其中所述藥物組合物通過非腸道或粘膜途徑施用。
12.權利要求11的治療方法，其中所述藥物組合物通過選自真皮內(nèi)途徑、皮下途徑、肌內(nèi)途徑和靜脈內(nèi)途徑的非腸道途徑施用。
13.權利要求11的治療方法，其中所述藥物組合物通過選自直腸途徑和經(jīng)口途徑的粘膜途徑施用。
14.用于治療炎癥性腸病和1型糖尿病的藥物組合物，其包含序列為SEQID N0:1的源自人類hsp60的APL肽或其類似物。
15.權利要求14的藥物組合物，其中所述炎癥性腸病選自克羅恩病和潰瘍性結腸炎。
全文摘要
本發(fā)明涉及醫(yī)藥領域，具體是涉及源自60kDa的人類熱擊蛋白的APL或其類似物在制備用于治療克羅恩病、潰瘍性結腸炎和1型糖尿病的藥物組合物中的用途。該肽生物分布進入胃腸道，并且還促進誘導具有克羅恩病的患者的激活的腸固有層和外周血T細胞的凋亡。此外，該肽誘導具有1型糖尿病的患者的單核細胞的凋亡。
文檔編號A61P3/10GK102307587SQ200980156252
公開日2012年1月4日 申請日期2009年12月29日 優(yōu)先權日2008年12月29日
發(fā)明者A·巴爾貝拉貝當古, G·R·帕德倫帕勒馬瑞斯, I·曼恩德茲瓦爾德斯, M·D·C·多民古斯霍塔, N·洛倫索佩雷斯, V·法爾肯卡瑪 申請人:遺傳工程與生物技術中心