一種用于腸道疾病檢測(cè)的試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種用于腸道疾病檢測(cè)的試劑盒，該試劑盒含有結(jié)合Metrnl的適體，能夠快速高效的鑒定潰瘍性結(jié)腸炎。該試劑盒制備簡(jiǎn)單，成本低廉，適宜于大面積的推廣使用，具有極高的應(yīng)用價(jià)值。
【專利說(shuō)明】
一種用于腸道疾病檢測(cè)的試劑盒
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及醫(yī)學(xué)檢測(cè)領(lǐng)域，特別涉及一種用于腸道疾病檢測(cè)的試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002] 炎癥性腸病（Inf lammatcxryBowelDisease，IBD)又稱腸炎，是一組反復(fù)發(fā)作的慢 性腸炎癥性腸道疾病。炎癥性腸病主要包括克羅恩病和潰瘍性結(jié)腸炎 (ulcerativecolitis，UC)兩類。在發(fā)達(dá)國(guó)家，發(fā)病率達(dá)到了 1/1000。在中國(guó)，近十年間炎癥 性腸病的總病例約為35萬(wàn)。值得注意的是，該病患病人數(shù)在逐年增加，與前10年相比，炎癥 性腸病總病例數(shù)增長(zhǎng)約超過(guò)24倍，其中，克羅恩病患者數(shù)量增長(zhǎng)甚至超過(guò)15倍。潰瘍性結(jié)腸 炎病變主要位于結(jié)腸的黏膜層，且以潰瘍?yōu)橹鳎嗬奂爸蹦c和遠(yuǎn)端結(jié)腸，但可向近端擴(kuò)展， 導(dǎo)致遍及整個(gè)結(jié)腸，其重要癥狀有腹瀉、脈血便、腹痛和里急后重，該病病程長(zhǎng)，病情輕重不 一，常反復(fù)發(fā)作，與結(jié)腸癌的發(fā)病有關(guān)，臨床上常常表現(xiàn)為反復(fù)發(fā)作而治愈難度大，被世界 衛(wèi)生組織列為現(xiàn)代難治病之一。
[0003] 目前，腸鏡、病理學(xué)及影像學(xué)檢查是診斷及炎癥性腸病患者定期復(fù)查的主要手段， 該些檢查費(fèi)用較高，大多數(shù)為侵入性的有創(chuàng)檢查，風(fēng)險(xiǎn)高，而該疾病病程偏長(zhǎng)，患者常需反 復(fù)定期復(fù)查腸鏡及其他檢查，患者的忍受性差，嚴(yán)重影響了患者的生活質(zhì)量及工作。因此， 急需尋找一種對(duì)炎癥性腸病診斷特異性高，創(chuàng)傷小，操作簡(jiǎn)單，方便高危人群，能夠檢測(cè)疾 病的發(fā)展及預(yù)后的血清標(biāo)志物，該樣無(wú)論是對(duì)臨床還是對(duì)患者帶來(lái)很大的利益。
[0004] Metrnl蛋白共由311個(gè)氨基酸組成，在NCBI中的注冊(cè)號(hào)為NM_001004431.1，注釋為 人神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞分化調(diào)節(jié)因子meteorin樣分子。Metrnl蛋白已經(jīng)在人、小鼠、牛、雞、非洲瓜 贍和斑馬魚(yú)中鑒定出來(lái)。
[0005] CN104977415 A中公開(kāi)了關(guān)于Metrnl蛋白作為炎癥性腸病診斷血清標(biāo)志物的應(yīng) 用。雖然可以采用抗體通過(guò)酶聯(lián)免疫反應(yīng)來(lái)定量分析Metrnl的含量，但是該方法對(duì)抗體的 要求比較高，并且檢測(cè)成本也比較高，因此，對(duì)于貧窮落后地區(qū)，并不適宜大面積推廣。
[0006] SELEX技術(shù)是20世紀(jì)90年代初發(fā)展起來(lái)的一種新的組合化學(xué)技術(shù)。利用該技術(shù)可 以從隨機(jī)單鏈寡核苷酸庫(kù)中篩選到特異性與靶物質(zhì)高度親和的核酸適配體。其基本思路是 體外化學(xué)合成一個(gè)單鏈寡核苷酸庫(kù)，與靶物質(zhì)混合，形成靶物質(zhì)-核酸復(fù)合物，洗脫未結(jié)合 的核酸，分離與靶物質(zhì)結(jié)合的核酸分子，并以此核酸分子為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，再進(jìn)入下輪 的篩選。通過(guò)重復(fù)的篩選與擴(kuò)增，一些與靶物質(zhì)不結(jié)合或與靶物質(zhì)有低親和力、中親和力的 核酸分子被洗去，而與革G物質(zhì)有強(qiáng)未和力的核酸分子從非常大的隨機(jī)庫(kù)中分尚出來(lái)，且純 度隨SELEX過(guò)程的進(jìn)行而增高，最后占據(jù)庫(kù)的大多數(shù)（>90%左右）。自Tuerk和Ellington等 首先運(yùn)用此技術(shù)篩選到特異性吸附噬菌體T4DNA聚合酶和有機(jī)染料分子的特異核酸適配體 后，經(jīng)過(guò)十幾年的發(fā)展，SELEX技術(shù)已經(jīng)成為一種重要的研宄手段和工具。因此，采用selex 技術(shù)，篩選特定的結(jié)合ESP的適配體，進(jìn)而將適配體制備成為特異性檢測(cè)ESP的試劑盒，準(zhǔn) 確、快速、簡(jiǎn)便地進(jìn)行肺吸蟲(chóng)病的診斷與鑒別診斷、以及療效考核具有重要意義及廣闊的應(yīng) 用前景。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明的技術(shù)方案通過(guò)以下步驟實(shí)現(xiàn)：
[0008] 本發(fā)明的目的是提供一種Metrnl蛋白的核酸適配體序列。
[0009] 本發(fā)明中，所述的Metrnl的核酸適配體(序列1-22)能夠特異結(jié)合Metrnl蛋白。
[0010] 本發(fā)明的進(jìn)一步的目的是提供所述核酸適配體序列的用途。本發(fā)明中根據(jù)對(duì)該序 列應(yīng)用，可進(jìn)一步用于制備特異性結(jié)合Metrnl蛋白的試劑盒。
[0011] 從體外合成的隨機(jī)寡聚DNA文庫(kù)，（5 '-AACATTGACGAAGCGTAGAT(N35) AGAACTTGAGCAGATGCGAC-3 '），其中N35為35個(gè)隨機(jī)寡核苷酸;從中篩選出與METRNL蛋白特異 結(jié)合的核酸適配體；將篩選出的序列用引物PI : AACATTGACGAAGCGTAGAT ;引物P2 : GTCGCATCTGCTCAAGTTCT，進(jìn)行擴(kuò)增并進(jìn)行TA克隆入pMD19-T載體(購(gòu)自上海博光生物公司）， 轉(zhuǎn)化DH5a細(xì)菌(購(gòu)自北京天根生物公司）；挑去白色菌落進(jìn)行PCR確定陽(yáng)性克隆后，抽提質(zhì)粒 并測(cè)序反應(yīng)，上測(cè)序儀測(cè)序。
[0012]本發(fā)明采用核酸適配體的體外篩選(SELEX)技術(shù)，以METRNL蛋白為正篩靶標(biāo)，篩選 與METRNL特異結(jié)合的核酸適配體，制得具有特異結(jié)合Metrnl的序列，本發(fā)明中命名為適配 體METRNL-1~22。序列如下：

[0035] 以上述核酸適配子篩選文庫(kù)為基礎(chǔ)，可對(duì)文庫(kù)兩端的固定序列的個(gè)別核苷酸進(jìn)行 替換、顛倒、移位，或?qū)ζ溟L(zhǎng)度進(jìn)行小幅延長(zhǎng)或縮短，或?qū)ξ膸?kù)中間的隨機(jī)序列進(jìn)行延長(zhǎng)或 縮短，或?qū)U(kuò)增文庫(kù)的引物作相應(yīng)的簡(jiǎn)單改造，然后制備簡(jiǎn)單改造后的文庫(kù)和引物進(jìn)行核 酸適配子的篩選、PCR擴(kuò)增和分析與應(yīng)用。
[0036] 以上述核酸適配子篩選文庫(kù)為基礎(chǔ)，可隨機(jī)改變文庫(kù)中間的隨機(jī)序列區(qū)的核苷酸 組成，通過(guò)計(jì)算機(jī)軟件模擬寡核苷酸序列的二級(jí)結(jié)構(gòu)或三級(jí)結(jié)構(gòu)，設(shè)計(jì)出核酸適配子或改 造從本文庫(kù)篩選出的核酸適配子。
[0037] 可利用上述任何一個(gè)原始或簡(jiǎn)單改造后的文庫(kù)進(jìn)行核酸適配子的篩選、分析、改 造和應(yīng)用。
[0038] 本發(fā)明的有益效果:本發(fā)明設(shè)計(jì)出了一個(gè)性能優(yōu)秀的隨機(jī)單鏈寡核苷酸文庫(kù)。文 庫(kù)具有接近長(zhǎng)度下限的短固定序列和較長(zhǎng)的隨機(jī)序列，充分保證了文庫(kù)中單鏈寡核苷酸的 多樣性。文庫(kù)固定序列（引物序列）的獨(dú)特設(shè)計(jì)能使用高退火溫度進(jìn)行PCR擴(kuò)增，既能有效獲 得目的產(chǎn)物，又能有效抑制非特異性產(chǎn)物。本文庫(kù)及引物應(yīng)用于METRNL的核酸適配子篩選 獲得成功，所述的適配子可以用于制備檢測(cè)試劑盒，從而用于人腸道疾病的檢測(cè)。
【具體實(shí)施方式】
[0039]實(shí)施例1人Metrnl蛋白的獲得
[0040] 根據(jù)人Metrnl蛋白的氨基酸序列NP_001004431.1獲得相應(yīng)的基因序列，利用CN 1318594 C中實(shí)施例1的真核表達(dá)蛋白的方法，進(jìn)行蛋白的表達(dá)，采用常規(guī)的蛋白純化方法 得到純化的蛋白，濃度為150mg/ml，4度儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?br>[0041] 實(shí)施例2適配子的獲得
[0042] 從體外合成的隨機(jī)寡聚DNA文庫(kù)，5' -AACATTGACGAAGCGTAGAT(N35) AGAACTTGAGCAGATGCGAC-37 〇
[0043] 所用引物：
[0044] F:5，-AACATTGACGAAGCGTAGAT-3 '
[0045] R:5，-GTCGCATCTGCTCAAGTTCT-3
[0046] 將單鏈DNA文庫(kù)擴(kuò)增為雙鏈DNA，產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳并切膠回收純化；以回 收的雙鏈DNA為模板，體外轉(zhuǎn)錄出單鏈RNA隨機(jī)文庫(kù)，轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物經(jīng)PAGE純化。80yg RNA文庫(kù)經(jīng) 硝酸纖維素膜反篩去除與膜結(jié)合的RNA分子，然后與30ug Metrnl蛋白37°C孵育40min，反應(yīng) 液經(jīng)硝酸纖維素膜濾過(guò)，洗滌濾膜；然后將濾膜剪碎，置于洗脫緩沖液（6mol/L尿素， 0.7mo 1/L醋酸銨，1.6mmo 1/L EDTA，0.15 % SDS)中煮沸5min，離心，取上清，無(wú)水乙醇沉淀 RNA，并重新溶解于20ylDEPC水中；以RNA為模板RT-PCR擴(kuò)增雙鏈DNA，體外轉(zhuǎn)錄出RNA文庫(kù)用 于下一輪篩選;每輪篩選過(guò)程中RT-PCR得到雙鏈DNA文庫(kù)，以該雙鏈DNA為模板體外轉(zhuǎn)錄出 適配子庫(kù)，篩選共進(jìn)行15輪。將最后一輪篩選得到的適配子上測(cè)序儀測(cè)序。測(cè)定得到序列如 SEQ ID NO :1-22所示。
[0047]實(shí)施例3特異性高親和力的Metrnl結(jié)合適配子的獲得
[0048] 將適配子分別取1.5yg，用牛小腸堿性磷酸酶(CIP)37°C消化lh，純化回收去磷酸 化的適配子;通過(guò)T4多核苷酸激酶標(biāo)記[γ-32Ρ]ΑΤΡ于去磷酸化的適配子分子末端。lOnmol 放射性標(biāo)記的適配子分別與不同濃度（1_200ηΜ)的Metrnl蛋白37°C孵育30min，各組反應(yīng)液 經(jīng)硝酸纖維素膜濾過(guò)，洗滌濾膜，干燥濾膜，液閃計(jì)數(shù)儀測(cè)定濾膜上殘留的放射量，同一樣 品平行做兩次測(cè)定。計(jì)算各個(gè)適配子與Metrnl蛋白的解離常數(shù)。結(jié)果如下：
[0051]從以上結(jié)果可以看出，本發(fā)明的22個(gè)適配子具有非常強(qiáng)的結(jié)合特性，現(xiàn)有技術(shù)中 也沒(méi)有所述結(jié)合特性的適配子能夠結(jié)合Metrnl蛋白。
[0052]實(shí)施例4降解活性分析
[0053]分別采用人血白蛋白、IgA、血紅蛋白，外周血單核細(xì)胞P-糖蛋白，胰腺酶原粒的糖 蛋白2、Metrnl蛋白與22條適配子進(jìn)行特異性檢測(cè)，經(jīng)過(guò)結(jié)合試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，這些適配子都不與 這些蛋白相結(jié)合，而只與Metrnl蛋白結(jié)合保持較高的特異性。
[0054] 將所述的適配子，取0.4ug，分別置于常溫的血清、水溶液中，放置四周。通過(guò)RT-PCR檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)四周的放置其結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，沒(méi)有被降解。
[0055]實(shí)施例5臨床試驗(yàn)分析
[0056] 將22個(gè)適配子分別與Metrnl蛋白通過(guò)免疫磁珠分離的方式構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)品檢測(cè)的標(biāo) 準(zhǔn)曲線。然后將40組樣本的血清樣本(30組為潰瘍性結(jié)腸炎患者，10組為正常人群)分別去 1〇μ1加入到無(wú)菌離心管中，加入PBS溶液震蕩溶解。分別將偶聯(lián)有磁珠的22組適配子與40組 的樣本溶液混合孵育2〇分鐘（一種適配子對(duì)應(yīng)檢測(cè)50組血清樣本），而后磁分離，即可獲得 相應(yīng)的分離的Metrnl蛋白，通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線濃度檢測(cè)獲得相應(yīng)的蛋白濃度結(jié)果，通過(guò)檢測(cè)，針 對(duì)同一個(gè)樣本，各適配子檢測(cè)出的濃度幾乎沒(méi)有差距;而各組之間的濃度存在明顯的差異， 以正常人的蛋白濃度的平均值作為對(duì)照，結(jié)果如下：
[0058]從以上結(jié)果可以看出，潰瘍性結(jié)腸炎Metrnl蛋白濃度顯著的增加，與正常人之間 可以顯著的區(qū)分開(kāi)來(lái)。說(shuō)明本發(fā)明的適配子可以用于檢測(cè)分析。
[0059]上述實(shí)施例為本發(fā)明較佳的實(shí)施方式，但本發(fā)明的實(shí)施方式并不受上述實(shí)施例的 限制，其他的任何未背離本發(fā)明的精神實(shí)質(zhì)與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡(jiǎn)化， 均應(yīng)為等效的置換方式，都包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種用于腸道疾病檢測(cè)的試劑盒，其特征在于:含有結(jié)合Metrnl的適體。2. 如權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于:所述適體為SEQ ID No. 1-22任一條序列所 示，或者在該序列的基礎(chǔ)上進(jìn)行的一個(gè)或幾個(gè)核苷酸的替換，并保留其活性。3. 權(quán)利要求1-2任一項(xiàng)所述的試劑盒用于檢測(cè)潰瘍性結(jié)腸炎的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】G01N33/68GK106018828SQ201610451600
【公開(kāi)日】2016年10月12日
【申請(qǐng)日】2016年6月19日
【發(fā)明人】曹帥
【申請(qǐng)人】曹帥