專(zhuān)利名稱(chēng)：免疫增強(qiáng)型乙肝治療性多價(jià)疫苗及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種多價(jià)疫苗，特別涉及一種免疫增強(qiáng)型乙肝治療性多價(jià)疫苗，還涉 及該疫苗的制備方法。
背景技術(shù)：
乙型肝炎病毒(HBV)是一種嗜肝的DNA病毒。乙型病毒性肝炎簡(jiǎn)稱(chēng)乙肝，是由HBV 引起，主要通過(guò)血液、體液及母嬰傳播，具有慢性攜帶狀態(tài)的傳染病。目前世界上有3億多 人為慢性HBV感染，我國(guó)約占半數(shù)。此種感染容易發(fā)展為慢性肝炎和肝硬化，少數(shù)病例可轉(zhuǎn) 變?yōu)樵l(fā)性肝細(xì)胞癌，是當(dāng)前WHO公布的人類(lèi)疾病死亡原因中居第9位的疾病。目前，慢 性HBV感染主要采用抗病毒藥物如α -干擾素和拉米夫定等進(jìn)行治療，但療效都不甚理想。 α -干擾素治療慢性乙肝的近期應(yīng)答率為40% 60%，用藥后1年的應(yīng)答率僅為20% 40%，且治療時(shí)可發(fā)生與劑量相關(guān)的副作用。拉米夫定治療慢性乙肝持續(xù)用藥1年時(shí)，乙型 肝炎病毒e抗原(HBeAg)陰轉(zhuǎn)率為20% 25% ,HBeAg血清轉(zhuǎn)換率為15% 20%，治療時(shí) 間長(zhǎng)易出現(xiàn)耐藥及HBV DNA多聚酶基因酪氨酸-蛋氨酸-天門(mén)冬氨酸-天門(mén)冬氨酸(YMDD) 變異，停藥后常導(dǎo)致反跳。因此，積極尋求更為有效的抗病毒藥物仍為當(dāng)務(wù)之急。研究發(fā)現(xiàn)，HBV感染的慢性化主要是由于機(jī)體對(duì)HBV的免疫應(yīng)答特別是細(xì)胞免疫 應(yīng)答不能清除病原，從而導(dǎo)致感染的持續(xù)存在。在急性HBV感染時(shí)，機(jī)體存在大量的針對(duì) HBV多個(gè)抗原表位的多特異性、多克隆的細(xì)胞毒性T細(xì)胞(CTL)應(yīng)答，而在慢性HBV感染時(shí)， 這些CTL應(yīng)答非常微弱甚至檢測(cè)不到。因此，采取恰當(dāng)?shù)拿庖叻绞剑蚱茩C(jī)體對(duì)HBV的免疫 耐受，重建活躍的免疫應(yīng)答，有望清除病毒，終止慢性HBV感染。目前，我國(guó)還沒(méi)有乙肝治療性疫苗正式上市，國(guó)內(nèi)很多單位都在進(jìn)行乙肝治療性 疫苗的研究，從目前研究結(jié)果來(lái)看，乙肝治療性疫苗較現(xiàn)有抗病毒藥物療效更好。在乙肝治 療性疫苗的研制中，基于乙肝病毒蛋白抗原CTL表位的多肽疫苗的研制是一個(gè)重要方向。 但是，單純的多肽疫苗存在免疫原性弱、半衰期短及不易被APC攝取等固有缺陷，必須對(duì)其 進(jìn)行修飾、改進(jìn)。CTL是通過(guò)其T細(xì)胞受體(TCR)特異性識(shí)別抗原遞呈細(xì)胞(APC)表面的主要組織 相容性復(fù)合體(MHC) I類(lèi)分子-肽復(fù)合物而得以活化，并最終殺死靶細(xì)胞。其中，與MHC-I類(lèi) 分子特異性結(jié)合的短肽即CTL表位在CTL活化過(guò)程中起關(guān)鍵作用。但大多數(shù)MHC-I類(lèi)分子 只遞呈內(nèi)源性抗原。外源性抗原絕大多數(shù)進(jìn)入MHC-II類(lèi)抗原遞呈途徑以激活輔助性T細(xì) 胞(Th細(xì)胞)，僅有少數(shù)可被MHC-I類(lèi)分子遞呈，即交叉遞呈。因此，如何將外源性短肽有效 投入APC內(nèi)MHC-I類(lèi)抗原遞呈途徑是激發(fā)特異性CTL應(yīng)答的關(guān)鍵，也是基于表位開(kāi)發(fā)疫苗 的瓶頸問(wèn)題。由于細(xì)胞膜的屏障作用，生物大分子不能自由進(jìn)入細(xì)胞。近年來(lái)，一些具有細(xì)胞 膜穿透能力的小分子多肽(其長(zhǎng)度一般不超過(guò)30個(gè)氨基酸)相繼被發(fā)現(xiàn)，其可有效攜帶 外源性大分子進(jìn)入細(xì)胞，并對(duì)宿主細(xì)胞沒(méi)有顯著毒副作用。這些具有細(xì)胞穿透能力的多肽 被命名為細(xì)胞穿膜肽(CPP)。研究最早的CPP為人類(lèi)免疫缺陷病毒(HIV)-I的反式激活蛋白Tat。1988年，Green和Frankel證實(shí)Tat能跨膜轉(zhuǎn)移到細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核內(nèi)。1997年， Vives等發(fā)現(xiàn)Tat中一個(gè)富含堿性氨基酸、帶正電荷的多肽片段與蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)功能密切相關(guān)， 稱(chēng)之為蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)域。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，由Tat第49-57位氨基酸殘基組成的序列(Arg-Lys-Lys-Arg-Arg-Gln-Arg-Arg-ArgjRKKRRQRRR)即可完全行使蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)的功能，這是Tat既有 穿膜特性又無(wú)細(xì)胞毒性的最小片段。另外，研究發(fā)現(xiàn)，Tat49-57可有效促進(jìn)與之偶聯(lián)的外 源CTL表位進(jìn)入MHC-I類(lèi)抗原遞呈途徑，表現(xiàn)為動(dòng)力學(xué)顯著增強(qiáng)，且該過(guò)程表現(xiàn)為蛋白酶體 /TAP非依賴、氨基肽酶依賴。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(ER)是MHC-I類(lèi)分子遞呈抗原肽的最重要場(chǎng)所，若使外源性抗原肽靶向轉(zhuǎn) 運(yùn)至ER腔，可望增強(qiáng)外源性抗原肽被MHC-I類(lèi)分子提呈的效率。研究發(fā)現(xiàn)，ER滯留信號(hào)一 賴氨酸-天冬氨酸-谷氨酸-亮氨酸(Lys-Asp-Glu-Leu，KDEL)基序可明顯增強(qiáng)與之偶聯(lián) 的外源CTL表位在APC內(nèi)的MHC-I類(lèi)抗原遞呈效率，并且顯著延長(zhǎng)APC表面MHC-肽復(fù)合物 的遞呈時(shí)間，提示羧基端KDEL基序修飾是將外源肽有效導(dǎo)入APC內(nèi)MHC-I類(lèi)抗原遞呈途徑 的一個(gè)簡(jiǎn)單有效的新策略。LIGHT (homologous to 1 ympho tox i ns , inducible, competes with HSVglycoprotein D for HVEM, expressed by Tlymphocyte)是一個(gè)新發(fā)現(xiàn)的腫瘤壞死因子 (TNF)超家族成員。LIGHT基因定位于人類(lèi)染色體16p 11. 2,LIGHT mRNA高表達(dá)于脾臟、激 活的T細(xì)胞和巨噬細(xì)胞。LIGHT蛋白為典型的II型跨膜蛋白，其一級(jí)結(jié)構(gòu)由240個(gè)氨基酸 組成，包括胞質(zhì)內(nèi)位于N端的37個(gè)氨基酸、跨膜區(qū)的22個(gè)氨基酸以及胞外區(qū)的181個(gè)氨基 酸，其第102位氨基酸殘基為N-端糖基化位點(diǎn)。研究發(fā)現(xiàn)，LIGHT可與3種不同的受體淋 巴毒素β受體(LT β R)、單純皰疹病毒侵入介導(dǎo)物(HVEM)及誘騙受體(DcR3)結(jié)合，通過(guò)非 半胱天冬氨酸蛋白酶和非CD28依賴途徑分別誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的凋亡和共刺激T細(xì)胞的活化。

發(fā)明內(nèi)容
有鑒于此，本發(fā)明的目的之一在于提供一種免疫增強(qiáng)型乙肝治療性多價(jià)疫苗，目 的之二在于提供所述免疫增強(qiáng)型乙肝治療性多價(jià)疫苗的制備方法。為達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案1、免疫增強(qiáng)型乙肝治療性多價(jià)疫苗，該疫苗為乙肝病毒核心抗原(HBcAg)表位 肽、乙肝病毒表面抗原(HBsAg)表位肽、乙肝病毒e抗原(HBeAg)表位肽與LIGHT基因重組 表達(dá)載體的復(fù)合物；所述HBcAg表位肽由表位HBcAg87-95、穿膜序列HIV-Tat49_57、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)滯留信號(hào) 序列KDEL和接頭(linker)序列組成；所述HBsAg表位肽由表位HBsAgl72-180、穿膜序列HIV-Tat49_57、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)滯留信 號(hào)序列KDEL和接頭序列組成；所述HBeAg表位肽由表位HBeAgl47_155、穿膜序列HIV_Tat49_57、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)滯留信 號(hào)序列KDEL和接頭序列組成；在所述HBcAg表位肽、HBsAg表位肽和HBeAg表位肽中，穿膜序列均位于氨基端， 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)滯留信號(hào)序列均位于羧基端，表位與穿膜序列或內(nèi)質(zhì)網(wǎng)滯留信號(hào)序列之間均以接頭 序列連接。進(jìn)一步，所述接頭序列為AAY ；
4
進(jìn)一步，所述HBcAg表位肽、HBsAg表位肽和HBeAg表位肽的摩爾比為1 1 1;進(jìn)一步，所述LIGHT基因重組表達(dá)載體是在真核表達(dá)載體PCI-neo中插入LIGHT cDNA全長(zhǎng)序列而得到。2、所述免疫增強(qiáng)型乙肝治療性多價(jià)疫苗的制備方法，是在攪拌條件下，向溶解有 LIGHT基因重組表達(dá)載體的磷酸鹽緩沖液中滴加溶解有HBcAg表位肽、HBsAg表位肽和 HBeAg表位肽的水溶液，滴加完畢后繼續(xù)攪拌30分鐘，再靜置30分鐘，即得。進(jìn)一步，所述HBcAg表位肽、HBsAg表位肽和HBeAg表位肽的摩爾比為1 1 1。本發(fā)明的有益效果在于本發(fā)明疫苗可通過(guò)穿膜序列進(jìn)入細(xì)胞，再通過(guò)內(nèi)質(zhì) 網(wǎng)滯留信號(hào)序列靶向并滯留于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，有效促進(jìn)乙肝病毒蛋白抗原表位HBcAg87-95/ HBsAgl72-180/HBeAgl47-155進(jìn)入MHC-I類(lèi)抗原遞呈途徑激發(fā)特異性CTL應(yīng)答，同時(shí)LIGHT 發(fā)揮免疫佐劑作用，共刺激T細(xì)胞活化，從而產(chǎn)生廣泛的免疫激活效應(yīng)，誘導(dǎo)強(qiáng)有力的抗病 毒免疫。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)，本發(fā)明疫苗能夠激發(fā)CTL分泌干擾素-γ (IFN-γ)；能夠激 發(fā)CTL產(chǎn)生細(xì)胞毒效應(yīng)，殺傷HBV感染肝細(xì)胞，使HBV轉(zhuǎn)基因小鼠血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶 (ALT)活性明顯升高；還能夠抑制HBV的復(fù)制，顯著降低HBV轉(zhuǎn)基因小鼠血清HBV DNA載量。 本發(fā)明疫苗制備方法簡(jiǎn)單，成本低廉，在慢性HBV感染治療領(lǐng)域有著較好的開(kāi)發(fā)應(yīng)用前景。


為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和優(yōu)點(diǎn)更加清楚，下面將結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn) 一步的詳細(xì)描述，其中圖1為HBcAg表位肽、HBsAg表位肽和HBeAg表位肽的一級(jí)結(jié)構(gòu)示意圖；圖2為L(zhǎng)IGHT基因的瓊脂糖凝膠電泳鑒定圖；圖3為本發(fā)明疫苗的透射電鏡圖；圖4為酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)(ELISP0T)法檢測(cè)本發(fā)明疫苗激發(fā)CTL分泌IFN- γ的能力；圖5為給予本發(fā)明疫苗后HBV轉(zhuǎn)基因小鼠血清ALT活性檢測(cè)結(jié)果；圖6為給予本發(fā)明疫苗后HBV轉(zhuǎn)基因小鼠血清HBV DNA抑制率檢測(cè)結(jié)果。
具體實(shí)施例方式以下將參照附圖，對(duì)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例進(jìn)行詳細(xì)的描述。優(yōu)選實(shí)施例中未注明 具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，例如分子克隆實(shí)驗(yàn)指南(第三版，J.薩姆布魯克 等著，黃培堂等譯，科學(xué)出版社，2002年)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。一、免疫增強(qiáng)型乙肝治療性多價(jià)疫苗的制備 1、HBcAg表位肽、HBsAg表位肽和HBeAg表位肽的設(shè)計(jì)與合成
本發(fā)明設(shè)計(jì)的HBcAg表位肽、HBsAg表位肽和HBeAg表位肽的一級(jí)結(jié)構(gòu)如圖1所 示，各表位與穿膜序列或內(nèi)質(zhì)網(wǎng)滯留信號(hào)序列之間以接頭序列連接，以便于各表位保持獨(dú) 立性和能夠有效遞呈。在本實(shí)施例中，接頭序列為丙氨酸_丙氨酸_酪氨酸(Ala-Ala-Tyr， AAY) ；HBcAg表位肽的氨基酸序列如SEQ ID No. 1所示，HBsAg表位肽的氨基酸序列如SEQ ID No. 2所示，HBeAg表位肽的氨基酸序列如SEQ ID No. 3所示；同時(shí)，以卵清蛋白(OVA)表 位肽作為對(duì)照肽(由表位0VA257-264、穿膜序列HIV-Tat49_57、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)滯留信號(hào)序列KDEL 和接頭序列組成，其氨基酸序列如SEQ ID No. 4所示。
多肽的合成在ABI 431A型固相多肽合成儀(美國(guó)PE公司)上進(jìn)行。方法采用標(biāo) 準(zhǔn)芴甲氧羰基(Fmoc)方案，精氨酸采用兩次偶聯(lián)。起始選用0. 125mmol對(duì)羥甲基苯氧甲基 聚苯乙烯樹(shù)脂(HMP樹(shù)脂)，按照多肽序列使肽鏈從羧基端逐個(gè)向氨基端延伸，每種氨基酸 的用量為0.5mmol，與樹(shù)脂的摩爾比為4 1。各種氨基酸的α -氨基為Fmoc保護(hù)，其余 側(cè)鏈保護(hù)基團(tuán)分別為L(zhǎng)ys(Boc)、Ser (tBu)、Glu(OtBu)、Arg(Pmc)、His(Trt)、Thr (tBu)和 Tyr (tBu)。第一個(gè)氨基酸連接到樹(shù)脂上用4-二甲氨基吡啶(DMAP)，氨基酸的活化用1-羥 基苯并三唑(HOBt)和二環(huán)己基碳二亞胺(DCC)，偶聯(lián)后用體積分?jǐn)?shù)為20%的哌啶水溶液去 除Fmoc保護(hù)基。多肽合成后，將樹(shù)脂-粗肽產(chǎn)品在冰浴條件下混合于IOmL切割液A(由結(jié) 晶苯酚0. 75g、l，2-乙二硫醇即EDT 0. 25mL、苯甲硫醚0. 5mL、去離子水0. 25mL和三氟乙酸 即TFA IOmL組成)中，待切割液溫度上升至室溫后，攪拌反應(yīng)2小時(shí)，使肽鏈從樹(shù)脂上裂解 下來(lái)，同時(shí)去除多種保護(hù)基團(tuán)。將反應(yīng)混合液經(jīng)G4玻砂漏斗過(guò)濾以去除樹(shù)脂，先后用ImL TFA,5 IOmL 二氯甲烷反復(fù)沖洗反應(yīng)瓶、樹(shù)脂和漏斗。將濾液在常溫低壓下蒸發(fā)至1 2mL，加入50mL預(yù)冷乙醚沉淀多肽，4°C放置過(guò)夜，G6玻砂漏斗過(guò)濾，真空抽干，即得多肽粗 品，-20°C保存?zhèn)溆?。將多肽粗品用二甲基亞?DMSO)溶解制成濃度為20mg/mL的溶液，經(jīng)孔徑為 0. 45 μ m的微孔濾膜過(guò)濾后，在AKTA explorer 100型中壓液相色譜儀(瑞典Amerssham Bioscienc公司)上用SOURCE凝膠柱進(jìn)行純化。流動(dòng)相A由體積百分含量為10%的乙醇和 體積百分含量為0. 的TFA組成，流動(dòng)相B由體積百分含量為90%的乙醇和體積百分含 量為0. 1 %的TFA組成；洗脫梯度為先用流動(dòng)相A 1. 5個(gè)柱體積洗脫，再用流動(dòng)相A和流 動(dòng)相B的混合液(流動(dòng)相B占混合液的體積分?jǐn)?shù)在8個(gè)柱體積內(nèi)由0%逐漸增加至80% ) 洗脫，再用流動(dòng)相A和流動(dòng)相B的混合液(流動(dòng)相B占混合液的體積分?jǐn)?shù)在0. 5個(gè)柱體積內(nèi) 由80%逐漸增加至100% )洗脫，在主峰處收集多肽溶液，冷凍干燥，即得多肽純品，用DMSO 溶解，-20°C保存?zhèn)溆?。將多肽純品用Delta 600型高壓液相色譜儀(美國(guó)Waters公司)鑒定純度，采用 Symmetry Shield C18柱，流動(dòng)相由體積百分含量為10% 60%的乙腈和體積百分含量 為0. 1 %的TFA組成，梯度洗脫，流速為lmL/min。結(jié)果顯示，合成多肽的純度均達(dá)到90%以 上。同時(shí)，將多肽純品用API 2000LC/MS型電噴霧離子化質(zhì)譜儀測(cè)定分子量。結(jié)果顯示，合 成多肽的分子量均與理論值相符。2、LIGHT基因重組表達(dá)載體的構(gòu)建收集人外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)，用重組白介素4 (rIL-4)和重組粒細(xì)胞-巨噬細(xì) 胞集落刺激因子(rGM-CSF)誘導(dǎo)分化成未成熟樹(shù)突狀細(xì)胞(DC)，用RNA抽提試劑盒抽提未 成熟DC細(xì)胞總RNA，紫外分光光度法測(cè)定濃度和純度后，-70°C保存?zhèn)溆?。根?jù)GenBank登錄號(hào)為NM_003807的LIGHT基因的完整開(kāi)放閱讀框0RF，設(shè)計(jì)如 下 PCR 引物上游引物5' -cttgggcatggaggagagtgtcgta-3‘ (SEQ ID No. 6)，下游引物 5' -tcacaccatgaaagccccgaagtaag-3‘ (SEQ ID No. 7)，上下游引物兩端未加限制性酶切 位點(diǎn)。PCR引物由寶生物工程(大連)有限公司合成。將未成熟DC細(xì)胞總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，再以該cDNA為模板，采用上述上下游引 物PCR擴(kuò)增LIGHT cDNA全長(zhǎng)，PCR體系總體積為100 μ L，PCR循環(huán)條件參數(shù)為94°C預(yù)變性 2分鐘；再94°C變性30秒、60°C退火30秒、72°C延伸1分鐘，共30個(gè)循環(huán)；最后72°C延伸
610分鐘。將PCR產(chǎn)物經(jīng)質(zhì)量分?jǐn)?shù)為的瓊脂糖凝膠電泳鑒定(結(jié)果如圖2所示，M泳道 為DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)，1泳道為PCR產(chǎn)物，可見(jiàn)PCR產(chǎn)物在分子量約720bp處有唯一條帶，與預(yù) 期分子量相符)后，切膠回收純化，再與T載體pGEM-T Easy在T4DNA連接酶作用下于16°C 連接過(guò)夜，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5 α感受態(tài)細(xì)菌，用含有氨芐青霉素的LB平板篩選陽(yáng)性克隆，挑 取陽(yáng)性克隆單菌落，用含有氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基過(guò)夜培養(yǎng)后提取質(zhì)粒，用限制性內(nèi)切酶 EcoR I和Pst I進(jìn)行雙酶切鑒定，并委托上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司進(jìn)行測(cè)序驗(yàn) 證，正確插入了 LIGHT cDNA全長(zhǎng)序列(SEQ ID No. 5)的陽(yáng)性克隆質(zhì)粒命名為L(zhǎng)IGHT-pGEM_T Easy。用EcoR I從LIGHT-pGEM-T Easy中酶切出LIGHT cDNA全長(zhǎng)，經(jīng)質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1 %的 瓊脂糖凝膠電泳鑒定后，切膠回收純化，紫外分光光度法測(cè)定濃度；同時(shí)，用EcoR I使真核 表達(dá)載體PCI-neo線性化，經(jīng)質(zhì)量分?jǐn)?shù)為的瓊脂糖凝膠電泳鑒定后，切膠回收純化，紫 外分光光度法測(cè)定濃度；再將LIGHT cDNA全長(zhǎng)與線性化載體pCI-neo在T4 DNA連接酶作 用下于16°C連接過(guò)夜，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5ci感受態(tài)細(xì)菌，用含有氨芐青霉素的LB平板篩選 陽(yáng)性克隆，挑取陽(yáng)性克隆單菌落，用含有氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基過(guò)夜培養(yǎng)后提取質(zhì)粒，用 EcoR I和Kpn I進(jìn)行雙酶切鑒定，所得陽(yáng)性克隆質(zhì)粒命名為L(zhǎng)IGHT-pCI-neo。3、HBcAg表位肽、HBsAg表位肽、HBeAg表位肽與LIGHT基因重組表達(dá)載體的復(fù)合 物的制備將LIGHT-pCI-neo用濃度為0. lmol/L、pH為7. 4的磷酸鹽緩沖液(PBS)溶解制 成濃度為500 μ g/mL的溶液，取該溶液100 μ L，在混旋狀態(tài)下以5 μ L/min的速度滴加總濃 度為1000 μ g/mL的多肽溶液(由摩爾比為1 1 1的HBcAg表位肽、HBsAg表位肽和 HBeAg表位肽組成)100 μ L，滴加完畢后繼續(xù)混旋30分鐘，再靜置30分鐘，即得HBcAg表位 肽、HBsAg表位肽、HBeAg表位肽與LIGHT基因重組表達(dá)載體的復(fù)合物，也即本發(fā)明所述免疫 增強(qiáng)型乙肝治療性多價(jià)疫苗。透射電鏡分析將新制復(fù)合物滴于200目銅網(wǎng)上，吸附3分鐘，用吸水紙吸干，晾 干30秒，以質(zhì)量體積百分濃度為的醋酸鈾水溶液負(fù)染30秒，用吸水紙吸干，晾干30秒， SOkV透射電鏡觀察。結(jié)果如圖3所示，所得復(fù)合物呈大小均一的近圓形顆粒，絕大多數(shù)顆粒 長(zhǎng)徑小于25nm。二、免疫增強(qiáng)型乙肝治療性多價(jià)疫苗的抗病毒活性研究效應(yīng)細(xì)胞的制備將30只6 8周齡雌性HBV轉(zhuǎn)基因Babl/c小鼠隨機(jī)分為3組 實(shí)驗(yàn)組、對(duì)照組和空白組，每組10只；實(shí)驗(yàn)組以濃度為0. 5mg/mL的本發(fā)明疫苗為免疫原， 對(duì)照組以濃度為0. 5mg/mL的OVA表位肽與LIGHT-pCI-neo的復(fù)合物為免疫原，空白組以濃 度為0. lmol/L、pH為7. 4的PBS為免疫原；各組于小鼠背側(cè)尾根部皮下注射免疫原，每只 100μ L，之后每間隔1周，以同樣方法加強(qiáng)免疫1次，共免疫3次。1、ELISP0T法檢測(cè)本發(fā)明疫苗激發(fā)CTL分泌IFN- γ的能力末次免疫后1周，斷頸處死小鼠，在無(wú)菌條件下取脾臟，用100目篩網(wǎng)碾磨，收集細(xì) 胞懸液，用聚蔗糖-泛影葡胺分層液密度梯度離心法分離脾淋巴細(xì)胞，用含有體積百分濃 度為10%的胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基調(diào)節(jié)細(xì)胞密度為1 X IO6個(gè)/mL，即得效應(yīng)細(xì)胞懸 液；采用ELISP0T檢測(cè)試劑盒進(jìn)行檢測(cè)，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)操作在96孔培養(yǎng)板中，每孔加 入體積百分濃度為70%的乙醇溶液100 μ L，室溫放置10分鐘，PBS洗滌，再加入IFN-γ捕獲抗體(稀釋度為1 100) 100 μ L，溫度4°C孵育過(guò)夜，PBS洗滌，再加入質(zhì)量百分濃度為 2%的脫脂奶粉溶液100 μ L，室溫封閉2小時(shí)，PBS洗滌，再加入效應(yīng)細(xì)胞懸液100 μ L，溫度 37°C孵育48小時(shí)，PBST (即含有質(zhì)量百分濃度為0. 的吐溫20的PBS)洗滌，再加入生物 素標(biāo)記的抗IFN- γ抗體(稀釋度為1 100) 100 μ L，溫度37°C孵育1. 5小時(shí)，PBST洗滌， 再加入鏈霉親和素標(biāo)記的堿性磷酸酶(稀釋度為1 5000) 10(^1^，溫度371孵育1小時(shí)， PBST洗滌，拍干培養(yǎng)板，再加入即用型BCIP/NBT底物反應(yīng)液100 μ L，室溫避光顯色2 10 分鐘至斑點(diǎn)形成，用蒸餾水終止反應(yīng)，干燥后檢測(cè)斑點(diǎn)數(shù)；同時(shí)設(shè)置陰性對(duì)照組(不加入效 應(yīng)細(xì)胞懸液)，各組斑點(diǎn)數(shù)以3個(gè)復(fù)孔的均值表示。結(jié)果如圖4所示，實(shí)驗(yàn)組的斑點(diǎn)數(shù)明顯高于對(duì)照組、空白組，表明本發(fā)明的疫苗復(fù) 合物具有良好的免疫原性，能夠有效激發(fā)CTL分泌IFN- γ。2、HBV轉(zhuǎn)基因小鼠血清ALT活性檢測(cè)末次免疫后1周，斷頸處死小鼠，取眼眶靜脈血，用全自動(dòng)生化儀檢測(cè)血清ALT活 性。結(jié)果如圖5所示，實(shí)驗(yàn)組的血清ALT活性明顯高于對(duì)照組和空白組，表明本發(fā)明疫 苗能夠有效激發(fā)CTL產(chǎn)生細(xì)胞毒效應(yīng)，殺傷HBV感染肝細(xì)胞，從而導(dǎo)致血清ALT活性明顯升聞。3、HBV轉(zhuǎn)基因小鼠血清HBV DNA抑制率檢測(cè)末次免疫后1周，斷頸處死小鼠，取眼眶靜脈血，用全自動(dòng)生化儀檢測(cè)血清HBV DNA抑制率。結(jié)果如圖6所示，實(shí)驗(yàn)組的血清HBV DNA抑制率明顯高于對(duì)照組和空白組，表明本 發(fā)明疫苗能夠有效抑制HBV的復(fù)制，顯著降低血清HBV DNA載量。最后說(shuō)明的是，以上實(shí)施例僅用以說(shuō)明本發(fā)明的技術(shù)方案而非限制，盡管通過(guò)參 照本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例已經(jīng)對(duì)本發(fā)明進(jìn)行了描述，但本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，可 以在形式上和細(xì)節(jié)上對(duì)其作出各種各樣的改變，而不偏離所附權(quán)利要求書(shū)所限定的本發(fā)明 的精神和范圍。
8
權(quán)利要求
免疫增強(qiáng)型乙肝治療性多價(jià)疫苗，其特征在于該疫苗為乙肝病毒核心抗原表位肽、乙肝病毒表面抗原表位肽、乙肝病毒e抗原表位肽與LIGHT基因重組表達(dá)載體的復(fù)合物；所述乙肝病毒核心抗原表位肽由乙肝病毒核心抗原表位HBcAg87 95、穿膜序列HIV Tat49 57、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)滯留信號(hào)序列KDEL和接頭序列組成；所述乙肝病毒表面抗原表位肽由乙肝病毒表面抗原表位HBsAg172 180、穿膜序列HIV Tat49 57、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)滯留信號(hào)序列KDEL和接頭序列組成；所述乙肝病毒e抗原表位肽由乙肝病毒e抗原表位HBeAg147 155、穿膜序列HIV Tat49 57、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)滯留信號(hào)序列KDEL和接頭序列組成；在所述乙肝病毒核心抗原表位肽、乙肝病毒表面抗原表位肽和乙肝病毒e抗原表位肽中，穿膜序列均位于氨基端，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)滯留信號(hào)序列均位于羧基端，表位與穿膜序列或內(nèi)質(zhì)網(wǎng)滯留信號(hào)序列之間均以接頭序列連接。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述免疫增強(qiáng)型乙肝治療性多價(jià)疫苗，其特征在于所述接頭序列 為 AAY。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述免疫增強(qiáng)型乙肝治療性多價(jià)疫苗，其特征在于所述乙肝 病毒核心抗原表位肽、乙肝病毒表面抗原表位肽和乙肝病毒e抗原表位肽的摩爾比為 1:1:1。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述免疫增強(qiáng)型乙肝治療性多價(jià)疫苗，其特征在于所述LIGHT基 因重組表達(dá)載體是在真核表達(dá)載體PCI-neo中插入LIGHT cDNA全長(zhǎng)序列而得到。
5.權(quán)利要求1所述免疫增強(qiáng)型乙肝治療性多價(jià)疫苗的制備方法，其特征在于在攪拌 條件下，向溶解有LIGHT基因重組表達(dá)載體的磷酸鹽緩沖液中滴加溶解有乙肝病毒核心抗 原表位肽、乙肝病毒表面抗原表位肽和乙肝病毒e抗原表位肽的水溶液，滴加完畢后繼續(xù) 攪拌30分鐘，再靜置30分鐘，即得。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述免疫增強(qiáng)型乙肝治療性多價(jià)疫苗的制備方法，其特征在于所 述乙肝病毒核心抗原表位肽、乙肝病毒表面抗原表位肽和乙肝病毒e抗原表位肽的摩爾比 為 1 1 1。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了免疫增強(qiáng)型乙肝治療性多價(jià)疫苗及其制備方法，該疫苗為HBcAg表位肽、HBsAg表位肽、HBeAg表位肽與LIGHT基因重組表達(dá)載體的復(fù)合物；HBcAg表位肽/HBsAg表位肽/HBeAg表位肽分別由表位HBcAg87-95/HBsAg172-180/HBeAg147-155與穿膜序列HIV-Tat49-57、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)滯留信號(hào)序列KDEL和接頭序列組成，穿膜序列位于氨基端，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)滯留信號(hào)序列位于羧基端，表位與穿膜序列或內(nèi)質(zhì)網(wǎng)滯留信號(hào)序列之間以接頭序列連接；該疫苗可成功進(jìn)入細(xì)胞并靶向內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，有效促進(jìn)乙肝病毒蛋白抗原表位進(jìn)入MHC-I類(lèi)抗原遞呈途徑激發(fā)特異性CTL應(yīng)答。
文檔編號(hào)A61K39/295GK101920021SQ20101013074
公開(kāi)日2010年12月22日 申請(qǐng)日期2010年3月23日 優(yōu)先權(quán)日2010年3月23日
發(fā)明者吳玉章, 楊曌 申請(qǐng)人:中國(guó)人民解放軍第三軍醫(yī)大學(xué)