專利名稱：一種瓊脂糖加強三維納米多孔細菌纖維素支架及其應(yīng)用的制作方法
一種瓊脂糖加強三維納米多孔細菌纖維素支架及其應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種細菌纖維素支架，具體地說，是關(guān)于一種瓊脂糖加強三維納米多孔細菌纖維素支架及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
支架在組織工程，組織缺損修復(fù)中扮演重要角色，不但支持細胞在其內(nèi)生長，引導新的組織形成，并且要能夠降解為無毒物質(zhì)。但是，在這一領(lǐng)域我們還沒有發(fā)現(xiàn)理想的支架材料。近來，仿生材料吸引了眾多科學家從仿生學角度出發(fā)進行生物材料研制。主要是合成組分、結(jié)構(gòu)、功能特點與人體組織環(huán)境相似的材料。對于結(jié)構(gòu)仿生，已有幾種新的加工方法被應(yīng)用以達到在不程度上仿造細胞外基質(zhì)，如靜電紡絲，自組裝技術(shù)等。細菌纖維素 (Bacterial cellulose, BC)又稱為生物纖維素，是一種由納米纖維素纖維構(gòu)成的具有納米結(jié)構(gòu)的支架，具有很好的生物相容性。有研究表明BC具有應(yīng)用為軟骨組織工程、骨組織工程支架的可能，并可以促進傷口愈合。然而，天然BC不存在供細胞在其內(nèi)生長的大孔結(jié)構(gòu)。 我們命名這種纖維素為二維細菌纖維素OD BC)。我們采用仿生學方法將2D BC加工成三維細菌纖維素支架(3D BC)，然而該三維細菌纖維素支架的最大壓縮載荷和楊氏模量不是很理想。

發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是針對現(xiàn)有技術(shù)中的不足，提供一種瓊脂糖加強三維納米多孔細菌纖維素支架。本發(fā)明的再一的目的是，提供一種瓊脂糖加強三維納米多孔細菌纖維素支架的用途。為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案是一種瓊脂糖加強三維納米多孔細菌纖維素支架，由以下方法制備得到將細菌纖維素水凝膠置入水中，然后加入0. 5% -3% (g/ml)瓊脂糖，攪拌至細菌纖維素得到碎片狀細菌纖維素，制成細菌纖維素混懸液，再將上述懸濁液加熱至瓊脂糖完全溶解，然后將上述懸濁液加入模具中加工得到三維納米多孔細菌纖維素支架。所述的細菌纖維素水凝膠置入水中，所述的細菌纖維素水凝膠與水的比例為 1 l(g/rnl)。所述的瓊脂糖加入量為1 % (g/ml)。為實現(xiàn)上述第二個目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案是瓊脂糖加強三維納米多孔細菌纖維素支架作為軟骨組織工程支架在組織修復(fù)和組織工程中的應(yīng)用。本發(fā)明優(yōu)點在于1、瓊脂糖加強三維納米多孔細菌纖維素支架可支持C5. 18細胞和成人骨髓基質(zhì)細胞黏附、增殖、并形成組織。
2、瓊脂糖加強三維納米多孔細菌纖維素支架的最大壓縮載荷和楊氏模量是三維納米多孔細菌纖維素支架的最大壓縮載荷和楊氏模量3倍。3、瓊脂糖加強三維納米多孔細菌纖維素支架中的瓊脂糖有利于成軟骨細胞生長和保持其表型。并且，隨著瓊脂糖在長期培養(yǎng)過程中逐漸降解，支架孔壁納米纖維逐漸暴露，細胞可與納米纖維發(fā)生相互作用。而且，C5. 18和hBMSCs可以在3D A/BC支架內(nèi)生存。 瓊脂糖加強三維納米多孔細菌纖維素支架是一種具有吸引力的軟骨組織工程支架。

附圖1是具有大孔的3D BC支架和3D A/BC支架。附圖2為3D BC支架和3D A/BC支架的孔隙分布曲線。附圖3顯示3D BC支架和3D A/BC支架最大壓縮強度和楊氏模量。附圖4顯示3D BC支架和3D A/BC支架內(nèi)的hBMSCs和C5. 18細胞培養(yǎng)活性圖。附圖5顯示三維支架內(nèi)的細胞貼附與形貌圖。附圖6顯示3D A/BC支架內(nèi)hBMSCs和C5. 18細胞的增殖圖。附圖7顯示的是3D A/BC支架接種細胞6周后的H&E染色結(jié)果。
具體實施方式下面結(jié)合附圖對本發(fā)明的具體實施方式
作詳細說明。實施例11.材料與方法1. 1.細菌纖維素和三維細菌纖維素支架的準備原始細菌纖維素由以下方法制備合成將木醋桿菌(G. xylinus)恒溫靜置培養(yǎng)于培養(yǎng)基中6天，生成的細菌纖維素膜浮于液面。膜取出后，用蒸餾水反復(fù)沖洗，除去表面培養(yǎng)基及雜質(zhì)后浸于0. IM NaOH溶液中，100°C煮沸20分鐘，去除液膜中的菌體和殘留培養(yǎng)基，再用蒸餾水反復(fù)沖洗，至PH約7. 2。細菌纖維素經(jīng)凍干后進表征。同時用水將BC打碎， 攪拌形成BC混懸液(BC與水比例為1 lg/ml)。BC混懸液再倒入所需要的模具中(本研究中使用M孔培養(yǎng)板中，以M空培養(yǎng)板為模具)冷凍干燥2天。1. 2. 3DA/BC 支架的加工BC膜(50g)放入瓊脂糖(Solarbio，Spain)水溶液，進行搗碎混合，形成含有瓊脂糖的混懸液(所述的瓊脂糖的混懸液中BC水凝膠50g，去離子水50g，瓊脂糖0. 5g)。 然后在M孔培養(yǎng)板中-30°C冷凍1天，再50°C冷凍干燥2天即可得到3D A/BC支架。1. 3.孔隙鑒定3D BC支架和3D A/BC支架的表面結(jié)構(gòu)經(jīng)掃描電鏡觀(JSM-6700F)觀察。孔隙分布采用壓汞儀法進行檢測(PoreMaster 60GT, QuantachromeInstruments) 這種壓汞儀可以檢測直徑在3. 6nm至950 μ m孔隙。1. 4.力學測試3D BC支架和3D A/BC支架干態(tài)力學性能采用萬能力學實驗機檢測(Instron 8874)，使用250N傳感器。樣品為直徑15mm，厚度7mm。壓縮速度為2mm/min。壓縮模量采自壓縮曲線線性區(qū)。楊氏模量和最大壓縮載荷由7-8個樣本計算得來。
1. 5. hBMSC的分離培養(yǎng)檢測所有骨髓采集實驗均經(jīng)上海交通大學醫(yī)學院倫理委員會批準。hBMSCs的分離擴增根據(jù)Pittenger和Fang等報道的方法進行。骨髓液取自無骨代謝性疾病自愿者股骨髓腔， 年齡22-45歲，在股骨骨折行髓內(nèi)釘植入手術(shù)時獲得。hBMSC擴增至第5代前使用。使用 DMEM高糖培養(yǎng)基(Sigma)，10%胎牛血清(FBS，Hyclone)，青霉素100U/ml，鏈霉素IOOmg/ 1 (Hyclone)。根據(jù)已有報道方法，流式細胞儀法檢測細胞表面標志。1. 6.立體培養(yǎng)收集hBMSCs和C5. 18細胞(由美國羅切斯特大學陳棣教授提供)分別經(jīng)含有10% 胎牛血清的DMEM重懸，分別達到2 X IO6個/ml和1 X IO7個/ml。直徑15mm、厚度7mm材料一分為二，每一半作為一個樣本。細胞懸液以500 μ 1每個樣本滴加至3D BC和3D A/BC兩種支架表面。為使細胞均勻分布于材料內(nèi)部使用槍頭滴加時反復(fù)輕壓材料，使得材料將細胞懸液吸入材料內(nèi)部。然后，支架細胞復(fù)合體在37°C、5% CO2條件下孵育4小時，使得細胞貼附于材料上。每小時向每個材料上滴加50 μ 1細胞培養(yǎng)基，防止支架干燥。4小時后每孔加入培養(yǎng)基6ml繼續(xù)培養(yǎng)。1. 7.細胞增殖檢測如上述方法將細胞接種于3D A/BC支架內(nèi)。采用alamarBlue細胞檢測試劑盒 (Invitrogen)根據(jù)廠家說明書進行測定。接種有細胞的支架移至新的M孔板中，每孔加入含有10% alamarBlue的培養(yǎng)基，在37°C，5% CO2條件下孵育4小時。每孔取100 μ 1液體移至96孔板中，使用酶標儀(BIO-TEKInstruments，Inc, Vermont, USA)進行檢測。激發(fā)光 530nm，發(fā)射光590nm，無細胞支架材料同法進行檢測作為空白對照組。含有alamarBlue的培養(yǎng)基吸取送檢后，接種細胞的支架移至新的6孔板內(nèi)，每孔加培養(yǎng)基6ml。1. 8.激光共聚焦檢測細胞在材料內(nèi)培養(yǎng)達4周，細胞活性采用活性染色法(calcein-AM，ethidium homodimer-1, Sigma)檢測。接種有細胞的3D BC支架和3D 4作(支架1乂？83洗2次，然后加入calcein-AM達終濃度1 μ g/ml和KhD-I達終濃度μ g/ml，孵育20分鐘。樣本經(jīng)1 XPBS 洗1次后，一小時內(nèi)采用激光共聚焦顯微鏡進行觀察、拍照(Leica TCS SP5，Germany)。1.9. SEM觀察支架內(nèi)細胞 培養(yǎng)達4周后，接種細胞的支架1 X PBS洗2次，2. 5 %戊二醛(pH7. 4)固定過夜，繼之0. IM 二甲基胂酸鹽緩沖液配制的四氧化鋨固定。然后，梯度酒精脫水(50%，70%， 80%，90%，95%，99%，100% )，液態(tài)C02臨界點干燥，樣本從中間切開后表面噴金，經(jīng)掃描電鏡(JSM-6700F)觀察。1. 10.組織學分析hBMSCs和C5. 18細胞培養(yǎng)于3D A/BC支架內(nèi)達6周，進行組織學分析。標本首先 4%多聚甲醛4°C固定M小時。然后，石蠟包埋，切成6 μ m厚切片行HE染色1. 11.統(tǒng)計學分析計算均數(shù)和標準差(生物力學實驗N = 7 ；細胞增殖實驗N = 6)，以均數(shù)士標準差(SD)表示。細胞增殖實驗采用單因素方差分析，Durmett t-tests法以0周為對照進行多組比較檢驗；生物力學實驗使用獨立樣本t檢驗(one-wayANOVA，SPSS 16. Osoftware)。 差異顯著性以*P < 0. 05和< 0. 01表示。
2.結(jié)果2. 1.支架表征具有大孔的3D BC支架(圖1中的A)和3D A/BC支架(圖1中的B)可以根據(jù)模子的形狀做成不同的形狀，如圓柱體。圖1中可以看到，3D BC支架(圖1中的B，C，D)和 3D A/BC支架(圖1中的F，G，H)均有不規(guī)則的直徑大于100 μ m的大孔遍布支架內(nèi)，由大于100 μ m的大孔相連通，且具有顯著的納米特征。3D BC支架孔壁上可見納米纖維(直徑
<IOOnm)(圖1中的C，D)，3D A/BC支架(圖1中的G，H)孔壁上可見納米線狀溝壑(寬度
<IOOnm)。2.2.比表面積和孔隙率分析圖2為3D BC支架和3D A/BC支架的孔隙分布曲線。3D BC支架孔隙直徑主要在 100 μ m，最大可達1000 μ m(圖2中的A)，并可檢測到納米孔隙(直徑< lOOnm)，提示納米纖維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的存在。同樣，3D A/BC支架的孔隙直徑也主要分布在IOOym(圖2中的B)， 對比3D BC支架和3D A/BC支架的比表面積，3D BC支架的比表面積為95士2m2/g，3D A/ BC支架亦具有80 士 5m2/g的高比表面積。3D BC支架孔隙率為93 士 0. 3%，3D A/BC支架為 88. 5士0. 4%。2. 3. 3D BC支架和3D A/BC支架的力學性能。圖3顯示有最大壓縮強度和楊氏模量(mean士SD，η = 7)。3D A/BC支架與 3D BC支架相比具有較高的楊氏模量(P = 0.000)(圖3中的A)和最大壓縮載荷(P = 0.000)(圖3中的B)。3D A/BC支架最大壓縮強度為641 士 0. 813N)，楊氏模量為 (0. 039士0. 006MPa)，均約為3D BC支架相應(yīng)值的三倍(最大壓縮強度1. 244士0. 414N，楊氏模量0. 011 士 0. 004MPa)。2. 4. hBMSCs 的鑒定從3位自愿者獲得的hBMSCs表達相同的表面標志物。流式細胞分析>94% hBMSCs表達間質(zhì)細胞表面標志⑶44，⑶90 and⑶105，但是不表達造血細胞表面標志⑶34， ⑶45和紅祖細胞表面標志⑶71。結(jié)果表明獲得的hBMSCs為骨髓基質(zhì)細胞。2.5.細胞在三維支架的內(nèi)長期活性圖4顯示3D BC支架(圖4中的A，B，E，F(xiàn))和3D A/BC支架(圖4中的C，D，G， H)內(nèi)的hBMSCs和C5. 18細胞培養(yǎng)4周。圖片采用熒光共聚焦顯微鏡獲得于材料表面以下 > 100 μ m深處?？梢姶罅炕畹?綠色)hBMSCs (圖4中的A，B，C，D)和C5. 18 cells (圖4 中的E，F(xiàn)，G，H)在支架內(nèi)增殖，沿支架孔壁伸展。hBMSCs表現(xiàn)為長梭形，C5. 18為球型。支架內(nèi)活細胞之間可見少量死細胞(紅色)。另外，3D A/BC支架內(nèi)生長的hBMSCs (圖4中的 C，D)和C5. 18細胞(圖4中的A，B)較3DBC支架內(nèi)生長的hBMSCs (圖4中的E，F(xiàn))和C5. 18細胞更緊密。并且，3D A/BC支架內(nèi)孔隙較3D BC支架內(nèi)保持的更為規(guī)則。2.6.三維支架內(nèi)的細胞貼附與形貌圖5顯示C5. 18在3D A/BC支架內(nèi)為球型，hBMSCs為長梭形。細胞聚集于支架孔隙內(nèi)，黏附于孔壁上。高倍視野顯示C5. 18(圖5中的C，F(xiàn))和hBMSCs (圖4中的I)細胞是通過它們的偽足錨于納米細菌纖維構(gòu)成的孔壁上。另外，長時間培養(yǎng)過程中，隨著瓊脂糖的降解，3D A/BC支架孔壁的納米纖維逐漸顯露(圖4中的L)。
2. 7. 3D A/BC支架內(nèi)hBMSCs和C5. 18細胞的增殖圖6顯示的是hBMSCs (A)和C5. 18(B)細胞在3D A/BC支架內(nèi)0，1，2，3，4周的增殖情況。隨培養(yǎng)時間的延長細胞數(shù)量增加。2. 8.組織學圖7顯示的是3D A/BC支架接種細胞6周后的H&E染色結(jié)果。圖內(nèi)顯示支架近表面孔隙內(nèi)C5. 18 (圖7中的C，E)和hBMSCs (圖7中的D，F(xiàn))細胞過量生長，遠于支架表面孔隙還沒有完全被細胞占據(jù)，隨處可見三角形和球形C5. 18細胞(圖7中的E)和長梭形 hBMSCs (圖7中的F)細胞。另外支架近表面處已形成組織。本發(fā)明3D BC支架(95 士 2. 02m2/g)和3D A/BC支架(80 士 5m2/g)均具有較大的比表面積。大比表面積可能是由于納米纖維結(jié)構(gòu)存在的結(jié)果。并且大比表面積有利于細胞黏附，細胞生存與生長所需營養(yǎng)的快速分布，這對細胞生長十分關(guān)鍵。3D BC支架和3D A/BC 支架均顯示出高孔隙率，分別為93士0.3%和88. 5士0.4%。與普通BC相比較，3D BC支架和3D A/BC支架具有內(nèi)連大孔結(jié)構(gòu)，并且孔隙壁為納米纖維構(gòu)成(圖1，圖2)。圖2顯示3D BC支架和3D A/BC支架孔隙的主要直徑均在100 μ m左右，此特點對細胞遷移，組織長入十分重要。圖4中，我們可以看到活細胞生長于3D BC支架(圖4中的A，B，E，F(xiàn))和3D A/BC 支架(圖4中的C，D，G，H)內(nèi)。所以，我們相信3D BC支架和3DA/BC支架較BC更適合作為組織工程支架。但是，3D BC支架在接種細胞需要長期培養(yǎng)時強度較差。為研制納米軟骨支架，我們采用瓊脂糖對3D BC支架的強度進行加強。結(jié)果3D A/BC支架的最大壓縮載荷和楊氏模量提高達3D BC支架的3倍。另外，瓊脂糖有利于成軟骨細胞生長和保持其表型。 并且，隨著瓊脂糖在長期培養(yǎng)過程中逐漸降解，支架孔壁納米纖維逐漸暴露，細胞可與納米纖維發(fā)生相互作用(圖4中的L)。而且，C5. 18和hBMSCs可以在3D A/BC支架內(nèi)生存，并且培養(yǎng)6周可形成組織(圖7)。因此，我們的研究結(jié)果說明，3DA/BC支架更適合作軟骨支
^K O實施例2不同比例的瓊脂糖加強三維納米多孔細菌纖維素支架的平行試驗將BC置入0. 5%-3% (g/ml)瓊脂糖水溶液中，以1 1 (g/ml)為佳。同采用攪拌機攪拌至BC粉碎(參見表1)，依據(jù)需要調(diào)整攪拌速度和時間Q2000轉(zhuǎn)/分，3-5分鐘)，可以得到不同大小片狀BC。經(jīng)攪碎3-5min后可制成混懸液。再將懸濁液加熱至瓊脂糖完全溶解。然后將懸濁液加入所需要的不同形狀的模具(如M孔細胞培養(yǎng)板)中，放入-20°C 冰箱預(yù)凍2-Mh，在-50士 10°C下冷凍干燥48-72h，即可得到產(chǎn)品。表1樣品的制備設(shè)計
權(quán)利要求
1.一種瓊脂糖加強三維納米多孔細菌纖維素支架，其特征在于，所述的三維納米多孔細菌纖維素支架由以下方法制備得到將細菌纖維素水凝膠置入0. 5%-3% (g/ml)瓊脂糖水溶液中，攪拌至細菌纖維素粉碎得到片狀細菌纖維素，制成細菌纖維素混懸液，再將上述懸濁液加熱至瓊脂糖完全溶解，然后將上述懸濁液加入模具中加工得到三維納米多孔細菌纖維素支架。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的三維納米多孔細菌纖維素支架，其特征在于，所述的細菌纖維素水凝膠置入水中，所述的細菌纖維素水凝膠與水的比例為1 l(g/ml)。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的三維納米多孔細菌纖維素支架，其特征在于，所述的瓊脂糖加入量為1% (g/ml)。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3任一所述的三維納米多孔細菌纖維素支架作為軟骨組織工程支架在組織修復(fù)和組織工程中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種瓊脂糖加強三維納米多孔細菌纖維素支架，所述的三維納米多孔細菌纖維素支架由以下方法制備得到將細菌纖維素水凝膠置入0.5％-3％(g/ml)瓊脂糖溶液中，攪拌至細菌纖維素粉碎得到片狀細菌纖維素，制成細菌纖維素混懸液，再將上述懸濁液加熱至瓊脂糖完全溶解，然后將上述懸濁液加入模具中加工得到三維納米多孔細菌纖維素支架一種細菌纖維素支架。本發(fā)明還提供了瓊脂糖加強三維納米多孔細菌纖維素支架的用途。本發(fā)明支架中的瓊脂糖有利于成軟骨細胞生長和保持其表型。并且，隨著瓊脂糖在長期培養(yǎng)過程中逐漸降解，支架孔壁納米纖維逐漸暴露，細胞可與納米纖維發(fā)生相互作用，本發(fā)明支架是一種具有吸引力的軟骨組織工程支架。
文檔編號A61L27/56GK102210888SQ20101014180
公開日2011年10月12日 申請日期2010年4月8日 優(yōu)先權(quán)日2010年4月8日
發(fā)明者萬怡灶, 戴尅戎, 楊春喜, 高川 申請人:上海交通大學醫(yī)學院附屬第九人民醫(yī)院, 天津大學