專利名稱：：小鼠il-15亞型蛋白的制備及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種小鼠單抗蛋白的制備，特別涉及一種小鼠IL-15亞型蛋白的制備及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：IL-15mRNA(interleukin15，IL-15)廣泛表達(dá)于各種組織中，包括胎盤、骨骼肌、腎臟、心臟、肺、腦、腸上皮，并同樣表達(dá)于髓系的造血干細(xì)胞中比如巨噬細(xì)胞、樹(shù)突狀細(xì)胞。IL-15在結(jié)構(gòu)上與白細(xì)胞介素2(interleukin2，IL-2)有同源性，IL-15受體由具有高親和力的IL-15受體a鏈、IL-2/15受體β鏈以及公共鏈Y鏈組成，因此IL-15具有一些和IL-2相近的功能，比如刺激T細(xì)胞活化和增殖，增強(qiáng)NK細(xì)胞殺傷活性并促進(jìn)B細(xì)胞產(chǎn)生免疫球蛋白。最近研究發(fā)現(xiàn)IL-15在NK細(xì)胞、NKT細(xì)胞以及腸上皮細(xì)胞的分化、增殖、活化過(guò)程中發(fā)揮了重要作用，IL-15與IL-17對(duì)⑶8記憶性T細(xì)胞的穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)非常重要。研究還證明IL-15通過(guò)一種特殊的“反遞呈”機(jī)制來(lái)調(diào)控⑶8記憶性T細(xì)胞的增殖和NK細(xì)胞的生存周期，即一種表達(dá)IL_15a鏈?zhǔn)荏w的細(xì)胞能夠?qū)L-15遞呈給表達(dá)IL-15i3鏈和、鏈的細(xì)胞。更多的研究表明IL-15是一種有廣泛生物學(xué)功能的功能強(qiáng)大的細(xì)胞因子，除了對(duì)免疫系統(tǒng)有著重要的調(diào)節(jié)作用，在非免疫系統(tǒng)中也同樣重要，比如對(duì)骨骼肌合成代謝也發(fā)揮重要調(diào)節(jié)作用。由于IL-15具有強(qiáng)大的免疫調(diào)節(jié)功能，并對(duì)多種器官具有潛在的調(diào)節(jié)作用，因此其在體內(nèi)的表達(dá)在多個(gè)水平受到嚴(yán)格控制。人和小鼠的IL-15基因5'調(diào)控區(qū)均包含干擾素反應(yīng)因子元件(IRF-E)及NF-κB結(jié)合位點(diǎn)用于上調(diào)IL-15mRNA的表達(dá)。IL-15基因的調(diào)控主要發(fā)生在轉(zhuǎn)錄后水平，IL-15mRNA的5'UTR區(qū)域存在的多個(gè)起始密碼子(小鼠為5個(gè)AUGs，人類為12個(gè)AUGs)阻礙了IL-15蛋白的有效翻譯，IL-15mRNA的3'UTR區(qū)域的調(diào)控序列同樣能阻止IL-15蛋白的分泌。選擇性剪切也同樣參與了對(duì)IL-15基因表達(dá)的調(diào)控。早期研究發(fā)現(xiàn)的三種IL-15亞型編碼相同的成熟蛋白，但是其信號(hào)肽之間存在區(qū)別由48aa組成的長(zhǎng)信號(hào)肽(LSP)從3號(hào)外顯子中編碼區(qū)內(nèi)的真正的起始密碼子開(kāi)始表達(dá)，而短信號(hào)肽(SSP，小鼠為26aa，人類為21aa)則由一個(gè)新產(chǎn)生的5號(hào)外顯子中的起始密碼子開(kāi)始表達(dá)終止于非成熟的終止密碼子。這些不同的信號(hào)肽將IL-15蛋白運(yùn)輸至胞外不同的位置。短信號(hào)肽IL-15亞型，蛋白翻譯效率很高，但是很難分泌；而長(zhǎng)信號(hào)肽IL-15亞型，蛋白翻譯效率較低，但是能直接被運(yùn)輸至高爾基體并分泌。由于IL-15主要通過(guò)IL-15Ra的反式遞呈發(fā)揮功能，共調(diào)節(jié)IL-15及IL-15R有可能會(huì)促使IL-15產(chǎn)生多種功能活性。近期于小鼠小腸上皮細(xì)胞發(fā)現(xiàn)的兩種新的IL-15亞型，與正常的IL-15mRNA相比，分別缺少6號(hào)外顯子及7號(hào)外顯子的一部分，直接導(dǎo)致其編碼的成熟蛋白與正常IL-15蛋白有區(qū)別，研究證明其信號(hào)肽均為L(zhǎng)SP。這兩種編碼成熟蛋白改變的IL-15亞型提示IL15/IL-15-R體系比目前所已知的可能更為復(fù)雜。關(guān)于小鼠IL-15亞型蛋白的制備及應(yīng)用，經(jīng)查新國(guó)外僅有美國(guó)康涅狄格州健康中心XTan和LLefranc，ois在小腸上皮細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)并命名該亞型為AE6IL-15。小鼠小腸上皮細(xì)胞中該亞型是在免疫體系處于常態(tài)下發(fā)現(xiàn)的，而未見(jiàn)在免疫體系處于激發(fā)態(tài)下制備IL-15亞型蛋白的報(bào)道。本發(fā)明首次于小鼠脾細(xì)胞處于免疫激活狀態(tài)下發(fā)現(xiàn)該種亞型，提示該種亞型蛋白可能在免疫體系的負(fù)反饋調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要的作用。
發(fā)明內(nèi)容發(fā)明目的本發(fā)明目的為制備在免疫體系處于激發(fā)態(tài)下制備IL-15亞型蛋白，通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)檢測(cè)其對(duì)正常IL-15蛋白的拮抗作用，提供該亞型蛋白在自身免疫性疾病等臨床治療中的應(yīng)用。技術(shù)方案為達(dá)到上述目的，本發(fā)明具體技術(shù)方案是，制備有功能活性的小鼠IL-15亞型蛋白，其制備方法包括以下步驟(1)擴(kuò)增IL-15亞型基因片段取C57BL/6小鼠脾臟，制備脾細(xì)胞懸液，使用0.1μg/ml-100μg/mLPS作用24h_48h刺激小鼠脾細(xì)胞，獲得刺激后的C57BL/6小鼠脾細(xì)胞懸液，通過(guò)Trizol-氯仿法抽提總RNA。根據(jù)NCBI所公布小鼠IL_15cDNA序列(NM008357.1)及pET43.1原核表達(dá)載體的結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)特異性引物，見(jiàn)SeqNO.1和SeqNO.2，經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄-PCR常規(guī)操作擴(kuò)增獲得小鼠IL-15目的片段。(2)獲取IL-15亞型基因克隆取步驟1所得PCR產(chǎn)物，按照凝膠回收試劑盒說(shuō)明回收IL-15基因亞型片段。將回收所得PCR產(chǎn)物與PGEM-T克隆載體連接、4°C連接過(guò)夜。取連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至DHlOB的感受態(tài)細(xì)菌，挑菌并酶切鑒定獲得陽(yáng)性質(zhì)粒。取該質(zhì)粒進(jìn)一步測(cè)序鑒定其基因序列見(jiàn)SeqNO.3。(3)構(gòu)建重組IL-15的pET43.1原核表達(dá)載體取測(cè)序鑒定正確的步驟2所得質(zhì)粒及原核表達(dá)載體PET43.1，分別進(jìn)行雙酶切并按照凝膠回收試劑盒說(shuō)明書回收酶切所得片段。將回收所得酶切片段連接過(guò)夜，取連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)DHlOB菌，挑菌，按照質(zhì)粒小抽試劑盒說(shuō)明抽提質(zhì)粒酶切鑒定。(4)pET43.1_IL_15轉(zhuǎn)化菌的表達(dá)取鑒定正確的步驟3中重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞BL21(DE3)，挑取單菌落，抽提質(zhì)粒，酶切鑒定，篩選正確轉(zhuǎn)化的表達(dá)菌PET43.1-IL-15/BL21。本發(fā)明采用轉(zhuǎn)化菌自發(fā)表達(dá)方案進(jìn)行融合蛋白的表達(dá)。這種實(shí)驗(yàn)方案，只需轉(zhuǎn)化菌生長(zhǎng)密度培養(yǎng)至飽和，操作方便，且其表達(dá)量可達(dá)IPTG誘導(dǎo)的幾倍，Western-blot鑒定所得融合蛋白。(5)純化并獲得無(wú)標(biāo)簽的IL-15亞型蛋白非變性裂解液裂解步驟4所得融合蛋白，并進(jìn)行超聲裂解。取所得蛋白樣品經(jīng)蛋白純化工作站進(jìn)行純化。應(yīng)用超濾離心管去除純化所得蛋白中的咪唑，腸激酶切融合蛋白中用于提高表達(dá)蛋白可溶性的大片段的Nus-標(biāo)簽蛋白。利用超濾離心截留管離心酶切處理后的蛋白樣品，所得濾膜的下層液，即為酶切后的無(wú)標(biāo)簽蛋白的IL-15亞型蛋白，Western-blot鑒定所得該亞型蛋白，見(jiàn)SeqNO.4。本發(fā)明還涉及該IL-15亞型蛋白的功能檢測(cè)。其功能檢測(cè)包括以下步驟(DCTLL-2細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)檢測(cè)純化所得IL-15亞型蛋白的功能收集生長(zhǎng)良好的CTLL-2細(xì)胞，制備成細(xì)胞懸液。取制備好的IL-15及其亞型的純化蛋白，及rhIL_15蛋白標(biāo)準(zhǔn)品，進(jìn)行梯度稀釋，100μ1/孔加入96孔板中，每反應(yīng)孔也同樣加入100μ1的CTLL-2細(xì)胞，并設(shè)只加入100μ1CTLL-2細(xì)胞和100μ11640培養(yǎng)基的孔作為對(duì)照。37°C、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)18h，于檢測(cè)前6h加入3H(1μCi/孔)，收集細(xì)胞，β液閃計(jì)數(shù)器計(jì)數(shù)。(2)IL-15亞型蛋白在免疫激活狀態(tài)中的負(fù)調(diào)控功能取C57BL/6小鼠脾臟，制備脾細(xì)胞懸液加至96孔板中，加入倍比稀釋的LPS培養(yǎng)24h，另設(shè)兩組在此基礎(chǔ)上分別加入倍比稀釋的純化所得正常IL-15蛋白及IL-15亞型蛋白培養(yǎng)24h，各組稀釋度均設(shè)3個(gè)復(fù)孔，37°0、5%0)2培養(yǎng)箱培養(yǎng)1811，于檢測(cè)前611加入3!1(14以/孔)，收集細(xì)胞，β液閃計(jì)數(shù)器計(jì)數(shù)。一種小鼠IL-15亞型蛋白在制備自身免疫性疾病藥物的應(yīng)用。所述的自身免疫性疾病為類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、多發(fā)性硬化、強(qiáng)直性脊柱炎、炎癥性腸病、難治性乳糜泄、銀屑病、丙型病毒性肝炎和逆轉(zhuǎn)錄病毒HTLV-I相關(guān)疾病、阿狄森病、兒童哮喘、纖維肌痛、慢性疲勞綜合征、甲狀腺炎、血管炎、克隆病、腸炎以及雷諾氏病的任一種或多種。本研究同樣取臨床上進(jìn)行初診的類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者的外周血進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，經(jīng)紅細(xì)胞裂解處理后，取病人外周血直接進(jìn)行培養(yǎng)，并加入LPS刺激培養(yǎng)72h，同時(shí)取正常人外周血同樣經(jīng)過(guò)或未經(jīng)LPS刺激進(jìn)行培養(yǎng)作為對(duì)照。取所培養(yǎng)的外周血細(xì)胞抽提總RNA并進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄-PCR。結(jié)果顯示，正常人外周血經(jīng)LPS刺激72h后出現(xiàn)小片段的亞型條帶，而患者的外周血?jiǎng)t刺激不出小片段的亞型條帶。該實(shí)驗(yàn)?zāi)壳耙咽占?名患者外周血進(jìn)行研究，均能得到很好的重復(fù)，從而證明在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者中無(wú)法產(chǎn)生此種具有拮抗作用的IL-15亞型。流感病毒所引發(fā)的急性肺炎會(huì)導(dǎo)致流感患者尤其是處于兒童階段的流感患者極高的病死率。RisaNakamura等發(fā)現(xiàn)IL-15敲基因小鼠在感染流感病毒后其急性肺炎發(fā)病率顯著降低，而機(jī)體抵抗流感病毒的能力卻未受影響，這就預(yù)示著阻斷流感患者體內(nèi)IL-15的功能能夠在不影響患者對(duì)流感病毒的抵抗能力的情況下，顯著降低流感所致的急性肺炎的發(fā)病率及病死率。本發(fā)明已證明所發(fā)現(xiàn)的缺少六號(hào)外顯子的IL-15亞型蛋白對(duì)正常IL-15功能起到負(fù)調(diào)控作用，因此該種IL-15亞型蛋白在用于流感所致的急性肺炎治療上具有非常廣闊的應(yīng)用前景。有益效果1、IL-15是一種促炎癥細(xì)胞因子，可通過(guò)抑制IL-2誘導(dǎo)的AI⑶及促進(jìn)⑶8+記憶性T細(xì)胞生存而導(dǎo)致自身免疫性疾病。本發(fā)明于LPS刺激過(guò)的小鼠脾臟細(xì)胞發(fā)現(xiàn)缺失第6號(hào)外顯子的IL-15亞型。本發(fā)明所述拮抗正常IL-15基因功能的IL-15亞型蛋白為制備預(yù)防或治療IL-15基因高表達(dá)相關(guān)疾病的藥物或制劑提供了新的、較好的選擇。本發(fā)明在小鼠脾臟細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的缺失6號(hào)外顯子的IL-15亞型蛋白，與之前小鼠小腸上皮細(xì)胞發(fā)現(xiàn)的AE6IL-15亞型蛋白結(jié)構(gòu)相同。不同之處在于，本研究中小鼠脾臟細(xì)胞經(jīng)過(guò)LPS刺激培養(yǎng)即在免疫系統(tǒng)激活狀態(tài)下發(fā)現(xiàn)了該種亞型，而小鼠小腸上皮細(xì)胞中該亞型是在免疫體系處于常態(tài)下發(fā)現(xiàn)的。本研究證明，未經(jīng)LPS刺激的脾細(xì)胞檢測(cè)不到該種亞型，而在LPS刺激后的原代培養(yǎng)或細(xì)胞株來(lái)源的巨噬細(xì)胞及B細(xì)胞中均可檢測(cè)到該亞型，提示該亞型有可能在免疫系統(tǒng)激活的條件下發(fā)揮著重要的負(fù)反饋調(diào)控功能。一般而言，由mRNA選擇性剪切所形成的蛋白亞型被認(rèn)為是產(chǎn)生蛋白功能多樣性，組織特異性的一種進(jìn)化方式。更為特殊的是IL-15基因?qū)儆谒穆菪鞍准易澹摷易逯性S多細(xì)胞因子均可通過(guò)選擇性剪切產(chǎn)生相應(yīng)亞型，其中IL-2和IL-4通過(guò)選擇性剪切形成的亞型均對(duì)其自身功能發(fā)揮競(jìng)爭(zhēng)性抑制作用。IL-2和IL-4均通過(guò)長(zhǎng)的AB環(huán)與IL_2Ra結(jié)合，而其選擇性剪切產(chǎn)生的亞型由于缺失2號(hào)外顯子導(dǎo)致其編碼的AB環(huán)主要部分缺失，從而形成了天然的IL-2、IL-4的拮抗蛋白，研究表明IL-2、IL-4基因亞型能抑制T細(xì)胞的增殖。本研究的體外實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)也同樣顯示了缺失6號(hào)外顯子的IL-15蛋白亞型對(duì)正常IL-15蛋白的功能活性具有負(fù)向調(diào)控作用，并能抑制LPS產(chǎn)生的刺激細(xì)胞增殖的功能。然而研究證明IL-15并不依靠AB環(huán)與IL-15Ra相結(jié)合，因此該種IL-15亞型蛋白的負(fù)調(diào)控功能并非由此種機(jī)制實(shí)現(xiàn)。本研究通過(guò)軟件構(gòu)建該亞型蛋白結(jié)構(gòu)并進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，缺失了6號(hào)外顯子的IL-15亞型蛋白可能由于其無(wú)法形成功能活性的二聚體，而直接以單體形式與IL-15R競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合，從而產(chǎn)生了對(duì)正常IL-15蛋白的負(fù)調(diào)控功能。2、大量研究證明IL-15是一種促炎癥細(xì)胞因子，Alleva等研究發(fā)現(xiàn)IL-15位于促炎癥細(xì)胞因子鏈的頂部即始發(fā)者。IL-15表達(dá)引發(fā)促炎細(xì)胞因子TNFa、IL-UIL-6、MIPlα,MIPlβ和IL_8異常高水平表達(dá)。而且，IL-15可通過(guò)抑制IL-2誘導(dǎo)的AI⑶及促進(jìn)CD8+記憶性T細(xì)胞生存而導(dǎo)致自身免疫性疾病。事實(shí)上多種自身免疫性炎癥性疾病患者IL-15表達(dá)失調(diào)，諸如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、多發(fā)性硬化、炎癥性腸病、難治性乳糜泄、銀屑病、丙型病毒性肝炎和逆轉(zhuǎn)錄病毒HTLV-I相關(guān)疾病。目前已經(jīng)研制了多種抑制IL-15活性的藥物，包括可溶性IL-15Rci、突變的IL-15和針對(duì)IL-15或IL-2/15R0的特異性抗體。一種C末端Q101D、Q108DIL-15突變體/FcY2a融合蛋白具有拮抗體外IL-15激發(fā)的細(xì)胞增殖作用，這種突變型IL-15可明顯減輕小鼠發(fā)生抗原特異性遲發(fā)型超敏反應(yīng)并延長(zhǎng)胰島細(xì)胞移植物生存時(shí)間。應(yīng)用可溶性高親合力IL-15Ra可預(yù)防小鼠發(fā)生膠原誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎并抑制同種異基因移植物排斥。應(yīng)用抗IL-15的抗體可有效治療小鼠多種自身免疫性疾病。促炎細(xì)胞因子IL-15在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎發(fā)病中起重要作用，而且，I/II期臨床試驗(yàn)表明IL-15抗體HuMaX-IL15治療活動(dòng)性類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎約63%患者有效。針對(duì)IL-2/15Ri3的人源抗體Mikβ1單藥可延長(zhǎng)猴同種異基因心臟移植物存活時(shí)間。利用Miki31單克隆抗體治療12例T細(xì)胞大顆粒淋巴細(xì)胞白血病I期臨床試驗(yàn)結(jié)果顯示毒性作用很少，可封閉白血病細(xì)胞表面>95%的IL-2/15Ri3受體。然而，以上各種藥物其機(jī)理都是人為的干預(yù)及阻斷IL-15與其受體的結(jié)合及利用抗體阻斷劑特異性降低體內(nèi)IL-15及其受體的水平來(lái)減弱IL-15在體內(nèi)的作用。這些方式有可能帶來(lái)各種未知的風(fēng)險(xiǎn)由于IL-15與IL-2共用一部分受體，而在干預(yù)IL-15與受體結(jié)合的過(guò)程中有可能也會(huì)影響IL-2與其相應(yīng)受體結(jié)合，從而影響體內(nèi)免疫系統(tǒng)的穩(wěn)態(tài)；IL-15可激活T細(xì)胞和NK細(xì)胞并抑制AI⑶發(fā)生，促進(jìn)⑶8+記憶性T細(xì)胞增殖與生存因此在增強(qiáng)機(jī)體殺傷腫瘤的能力方面發(fā)揮著重要作用，IL-15抗體的使用則有可能會(huì)影響IL-15在體內(nèi)的免疫調(diào)控作用；人為的加入機(jī)體內(nèi)本不存在的組分，其毒副作用及應(yīng)用安全性都仍需進(jìn)一步的長(zhǎng)期驗(yàn)證及觀察。本發(fā)明中發(fā)現(xiàn)的該種IL-15亞型蛋白在機(jī)體免疫系統(tǒng)激活后高水平表達(dá)，而在免疫系統(tǒng)正常狀態(tài)下無(wú)法檢測(cè)到該蛋白的表達(dá)。提示在此免疫激活狀態(tài)下此亞型蛋白可能發(fā)揮了重要的調(diào)控功能，且體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示此亞型蛋白對(duì)正常IL-15蛋白功能起負(fù)調(diào)控作用，因此，這種缺失六號(hào)外顯子的IL-15亞型蛋白可能是正常IL-15蛋白天然的拮抗劑，能夠通過(guò)與IL-15受體競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合從而阻斷自身免疫性疾病中IL-15介導(dǎo)的炎性反應(yīng)。這種機(jī)體在免疫激活狀態(tài)下天然存在的負(fù)向調(diào)控蛋白有望在自身免疫疾病的治療中發(fā)揮更為有效且安全的作用。關(guān)于小鼠IL-15亞型蛋白的制備及應(yīng)用，經(jīng)查新未見(jiàn)國(guó)內(nèi)有相關(guān)報(bào)道，國(guó)外僅有美國(guó)康涅狄格州健康中心XTan和LLefranc，0is在小腸上皮細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)并命名該亞型為AE6IL-15。本發(fā)明首次在免疫系統(tǒng)激活狀態(tài)下發(fā)現(xiàn)了該亞型蛋白，并做了其功能的相關(guān)研究，從而為其在機(jī)體免疫調(diào)控中發(fā)揮的作用提供了更為直接的證據(jù)。本發(fā)明所述的一種小鼠IL-15亞型蛋白可以治療自身免疫疾病，特別是類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、多發(fā)性硬化、強(qiáng)直性脊柱炎、炎癥性腸病、難治性乳糜泄、銀屑病、丙型病毒性肝炎和逆轉(zhuǎn)錄病毒HTLV-I相關(guān)疾病、阿狄森病、兒童哮喘、纖維肌痛、慢性疲勞綜合征、甲狀腺炎、血管炎、克隆病、腸炎以及雷諾氏病的任一種或多種。通過(guò)臨床數(shù)據(jù)表明，本發(fā)明對(duì)如上疾病具有很好治療作用。注所述的LPS購(gòu)自Promega公司。本申請(qǐng)按照《分子克隆手冊(cè)》P96-99、P518、P611、P627-628頁(yè)所述方法，以及Axygen、Fermentas>Takara公司的試齊Ll手冊(cè)進(jìn)行試驗(yàn)。3、流感病毒所引發(fā)的急性肺炎會(huì)導(dǎo)致流感患者尤其是處于兒童階段的流感患者極高的病死率。RisaNakamura等發(fā)現(xiàn)IL-15敲基因小鼠在感染流感病毒后其急性肺炎發(fā)病率顯著降低，而機(jī)體抵抗流感病毒的能力卻未受影響，這就預(yù)示著阻斷流感患者體內(nèi)IL-15的功能能夠在不影響患者對(duì)流感病毒的抵抗能力的情況下，顯著降低流感所致的急性肺炎的發(fā)病率及病死率。本發(fā)明已證明所發(fā)現(xiàn)的缺少六號(hào)外顯子的IL-15亞型蛋白對(duì)正常IL-15功能起到負(fù)調(diào)控作用，因此該種IL-15亞型蛋白在用于流感所致的急性肺炎治療上具有非常廣闊的應(yīng)用前景圖1.實(shí)施例1中小鼠IL-15亞型基因的擴(kuò)增及克?。黄渲蠥中的U50bppladder；2、小鼠脾臟擴(kuò)增IL-15；3、LPS刺激小鼠脾臟擴(kuò)增IL-15；B中的l、100bppladder；2、IL-15擴(kuò)增產(chǎn)物克隆酶切；3、IL-15亞型克隆酶切；圖2.實(shí)施例1中重組小鼠IL-15亞型基因的表達(dá)載體的構(gòu)建及鑒定；其中1、Marker；2、重組小鼠IL-15亞型基因的pET43.1原核表達(dá)載體；圖3.實(shí)施例1中小鼠IL-15亞型蛋白的原核表達(dá)及可溶性鑒定；其中A中的1、空載pET43.1表達(dá)蛋白；2-3、IL-15亞型基因融合蛋白；4、蛋白質(zhì)Marker；B中的1、蛋白質(zhì)Marker；2、IL-15亞型基因表達(dá)具體超聲裂解上清；圖4.實(shí)施例一中小鼠IL-15亞型蛋白的純化及腸激酶切結(jié)果；其中A中的1、蛋白質(zhì)Marker；2-3、各洗脫峰所對(duì)應(yīng)蛋白樣品；B中的1、蛋白質(zhì)Marker；2_3、腸激酶酶切后IL-15亞型融合蛋白；圖5.實(shí)施例1中小鼠IL-15亞型蛋白的Westernblot鑒定結(jié)果；圖6.實(shí)施例1中小鼠IL-15亞型蛋白是細(xì)胞經(jīng)LPS刺激后選擇性剪切而產(chǎn)生；其中1、未經(jīng)任何處理的脾臟細(xì)胞IL-15的表達(dá)；2經(jīng)LPS刺激24h后脾臟細(xì)胞IL-15的表達(dá)；3-經(jīng)LPS刺激12h后加入放線菌酮繼續(xù)培養(yǎng)12h脾臟細(xì)胞IL-15的表達(dá)。圖7.實(shí)施例7中小鼠IL-15亞型蛋白的結(jié)構(gòu)模擬及功能預(yù)測(cè)；圖8.實(shí)施例7中小鼠IL-15亞型蛋白的負(fù)調(diào)控功能；圖9為實(shí)施例8初診的類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者的外周血進(jìn)行實(shí)驗(yàn)結(jié)果電泳圖其中1、4為DNAMarker2、為未經(jīng)LPS刺激培養(yǎng)的正常人外周血3、為經(jīng)LPS刺激培養(yǎng)的正常人外周血5、為未經(jīng)LPS刺激培養(yǎng)的患者外周血6、為經(jīng)LPS刺激培養(yǎng)的患者外周血圖10為實(shí)施例9小鼠IL-15及其亞型對(duì)不同用量的抗⑶3⑶28抗體激活的初診類風(fēng)濕病人外周血單個(gè)核淋巴細(xì)胞增殖活性的影響。具體實(shí)施例方式下面結(jié)合附圖及實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步描述實(shí)施例1，制備純化的有功能的無(wú)標(biāo)簽小鼠IL-15亞型蛋白1.細(xì)胞總RNA的提取取C57BL/6小鼠脾臟，制備脾細(xì)胞懸液，使用0.1μg/mlLPS作用48h刺激小鼠脾細(xì)胞，獲得刺激后的C57BL/6小鼠脾細(xì)胞懸液，加裂解液Trizol1ml，反復(fù)吹打混勻，將細(xì)胞溶于Trizol中，室溫孵育樣本5min裂解細(xì)胞；加入0.2ml氯仿，劇烈混勻15s，室溫孵育樣本3-5min，4°C，12000g離心15min；離心后轉(zhuǎn)移上層無(wú)色水相至EP管，加入0.5ml異丙醇，混勻，冰浴IOmin；4°C，12000g離心lOmin，小心移去上清液；加入lml75%乙醇，顛倒混勻，4°C，7500g離心5min，洗兩次；徹底棄上清，將RNA略干燥后溶解在20μ1無(wú)RNase水中，-80°C保存。2.RT-PCR擴(kuò)增小鼠IL-15亞型基因編碼區(qū)片段以4μ1步驟1提取的總RNA為模板，ΙμOligodT為下游引物，加入雙蒸水補(bǔ)足體系至12μ1，離心混勻，70°C5min，放置冰上冷卻；加5X逆轉(zhuǎn)錄buffer4μ1，RNaseInhibitor1μ1,IOmMdNTP2μ1離心混勻，37°C放置5min，加入MMLVlμ1，42°C60min,70°C10min，4°C保存所得cDNA。根據(jù)NCBI所公布小鼠IL_15cDNA序列(NM008357.1)及PET43.1原核表達(dá)載體的結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)上下游分別帶有SacI和XhoI內(nèi)切酶序列的引物序列(上海生工合成，見(jiàn)SeqNO.1和2或表1)。表1小鼠IL-15引物序列<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>以反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板，利用所設(shè)計(jì)引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系為IOXTaqbuffer5μ1,MgC124μ1,IOmMdNTP1μ1，10μM上下游引物各1μ1，模板cDNA5μ1，TaqDNA聚合酶1μ1，ddH20補(bǔ)充至總體積50μ1。擴(kuò)增條件為94°C預(yù)變性5min，94V變性60s，56°C退火60s，72°C延伸60s，擴(kuò)增34個(gè)循環(huán)，72°C延伸IOmin。2%瓊脂糖凝膠電泳鑒定所得PCR擴(kuò)增產(chǎn)物(圖1A)。3.小鼠IL-15基因克隆及鑒定取20μ1步驟2所得PCR產(chǎn)物，按照凝膠回收試劑盒說(shuō)明進(jìn)行回收。取回收所得PCR產(chǎn)物與PGEM-T克隆載體按以下體系進(jìn)行連接PCR產(chǎn)物5μ1，PGEM-T克隆載體1μ1，Τ4連接酶1μ1，IOX連接緩沖液1μ1，三蒸水2μ1，4°C連接過(guò)夜。將此連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至DHlOB的感受態(tài)細(xì)菌，通過(guò)藍(lán)白斑篩選，取白色陽(yáng)性菌落，搖菌過(guò)夜，按照質(zhì)粒小抽試劑盒說(shuō)明抽提質(zhì)粒。取所得質(zhì)粒按照以下體系進(jìn)行酶切鑒定質(zhì)粒5μ1，10Xbuffer2μ1,SacI內(nèi)切酶1μl，XhoI內(nèi)切酶1，雙蒸水Ily1，30°C水浴2h。取初步酶切鑒定結(jié)果為陽(yáng)性的相應(yīng)質(zhì)粒(圖1B)至上海生工測(cè)序以得到準(zhǔn)確的小鼠IL-15亞型基因克隆(見(jiàn)SeqNO.3)。4.構(gòu)建重組小鼠IL-15亞型基因的pET43.1原核表達(dá)載體取測(cè)序鑒定正確的PGEM-T-IL-15質(zhì)粒及原核表達(dá)載體pET43.1，進(jìn)行SacI、XhoI內(nèi)切酶雙酶切，酶切體系如下質(zhì)粒5μ1，10Xbuffer2μ1，SacI內(nèi)切酶1μ1，XhoI內(nèi)切酶1111，雙蒸水11111，371水浴211。按照凝膠回收試劑盒說(shuō)明書回收酶切所得片段。按以下體系連接:pET43.1載體3μl，PGEM-T-IL-155y1，T4連接酶1μ1，IOX連接緩沖液1μ1，4°C連接過(guò)夜。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)DHlOB菌，挑菌，按照質(zhì)粒小抽試劑盒說(shuō)明抽提質(zhì)粒酶切鑒定(圖2)，并將鑒定為陽(yáng)性的相應(yīng)質(zhì)粒至上海生工測(cè)序。5.pET43.1-IL-15亞型基因轉(zhuǎn)化菌的表達(dá)5.1重組質(zhì)粒pET-43.1-IL-15轉(zhuǎn)化表達(dá)菌BL21(DE3)取鑒定正確的重組質(zhì)粒pET-43.1-IL-15及空的ρΕΤ_43.1表達(dá)載體質(zhì)粒轉(zhuǎn)化制備好的感受態(tài)細(xì)胞BL21(DE3)，均勻涂板，置37°C過(guò)夜培養(yǎng)；挑取若干單菌落分別接種于含ΑΜΡ(75μg/ml)的LB液體培養(yǎng)基中37°C振蕩培養(yǎng)過(guò)夜，抽提質(zhì)粒，電泳鑒定，篩選正確轉(zhuǎn)化的表達(dá)菌pET-43.1-IL-15/BL21。轉(zhuǎn)化菌株于15%甘油的培養(yǎng)液中置_70°C保種備用。5.2轉(zhuǎn)化菌的自發(fā)表達(dá)本實(shí)驗(yàn)采用轉(zhuǎn)化菌自發(fā)表達(dá)方案。從以上BL-21轉(zhuǎn)化菌平板上挑取菌落，在含AMP(75μg/ml)MDG非表達(dá)培養(yǎng)基中37°C培養(yǎng)，過(guò)夜，至菌液密度達(dá)到飽和，吸取Iml菌液至IOOml的含々1^(75118/1111)2￥115052表達(dá)培養(yǎng)基中37°C培養(yǎng)過(guò)夜。這種實(shí)驗(yàn)方案，只需轉(zhuǎn)化菌生長(zhǎng)密度培養(yǎng)至飽和，操作方便，且其表達(dá)量可達(dá)IPTG誘導(dǎo)的幾倍。MDG非表達(dá)培養(yǎng)基(IOml)ZYM-5052表達(dá)培養(yǎng)基(IOml)9.15mlH2O9.58mlZY20μIlMMgSO420μIlMMgSO42μIlOOOXmetals2μIlOOOXmetals125μ140%glucose200μ150X5052500μ15%aspartate200μ150XM200μ150XM其中上述培養(yǎng)基的成分配比如下50XM以蒸餾水調(diào)節(jié)終體積為IOOmL17.75gNa2HPO417.OgKH2PO413.4gNH4Cl3.55gNa2SO41000Xmetals以蒸餾水調(diào)節(jié)終體積為IOOml36mlsterileH2O50ml0.IMFeCl3in0·12MHCl270.3050μMFe2mllMCaCl2110.9920μMCaImllMMnCl2-4H20197.9110μMMnImllMZnS04_7H20287.5610μMZnIml0.2ΜCoC12_6H20237.952μMCo2ml0.IMCuC12_2H20170.4862μMCuIml0.2MNiCl2_6H20237.722μMNi2ml0.IMNa2Mo04_5H20241.982μMMo2ml0.IMNa2Se03_5H20263.032μMSe2ml0.IMH3BO350X5052以蒸餾水調(diào)節(jié)終體積為100ml25gglycerol73mlH2O2.5gglucoseIOgα-lactoseZY以蒸餾水調(diào)節(jié)終體積為1000mlIOgtryptone5gyeastextractlliterofH2O5.3小鼠IL-15亞型融合蛋白的SDS-PAGE電泳鑒定收集Iml表達(dá)培養(yǎng)基中的菌體，12000g、30s離心，棄上清、PBS重懸菌體，12000g、30s離心，小心吸凈管壁上的液滴，盡可能使沉淀物不帶有殘留液體。加入2025倍于菌體沉淀體積的PBS，振蕩混勻，加入等體積的2X上樣緩沖液，繼續(xù)振蕩20秒；沸水浴中放置3-5min，12000g離心lOmin，將上清夜移至另一離心管中，吸取上清樣品10μ1進(jìn)行SDS聚丙烯酰胺電泳分析融合蛋白是否表達(dá)(圖3Α)，剩余樣品保存于-20°C備用。6.小鼠IL-15基因原核表達(dá)產(chǎn)物的NTA-Agarose親和層析法純化6.1小鼠IL-15基因原核表達(dá)產(chǎn)物可溶性的鑒定將100ml的以上所得的表達(dá)菌液4000rpm離心15min，棄上清，IOml裂解液重懸菌體，室溫放置15min。將重懸菌液置于超聲破碎儀中，以工作功率400W、工作時(shí)間10s、間歇時(shí)間4s工作50次，于冰上超聲裂解1小時(shí)。取超聲裂解后的菌液于12000rpm，4°C離心20min。吸取上清樣品10μ1進(jìn)行SDS聚丙烯酰胺電泳分析，并同時(shí)以未經(jīng)超聲裂解10μ1制備好的表達(dá)產(chǎn)物樣品作為對(duì)照(圖3Β)。6.2保持功能活性的小鼠IL-15基因原核表達(dá)產(chǎn)物的制備經(jīng)以上檢測(cè)證明該表達(dá)產(chǎn)物是可溶性的，因此在制備過(guò)程中，只需裂解液是非變性的，就有可能得到有功能活性的蛋白。按以下配方配制非變性裂解液50mMTris-HCl(PH8.0),500mMNaCl，5mMMgCl2,0.1%NP_40，2mM咪唑。將IOOml的以上所得的表達(dá)菌液4000rpm離心15min，棄上清，IOml非變性裂解液重懸菌體并同時(shí)加入PMSF防止蛋白降解。將重懸菌液置于超聲破碎儀中，于冰上超聲裂解1小時(shí)。取超聲裂解后的菌液于12000rpm，4°C離心20min。所得上清即為可溶的有活性的表達(dá)蛋白，置于4°C備用。6.3AKTA蛋白純化工作站純化蛋白1)平衡層析系統(tǒng)上樣緩沖液清洗A泵，洗脫緩沖液清洗B泵。開(kāi)啟A泵，用上樣緩沖液平衡管路，上樣環(huán)和histrapHP預(yù)裝柱。2)上樣切換工作站于load位，使用BDIOml注射器將5ml樣本緩緩?fù)迫?ml上樣環(huán)中。切換工作站于inject位，啟動(dòng)A泵用上樣緩沖液以0.lml/min的速度將上樣環(huán)中的樣本推入到預(yù)裝柱中。3)洗滌上樣結(jié)束后，啟動(dòng)A泵，用15個(gè)柱體積的上樣緩沖液以lml/min的速度沖洗柱子。同時(shí)啟動(dòng)A泵與B泵，以95%上樣緩沖液加5%洗脫緩沖液的輸出比例，用15個(gè)柱體積的液體以lml/min的速度沖洗柱子。4)梯度洗脫同時(shí)啟動(dòng)A泵與B泵，設(shè)定程序，使輸出比例由95%上樣緩沖液加5%洗脫緩沖液逐步過(guò)渡到100%洗脫液。在輸出比例變化中，工作站監(jiān)控圖出現(xiàn)峰時(shí)，點(diǎn)擊hold選項(xiàng)，維持輸出比例不變，直至峰消失，取消hold選項(xiàng)。收集出現(xiàn)的每一個(gè)層析峰所對(duì)應(yīng)的樣品。6.4純化蛋白樣本的鑒定與質(zhì)控DSDS-PAGE電泳檢測(cè)各個(gè)層析峰所對(duì)應(yīng)的樣品(圖4A)。根據(jù)電泳結(jié)果確定目標(biāo)蛋白的洗脫峰，并且通過(guò)軟件分析目標(biāo)蛋白的純度。2)取0.8ml蛋白標(biāo)準(zhǔn)配制液加入蛋白標(biāo)準(zhǔn)(20mgBSA)中，充分溶解后配制成25mg/ml的蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液。取適量25mg/ml蛋白標(biāo)準(zhǔn)，稀釋至終濃度為0.5mg/ml。根據(jù)樣品數(shù)量，按50體積BCA試劑A加1體積BCA試劑B(501)配制適量BCA工作液，充分混勻。將標(biāo)準(zhǔn)品按0，1,2,4,8,12，16,20μ1加到96孔板的標(biāo)準(zhǔn)品孔中，加標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液補(bǔ)足到20μ1。加適當(dāng)體積樣品到96孔板的樣品孔中，加標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液到20μ1。各孔加入200μ1BCA工作液，37°C放置20-30分鐘。測(cè)定各孔OD值(562nm)，根據(jù)所得標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出樣品的蛋白濃度。7.獲取無(wú)大標(biāo)簽片段的目的蛋白因在以上純化所得的蛋白中，有大片段的用于提高表達(dá)蛋白的可溶性的Nus-Tag，為了排除其對(duì)目的蛋白功能活性可能具有的影響，純化后需利用腸激酶將其切掉。7.1咪唑的去除上步所得純化蛋白處于咪唑環(huán)境中，無(wú)法進(jìn)行腸激酶酶切反應(yīng)，吸Iml純化蛋白于30KD超濾離心截留管，12000rpm,4°C離心30min，將截留管倒置，2000rpm,4°C離心15min，所得液體即為去除咪唑的純化蛋白。7.2腸激酶酶切用稀釋液將IOX酶切緩沖液稀釋為IX酶切緩沖液，置于4°C待用，取2U/yl的腸激酶做1、0·1、0·01,0.001,0.0001,0.00001,0.0000001七個(gè)稀釋度的稀釋，取各稀釋度稀釋好的腸激酶1μ1加入50μg的融合蛋白中，再加入相應(yīng)體積的1X酶切緩沖液，室溫孵育16h，取各個(gè)酶切反應(yīng)體系中的樣品10μ1，通過(guò)SDS-PAGE電泳檢測(cè)，從而確定最佳的腸激酶用量。將蛋白樣品按照最佳條件進(jìn)行腸激酶酶切，利用50KD的超濾離心截留管，離心，截留，離心所得濾膜的下層液，即為酶切后的小片段的目的蛋白(圖4Β)。8.Westernblot檢測(cè)純化所得小鼠IL-15亞型基因蛋白的表達(dá)取制備好的蛋白10μ1，加2μ15X上樣緩沖液混勻煮沸后上樣，進(jìn)行SDS-PAGE(20%濃縮液，5%分離膠)電泳40v，4h。40v濕轉(zhuǎn)7h，將凝膠中的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。麗春紅s染膜、考馬斯亮藍(lán)染膠，通過(guò)與蛋白marker比較，確定目的條帶位置。5%TBST脫脂奶粉封閉lh，一抗37°C孵育1小時(shí)，充分洗膜，辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記二抗37°C孵育1小時(shí)，充分洗膜，ECL顯色(圖5)。免抗小鼠IL-15—抗工作濃度為1200，β-actin工作濃度為1800，羊抗兔IgG二抗工作濃度12000。9.小鼠IL-15亞型蛋白是細(xì)胞經(jīng)LPS刺激后選擇性剪切而產(chǎn)生本發(fā)明選用放線菌酮，一種典型的真核生物蛋白合成抑制劑驗(yàn)證這種缺少第六號(hào)外顯子的小鼠IL-15基因表達(dá)的蛋白，是否由LPS刺激細(xì)胞后基因進(jìn)行選擇性剪切而表達(dá)形成。取C57BL/6小鼠脾臟，制備脾細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞濃度至lX107/ml，2ml/孔加至六孔板中，設(shè)一孔普通培養(yǎng)狀態(tài)下的脾細(xì)胞為對(duì)照，一孔加入LPS(10μg/ml)培養(yǎng)24h，一孔加入LPS(10yg/ml)培養(yǎng)12h后加入放線菌酮(1μg/ml)繼續(xù)培養(yǎng)12h。收集各孔細(xì)胞，離心，棄上清，裂解細(xì)胞獲取蛋白，加入5X上樣緩沖液，煮沸變性，經(jīng)WesternBlot檢測(cè)小鼠IL-15亞型蛋白表達(dá)的變化(圖6)。由于小鼠IL-15蛋白及其亞型在RNA水平上只相差40個(gè)堿基，其表達(dá)的蛋白大小兩者僅相差I(lǐng)KD左右，因此，本發(fā)明利用20%的分離膠，并延長(zhǎng)電泳時(shí)間，盡可能的把這兩種蛋白區(qū)分開(kāi)。結(jié)果表明，未經(jīng)任何處理的脾細(xì)胞表達(dá)正常的小鼠IL-15蛋白，加入LPS培養(yǎng)24h后的脾細(xì)胞表達(dá)小鼠IL-15亞型蛋白，放線菌酮的加入減少了小鼠IL-15亞型蛋白的表達(dá)，從而證明小鼠IL-15亞型是細(xì)胞被LPS刺激后選擇性剪切而產(chǎn)生的。實(shí)施例2本實(shí)施例中步驟1中所用的LPS的濃度為10μg/ml，作用時(shí)間為24小時(shí)。其余的試劑和操作步驟完全一樣。實(shí)施例3本實(shí)施例中步驟1所用的LPS的濃度為20μg/ml，作用時(shí)間為24小時(shí)；其余的試劑和操作步驟完全一樣。實(shí)施例4本實(shí)施例中步驟1所用的LPS的濃度為70μg/ml，作用時(shí)間為36小時(shí)。其余的試劑和操作步驟完全一樣。實(shí)施例5本實(shí)施例中步驟1所用的LPS的濃度為100μg/ml，作用時(shí)間為36小時(shí)。其余的試劑和操作步驟完全一樣。實(shí)施例6本實(shí)施例中步驟1所用的LPS的濃度為50μg/ml，作用時(shí)間為24小時(shí)。其余的試劑和操作步驟完全一樣。實(shí)施例7小鼠IL-15亞型蛋白的功能檢測(cè)1.小鼠IL-15亞型蛋白結(jié)構(gòu)模擬及功能預(yù)測(cè)由上述結(jié)果可見(jiàn)，這種小鼠IL-15亞型蛋白是在細(xì)胞經(jīng)LPS刺激后也即免疫系統(tǒng)被激活后經(jīng)選擇性剪切缺失6號(hào)外顯子表達(dá)形成的。本發(fā)明經(jīng)過(guò)軟件初步分析處理預(yù)測(cè)了這種在免疫系統(tǒng)激活狀態(tài)下產(chǎn)生的小鼠IL-15亞型發(fā)揮何種功能。可以得到的初步結(jié)論是小鼠IL-15亞型蛋白由于6號(hào)外顯子的缺失，無(wú)法折疊形成正常的二聚體，但是其單體仍能和小鼠IL-15受體結(jié)合，S卩小鼠IL-15亞型蛋白可能競(jìng)爭(zhēng)性的和受體結(jié)合，但并不能發(fā)揮正常小鼠IL-15的功能活性(圖7)。2.小鼠IL-15亞型蛋白的負(fù)向調(diào)節(jié)功能本發(fā)明利用需依賴IL-2或IL-15基因生長(zhǎng)的CTLL-2細(xì)胞，體外實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證小鼠IL-15亞型蛋白發(fā)揮的功能。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的CTLL-2細(xì)胞，臺(tái)盼藍(lán)染色確定活細(xì)胞率達(dá)95%以上，無(wú)血清1640培養(yǎng)基洗滌細(xì)胞兩遍。調(diào)整細(xì)胞濃度至5XlO5Ail，備用。取以上實(shí)驗(yàn)所得的純化的小鼠IL-15及其亞型蛋白各10μg，于96孔培養(yǎng)板中用1640完全培養(yǎng)基進(jìn)行倍比稀釋，每個(gè)稀釋度設(shè)三個(gè)復(fù)孔，取CTLL-2細(xì)胞100μ1/孔加入96孔培養(yǎng)板中，37°C、5%C02培養(yǎng)箱培養(yǎng)18h，于檢測(cè)前6h加入3H(lyCi/孔)，收集細(xì)胞，β液閃計(jì)數(shù)器計(jì)數(shù)(圖8Α)。結(jié)果顯示，正常的小鼠IL-15蛋白可以顯著促進(jìn)CTLL-2細(xì)胞的增殖，而小鼠IL-15亞型蛋白不能促進(jìn)CTLL-2細(xì)胞的增殖。為進(jìn)一步驗(yàn)證小鼠IL-15亞型蛋白是否可以負(fù)調(diào)控正常小鼠IL-15蛋白的功能活性，在以上的實(shí)驗(yàn)體系中又增設(shè)了以下幾個(gè)實(shí)驗(yàn)組取純化得到的正常小鼠IL-15蛋白1μg/孔加入96孔培養(yǎng)板中，取8μg小鼠IL-15亞型蛋白倍比稀釋加入相應(yīng)孔中，每個(gè)稀釋度設(shè)3個(gè)復(fù)孔；取rh小鼠IL-15標(biāo)準(zhǔn)品500ng/孔加入96孔培養(yǎng)板中，取8μg小鼠IL-15亞型蛋白倍比稀釋加入相應(yīng)孔中，每個(gè)稀釋度設(shè)3個(gè)復(fù)孔；取rh小鼠IL-15標(biāo)準(zhǔn)品500ng/孔加入96孔培養(yǎng)板中，取8μg純化所得正常小鼠IL-15蛋白倍比稀釋加入相應(yīng)孔中，每個(gè)稀釋度設(shè)3個(gè)復(fù)孔；取rh小鼠IL-15標(biāo)準(zhǔn)品500ng/孔加入96孔培養(yǎng)板中，并倍比稀釋，每個(gè)稀釋度設(shè)3個(gè)復(fù)孔。同樣通過(guò)3H嵌入法檢測(cè)CTLL-2的增殖(圖8B，C)。結(jié)果表明，8yg的小鼠IL-15亞型蛋白可以顯著降低Iyg正常小鼠IL-15蛋白及500ngrh小鼠IL-15標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)CTLL-2細(xì)胞的增殖促進(jìn)作用，并且小鼠IL-15亞型蛋白的這種負(fù)調(diào)節(jié)作用，隨著其加入量的倍比稀釋而降低。本發(fā)明設(shè)計(jì)以下體外實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步確認(rèn)小鼠IL-15亞型蛋白的負(fù)性調(diào)控功能。取C57BL/6小鼠脾臟，制備脾細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞濃度至5X106/ml，100μ1/孔加至96孔板中，加入以1.25μg/ml為起始濃度進(jìn)行倍比稀釋的LPS培養(yǎng)24h，另設(shè)兩組在此基礎(chǔ)上分別加入倍比稀釋的8μg純化所得正常小鼠IL-15蛋白及小鼠IL-15亞型蛋白培養(yǎng)24h，各組稀釋度均設(shè)3個(gè)復(fù)孔，37°C,5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)18h，于檢測(cè)前6h加入3H(1μCi/孔)，收集細(xì)胞，β液閃計(jì)數(shù)器計(jì)數(shù)。結(jié)果顯示，8yg的小鼠IL-15亞型蛋白可以顯著降低LPS對(duì)脾臟細(xì)胞的刺激增殖作用，且其負(fù)調(diào)節(jié)作用隨加入量的倍比稀釋而降低，而純化所得正常小鼠IL-15蛋白對(duì)LPS刺激無(wú)此負(fù)向調(diào)控作用。本發(fā)明公開(kāi)了一種拮抗正常小鼠IL-15蛋白功能的小鼠IL-15亞型蛋白，所述該小鼠IL-15亞型蛋白由小鼠脾細(xì)胞在LPS刺激下經(jīng)選擇性剪切形成缺失第六號(hào)外顯子的小鼠IL-15亞型基因表達(dá)產(chǎn)生。其功能經(jīng)體外實(shí)驗(yàn)檢測(cè)可以在免疫激活狀態(tài)下拮抗正常小鼠IL-15蛋白的功能，因此，本發(fā)明所述拮抗正常小鼠IL-15基因功能的小鼠IL-15亞型蛋白為制備預(yù)防或治療小鼠IL-15基因高表達(dá)相關(guān)疾病的藥物或制劑提供了新的、較好的選擇。實(shí)施例8本研究同樣取臨床上進(jìn)行初診的類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者的外周血進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，經(jīng)紅細(xì)胞裂解處理后，取病人外周血直接進(jìn)行培養(yǎng)，并加入LPS刺激培養(yǎng)24h，同時(shí)取正常人外周血同樣經(jīng)過(guò)或未經(jīng)LPS刺激進(jìn)行培養(yǎng)作為對(duì)照。取所培養(yǎng)的外周血細(xì)胞抽提總RNA并進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄-PCR。結(jié)果顯示，正常人外周血經(jīng)LPS刺激72h后出現(xiàn)小片段的亞型條帶，而患者的外周血?jiǎng)t刺激不出小片段的亞型條帶。該實(shí)驗(yàn)?zāi)壳耙咽占?名患者外周血進(jìn)行研究，均能得到很好的重復(fù)，從而證明在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者中無(wú)法產(chǎn)生此種具有拮抗作用的小鼠IL-15亞型。(見(jiàn)下表)表LPS刺激正常人及初診類風(fēng)濕患者外周血24h后通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄PCR檢測(cè)IL-15及IL-15亞型基因的表達(dá)結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>經(jīng)單因素方差分析，LPS刺激培養(yǎng)正常人外周血與初診類風(fēng)濕患者外周血24h后IL-15亞型基因的表達(dá)差異具有顯著性P<0.001實(shí)施例9小鼠IL-15蛋白及其亞型蛋白對(duì)不同用量的抗⑶3⑶28抗體激活的初診類風(fēng)濕病人外周血單個(gè)核淋巴細(xì)胞增殖活性的影響將抗CD3CD28抗體按照2yg/60yl/l、4yg/60yl/、8yg/60y1/孔的量加入96孔板中，每種抗體用量設(shè)3個(gè)復(fù)孔，4°C過(guò)夜包被培養(yǎng)板。實(shí)驗(yàn)前將抗體從孔板中吸走。取初診類風(fēng)濕病人外周血4ml，用Ficoll分離液分離得到外周血單個(gè)核淋巴細(xì)胞并進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞濃度至5X105個(gè)/ml,100μ1/孔加入已包被的96孔板中。取純化所得小鼠IL-15蛋白及其亞型蛋白按10yg/100y1/孔加入96孔板中。37°C、5%C02培養(yǎng)箱培養(yǎng)18h，于檢測(cè)前6h加入1微居/孔的3H繼續(xù)培養(yǎng)后，通過(guò)細(xì)胞收集器進(jìn)行收集，經(jīng)β液閃計(jì)數(shù)器進(jìn)行讀數(shù)。結(jié)果證明病人外周血單個(gè)核淋巴細(xì)胞在被抗CD3CD28抗體激活后，小鼠IL-15亞型蛋白的加入能顯著抑制T細(xì)胞的增殖，而加入野生型的小鼠IL-15蛋白則顯著促進(jìn)了T細(xì)胞的增殖，S卩小鼠IL-15亞型蛋白的加入能夠顯著抑制類風(fēng)濕病人外周血T細(xì)胞的增殖活性，從而對(duì)自身免疫性疾病的病程起到減緩及治療的作用。權(quán)利要求一種小鼠IL-15亞型融合蛋白的制備方法，其特征包括以下步驟(1)擴(kuò)增小鼠IL-15亞型基因片段取C57BL/6小鼠脾臟，制備脾細(xì)胞懸液，使用0.1μg/ml-100μg/mLPS作用24h-48h刺激小鼠脾細(xì)胞，獲得刺激后的C57BL/6小鼠脾細(xì)胞懸液，通過(guò)Trizol-氯仿法抽提總RNA；根據(jù)NCBI所公布小鼠IL-15cDNA序列NM008357.1及pET43.1原核表達(dá)載體的結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)特異性引物SeqNO.1和SeqNO.2，經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄-PCR操作擴(kuò)增獲得小鼠IL-15目的片段；(2)獲取小鼠IL-15亞型基因克隆取步驟1所得PCR產(chǎn)物，按照凝膠回收試劑盒說(shuō)明回收IL-15基因亞型片段；將回收所得PCR產(chǎn)物與PGEM-T克隆載體連接、4℃連接過(guò)夜；取連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至DH10B的感受態(tài)細(xì)菌，挑菌并酶切鑒定獲得陽(yáng)性質(zhì)粒；取該質(zhì)粒進(jìn)一步測(cè)序鑒定其基因序列SeqNO.3；(3)構(gòu)建重組小鼠IL-15的pET43.1原核表達(dá)載體取測(cè)序鑒定正確的步驟2所得質(zhì)粒及原核表達(dá)載體pET43.1，分別進(jìn)行SacI、XhoI內(nèi)切酶雙酶切并按照凝膠回收試劑盒說(shuō)明書回收酶切所得片段；將回收所得酶切片段連接過(guò)夜，取連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)DH10B菌，挑菌，按照質(zhì)粒小抽試劑盒說(shuō)明抽提質(zhì)粒酶切鑒定；(4)pET43.1-IL-15亞型基因轉(zhuǎn)化菌的表達(dá)取鑒定正確的步驟3中重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞BL21(DE3)，挑取單菌落，抽提質(zhì)粒，酶切鑒定，篩選正確轉(zhuǎn)化的表達(dá)菌pET43.1-IL-15/BL21；(5)純化并獲得無(wú)標(biāo)簽的小鼠IL-15亞型蛋白SeqNO.4。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于所述的PET43.1-IL-15亞型基因轉(zhuǎn)化菌的表達(dá)進(jìn)行自發(fā)表達(dá)，即從以上BL-21轉(zhuǎn)化菌平板上挑取菌落，在含AMP(75ug/ml)MDG非表達(dá)培養(yǎng)基中37°C培養(yǎng)，過(guò)夜，至菌液密度達(dá)到飽和，吸取1ml菌液至100ml的含AMP(75ug/ml)ZYM5052表達(dá)培養(yǎng)基中37°C培養(yǎng)過(guò)夜，其中所述的MDG非表達(dá)培養(yǎng)基(10ml)ZYM-5052表達(dá)培養(yǎng)基(10ml)9.15mlH209.58mlZY20u11MMgS0420u11MMgS042u1lOOOXmetals2u1lOOOXmetals125u140%glucose200u150X5052500ul5%aspartate200u150XM200u150XM。3.一種小鼠IL-15亞型蛋白在制備自身免疫性疾病藥物的應(yīng)用。4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于所述的自身免疫性疾病為類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、多發(fā)性硬化、強(qiáng)直性脊柱炎、炎癥性腸病、難治性乳糜泄、銀屑病、丙型病毒性肝炎、逆轉(zhuǎn)錄病毒HTLV-1相關(guān)疾病、阿狄森病、兒童哮喘、纖維肌痛、慢性疲勞綜合征、甲狀腺炎、血管炎、克隆病、腸炎或雷諾氏病。5.一種小鼠IL-15亞型蛋白在制備用于流感所致的急性肺炎治療藥物的應(yīng)用。全文摘要本發(fā)明涉及一種小鼠單抗蛋白的制備，特別涉及一種小鼠IL-15亞型蛋白的制備及其應(yīng)用；制備在免疫體系處于激發(fā)態(tài)下制備小鼠IL-15亞型蛋白，通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)檢測(cè)其對(duì)正常小鼠IL-15蛋白的拮抗作用，提供該亞型蛋白在自身免疫性疾病等臨床治療中的應(yīng)用；本研究證明，未經(jīng)LPS刺激的脾細(xì)胞檢測(cè)不到該種亞型，而在LPS刺激后的原代培養(yǎng)或細(xì)胞株來(lái)源的巨噬細(xì)胞及B細(xì)胞中均可檢測(cè)到該亞型，提示該亞型有可能在免疫系統(tǒng)激活的條件下發(fā)揮著重要的負(fù)反饋調(diào)控功能；本發(fā)明首次在免疫系統(tǒng)激活狀態(tài)下發(fā)現(xiàn)了該亞型蛋白，并做了其功能的相關(guān)研究，從而為其在機(jī)體免疫調(diào)控中發(fā)揮的作用提供了更為直接的證據(jù)。文檔編號(hào)A61P37/02GK101831435SQ20101016760公開(kāi)日2010年9月15日申請(qǐng)日期2010年5月10日優(yōu)先權(quán)日2010年5月10日發(fā)明者劉海燕,胡博申請(qǐng)人:劉海燕