專利名稱：香草酸在預(yù)防及治療輻射損傷中的用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及香草酸在預(yù)防及治療輻射損傷中的用途。
背景技術(shù)：
高能量輻射能引起細(xì)胞損傷和死亡的特點(diǎn)被廣泛用于癌癥治療中。而值得重視的 是輻射不僅殺傷腫瘤細(xì)胞也對(duì)正常的細(xì)胞造成了損傷，另外一些特殊人群比如輻射儀器操 作人員，宇航員，核基地工作人員等都需要避免輻射損傷，意外核事故中受輻射損傷者更需 要有效救治，所以多年來(lái)各國(guó)科學(xué)家一直致力于抗輻射藥物的研究。對(duì)輻射防護(hù)劑的研究 開(kāi)始于20世紀(jì)早期，主要包括巰基類、維生素類、氨基酸類和抗氧化類等。但由于高效、低 毒可供臨床應(yīng)用的輻射防護(hù)劑較難發(fā)現(xiàn)，人們將注意力轉(zhuǎn)移到了天然藥物上，因其易獲得， 副作用小倍受關(guān)注，成為有潛力可挖掘的資源，如單味藥人參、刺五加、靈芝和中藥復(fù)方四 物湯、八珍補(bǔ)血湯都有一定的抗輻射效果，因此可以合理的推測(cè)中草藥中含有的某些化合 物能夠保護(hù)機(jī)體免于輻射誘導(dǎo)的機(jī)體損傷。電離輻射使組織和細(xì)胞中產(chǎn)生大量活性氧(ROS)，通過(guò)直接和間接作用損傷生物 大分子(如DNA，蛋白質(zhì)，脂類等)，引起細(xì)胞死亡和機(jī)體功能喪失，而酚酸類具有抗氧化作 用，可以通過(guò)清除自由基發(fā)揮輻射防護(hù)作用。Abdelhak Mansouri等報(bào)道苯甲酸類衍生物 比桂皮酸類衍生物具有更強(qiáng)的過(guò)氧化氫清除能力，其中以香草酸最有效，IC50是0. 59 μ M0 ChannaKeshava等報(bào)道香草醛作為食品香料添加劑，具有抗氧化、抗誘變和抑制化學(xué)致癌作 用，可以降低輻射誘導(dǎo)的V79細(xì)胞中微核率和染色體畸變的產(chǎn)生。而香草酸作為香草醛的 衍生物，具有抗細(xì)菌、抗真菌等作用。。張俏忻等討論了香草酸能夠表現(xiàn)出一定的保護(hù)DNA 抗氧化活性。本實(shí)驗(yàn)室在前期對(duì)蕨類卷柏科(Selaginellaceae)卷柏屬(Selaginella)植 物卷柏不同部位抗輻射活性篩選的基礎(chǔ)上，得到卷柏水部位通過(guò)促進(jìn)照射后小鼠造血系統(tǒng) 恢復(fù)，提高免疫力和抗氧化能力而表現(xiàn)出一定的抗輻射作用，提示卷柏中某些天然化合物 能夠保護(hù)機(jī)體免于輻射損傷。對(duì)卷柏進(jìn)行化學(xué)成分分析及結(jié)構(gòu)鑒定，得到卷柏中含有大量 的酚酸類、木脂素類、黃酮類等化合物，而卷柏水部位中以酚酸類化合物居多，現(xiàn)有技術(shù)對(duì) 其中含量豐富、結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單的香草酸的應(yīng)用進(jìn)行了廣泛的研究。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供香草酸在預(yù)防及治療輻射損傷的藥物中的新用途。本實(shí)驗(yàn)室通過(guò)細(xì)胞、動(dòng)物水平對(duì)香草酸的抗輻射活性進(jìn)行反復(fù)篩選，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表 明香草酸可以抑制6tlCtlY射線照射導(dǎo)致的V79細(xì)胞活力喪失，并能提高6tlCtlY射線6Gy—次 全身照射BALB/c小鼠的活存率，從而完成了本發(fā)明。本發(fā)明中所述“香草酸”可以是植物中提取的單體化合物，也可以是化學(xué)合成的香 草酸，還可以是含香草酸的提取物。香草酸可與藥學(xué)上可接受的載體按本領(lǐng)域已知方法制備成各種藥物組合物，如片 齊U、膠囊劑、顆粒劑、注射劑等各種固體、液體制劑或貼劑等；或和其他中藥單體組合制成各種不同的劑型，通過(guò)不同的給藥途徑用于預(yù)防及治療輻射損傷。本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn)
1、發(fā)現(xiàn)了香草酸的新的醫(yī)療用途。2、香草酸作為常用中藥卷柏的已知提取物，天然存在于許多植物或有機(jī)物質(zhì)中， 來(lái)源廣，原料易得，用藥劑量小，安全性大，藥用前景廣闊。3、香草酸可以提高6tlCtl γ射線6Gy全身照射BALB/c小鼠的活存率，這特點(diǎn)有助于 將其開(kāi)發(fā)成輻射防護(hù)藥物，用于預(yù)防和治療輻射損傷，改善患者生存質(zhì)量。


圖1香草酸的不同濃度對(duì)V79細(xì)胞毒性試驗(yàn)圖2V79細(xì)胞的輻射劑量毒性試驗(yàn)圖3香草酸對(duì)4Gy6°CQ γ射線導(dǎo)致的V79細(xì)胞活力喪失的保護(hù)作用(24h檢測(cè))圖4香草酸對(duì)4Gy6°CQ γ射線導(dǎo)致的V79細(xì)胞活力喪失的保護(hù)作用(48h檢測(cè))圖5香草酸預(yù)防給藥對(duì)6tlCtl γ射線6Gy —次全身照射BALB/c小鼠活存率的影響。
具體實(shí)施例方式通過(guò)以下實(shí)施例來(lái)闡述本發(fā)明所述藥物香草酸體外及體內(nèi)抗輻射作用進(jìn)行評(píng)價(jià)， 但并不限于以下途徑。這些生物實(shí)驗(yàn)中主要包括1.化合物香草酸細(xì)胞毒性檢測(cè)；2.化合 物香草酸對(duì)6tlCtlY射線導(dǎo)致的V79細(xì)胞活力喪失的影響；3.化合物香草酸對(duì)6tlCtlY射線6Gy 一次全身照射BALB/c小鼠活存率的影響。[實(shí)施例一]香草酸細(xì)胞毒性檢測(cè)材料與方法1.V79細(xì)胞培養(yǎng)V79細(xì)胞在含10%胎牛血清(Gibco)及100IU/ml青霉素、100g/ml鏈霉素的DMEM 培養(yǎng)基中，于37°C，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。觀察細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好，培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后， 將V79細(xì)胞接種96孔板，5X IO3細(xì)胞/孔，37°C，5% CO2孵育12小時(shí)，細(xì)胞匯合后進(jìn)行給 藥實(shí)驗(yàn)，共同孵育24h后，待細(xì)胞長(zhǎng)至70 80% 60C0 γ射線照射處理。2.香草酸對(duì)V79細(xì)胞增殖的影響V79細(xì)胞在含10%胎牛血清(Gibco)及100IU/ml青霉素、100g/ml的DMEM培養(yǎng)基 中，于37°C，5%C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。觀察細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好，培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后，將V79 細(xì)胞接種96孔板，5X IO3細(xì)胞/孔，37V,5% CO2孵育12小時(shí)，細(xì)胞匯合后，將化合物香草 酸以終濃度 15. 625μ g/ml、31. 25 μ g/ml、62. 5 μ g/ml、125 μ g/ml、250 μ g/ml、500 μ g/ml、 1000 μ g/ml分別給藥，每濃度3孔，同時(shí)設(shè)無(wú)藥物細(xì)胞對(duì)照和空白對(duì)照，37°C ,5% CO2培養(yǎng)， 48小時(shí)觀察結(jié)果。每孔加入CCK-8工作液10 μ 1，避光，37°C，5% CO2培養(yǎng)2小時(shí)，在酶標(biāo)儀 (BIO-RADModel 680)上測(cè)定450nm處吸光值A(chǔ)。同時(shí)在倒置顯微鏡下每日觀察細(xì)胞形態(tài)。3.香草酸作用結(jié)果的處理與統(tǒng)計(jì)香草酸對(duì)V79細(xì)胞增殖的影響以不同組別吸光度值0D450表示=A450a驗(yàn)-A450
空白計(jì)算抑制率公式=(A450對(duì)照-A450給藥)/ (A450對(duì)照-A450空白)
IC50 計(jì)算公式lgIC50 = Xm-I (P-(3-Pm_Pn)/4)結(jié)果用Origin Pro 7. 5進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，與無(wú)藥物細(xì)胞對(duì)照組相比■·#，P < 0. 05 ； ##，P < 0. 01。結(jié)果化合物香草酸以2倍稀釋為濃度梯度的7個(gè)濃度處理V79細(xì)胞過(guò)程中，每日在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)，加藥組細(xì)胞形態(tài)與對(duì)照組細(xì)胞形態(tài)沒(méi)有明顯的變化。實(shí)驗(yàn)獨(dú)立 重復(fù)三次，CCK-8檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖1 ；溶劑DMS0、香草酸IC50分別是2. 44%,205. 12μ g/ml ； DMSO含量在2%，香草酸濃度在100μ g/ml以下時(shí)對(duì)細(xì)胞均沒(méi)有毒性。[實(shí)施例二]香草酸對(duì)6tlCtl γ射線導(dǎo)致的V79細(xì)胞活力喪失的保護(hù)作用材料與方法1.V79細(xì)胞培養(yǎng)方法見(jiàn)實(shí)施例一2.香草酸對(duì)6tlCtl γ射線導(dǎo)致的V79細(xì)胞活力喪失影響的檢測(cè)V79細(xì)胞在含10%胎牛血清(Gibco)及100IU/ml青霉素、100g/ml的DMEM培養(yǎng)基 中，于37°C，5%C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。觀察細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好，培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后，將V79 細(xì)胞接種96孔板，5X IO3細(xì)胞/孔，37°C,5% CO2孵育12小時(shí)，細(xì)胞匯合后，將化合物香草 酸以終濃度0. 2 μ g/ml、1 μ g/ml、5 μ g/ml、25 μ g/ml分別給藥，共同孵育24小時(shí)后6tlCtl γ射 線4Gy照射，劑量率為2. 3 2. 5Gy/min,同時(shí)設(shè)無(wú)藥物細(xì)胞對(duì)照和空白對(duì)照，繼續(xù)在37°C， 5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，分別在24小時(shí)、48小時(shí)兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)觀察結(jié)果。每孔加入CCK-8工作 液10 μ 1，避光，37°C，5% C02培養(yǎng)2小時(shí)，在酶標(biāo)儀上(BIO-RAD Model 680)測(cè)定450nm處 吸光值A(chǔ)。同時(shí)在倒置顯微鏡下每日觀察細(xì)胞形態(tài)。3.香草酸作用結(jié)果的處理與統(tǒng)計(jì)香草酸對(duì)6tlCtl γ射線導(dǎo)致V79細(xì)胞活力喪失的影響以不同組別吸光度值0D450表 示=A450試驗(yàn)-A450空白結(jié)果用Origin Pro 7. 5進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，與無(wú)藥物細(xì)胞對(duì)照組相比·.#，P < 0. 05 ； ##，P < 0. 01 ；與 4Gy 組相比*，P < 0. 05 ；**，P < 0. 01。結(jié)果實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)三次，CCK-8檢測(cè)結(jié)果24h見(jiàn)圖2 ;48h見(jiàn)圖3。香草酸在0. 2 5 μ g/ ml對(duì)6tlCtl γ射線導(dǎo)致V79細(xì)胞活力喪失呈劑量依賴的抑制作用。[實(shí)施例三]香草酸對(duì)6tlCtlγ射線6Gy —次全身照射BALB/c小鼠活存率的影響材料與方法1. BALB/c 小鼠飼養(yǎng)選用18 22g雄性BALB/c小鼠50只，由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供(動(dòng) 物合格證號(hào)SCXK-(軍)2007-004)。小鼠飼養(yǎng)環(huán)境溫度21 °C 士2°C，相對(duì)濕度50% 士 10%， 12小時(shí)燈光12小時(shí)黑暗。2.香草酸對(duì)6tlCtl γ射線6Gy —次全身照射BALB/c小鼠活存率的影響藥物制備精密稱取E523粉末1. 5mg,加生理鹽水3ml，配置成0. 5mg/ml溶液；香 草酸粉末60mg、120mg，分別加生理鹽水6ml，配置成10mg/ml、20mg/ml的溶液，超聲2小時(shí) 助溶，形成混懸液備用。
動(dòng)物分組及處理BALB/c雄性小鼠50只，按體重隨機(jī)分為模型組(6Gy)、陽(yáng)性對(duì)照 組(E523 5mg/kg)，香草酸低劑量組(100mg/kg)和高劑量組(200mg/kg)，每組10只，每天 定時(shí)灌胃蒸餾水或不同濃度藥物。除E523組照射6°C(lγ射線6Gy前24h灌胃一次外，其它 各組小鼠均于照射前24h和Ih分別灌胃兩次，之后每天定時(shí)觀察、稱重、記錄各組動(dòng)物死亡數(shù)。30天活存狀況觀察=6tlCtl γ射線6Gy照射后BALB/c小鼠體重減輕，皮毛干枯，精神 萎靡，行動(dòng)遲緩，團(tuán)縮拱背，視力障礙。與模型組相比，各給藥組小鼠的上述體征均有所改善ο3.香草酸作用結(jié)果的處理與統(tǒng)計(jì)香草酸預(yù)防給藥對(duì)6tlCtl γ射線6Gy —次全身照射BALB/c小鼠活存率的影響。結(jié) 果用OriginPro 7. 5進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。結(jié)果香草酸預(yù)防給藥對(duì)6Gy照射的BALB/c小鼠30天活存率影響的結(jié)果見(jiàn)表1。香草 酸預(yù)防性給藥能夠劑量依賴的提高6tlCtl γ射線6Gy —次全身照射BALB/c小鼠的活存率見(jiàn) 圖4。表1香草酸預(yù)防性給藥對(duì)6tlCtl γ射線6Gy照射的BALB/c小鼠活存率的影響
mmwm平均存活大數(shù)wm- 保護(hù)指數(shù) 與模型組比較*，P< 0. 05 ；**，P < 0. 01。
權(quán)利要求
一種抗輻射作用的藥物組合物，含藥用載體，特征為其活性成分為香草酸。
2.根據(jù)權(quán)力要求1所述的藥物組合物，其中所述藥物組合物可被配制成片劑、顆粒劑、 膠囊劑等固體制劑；注射劑、口服液等液體制劑或貼劑。
3.香草酸在制備預(yù)防及治療輻射損傷的藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及香草酸在預(yù)防及治療輻射損傷中的新用途。實(shí)驗(yàn)證明香草酸在小于100μg/ml濃度范圍內(nèi)對(duì)V79細(xì)胞無(wú)毒性；在0.2-5μg/ml對(duì)60Coγ射線導(dǎo)致V79細(xì)胞活力喪失呈劑量依賴的抑制作用；預(yù)防性給予100、200mg/kg可劑量依賴的提高60Coγ射線6Gy照射BALB/c小鼠的活存率，說(shuō)明香草酸可用于預(yù)防及治療輻射損傷。
文檔編號(hào)A61K31/192GK101862316SQ20101017918
公開(kāi)日2010年10月20日 申請(qǐng)日期2010年5月21日 優(yōu)先權(quán)日2010年5月21日
發(fā)明者任磊, 崔向君, 朱艷慧, 潘從澤, 王云飛, 王升啟, 趙海峰, 鄭曉珂 申請(qǐng)人:中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射與輻射醫(yī)學(xué)研究所