專利名稱：一種滴眼液及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種滴眼液，尤其是涉及一種治療炎癥性角膜新生血管及角膜上皮缺 損性疾病的滴眼液及其制備方法。
背景技術(shù)：
角膜病是常見的致盲性眼病之一，臨床上各種因素所致的角膜炎癥和角膜損傷均 可致角膜缺損、糜爛和潰瘍，若得不到有效治療，則將嚴重損傷患者的視功能和生活質(zhì)量。 據(jù)世界衛(wèi)生組織報告，目前，角膜病是引起視力喪失的第二位主要病因，僅次于白內(nèi)障，每 年因角膜潰瘍、眼外傷等造成的新增角膜盲為(150 200)萬，嚴重威脅著患者的健康([1] 趙家良.深入開展防盲治盲是我國眼科醫(yī)師的社會責任.中華眼科雜志，2005，41 :3-5)。 而在角膜病中，最主要的致盲原因是的角膜血管化和瘢痕化，由于參與角膜新生血管及角 膜炎癥的因素較多，發(fā)病原因復(fù)雜，文獻報道較少，同時缺乏系統(tǒng)研究，有關(guān)其發(fā)生機制、病 理過程等面的問題還尚未完全闡明，尋找新的藥物治療方向也已經(jīng)成為當前眼科界的一個 研究熱點。角膜新生血管(corneal neovascularization, CNV)可以繼發(fā)于多種角膜炎癥 性疾病(角膜炎、潰瘍等)及各類角膜損傷(角膜外傷、燒傷等)，是角膜對缺氧、炎癥等多 種刺激因素綜合的病理反應(yīng)，可能導致角膜移植時的排斥反應(yīng)和炎癥反應(yīng)，嚴重影響著患 者視力恢復(fù)。然而對于角膜新生血管、淋巴管及角膜炎癥的藥物研究，有望解決角膜創(chuàng)口愈 合困難和術(shù)后免疫排斥反應(yīng)二大關(guān)鍵問題，是目前治療角膜盲的新途徑。SA3K, (SERPINA3K,亦稱為 KBP kallikrein-binding protein)是新近發(fā)現(xiàn) 的一種內(nèi)源性激肽釋放酶結(jié)合蛋白，其基因序列也已發(fā)現(xiàn)。SA3K主要產(chǎn)生于肝臟及眼 部組織，具有抑制激肽釋放酶作用([2]Chai KX, Ma J-X，Murray SR, Chao J，Chao L Molecular cloningand analysis of the rat kallikrein-binding protein gene. J BiolChem 1991 ；266 16029-16036)。SA3K 屬絲氨酸蛋白酶抑制劑家族(serine proteinase inhibitor, SERPIN), ^WMSW^liJI([3] Tombran-Tink J, Mazuruk K, Rodriguez IR,Chung D,Linker T,Englander E,Chader GJ-Organization,evolutionary conservation, expression and unusual Alu density ofthehuman gene for pigment epithelium-derived factor, a unique neurotropHic serpin. Mol Vis 1996;2:11)。最 近的研究發(fā)現(xiàn)，SA3K在視網(wǎng)膜有抗新生血管、抗炎、抗氧化、抗纖維化活性([4]YamagiShi S, Inagaki Y, Nakamura K, Abe R, Shimizu Τ, Yoshimura A, Imaizumi T :Pigment epithelium-derived factor inhibits TNF-alpHa-induced interleukin-6expression inendothelial cells by suppressing NADpH oxidase—mediated reactive oxygen species generation. JMol Cell Cardiol 2004 ；37 497-506 ； [5]ffang JJ, Zhang SX, Mott R, Chen Y, Knapp RR, Cao W, Ma JX Anti-inflammatory effects of pigment epithelium-derived factor in diabeticnepHropathy. Am J pHysiol Renal pHysiol 2008 ；294 :F1166-1173 ； [6] Wang JJ, Zhang SX, MottR, Knapp RR, Cao W, Lau K, Ma JX Salutary effect of pigment epithelium-derived factorin diabetic nepHropathy
3evidence for antif ibrogenic activities.Diabetes 2006 ;55 1678-1685 ； [7] Zhang SX, Wang JJ, Dashti A, Wilson K, Zou MH, Szweda L, Ma JX, Lyons TJ Pigmentepithelium-derived factor mitigates inflammation and oxidative stress in retinal pericytes exposed tooxidized low-density lipoprotein. J Mol Endocrinol 2008 ；41 :135-143 ； [8] Zhang SX, Wang JJ, Gao G, Shao C, Mott R, Ma JX =Pigment epithelium-derived factor (PEDF) is an endogenousantiinflammatory factor. Faseb J 2006 ；20 :323-325)。最新的研究還提示SA3K在視網(wǎng)膜的抗新生血管、抗炎、抗氧化、抗纖維 化活性與Wnt信號通路有關(guān)，SA3K通過抑制、調(diào)控Wnt通路而起作用([9] Zhang B, Abreu JG, Zhou K, Chen Y, Hu Y, Zhou Τ, He X, MaJX. Blocking the Wnt pathway, a unifying mechanism for an angiogenic inhibitor in the serineproteinase inhibitor family. Proc Natl Acad Sci U S A. 2010 ；107(15) 6900-6905) Wnt信號轉(zhuǎn)導通路是細胞重要的信號轉(zhuǎn)導通路之一，在細胞的分化、遷移和增殖 中起到重要作用，是當前國際生物及醫(yī)學界的前緣、熱點研究領(lǐng)域之一([10]HUang H and He X. ffnt/b-catenin signaling :new(and old)players and new insights. Current Opinion in Cell Biology2008,20 119-125 ； [ll]Gordon MD, Nusse R. Wnt signaling multiple pathways, multiplereceptors, and multiple transcription factors. J Biol Chem. 2006 ；281 (32) 22429-33 ； [12]CleversH. ffnt/beta-catenin signaling in development and disease. Cell. 2006 ; 127 (3) :469_80)。目前，研究主要集中在腫 瘤、神經(jīng)發(fā)育、干細胞、視網(wǎng)膜等領(lǐng)域([13] 13. Luo J，Chen J，Deng ZL, Luo X，Song WX, Sharff KA, Tang N, Haydon RC, Luu HH, He TC. Wnt signaling andhuman diseases what are the therapeutic implications ？ Lab Invest. 2007 ；87 (2) :97_103 ; [14] Takahashi-Yanaga F,Sasaguri T. The ffnt/β -Catenin Signaling Pathway as a Target in DrugDiscovery. J ρHarmacol Sci. 2007 ；104,293-302 ； [15]Katohl Μ, Katoh Μ. WNT SignalingPathway and Stem Cell Signaling Network. Clin Cancer Res 2007 ； 13 (14) 4042-4045)。近年來，研究者發(fā)現(xiàn)Wnt通路在視網(wǎng)膜新生血管形成中起到重要作用([16] Lad N, Cheshier S, KalaniY. Wnt Signaling in Retinal Development and Disease. Stem Cells Dev 2009 ；18(1) :7_16 ； [17]ChenY, Hu Y, Lu K, Flannery JG, Ma JX =Very low density lipoprotein receptor, a negativeregulator of the wnt signaling pathway and choroidal neovascularization. J Biol Chem 2007 ；282 34420~34428)， 然而對其在眼表組織中作用的研究較少([18]Lyu J，Joo CK. Expressionof Wnt and MMP in epithelial cells during corneal wound healing. Cornea 2006 ；25 (10) :S24-28 ； [19]Lyu J, Joo CK. ffnt-7a Up—regulates Matrix Metalloproteinase-12Expression and PromotesCell Proliferation in Corneal Epithelial Cells during Wound Healing. J Biol Chem 2005 ；280 (22) :21653_21660)。對它們在正常角膜組織中的功能、與角膜組 織炎癥以及新生血管的形成機理、與角膜的損傷和修復(fù)過程以及角膜其它疾病的關(guān)系還不 清楚，作為Wnt信號轉(zhuǎn)導通路抑制劑_全新的LRP抑制劑SA3K則受到了越來越多眼科學 者的重視([9]Zhang B, Abreu JG, Zhou K, Chen Y, Hu Y, Zhou Τ, He X，Ma JX. Blocking the Wnt pathway, a unifyingmechanism for an angiogenic inhibitor in the serine proteinase inhibitor family. Proc Natl Acad SciU S A. 2010 ；107(15) :6900_5)。
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目前，市面上尚無抗炎、修復(fù)上皮及抗新生血管的滴眼液產(chǎn)品，臨床上應(yīng)用的大多 數(shù)眼科藥物具有局限的治療功能，而且各種藥品成分中可能存在相互影響和制約的因素， 加上多種聯(lián)合應(yīng)用眼藥中的毒性成分及防腐劑會給眼表微環(huán)境造成破壞，給本身就存在的 眼表疾患雪上加霜，對多種角膜病的治療帶來一定的困惑；此外，大多數(shù)抗炎產(chǎn)品多含有激 素類成分，長期使用可嚴重影響患者的眼表微環(huán)境，部分抗炎藥物還有相關(guān)的并發(fā)癥，如氯 霉素滴眼液大劑量用藥可致眼瞼、角膜水腫，眼球運動受限及視盤萎縮，長期應(yīng)用可致再生 障礙性貧血等；抗新生血管藥物，如青蒿琥酯([20]陳歡歡，周慧君.青蒿琥酯的抗血管生 成作用.藥學學報2004;39(1) 29-33)滴眼液，成分比較復(fù)雜，效果尚不夠肯定，且沒有抗 炎抗淋巴管作用；強力霉素滴眼劑是目前治療炎癥的有效藥物，但目前我國尚無正式商品 化的制劑。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種與現(xiàn)有的滴眼液相比，作用時間更短、價格較低、效果相 對較好、可同時起到抗角膜新生血管及快速修復(fù)上皮的滴眼液及其制備方法。本發(fā)明所述滴眼液(以下稱為SA3K滴眼液)的組成及其按體積百分比的含量為 牛血清0. 1 % 5%，增稠劑5% 15%、酸堿調(diào)節(jié)液 5%，滲透壓緩沖劑0. 1% 2%， 抗生素0. 5 % 2 %，SA3K原溶液5 % 30 %，余為平衡鹽溶液。本發(fā)明所述滴眼液的組成及其按體積百分比的含量最好為牛血清0.5% 2. 5%，增稠劑9. 5% 11. 5%、酸堿調(diào)節(jié)液20Z0 3%，滲透壓緩沖劑0. 2%，抗生素 1 % 1. 5 %，SA3K原溶液10 % 20 %，余為平衡鹽溶液。所述牛血清最好采用胎牛血清，尤其是特級胎牛血清，特級胎牛血清是在無菌條 件下通過心臟穿刺的方式采血取到，經(jīng)過40nm正壓氣流過濾的胎牛血清，具有極佳的促細 胞生長作用及產(chǎn)品穩(wěn)定性，內(nèi)毒素含量彡10EU/ml，血紅蛋白含量彡10mg/dl，按體積百分 比，所述牛血清的濃度為 15%，最好為10%。所述增稠劑可選自硫酸軟骨素、右旋糖酐、透明質(zhì)酸鈉、羧丙基甲基纖維素、羧甲 基纖維素、聚乙烯吡咯烷酮、聚丙烯醇、卡波姆、殼聚糖等中的至少一種。所述酸堿調(diào)節(jié)劑可選自碳酸鈉-碳酸氫鈉緩沖對、磷酸氫鈉-磷酸二氫鈉 緩沖對、羥乙基哌嗪乙硫磺酸(英文名為2-[4-(2-Hydroxyethyl)-l-piperazinyl] ethanesulfonic acid，簡寫為HEPES，分子式為C8H18N204S)、硼酸-硼砂緩沖對等中的一 種，最好選用作用較強的羥乙基哌嗪乙硫磺酸。所述滲透壓緩沖劑可選自氯化鈉、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、硼酸、硼砂、甘油、葡 萄糖等中的一種；所述滲透壓緩沖劑的用量參照眼科制劑標準。所述抗生素可選自慶大霉素、鏈霉素、妥布霉素等中的一種，最好采用妥布霉素。所述SA3K原溶液的制備可參照上述文獻[9]，其具體制備方法如首先將SA3K純 化，即將含SA3K重組DNA的質(zhì)粒在BL21株的大腸桿菌(E. coli)中擴增，后挑取大腸桿菌 單克隆接入后含KANA的LB培養(yǎng)基中，加入0. 5IPTG過夜誘導，后用鎳柱分離SA3K。所述平衡鹽溶液可采用PBS溶液。PBS溶液是最常用的平衡鹽溶液，也是抗炎藥物 的基礎(chǔ)溶液，其成分包含了部分離子成分，可以滿足用藥期間陰陽離子平衡和滲透壓的需 要。
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所述SA3K滴眼液，以IOml計，一般含有SA3K蛋白2. 5mg，pH值為7. 2 7. 4。本發(fā)明所述滴眼液的制備方法的具體步驟如下按滴眼液的配方，將增稠劑、牛血清、抗生素和SA3K原溶液加到平衡鹽溶液中混 合均勻，用酸堿調(diào)節(jié)劑調(diào)PH值為7. 2 7. 4，用滲透壓緩沖劑調(diào)滲透壓為350 380m0sm/ L，經(jīng)膜過濾除菌，即得SA3K滴眼液。與現(xiàn)有的滴眼液相比，本發(fā)明具有以下優(yōu)點
1)由于滴眼液成分簡單，因此成本相對較低，配制方便；2)由于沒有添加激素類成分，因此可以長期使用，大大減少用藥期間并發(fā)癥和后 遺癥的發(fā)生；3)由于添加抗生素后無污染，因此病原菌培養(yǎng)觀察發(fā)現(xiàn)此滴眼液能較長時間保存 (3個月)，應(yīng)用于大鼠角膜堿燒傷模型后發(fā)現(xiàn)，不僅可以預(yù)防和治療角膜新生血管，促進上 皮修復(fù)的發(fā)生，而且對控制角膜炎癥也發(fā)揮了一定的作用；4)由于加入牛血清，無病原微生物，低內(nèi)毒素，低補體，因此可以顯著減少使用其 他血清的不良反應(yīng)；5)由于加入一定劑量的增稠劑，因此可明顯提高藥物的舒適度；6)可方便臨床醫(yī)生工作，為術(shù)前控制和穩(wěn)定角膜新生血管及角膜炎癥性疾病患者 的病情提供更合理的手術(shù)時機；7)不僅可以用于抗角膜新生血管角膜炎癥性疾病，預(yù)防和治療角膜新生血管的 發(fā)生，而且能控制角膜炎癥，將來可能會用于各種炎癥或相關(guān)新生血管的藥物治療，并能被 廣大患者接受而應(yīng)用于臨床，同時將為其作用機制的進一步研究提供重要的線索和技術(shù)支 持；8)制作流程簡單、可靠，且易于實施。


圖1為經(jīng)過本發(fā)明所述不同濃度的SA3K滴眼液(20nM，40nM, 80nM, 160nM, 320nM) 分別作用于HUVEC(人臍靜脈血管內(nèi)皮細胞)和HCE(人角膜上皮細胞系)兩種細胞72小 時后細胞存活率的比較情況。在圖1中，橫坐標為SK3K滴眼液濃度(nM)，縱坐標為細胞成 活率(% )ο圖2為大鼠角膜堿燒傷后，經(jīng)過PBS滴眼液連續(xù)治療8天角膜上皮缺損染色的裂 隙燈照片。圖3為大鼠角膜堿燒傷后，經(jīng)過本發(fā)明所述SA3K滴眼液連續(xù)治療8天角膜上皮缺 損染色的裂隙燈照片。圖4為大鼠角膜堿燒傷后，經(jīng)過本發(fā)明所述SA3K滴眼液，PBS滴眼液和BSA滴眼液 連續(xù)治療8天內(nèi)的角膜上皮缺損面積比較情況和統(tǒng)計分析。在圖4中，橫坐標為時間(d)， 縱坐標為熒光計數(shù)；圖5為大鼠角膜堿燒傷后，經(jīng)過PBS滴眼液連續(xù)治療8天新生血管面積的裂隙燈 照片。圖6為大鼠角膜堿燒傷后，經(jīng)過本發(fā)明所述SA3K滴眼液連續(xù)治療8天新生血管面 積的裂隙燈照片。
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圖7為大鼠角膜堿燒傷后，經(jīng)過本發(fā)明所述SA3K滴眼液，PBS滴眼液和含BSA滴 眼液連續(xù)治療8天內(nèi)的新生血管面積變化情況和統(tǒng)計分析。在圖7中，橫坐標為時間(d)， 縱坐標為新生血管面積(mm2)。圖8為大鼠角膜堿燒傷后，經(jīng)過本發(fā)明所述SA3K滴眼液，PBS滴眼液和含BSA滴 眼液連續(xù)治療8天內(nèi)的炎癥指數(shù)變化情況和統(tǒng)計分析。在圖8中，橫坐標為時間(d)，縱坐 標為炎癥指數(shù)。圖9為大鼠角膜堿燒傷后，經(jīng)過PBS滴眼液連續(xù)治療8天中央角膜HE染色照片。圖10為大鼠角膜堿燒傷后，經(jīng)過本發(fā)明所述SA3K滴眼液連續(xù)治療8天中央角膜 HE染色照片。圖11為經(jīng)過本發(fā)明所述SA3K滴眼液及PBS滴眼液，BSA滴眼液連續(xù)治療8天的 大鼠角膜堿燒傷的VEGF和PEDF的Western blot圖片。圖12為經(jīng)過本發(fā)明所述SA3K滴眼液及PBS滴眼液，BSA滴眼液連續(xù)治療8天的 大鼠角膜堿燒傷的TNF-α的Western blot圖片。
具體實施例方式以下給出一種優(yōu)化的SA3K滴眼液制作方法實施例1以IOml滴眼液計，以7. 73ml PBS為基礎(chǔ)溶液，含有胎牛血清200 μ 1、低分子右旋 糖酐 100 μ 1、HEPES200 μ 1，妥布霉素 100 μ 1，SA3K 原溶液 1. 67ml，pH 值為 7. 2 7. 4，滲 透壓為 350 380m0sm/L。制備方法將1. 67ml SA3K原溶液和100 μ g低分子右旋糖酐溶解于2ml PBS溶液 中，然后和200 μ 1胎牛血清，1MHERES 200 μ 1及10%妥布霉素100 μ 1混合均勻，補加PBS 溶液于IOml，調(diào)節(jié)pH值為7. 2 7. 4，滲透壓為350 380m0sm/L，經(jīng)0. 2 μ m膜過濾除菌， 即得SA3K滴眼液。實施例2以IOml滴眼液計，以7. 73ml HBSS為基礎(chǔ)溶液，含有胎牛血清200 μ 1、低分子右旋 糖酐 100 μ 1、HERES 200 μ 1,妥布霉素 100 μ 1，SA3K 原溶液 1. 67ml，pH 值為 7. 2 7. 4，滲 透壓為 350 380m0sm/L。制備方法將1. 67ml SA3K原溶液和100 μ g低分子右旋糖酐溶解于2ml HBSS溶 液中，然后和200 μ 1胎牛血清，IM HERES 200 μ 1及10%妥布霉素100 μ 1混合均勻，補加 HBSS溶液于10ml，調(diào)節(jié)pH值為7. 2 7. 4，滲透壓為350 380m0sm/L，經(jīng)0. 2 μ m膜過濾 除菌，即得SA3K滴眼液。實施例3以IOml滴眼液計，以7. 73ml生理鹽水為基礎(chǔ)溶液，含有胎牛血清200ul、低分子右 旋糖酐 100 μ 1、HERES 200 μ 1，妥布霉素 100 μ 1，SA3K 原溶液 1. 67ml，pH 值為 7. 2 7. 4， 滲透壓為350 380m0sm/L。制備方法將1. 67ml SA3K原溶液和100 μ g低分子右旋糖酐溶解于2ml生理鹽水 溶液中，然后和200 μ 1胎牛血清，IM HERES 200 μ 1及10%妥布霉素100 μ 1混合均勻，補 加生理鹽水溶液于IOml，調(diào)節(jié)pH值為7. 2 7. 4，滲透壓為350 380m0sm/L，經(jīng)0. 2 μ m膜
7過濾除菌，即得SA3K滴眼液。實施例4
以IOml滴眼液計，以7. 73ml林格氏液為基礎(chǔ)溶液，含有胎牛血清200 μ 1、低分子 右旋糖酐 100μ 1、HEPES 200μ 1，妥布霉素 100μ 1，SA3K原溶液 1. 67ml，pH值為 7. 2 7. 4， 滲透壓為350 380m0sm/L。制備方法將1. 67ml SA3K原溶液和100 μ g低分子右旋糖酐溶解于2ml林格氏液 溶液中，然后和200 μ 1胎牛血清，IM HEPES 200 μ 1及10%妥布霉素100 μ 1混合均勻，補 加林格氏液溶液于IOml，調(diào)節(jié)ρΗ值為7. 2 7. 4，滲透壓為350 380m0sm/L，經(jīng)0. 2 μ m膜 過濾除菌，即得SA3K滴眼液。實施例5以IOml滴眼液計，以7. 73ml Harks液為基礎(chǔ)溶液，含有胎牛血清200 μ 1、低分子 右旋糖酐 100μ 1、HEPES 200μ 1，妥布霉素 100μ 1，SA3K原溶液 1. 67ml，pH值為 7. 2 7. 4， 滲透壓為350 380m0sm/L。制備方法將1. 67ml SA3K原溶液和100 μ g低分子右旋糖酐溶解于2ml Harks液 溶液中，然后和200 μ 1胎牛血清，IM HEPES 200 μ 1及10%妥布霉素100 μ 1混合均勻，補 加Harks液溶液于IOml，調(diào)節(jié)ρΗ值為7. 2 7. 4，滲透壓為350 380m0sm/L,經(jīng)0. 2 μ m膜 過濾除菌，即得SA3K滴眼液。實施例6以下給出一種優(yōu)化的SA3K滴眼液在體外影響HUVEC (人臍靜脈血管內(nèi)皮細胞)和 HCE (人角膜上皮細胞系)細胞生長的初步實驗研究目的了解不同濃度SA3K滴眼液在體外對HUVEC和HCE細胞的增殖的影響。方法采用原代HUVEC細胞株進行細胞培養(yǎng)，傳至第3代時，將3X10_4個/cm3細胞 培養(yǎng)于96孔板中，待細胞貼壁后，在培養(yǎng)液中分別加入含不同濃度SA3K(20nM，40nM，80nM， 160nM，320nM)的相應(yīng)培養(yǎng)液(HUVEC培養(yǎng)液為M-200，HCE培養(yǎng)液為DMEM)培養(yǎng)，利用MTT實 驗檢測培養(yǎng)72h后兩組細胞增殖情況。結(jié)果MTT實驗結(jié)果顯示72h后SA3K組的HUVEC細胞的生長明顯受到抑制，成活 細胞隨濃度逐漸減少，呈劑量效應(yīng)關(guān)系；而對HCE細胞增殖則沒有明顯抑制作用。結(jié)論不同濃度SA3K組在體外對HUVEC的增殖有抑制作用，而對HCE細胞則沒有 明顯影響，提示SA3K的抗新生血管的作用可能與其抑制血管內(nèi)皮細胞有關(guān)。參見圖1，HUVEC(人臍靜脈血管內(nèi)皮細胞)和HCE(人角膜上皮細胞系)細胞在 相同密度接種后，待細胞完全貼壁后給予含分別不同濃度SA3K的培養(yǎng)基連續(xù)處理72小時 的變化情況。結(jié)果顯示在濃度為40，80，160及320nM SA3K培養(yǎng)基培養(yǎng)下，HUVEC細胞(a) 的生長明顯受到抑制，成活細胞隨濃度逐漸減少，呈劑量效應(yīng)關(guān)系；而在相應(yīng)濃度(40，80， 160及320nM)的SA3K培養(yǎng)基培養(yǎng)下，HCE細胞(b)的生長沒有受到抑制，說明上述濃度SA3K 培養(yǎng)基對HUVEC細胞增殖有明顯抑制作用，而對HCE細胞增殖無抑制影響，提示SA3K的抗 新生血管的作用可能與其抑制血管內(nèi)皮細胞有關(guān)。實施例7以下給出一種優(yōu)化的SA3K滴眼液促進大鼠堿燒傷角膜的角膜上皮生長初步實驗 研究
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目的了解SA3K滴眼液對大鼠角膜堿燒傷模型中角膜上皮生長的影響。方法先將24只Wistar大鼠用1 % NaOH制作角膜堿燒傷模型，分為4組，第一組 為未燒傷對照組，第二組給予PBS滴眼液，(每次滴眼容量為10 μ 1，每天滴眼4次，下同)， 第三組給予BSA滴眼液(每次滴眼容量為10 μ 1，濃度為1.5mg/ml，每天滴眼4次，下同) 和第四組給予SA3K滴眼液(劑量為20 μ g/天，每次滴眼容量為10μ 1，濃度為500yg/ml， 每天滴眼4次，下同)點眼1，2，5，8天后，觀察大鼠角膜上皮修復(fù)情況。結(jié)果SA3K組角膜上皮缺損面積明顯少于PBS滴眼液及BSA滴眼液組，且在8天 后存在有統(tǒng)計學意義(P值< 0. 05)，說明SA3K滴眼液能有效促進上皮修復(fù).結(jié)論SA3K滴眼液能顯著促進大鼠堿燒傷角膜的角膜上皮生長。參見圖2 4，大鼠角膜堿燒傷模型制作后，給予PBS滴眼液(a)(圖2) ,BSA滴眼 液(b)和SA3K滴眼液(c)(圖3)連續(xù)點眼8天，觀察大鼠角膜上皮細胞修復(fù)改變情況。圖 4為PBS滴眼液(a)、BSA滴眼液(b)和SA3K滴眼液(c)在堿燒傷后1，2，5，8天角膜上皮 細胞修復(fù)的變化情況和統(tǒng)計分析，結(jié)果顯示SA3K組角膜上皮缺損面積明顯少于PBS滴眼液 組及BSA滴眼液組，且在8天后存在有統(tǒng)計學意義(P值< 0. 05)，說明SA3K滴眼液能有效 促進上皮修復(fù).實施例8以下給出一種優(yōu)化的SA3K滴眼液抑制大鼠角膜新生血管和炎癥的初步實驗研究目的了解SA3K滴眼液對大鼠角膜堿燒傷模型中新生血管和炎癥反應(yīng)的影響。方法將24只Wistar大鼠用1 % NaOH制作角膜堿燒傷模型，分為4組，第一組為 未燒傷對照組，第二組給予PBS滴眼液，(每次滴眼容量為10 μ 1，每天滴眼4次，下同)，第 三組給予BSA滴眼液(每次滴眼容量為10 μ 1，濃度為1.5mg/ml，每天滴眼4次，下同)和 第四組給予SA3K滴眼液(劑量為20 μ g/天，每次滴眼容量為10μ 1，濃度為500yg/ml，每 天滴眼4次，下同)點眼1，2，5，8天后，觀察兩組大鼠角膜新生血管生長和炎癥指數(shù)情況。 取點藥8天后角膜，采用Western blot技術(shù)對比兩組TNF- α、VEGF以及PEDF表達情況。結(jié)果在連續(xù)用藥8天后，SA3K組的角膜炎癥指數(shù)和新生血管面積明顯小于PBS 滴眼液組和BSA滴眼液。Western blot結(jié)果顯示，與PBS滴眼液組相比較，VEGF在SA3K組 明顯下調(diào)而PEDF則明顯上調(diào)；Western blot結(jié)果還顯示TNF-α在SA3K組明顯下調(diào)。結(jié)論SA3K滴眼液能顯著抑制大鼠堿燒傷角膜的新生血管形成和炎癥反應(yīng)發(fā)生。參見圖5 10，大鼠角膜堿燒傷模型制作后，給予PBS滴眼液(a)(圖5)、BSA滴 眼液(b)和SA3K滴眼液(c)(圖6)連續(xù)點眼8天，大鼠角膜新生血管面積和炎癥改變情 況。圖7為濃度為PBS滴眼液(a)、BSA滴眼液(b)和SA3K滴眼液(c)在堿燒傷后1,2,5, 8天角膜新生血管面積變化情況和統(tǒng)計分析，結(jié)果顯示SA3K組角膜新生血管面積明顯少于 PBS滴眼液及BSA滴眼液組，且在第5，8天時間點存在有統(tǒng)計學意義(P值均< 0. 05)，說明 SA3K滴眼液能有效抑制大鼠堿燒傷角膜的新生血管形成.圖8為濃度為PBS(a)、BSA(b)和 SA3K滴眼液(c)在堿燒傷后1，2，5，8天角膜炎癥變化情況統(tǒng)計分析，結(jié)果顯示，SA3K組角 膜炎癥指數(shù)明顯小于PBS及BSA滴眼液組，且在第5，8天時間點存在有統(tǒng)計學意義(P值均 < 0. 05)，說明SA3K滴眼液能有效控制大鼠堿燒傷角膜的炎癥。圖9 10，大鼠角膜堿燒 傷模型制作后，給予PBS滴眼液(圖9)和SA3K滴眼液(圖10)連續(xù)點眼8天，大鼠中央角 膜的HE照片情況，結(jié)果顯示SA3K滴眼液組中央角膜上的炎癥細胞明顯少于PBS滴眼液組，
9進一步說明了 SA3K滴眼液能顯著控制大鼠堿燒傷角膜的炎癥浸潤。
圖11 12為在堿燒傷后給予PBS滴眼液、BSA滴眼液和SA3K連續(xù)點眼8天，角 膜VEGF、PEDF和TNF- α的Western Blot變化情況。圖11結(jié)果顯示，SA3K組較PBS滴眼 液組和BSA滴眼液組VEGF水平明顯下調(diào)而PEDF水平明顯上調(diào)，說明了 SA3K滴眼液是通過 使VEGF表達下降，PEDF表達升高而抑制大鼠堿燒傷角膜新生血管形成的。圖12結(jié)果顯示， SA3K組較PBS滴眼液組和BSA滴眼液組TNF- α水平明顯下調(diào)，說明了 SA3K滴眼液也通過 使TNF-α表達下降而抑制大鼠堿燒傷角膜新生血管形成以及抑制炎癥發(fā)生的。
權(quán)利要求
一種滴眼液，其特征在于其組成及其按體積百分比的含量為牛血清0.1％～5％，增稠劑5％～15％、酸堿調(diào)節(jié)液1％～5％，滲透壓緩沖劑0.1％～2％，抗生素0.5％～2％，SA3K原溶液5％～30％，余為平衡鹽溶液。
2.如權(quán)利要求1所述的一種滴眼液，其特征在于其組成及其按體積百分比的含量 為牛血清0. 5 % 2. 5 %，增稠劑9. 5 % 11. 5 %、酸堿調(diào)節(jié)液2 % 3 %，滲透壓緩沖劑 0. 2%，抗生素 1. 5%, SA3K原溶液10% 20%，余為平衡鹽溶液。
3.如權(quán)利要求1所述的一種滴眼液，其特征在于所述牛血清為胎牛血清，最好是特級 胎牛血清。
4.如權(quán)利要求1所述的一種滴眼液，其特征在于按體積百分比，所述牛血清的濃度為 15%，最好為10%。
5.如權(quán)利要求1所述的一種滴眼液，其特征在于所述增稠劑選自硫酸軟骨素、右旋糖 酐、透明質(zhì)酸鈉、羧丙基甲基纖維素、羧甲基纖維素、聚乙烯吡咯烷酮、聚丙烯醇、卡波姆、殼 聚糖中的至少一種。
6.如權(quán)利要求1所述的一種滴眼液，其特征在于所述酸堿調(diào)節(jié)劑選自碳酸鈉-碳酸氫 鈉緩沖對、磷酸氫鈉_磷酸二氫鈉緩沖對、羥乙基哌嗪乙硫磺酸、硼酸_硼砂緩沖對中的一 種，最好為羥乙基哌嗪乙硫磺酸。
7.如權(quán)利要求1所述的一種滴眼液，其特征在于所述滲透壓緩沖劑選自氯化鈉、磷酸 氫二鈉、磷酸二氫鈉、硼酸、硼砂、甘油、葡萄糖中的一種。
8.如權(quán)利要求1所述的一種滴眼液，其特征在于所述抗生素選自慶大霉素、鏈霉素、妥 布霉素中的一種，最好為妥布霉素。
9.如權(quán)利要求1所述的一種滴眼液，其特征在于所述平衡鹽溶液為PBS溶液。
10.如權(quán)利要求1所述的一種滴眼液的制備方法，其特征在于其具體步驟如下按滴眼液的配方，將增稠劑、牛血清、抗生素和SA3K原溶液加到平衡鹽溶液中混合均勻，用酸堿調(diào)節(jié)劑調(diào)PH值為7. 2 7. 4，用滲透壓緩沖劑調(diào)滲透壓為350 380m0sm/L，經(jīng) 膜過濾除菌，即得SA3K滴眼液。
全文摘要
一種滴眼液及其制備方法，涉及一種滴眼液。提供一種與現(xiàn)有的滴眼液相比，作用時間更短、價格較低、效果相對較好、可同時起到抗角膜新生血管及快速修復(fù)上皮的滴眼液及其制備方法。所述滴眼液的組成及其按體積百分比的含量為牛血清0.1％～5％，增稠劑5％～15％，酸堿調(diào)節(jié)液1％～5％，滲透壓緩沖劑0.1％～2％，抗生素0.5％～2％，SA3K原溶液5％～30％，余為平衡鹽溶液。按滴眼液的配方，將增稠劑、牛血清、抗生素和SA3K原溶液加到平衡鹽溶液中混合均勻，用酸堿調(diào)節(jié)劑調(diào)pH值為7.2～7.4，用滲透壓緩沖劑調(diào)滲透壓為350～380mOsm/L，經(jīng)膜過濾除菌，即得SA3K滴眼液。
文檔編號A61P27/02GK101961486SQ20101050585
公開日2011年2月2日 申請日期2010年10月13日 優(yōu)先權(quán)日2010年10月13日
發(fā)明者劉曉琛, 劉祖國, 周躍平, 林志榮, 邵毅, 馬建興 申請人:廈門大學