專利名稱：一種防治有機(jī)磷農(nóng)藥所致血管損傷的藥物組合物及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種防治血管損傷的藥物組合物，具體地說是一種防治有機(jī)磷農(nóng)藥所 致血管損傷的藥物組合物，同時(shí)涉及該藥物組合物的制劑及其制備方法。
背景技術(shù)：
我國是農(nóng)業(yè)大國，有機(jī)磷(Organophosphorus Pesticide,0P)農(nóng)藥(三唑磷、辛硫 磷、丙溴磷等)依然在我國廣大農(nóng)村地區(qū)大量使用。雖然大多數(shù)農(nóng)民已經(jīng)注意預(yù)防急性有 機(jī)磷中毒，但是并沒有對長期慢性接觸有機(jī)磷農(nóng)藥對有機(jī)體的損傷引起足夠重視。研究表明，機(jī)體長時(shí)間接觸小劑量有機(jī)磷農(nóng)藥，可以導(dǎo)致血漿對氧磷酶-1活力和 濃度明顯下降，臨床上也與動脈粥樣硬化、冠心病、糖尿病等疾病的發(fā)生有關(guān)，血漿對氧磷 酶-1 (Paraoxonase-I)有強(qiáng)大的抗氧化作用，其活力和濃度下降直接導(dǎo)致機(jī)體抗氧化能力 下降，體內(nèi)自由基含量上升，且大量的研究表明氧化應(yīng)激與許多疾病(如動脈粥樣硬化、冠 心病、糖尿病)的發(fā)生存在著密切的聯(lián)系。我們在2006年到2009年對豫北地區(qū)長期使用有機(jī)磷農(nóng)藥的農(nóng)民進(jìn)行調(diào)查研究， 發(fā)現(xiàn)長期接觸有機(jī)磷農(nóng)藥大于10年的農(nóng)民體內(nèi)呈明顯的氧化應(yīng)激狀態(tài)，極易誘發(fā)多種血 管性疾病(如動脈粥樣硬化、糖尿病等)。血管內(nèi)皮功能的損傷是多種血管疾病(如動脈粥樣硬化、糖尿病等)形成的起始 因素。發(fā)明人通過多種實(shí)驗(yàn)途徑尋找長期低劑量接觸有機(jī)磷農(nóng)藥引起機(jī)體損傷的直接原 因，最終發(fā)現(xiàn)有機(jī)磷農(nóng)藥可以引起血管內(nèi)皮依賴性舒張反應(yīng)下降，血管組織氧化產(chǎn)物聚集， 培養(yǎng)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞單層通透性升高、凋亡增加，細(xì)胞培養(yǎng)液氧化產(chǎn)物聚集，最終導(dǎo) 致血管損傷，誘發(fā)各種血管疾病。因此，減少血管內(nèi)皮損傷可以有效的防治有機(jī)磷農(nóng)藥所致血管損傷，進(jìn)而防治有 機(jī)磷農(nóng)藥所致的各種心、腦血管疾病，本發(fā)明目的在于提供一種防治有機(jī)磷農(nóng)藥所致血管 損傷的藥物組合物。枸杞子是我國傳統(tǒng)中藥材，《本草綱目》中記載枸杞具有“補(bǔ)精氣諸不足，明目安 神，令人長壽”的功效。現(xiàn)在藥理學(xué)研究證明，枸杞具有增強(qiáng)機(jī)體免疫力、抗腫瘤、抗衰老、降 血脂、降血糖等作用。枸杞經(jīng)DEAE-纖維素柱分離純化，檢測到4種枸杞多糖組分(LBP)， LBP-I、LBP-II、LBP-III、LBP-IV,經(jīng)過S^hadex G-100凝膠色譜柱層析和液相色譜鑒定 這四種多糖分子量均一，但組成上存在著微觀不均一性；經(jīng)紅外光譜推測枸杞多糖可能 含-OH、-C00H、-NH2-或-NH-基團(tuán)。枸杞多糖組分-IV用于有機(jī)磷農(nóng)藥所致血管損傷的藥物中，已經(jīng)在《安徽農(nóng)業(yè)科 學(xué)》的2010年第15期公開。黃芪是我國傳統(tǒng)中藥材，《本草綱目》中記載黃芪具有“益氣補(bǔ)虛之功效”的功效。 現(xiàn)在藥理學(xué)研究證明，黃芪有增強(qiáng)機(jī)體免疫功能，抗氧化、預(yù)防動脈粥樣硬化，延緩衰老等 作用。
中國專利201010148676. 7、“黃芪多糖在制備防治有機(jī)磷農(nóng)藥所致血管內(nèi)皮損傷 的藥物中的應(yīng)用”，公開了黃芪多糖可以防治有機(jī)磷農(nóng)藥所致血管內(nèi)皮損傷。虎杖是我國傳統(tǒng)中藥材，《日華子本草》中記載虎杖具有“治產(chǎn)后惡血不下，心腹脹 滿。排膿，主瘡癤癰毒，婦人血暈，撲損瘀血，破風(fēng)毒結(jié)氣”的功效?；⒄忍崛∥锇邹继J醇具 有強(qiáng)大的抗氧化、螯合自由基及脂質(zhì)抗氧化作用。白藜蘆醇是一種有效的羥基、超氧化物和 金屬誘導(dǎo)基團(tuán)的清除劑，且對活性氧ROS引起的細(xì)胞膜脂質(zhì)過氧化合DNA損傷具有保護(hù)作 用。中國專利201010148671. 4、“白藜蘆醇在制備防治有機(jī)磷農(nóng)藥所致血管內(nèi)皮損傷 的藥物中的應(yīng)用”，公開了白藜蘆醇可以防治有機(jī)磷農(nóng)藥所致血管內(nèi)皮損傷。尚未見到枸杞多糖、黃芪多糖和白藜蘆醇三藥組成的復(fù)方防治有機(jī)磷農(nóng)藥所致血 管損傷的相關(guān)報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了一種防治有機(jī)磷農(nóng)藥所致血管損傷的藥物組合物。本發(fā)明的另一目的是提供一種防治有機(jī)磷農(nóng)藥所致血管損傷的藥物組合物的制 劑。本發(fā)明還提供了一種防治有機(jī)磷農(nóng)藥所致血管損傷的藥物組合物的制劑的制備 方法。本發(fā)明還提供了該藥物組合物在制備防治有機(jī)磷農(nóng)藥所致血管損傷的藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明還提供了該藥物組合物在制備防治有機(jī)磷農(nóng)藥所致血管內(nèi)皮損傷的藥物 中的應(yīng)用。本發(fā)明還提供了該藥物組合物在制備防治有機(jī)磷農(nóng)藥所致血管疾病的藥物中的 應(yīng)用。本發(fā)明提供的一種防治有機(jī)磷農(nóng)藥所致血管損傷的藥物組合物，其特征在于該藥 物組合物由枸杞多糖、黃芪多糖和白藜蘆醇組成。本發(fā)明提供的一種防治有機(jī)磷農(nóng)藥所致血管損傷的藥物組合物，由以下重量份的 藥物組成10-100份枸杞多糖、10-100份黃芪多糖和10-100份白藜蘆醇。本發(fā)明提供的一種防治有機(jī)磷農(nóng)藥所致血管損傷的藥物組合物，由以下重量份的 藥物組成10-80份枸杞多糖、10-80份黃芪多糖和10-80份白藜蘆醇。本發(fā)明提供的一種防治有機(jī)磷農(nóng)藥所致血管損傷的藥物組合物，由以下重量份的 藥物組成10-50份枸杞多糖、10-50份黃芪多糖和10-45份白藜蘆醇。本發(fā)明提供的一種防治有機(jī)磷農(nóng)藥所致血管損傷的藥物組合物，由以下重量比 的藥物組成枸杞多糖黃芪多糖白藜蘆醇為5:1:4。本法提供的防治有機(jī)磷農(nóng)藥所致血管損傷的藥物，枸杞多糖、黃芪多糖、白藜蘆醇 可以直接購買，也可以采用公知的提取方法制備。本發(fā)明還提供了一種防治有機(jī)磷農(nóng)藥所致血管損傷的藥物組合物的制劑，由該藥 物組合物與藥學(xué)上可接受的載體和稀釋劑組成。本發(fā)明還提供了一種防治有機(jī)磷農(nóng)藥所致血管損傷的藥物組合為的制劑的制備方法，將上述藥物按配比分別粉碎過篩，混合，裝入膠囊或壓制為片劑；或是與藥學(xué)上可接 受的載體混合，再裝入膠囊或壓制為片劑。本發(fā)明還提供了所述藥物組合物的服用方法為其服用量以枸杞多糖計(jì)成人， 20-30mg/次，3次/日；兒童，0. 15-0. 25mg/kg/次，3次/日，即可達(dá)到防治有機(jī)磷農(nóng)藥所致 血管內(nèi)皮損傷的效果，特別地，孕婦等特殊人群服用時(shí)需遵醫(yī)囑(目前尚未發(fā)現(xiàn)其特殊不 良反應(yīng))。名詞解釋本發(fā)明所述的“防治”意為預(yù)防和治療。經(jīng)體外試驗(yàn)研究表明，本發(fā)明提供的藥物組合物可顯著防治有機(jī)磷農(nóng)藥所致的血 管內(nèi)皮功能損傷，對有機(jī)磷農(nóng)藥所致血管損傷有預(yù)防和保護(hù)作用，可以預(yù)防血管疾病的發(fā) 生。與LBP-III、LBP-IV、黃芪多糖、白藜蘆醇相比，同劑量的本發(fā)明的復(fù)方效果好，也 證實(shí)本發(fā)明提供的枸杞多糖、黃芪多糖和白藜蘆醇具有協(xié)同效果。


圖1抗磷藥物組合對內(nèi)皮細(xì)胞形態(tài)的影響(Wright-Giemsa染色X 1000)，A組為 正常對照組；B組為溶媒對照組；C組為對氧磷對照組；D組為抗磷藥物組合1保護(hù)組；E組 為抗磷藥物組合2保護(hù)組；F組為LBP-III保護(hù)組；G組為過氧化氫保護(hù)組；H組為枸杞多糖 組分-IV保護(hù)組；I組為黃芪多糖保護(hù)組；J組為白藜蘆醇保護(hù)組。圖2抗磷藥物組合對內(nèi)皮細(xì)胞形態(tài)的影響(Hoechest33258熒光染色X 1000)，A 組為正常對照組；B組為溶媒對照組；C組為對氧磷對照組；D組為抗磷藥物組合1保護(hù)組； E組為抗磷藥物組合2保護(hù)組；F組為LBP-III保護(hù)組；G組為過氧化氫保護(hù)組；H組為枸杞 多糖組分-IV保護(hù)組；I組為黃芪多糖保護(hù)組；J組為白藜蘆醇保護(hù)組。圖3抗磷藥物組合對內(nèi)皮細(xì)胞鈣離子的影響，A組為正常對照組；B組為溶媒對照 組；C組為對氧磷對照組；D組為抗磷藥物組合1保護(hù)組；E組為抗磷藥物組合2保護(hù)組；F 組為LBP-III保護(hù)組；G組為過氧化氫保護(hù)組；H組為枸杞多糖組分-IV保護(hù)組；I組為黃芪 多糖保護(hù)組；J組為白藜蘆醇保護(hù)組。
具體實(shí)施例方式以下實(shí)施例用于說明本發(fā)明，但不應(yīng)限制本發(fā)明的范圍。實(shí)施例1 水溶劑1)按照以下重量稱取藥物100mg枸杞多糖、200mg黃芪多糖、700mg白藜蘆醇，混
合、溶于三蒸水，分裝即可。2)組方700mg枸杞多糖、300mg黃芪多糖、IOOmg白藜蘆醇，按照1)的方法制備。3)組方500mg枸杞多糖、IOOmg黃芪多糖、400mg白藜蘆醇，按照1)的方法制備成 水溶劑。實(shí)施例2 散劑1)按照以下重量稱取藥物5. Og枸杞多糖、3. Og黃芪多糖、2. Og白藜蘆醇，混合、 分裝即可。2)按照以下重量稱取藥物，3.0g枸杞多糖、3.0g黃芪多糖、4.0g白藜蘆醇，混合，分裝即可。3)按照以下重量稱取藥物，7.0g枸杞多糖、2.0g黃芪多糖、l.Og白藜蘆醇，混合， 分裝即可。4)按照以下重量稱取藥物，3.0g枸杞多糖、5.0g黃芪多糖、2.0g白藜蘆醇，混合， 分裝即可。實(shí)施例3 合劑按照以下份量稱取藥物5. Og枸杞多糖、1. Og黃芪多糖、4. Og白藜蘆醇，混合、分
裝、灌裝膠囊。實(shí)驗(yàn)例考察抗磷藥物組合對有機(jī)磷農(nóng)藥所致血管損傷的保護(hù)作用1、藥物采用實(shí)施例3的藥物，命名為抗磷藥物組合1 ；實(shí)施例1中的1)藥物，命 名為抗磷藥物組合2。2、目的探討一種本發(fā)明的中藥復(fù)方對對氧磷(PO)所致血管內(nèi)皮功能損傷的作 用及其機(jī)制。3、材料過氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、一氧化氮(NO)試劑盒購自南京建 成生物公司；混合醋酸纖維濾膜(直徑25mm、孔徑0.8 μ m)購自中國上海工業(yè)研究院；過氧 化氫(HA)、枸杞多糖組分-III (LBP-III)、枸杞多糖組分-IV(LBP-IV)、黃芪多糖、白藜蘆醇 購自長沙力康生物有限公司。4、動物與細(xì)胞雄性Sprague Dawley(SD)大鼠，體重180_220g，購自河南省實(shí)驗(yàn) 動物中心；HVUECV-304人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞株，購自長沙力康生物有限公司。5、實(shí)驗(yàn)分組及給藥共設(shè)10組正常對照組(A組)；溶對照組(B組)； PO (3. 63ymol/L)對照組(C組)；抗磷藥物組合1保護(hù)組(D組)抗磷藥物組合 l(10mg/mL)+P0(3. 63 μ mol/L)；抗磷藥物組合2保護(hù)組(E組)抗磷藥物組合2 (IOmg/ mL) +PO (3. 63ymol/L) ；LBP-111 保護(hù)組(F 組)=LBP-III (10mg/mL) +PO (3. 63 μ mol/L)； HA 保護(hù)組(G 組)=HA (200U/L) +PO (3. 63 μ mol/L) ；LBP-IV 保護(hù)組(H) =LBP-IV (IOmg/ mL)+PO(3. 63 μ mol/L)；黃芪多糖保護(hù)組(I)黃芪多糖(10mg/mL)+PO(3. 63 μ mol/L)；白藜 蘆醇保護(hù)組(J)白藜蘆醇(10mg/mL)+P0(3. 63 μ mol/L)。6、實(shí)驗(yàn)方法以大鼠離體胸主動脈血管環(huán)(EVAPVR)和培養(yǎng)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞 (HUVEC)為實(shí)驗(yàn)對象，以對氧磷為損傷藥物，以抗磷藥物組合為保護(hù)藥，檢測血管內(nèi)皮依賴 性舒張反應(yīng)(EDRR)、內(nèi)皮細(xì)胞單層通透性(ECMP)及細(xì)胞培養(yǎng)液生化指標(biāo)及細(xì)胞凋亡率。6. 1內(nèi)皮依賴性舒張功能的檢測大鼠稱重，腹腔注射3%戊巴比妥鈉(30mg/kg) 進(jìn)行麻醉，切斷雙側(cè)頸總動脈放血處死，開胸后快速取出胸主動脈置于4°C的K-H緩沖液 中，并通以95% 02+5% CO2混合氣體。分離并去除血管周圍的脂肪及結(jié)締組織，剪成3-4mm 長的血管環(huán)，將血管環(huán)移至含有K-H緩沖液(恒溫37°C，通以95% 02+5% CO2混合氣體)的 浴槽內(nèi)，環(huán)的一端用不銹鋼鉤固定于浴槽內(nèi)，另一端連張力換能器，將血管的收縮與舒張反 應(yīng)通過RM 6240B/C生物信號采集處理系統(tǒng)進(jìn)行記錄。6. 2內(nèi)皮細(xì)胞單層通透性的測定接種于濾膜的HUVEC繼續(xù)生長8d_10d，待濾膜 上形成致密的內(nèi)皮細(xì)胞單層后，即可檢測內(nèi)皮細(xì)胞單層通透性。濾膜上加入實(shí)驗(yàn)藥物，共 孵30min，然后濾膜用Hank’ s緩沖溶液沖洗2次，置于針頭式濾器內(nèi)(有效濾過面積S = 3. 14cm2)。針頭式濾器上孔接長頸儲液瓶(上腔)，下孔接量筒(下腔)。上腔中加入5g/L白蛋白液(液面距離濾膜高度維持在25cm)，蛋白液通過液體流動產(chǎn)生的牽引作用透過 濾膜進(jìn)入下腔。平衡5min后，收集5-lOmin濾出液，測量濾出液容積，計(jì)算濾出液生成速度 Jv，內(nèi)皮單層濾過系數(shù)Kf和滲透壓反射系數(shù)ο。6. 3細(xì)胞培養(yǎng)液中SOD、MDA及NO含量的測定取不同處理組的細(xì)胞培養(yǎng)液 100 μ L，按試劑盒說明分別檢測SOD活性、MDA及NO的含量。6. 4流式細(xì)胞儀檢測凋亡率將IO6個(gè)內(nèi)皮細(xì)胞與不同處理因子孵育12h后棄去培 養(yǎng)液，收集IO6個(gè)細(xì)胞，生理鹽水洗2遍，加入100%的冰乙醇固定24h，PBS洗2遍，RNA 酶37°C消化30min，50mg/L PI染色，流式細(xì)胞儀檢測，低于Gl期DNA含量主峰(亞Gl期 峰)的細(xì)胞為凋亡細(xì)胞。6. 5Right-GiemSa染色觀察內(nèi)皮細(xì)胞形態(tài)取下濾膜上的內(nèi)皮細(xì)胞單層用HBSS洗 2次，2%甲醛和戊二醛混合液固定lOmin，Wright-Giemsa常溫下染色5min后用蒸餾 水沖洗二遍，置于載玻片上用倒置顯微鏡觀察。6. 6Hoechest33258熒光染色觀察內(nèi)皮細(xì)胞形態(tài)將5 X IO5個(gè)內(nèi)皮細(xì)胞與各組藥 物共孵12h后，棄去培養(yǎng)液，收集細(xì)胞，用消化液(0. 25%胰蛋白酶和0. 02%乙二胺四乙酸 按照1 1的體積比配制)進(jìn)行消化，得到細(xì)胞懸液；滴加細(xì)胞懸液于載玻片上，制成單細(xì) 胞層；然后在4°C的溫度下，用甲醇與冰醋酸的體積比3 1的混合液固定5min;最后用 5mg/L的H0echeSt33258熒光染色5min，在紫外光激發(fā)下，用熒光顯微鏡觀察。6. 7細(xì)胞內(nèi)鈣離子測定流式細(xì)胞儀檢測(激發(fā)波長506nm，吸收波長526nm)萬個(gè) 細(xì)胞平均熒光強(qiáng)度。細(xì)胞鈣離子變化熒光強(qiáng)度 AF = F525處理組-F525對照組7、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法所有數(shù)據(jù)以均數(shù)士標(biāo)準(zhǔn)差(x ± s )表示。組間差異比較用ANOVA 及Newman-Student多重比較；t檢驗(yàn)分析，由SPSS 11. 5統(tǒng)計(jì)軟件完成，雙側(cè)P < 0. 05認(rèn) 為差異有顯著性。8、結(jié)果8. 1抗磷藥物組合對大鼠離體胸主動脈血管環(huán)舒張功能的影響結(jié)果見表1。大鼠離體胸主動脈環(huán)與PO (3.63 μ mol/L)共孵30min后，與正常組比 較，PO損傷組最大舒張百分率(Emax)顯著性降低，半數(shù)有效濃度(EC5tl)顯著性升高，抗磷藥 物組合1和抗磷藥物組合2組均明顯抑制PO所致的血管內(nèi)皮依賴性舒張反應(yīng)(EDRR)降低 (P < 0. 05)；抗磷藥物組合1保護(hù)組和抗磷藥物組合2保護(hù)組的Emax值和EC5tl存在顯著性 差異(P < 0. 05)，抗磷藥物組合2的效果較抗磷藥物組合1好。與LBP-III、LBP-IV、黃芪多糖、白藜蘆醇相比，同劑量抗磷藥物組合2保護(hù)組的 Efflax和EC5tl值存在顯著性差異，效果較LBP-III、LBP-IV、黃芪多糖、白藜蘆醇好。表1抗磷藥物組合對大鼠胸主動脈血管環(huán)Emax和EC5tl的影響([U
權(quán)利要求
1.一種防治有機(jī)磷農(nóng)藥所致血管損傷的藥物組合物，其特征在于，所述藥物由枸杞多 糖、黃芪多糖和白藜蘆醇組成。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的藥物組合物，其特征在于由以下重量份的藥物組成10_100 份枸杞多糖、10-100份黃芪多糖和10-100份白藜蘆醇。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的藥物組合物，其特征在于由以下重量份的藥物組成10-80份 枸杞多糖、10-80份黃芪多糖和10-80份白藜蘆醇。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的藥物組合物，其特征在于由以下重量份的藥物組成10-50份 枸杞多糖、10-50份黃芪多糖和10-45份白藜蘆醇。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-4任一項(xiàng)所述的藥物組合物，其特征在于由以下重量比的藥物組 成枸杞多糖黃芪多糖白藜蘆醇為5:1:4。
6.包括權(quán)利要求1-5任一項(xiàng)所述藥物組合物的制劑，其特征在于，還包括藥學(xué)上可接 受的載體或稀釋劑。
7.根據(jù)權(quán)利要求1-5任一項(xiàng)所述藥物組合物及權(quán)利要求6所述藥物組合物在制備防治 有機(jī)磷農(nóng)藥所致血管損傷的藥物中的應(yīng)用。
8.根據(jù)權(quán)利要求1-5任一項(xiàng)所述藥物組合物及權(quán)利要求6所述藥物組合物在制備防治 有機(jī)磷農(nóng)藥所致血管內(nèi)皮損傷的藥物中的應(yīng)用。
9.根據(jù)權(quán)利要求1-5任一項(xiàng)所述藥物組合物及權(quán)利要求6所述藥物組合物在制備防治 有機(jī)磷農(nóng)藥所致血管疾病的藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種防治有機(jī)磷農(nóng)藥所致血管損傷的藥物組合物，它是由枸杞多糖、黃芪多糖和白藜蘆醇組成，該復(fù)方可以預(yù)防長期接觸有機(jī)磷農(nóng)藥的人員發(fā)生各種心、腦血管疾病的可能。
文檔編號A61P9/14GK102000106SQ20101054600
公開日2011年4月6日 申請日期2010年11月12日 優(yōu)先權(quán)日2010年11月12日
發(fā)明者劉巨源, 尹雅玲, 張小毅, 李建蘭, 李生瑩, 李鵬, 海廣范, 潘國聘, 詹合琴 申請人:新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院