專(zhuān)利名稱(chēng)：組合物及制備α-(1,2)-支化的α-(1,6)葡聚寡糖的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及α-(1，2)-支化的 α-(1，6)葡聚寡糖(alpha-(1, 2)-branched alpha-(1,6)oligodextran).具體而言，本發(fā)明的實(shí)施方案涉及使用α-(1，2)_支化的 α-(1,6)葡聚寡糖來(lái)改善個(gè)體的胃腸和心血管健康的組合物及方法。
背景技術(shù)：
益生元(prebiotic)(例如寡糖)是被腸內(nèi)微生物群的微生物降解的非消化性膳食化合物。益生元的降解通常對(duì)宿主健康發(fā)揮有益效應(yīng)。這些有益健康的效應(yīng)是由對(duì)腸微生物群中向宿主提供健康益處的有限數(shù)量的微生物屬、種或株(特別是腸內(nèi)菌群的雙岐桿菌和乳酸菌)的生長(zhǎng)和/或生物活性進(jìn)行選擇性刺激引起的。已證明益生元在健康個(gè)體中增加糞便和粘膜的雙岐桿菌。寡糖廣泛用于食品，例如軟飲料、餅干、谷物制品、糖果和乳制品中。也已開(kāi)發(fā)了寡糖的其它應(yīng)用，例如防齲劑或者低甜度保濕劑。益生元的效應(yīng)主要是由選擇性地刺激腸中的雙岐桿菌(也稱(chēng)為雙歧生成性效應(yīng) (bifidogenic effect))和/或其它有益菌的生長(zhǎng)引起的。對(duì)該生長(zhǎng)的刺激使得能夠降低結(jié)腸的PH、增加短鏈脂肪酸的產(chǎn)生、預(yù)防致病微生物的增殖和粘附(屏蔽效應(yīng))、增加潛在致癌胺化化合物的代謝以及維生素B的產(chǎn)生。但是，寡糖的缺點(diǎn)是，若它們?cè)黾犹妓衔锇l(fā)酵，則它們也增加氣體形成。這意味著，主要副作用是氣脹(flatulence)、不適和胃氣脹 (bloating) 0目前，最明確定義的益生元是歸類(lèi)于膳食纖維的碳水化合物非消化性寡糖(也稱(chēng)為低聚糖)。寡糖具有低的聚合度。參與形成寡糖的糖單元多種多樣。實(shí)例包括己糖例如葡萄糖、半乳糖和果糖，以及戊糖例如木糖。寡糖可包含單一類(lèi)型的單糖(同質(zhì)寡糖) 或者混合單糖(雜寡糖)。寡糖目前是從天然聚合物例如淀粉或菊糖的降解、從天然物質(zhì)例如大豆的直接提取或者由化學(xué)合成或酶法合成制得。特定益生元對(duì)多種健康問(wèn)題的效應(yīng)仍然未知。在膳食不均衡的情況下，大部分人群表現(xiàn)出血脂肪值，特別是血液膽固醇值的含量升高。高膽固醇水平被公認(rèn)為是心血管病癥的主要風(fēng)險(xiǎn)因素。因此，急需針對(duì)顯著增高的膽固醇值(特別是LDL膽固醇)和增高的血脂肪值的治療。對(duì)此已記載了多種解決方法；但是，特定益生元寡糖對(duì)這樣的膽固醇相關(guān)的疾病或問(wèn)題的效應(yīng)仍然未知。特定益生元對(duì)明顯影響大部分人群的內(nèi)臟疼痛和肥胖(例如脂肪代謝)問(wèn)題也仍然未知。發(fā)明概述本發(fā)明提供用于改善個(gè)體健康的組合物，其包含α-(1，2)-支化的α-(1，6)葡聚寡糖。所述a-(ld)-支化的α-(1，6)葡聚寡糖具有受控的大小和受控的支化度。例如，在本發(fā)明的一實(shí)施方案中，所述α-(1，2)_支化的α-(1，6)葡聚寡糖的平均分子量為約10千道爾頓(kDa)至70kDa，并且包含約10%至50%的α-(1，2)_糖苷(alpha_(l， 2)-osidic)側(cè)鏈。本發(fā)明還提供用于改善個(gè)體健康的方法，其包括向個(gè)體給藥對(duì)所述個(gè)體的健康發(fā)揮有益效應(yīng)的有效量的包含a-(ld)-支化的α-(1，6)葡聚寡糖的組合物。所述有益效應(yīng)可包括例如改善腸健康、改善腸舒適度、降低脂質(zhì)含量、影響體重，或者預(yù)防或治療胃腸道病癥、糖尿病、肥胖或膽固醇相關(guān)的病癥。本發(fā)明還提供制備具有受控的大小和受控的支化度的葡聚寡糖(oligodextran) 的方法。例如，在本發(fā)明的一實(shí)施方案中，所述方法包括(1)提供數(shù)均分子量為 0. 5-lOOkDa的α-(1，6)葡聚寡糖；(2)將至少10%的α -(1，2)-糖苷側(cè)鏈引入所述α -(1， 6)葡聚寡糖上，由此獲得α-(1，2)_支化的α-(1，6)葡聚寡糖；和( 任選地純化所述 α-(1，2)_支化的α-(1，6)葡聚寡糖。應(yīng)理解以上概述和以下詳述均是本發(fā)明的示例而非限制。附圖簡(jiǎn)述

圖1顯示對(duì)于本發(fā)明化合物的各種實(shí)施方案，在控制pH(pH controlled) 的糞便分批培養(yǎng)發(fā)酵的Oh、10h,24h,36h和48h，對(duì)來(lái)自4位健康供體的雙岐桿菌屬(Bifidobacterium)、擬桿菌屬(Bacteroides)、乳桿菌屬(Lactobacillus)、梭菌屬(Clostridium)、奇異菌屬(Atopobium)、真細(xì)菌屬(Eubacterium)和梭菌 IX 群 (Clostridium Cluster IX)水平的平均細(xì)菌計(jì)數(shù)(LoglO個(gè)細(xì)胞/ml培養(yǎng)液)。圖2顯示在給藥本發(fā)明化合物的各種實(shí)施方案后，在控制pH的糞便分批培養(yǎng)發(fā)酵的10h,24h,36h ^P 48h，短鏈脂肪酸(SCFA)特別是乳酸(lactate)、乙酸(acetate)、丙酸 (propionate)禾口丁酸(butyrate)的測(cè)定(mM)。圖3顯示在本發(fā)明化合物的各種實(shí)施方案中，在控制pH的分批培養(yǎng)發(fā)酵中的乙酸比丙酸的比值(mM)。圖4A和4B顯示用本發(fā)明化合物的體外消化試驗(yàn)的結(jié)果。繪制表示具有受控的分子量(IkD或40kDa)和受控的支化度(％支化0^^16%或32% )的α-(1，2)_支化的 α-(1,6)葡聚寡糖的可消化性曲線(xiàn)的圖表。圖5顯示表示用本發(fā)明化合物進(jìn)行的氣體產(chǎn)生試驗(yàn)的結(jié)果的圖表。圖6Α顯示在4周給藥期間本發(fā)明化合物對(duì)大鼠體重增長(zhǎng)的效應(yīng)。圖6Β顯示依據(jù)在大鼠中的結(jié)腸直腸脹(colorectal distension)研究結(jié)果的本發(fā)明化合物的鎮(zhèn)痛性質(zhì)。圖7顯示本發(fā)明的化合物對(duì)大鼠腸微生物群的效應(yīng)。圖8A顯示在瘦和肥胖供體中本發(fā)明化合物對(duì)氣體產(chǎn)生速度的效應(yīng)。圖8B顯示在瘦和肥胖供體中菊糖(用作對(duì)照)對(duì)氣體產(chǎn)生速度的效應(yīng)。圖9A顯示在肥胖供體中給藥本發(fā)明化合物后溶組織梭菌(C. histolyticum)的水平。圖9B顯示在肥胖供體中給藥本發(fā)明化合物后普拉氏梭桿菌(F.prausnizii)的水平。圖IOA顯示葡萄糖的加入有助于獲得本發(fā)明的純?chǔ)?1，6結(jié)構(gòu)。圖IOB顯示降低蔗糖/葡萄糖的比值使得能夠控制產(chǎn)物的多分散性。
圖IOC顯示通過(guò)加入葡萄糖并調(diào)整蔗糖與葡萄糖的比值可在DP和MW的分布曲線(xiàn)方面控制期望的化合物的合成。圖11顯示在給藥本發(fā)明化合物后的接受高脂肪飲食的大鼠中的體重增長(zhǎng)。圖12顯示在給藥本發(fā)明化合物后的大鼠中的葡萄糖耐量。發(fā)明詳述本發(fā)明提供支化的葡聚寡糖化合物及包含這樣的化合物的組合物。本發(fā)明還提供用于改善個(gè)體健康(特別是用于改善胃腸健康和控制血液膽固醇水平)的方法，其包括向個(gè)體給藥對(duì)所述個(gè)體的健康發(fā)揮有益效應(yīng)的有效量的葡聚寡糖化合物。本發(fā)明還提供制備具有受控的大小和受控的支化度的葡聚寡糖的方法?！捌暇厶?dextran) ”是包含葡萄糖單元的聚合物，也稱(chēng)為多聚葡萄糖，并且包含至少50%的連續(xù)的α-1，6葡萄糖苷鍵(alpha 1,6 glucosidic bond)。各種結(jié)構(gòu)和分子量的葡聚糖已久為人所知。葡聚糖是通過(guò)在蔗糖培養(yǎng)基上培養(yǎng)乳酸菌(例如明串珠球菌屬(Leuconostoc)、乳球菌屬(Lactococcus)、鏈球菌屬(Streptococcus)、魏斯氏菌屬 (Weisella)和乳桿菌屬)制備的。參與它們的合成的酶是葡聚糖蔗糖酶(glucansucrase)， 其產(chǎn)生葡聚糖(glucan)并從蔗糖培養(yǎng)基中釋放果糖。術(shù)語(yǔ)葡聚糖、天然葡聚糖和高分子量葡聚糖在本文中同義使用。葡聚糖的平均分子量通常高于lOOOkDa。本文中使用的“葡聚寡糖“或“ α _(1，6)葡聚寡糖”指數(shù)均分子量介于常少于3個(gè)葡萄糖單元的寡聚葡糖苷(oligoglucoside)與天然葡聚糖(常高于IOOOkDa)的平均分子量之間的多聚葡萄糖。本文中使用的“α-(1，2)-支化的α_(1，6)葡聚寡糖”是指包含基本上由α-(1， 6)_鍵連接的α-D-吡喃葡萄糖基單元的基本為線(xiàn)性的骨架并具有α-(1，2)_糖苷側(cè)鏈的葡聚寡糖。該基本上由α-(1，6)_鍵連接的α-D-吡喃葡萄糖基單元的基本為線(xiàn)性的骨架在本文中常稱(chēng)為“骨架”或“受體”。應(yīng)注意，本文中使用的術(shù)語(yǔ)“葡萄糖”和“吡喃葡萄糖”被視為同義并可互換使用。 相似地，本文中使用的術(shù)語(yǔ)“葡萄糖基”和“吡喃葡萄糖基”單元被視為同義并可互換使用。本文中使用的術(shù)語(yǔ)“異麥芽糖寡糖(isomaltooligosaccharide)，，或IMOS是指包含由α-1，6葡萄糖苷鍵連接的葡萄糖單體的化合物，其可從α-淀粉酶、支鏈淀粉酶和 β-淀粉酶、α -葡糖苷酶對(duì)玉米淀粉或淀粉衍生產(chǎn)品的酶反應(yīng)商業(yè)生產(chǎn)。可商購(gòu)的產(chǎn)品包括異麥芽糖寡糖(DP為2-8，例如異麥芽糖、異麥芽三糖、異麥芽四糖、異麥芽五糖、異麥芽六糖、異麥芽七糖、異麥芽八糖)的混合物和葡萄糖的混合物，以及含有α-1，4和α_1，6 鍵二者的葡萄糖寡糖(glucooligosaccharide)(例如潘糖)的混合物?！捌骄肿恿俊笔侵竼蝹€(gè)高分子的分子量的常規(guī)算術(shù)平均值或平均值。它是通過(guò)測(cè)定η個(gè)聚合物分子的分子量，求得重量之和，并除以η來(lái)確定的。數(shù)均分子量是確定聚合物分子量的一種方式。聚合物的數(shù)均分子量可通過(guò)凝膠滲透色譜法、粘度測(cè)定法以及依數(shù)性法(例如蒸氣壓滲透壓測(cè)定法或端基滴定法)進(jìn)行測(cè)定。本文所稱(chēng)的“受控的分子量”是指可根據(jù)本發(fā)明調(diào)整或控制葡聚寡糖化合物的長(zhǎng)度乃至分子質(zhì)量或分子量?！爸Щ取笔侵腹羌苤兄С笑?(1, -位的葡萄糖單元或與之偶連的葡萄糖單元數(shù)除以該分子中所含的葡萄糖單元總數(shù)，以百分比表示。因此，支化度是指 α-(1, -位的葡萄糖單元占整個(gè)分子而不只是骨架的百分比?！笆芸氐闹Щ取笔侵缚筛鶕?jù)本發(fā)明的方法調(diào)整或控制該葡萄糖單元數(shù)。術(shù)語(yǔ)“本發(fā)明的化合物”、“支化的葡聚寡糖”和“α _(1，2)_支化的α-(1，6)葡聚寡糖”在本文中同義地使用。在一具體實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及0-(1, -支化的α-(1， 6)葡聚寡糖。在一優(yōu)選實(shí)施方案中，這樣的α-(1，2)_支化的α-(1，6)葡聚寡糖是包含基本上由α-(1，6)鍵連接的α-D-吡喃葡萄糖基單元的線(xiàn)性或基本為線(xiàn)性的骨架并且具有 α-(1，2)-糖苷側(cè)鏈(優(yōu)選一個(gè)或多個(gè)葡萄糖單元的鏈)的α _(1，2)-支化的α_(1，6)葡聚寡糖。在一優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及葡聚寡糖化合物，其中所述α-(1, -糖苷側(cè)鏈包含1、2或3個(gè)葡萄糖單元，優(yōu)選1個(gè)葡萄糖單元。在一實(shí)例中，單個(gè)葡萄糖單元與所述葡聚寡糖的骨架連接以形成支化的化合物。術(shù)語(yǔ)“ α -(1, -糖苷側(cè)鏈”在上下文中優(yōu)選地指通過(guò)α-(1, -鍵與所述線(xiàn)性骨架的葡萄糖單元連接的一個(gè)或多個(gè)葡萄糖單元的鏈。正如以下更詳細(xì)的描述，本發(fā)明的一個(gè)方面提供用于改善個(gè)體健康的組合物，其包含α-(1，2)_支化的α-(1，6)葡聚寡糖。在一實(shí)施方案中，所述葡聚寡糖是益生元化合物。本發(fā)明的葡聚寡糖優(yōu)選地包含至少10%的Ci-(Id)-糖苷側(cè)鏈以及基本為線(xiàn)性的骨架，所述骨架包含至少2個(gè)由α-(1，6)-鍵連接的α-D-吡喃葡萄糖基單元。所述基本為線(xiàn)性的骨架優(yōu)選地包含至少90%的α-(1，6)-D-吡喃葡萄糖苷鍵。所述包含α-(1，6)_鍵的骨架優(yōu)選地包含約10%至50%的α-(1，2)-糖苷側(cè)鏈和少于10%的α-(1,4)-鍵。每分子優(yōu)選地存在多于1個(gè)α-(1, -糖苷側(cè)鏈。在這些骨架上添加α-(1, -糖苷側(cè)鏈?zhǔn)蛊骄肿恿侩S支化度而增高。所述α-(1, -糖苷側(cè)鏈可隨機(jī)地分布于本發(fā)明的葡聚寡糖的整個(gè)骨架，或者它們可存在于所述骨架的某些區(qū)域，例如骨架的末端。在一優(yōu)選實(shí)施方案中，所述α-(1， 2)_糖苷側(cè)鏈隨機(jī)地分布于葡聚寡糖的整個(gè)骨架。優(yōu)選地，本發(fā)明的支化的葡聚寡糖的平均分子量介于寡聚葡糖苷的平均分子量 (通常低于IkDa)和天然葡聚糖的平均分子量(通常高于IOOOkDa)之間。例如，包含α _(1， 6)-鍵的骨架的平均分子量?jī)?yōu)選地為0. 5kDa至IOOkDa,或者IkDa至70kDa，或者IkDa至 IOkDa0在一優(yōu)選實(shí)施方案中，骨架的平均分子量為至少0.5kDa，或者至少lkDa，或者至少 IOkDa,或者至少40kDa，或者至少70kDa。由于添加α-(1-2)連接的殘基，本發(fā)明的α-(1， 2)_支化的α-(1，6)葡聚寡糖的平均分子量得以增加。因此，分子量的變化與支化度和側(cè)鏈中所含單元(例如葡萄糖單元)的總數(shù)直接相關(guān)。例如，所述骨架的平均分子量的范圍是約0.5kDa至約IOOkDa,而所述α-(1，2)_支化的α_(1，6)葡聚寡糖的平均分子量的范圍是約0. 60kDa (例如，約0. 5kDa的骨架加10%的支化度)至約170kDa (例如，約IOOkDa 的骨架加約40%的支化度)。在實(shí)施例部分提供本發(fā)明的α-(1，2)_支化的α-(1，6)葡聚寡糖化合物的其它優(yōu)選實(shí)例。在一優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明的α-(1，2)_支化的α_(1，6)葡聚寡糖具有多于一個(gè)α-(1，2)-糖苷側(cè)鏈，并且其支化度為至少10%的α-(1，2)-糖苷側(cè)鏈，例如至少15%， 或者至少20%，或者至少25%，或者至少30%，或者至少35%，或者至少40%的α-(1， 2)-糖苷側(cè)鏈。更優(yōu)選地，支化水平為約10%至40%，最優(yōu)選約15%、16%、18%、31%、 32%、33%或者 37%。在另一優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明的α-(1，2)_支化的α_(1，6)葡聚寡糖包含少于10%，優(yōu)選少于5%的α _(1，4)-鍵，更優(yōu)選地，其基本上沒(méi)有α _(1，4)_鍵。其優(yōu)點(diǎn)在于本發(fā)明的化合物所含的易水解鍵的含量低。因此，所述化合物高度不易消化，并且能夠相當(dāng)完整地到達(dá)腸的較下部，從而可最大影響局部微生物群。在又一實(shí)施方案中，所述支化的葡聚寡糖的骨架包含至少3個(gè)，例如至少4個(gè)，至少5個(gè)或者至少6個(gè)基本上由α-(1，6)-鍵連接的α-D-吡喃葡萄糖基單元。在另一實(shí)施方案中，所述骨架包含6-12個(gè)，或者6-10個(gè)α -D-吡喃葡萄糖基單元。在另一實(shí)施方案中， 所述葡聚寡糖的骨架包含100-1000個(gè)α -D-吡喃葡萄糖基單元。本發(fā)明的葡聚寡糖化合物包含基本上由α -(1，6)_鍵連接的α _D_吡喃葡萄糖基單元的線(xiàn)性或者基本為線(xiàn)性的骨架，并具有α-(1，2)_糖苷側(cè)鏈。術(shù)語(yǔ)“基本上由α-(1， 6)-鍵連接”是指所述線(xiàn)性骨架中的大多數(shù)葡萄糖單元通過(guò)α - (1，6)-鍵彼此連接。在一優(yōu)選實(shí)施方案中，所述化合物的線(xiàn)性骨架中至少90% ；至少92% ；至少95% ； 或乃至至少97%的葡萄糖單元在該線(xiàn)性骨架中通過(guò)α-(1，6)-鍵彼此連接。因此，在另一實(shí)施方案中，所述葡聚寡糖包含線(xiàn)性骨架，其含有至少90% ；至少92% ；至少95% ；或乃至至少97%的α _(1，6)_吡喃葡萄糖苷鍵。本發(fā)明還提供支化的葡聚寡糖化合物，其中所述線(xiàn)性骨架包含少于10%或者少于5%的在該線(xiàn)性骨架中彼此連接的葡萄糖單元的α-(1， 4)_ 鍵。在一優(yōu)選實(shí)施方案中，所述葡聚寡糖骨架包含至少2個(gè)基本上由a-D(l，6)-鍵連接的α -D-吡喃葡萄糖基單元，優(yōu)選3-600個(gè)α -D-吡喃葡萄糖基單元，更優(yōu)選6_10個(gè)單元。在另一實(shí)施方案中，所述線(xiàn)性骨架包含至少90%的α _(1，6)_吡喃葡萄糖苷鍵。在另一方面，本發(fā)明提供制備上述化合物的方法，所述化合物優(yōu)選地具有受控的大小和受控的支化度。本申請(qǐng)的申請(qǐng)人已發(fā)現(xiàn)具有目標(biāo)分子量和支化度的α-(1，2)_支化的α-(1，6)葡聚寡糖的合成方法。根據(jù)該方法，可制備具有多種分子量和支化度的多種葡聚寡糖化合物。具體而言，本申請(qǐng)的申請(qǐng)人已建立將α-(1, -支鏈接枝到包含葡萄糖單元的骨架上的方法。該包含葡萄糖單元的骨架優(yōu)選為線(xiàn)性或者基本為線(xiàn)性的葡聚寡糖，其平均分子量為0. 5-70kDa。因此，本發(fā)明的另一方面提供制備α-(1，2)_支化的α_(1，6)葡聚寡糖的方法， 其包括以下步驟提供具有適當(dāng)分子量的寡糖(優(yōu)選葡聚寡糖)，并將a-(lj)-糖苷側(cè)鏈引入所述葡聚寡糖上。任選地，所述方法包括純化步驟，用以除去在該制備方法中已獲得的不需要的副產(chǎn)物，例如果糖、葡萄糖、明串珠菌二糖、曲二糖和/或剩余的蔗糖。在一優(yōu)選實(shí)施方案中，上述制備具有受控的大小和受控的支化度的葡聚寡糖的方法包括以下步驟(1)提供平均分子量為0. 5-lOOkDa的a_(l，6)葡聚寡糖；( 將至少 10%的0-(1，2)_糖苷側(cè)鏈引入步驟(1)中所得的a-(l，6)葡聚寡糖上，由此獲得α _(1， 2)_支化的a-(l，6)葡聚寡糖；和(3)任選地純化所述a-(l，2)_支化的a-(l，6)葡聚寡糖以除去在該方法中已得到的不需要的副產(chǎn)物。在一優(yōu)選實(shí)施方案中，步驟(1)包括(Ia)使含有葡萄糖的原料進(jìn)行酶法轉(zhuǎn)葡萄糖基化(transglucosylation)反應(yīng)，由此獲得異麥芽糖寡糖(IMOS)；和(Ib)使所述IMOS 與葡聚糖蔗糖酶在蔗糖的存在下反應(yīng)，由此獲得a-(l，6)葡聚寡糖。在一實(shí)施方案中， (Ia)和(Ib)在單一步驟中進(jìn)行。所述含有葡萄糖的原料可包括例如葡聚糖、淀粉、葡萄糖漿、葡萄糖或者麥芽糖漿。
通常，IMOS是通過(guò)以麥芽糖漿為底物的轉(zhuǎn)葡萄糖基化酶法制得。所述麥芽糖漿可使用α-淀粉酶、支鏈淀粉酶、β-淀粉酶和/或α-葡糖苷酶作為催化劑進(jìn)行制備。因此， 根據(jù)本發(fā)明，通過(guò)轉(zhuǎn)葡萄糖基化獲得的IMOS可在沒(méi)有任何純化處理的情況下直接使用。另一方面，其它α-(1-6)葡聚寡糖通常是通過(guò)部分水解和分級(jí)分離高分子量葡聚糖而從蔗糖底物制得。在支化前，必須純化這些產(chǎn)物以消除果糖殘余物。步驟(1)中提供的葡聚寡糖優(yōu)選地具有線(xiàn)性或者基本為線(xiàn)性的骨架。更優(yōu)選地， 所述葡聚寡糖具有糖苷骨架，所述糖苷骨架包含至少90%的a-(l，6)-D-吡喃葡萄糖苷鍵，更優(yōu)選包含至少92 %、95 %或者97 %的α - (1，6) -D-吡喃葡萄糖苷鍵。在另一實(shí)施方案中，步驟(1)中提供的葡聚寡糖的分子量為0.5-100kDa;例如 l-70kDa或者l-40kDa。在又一實(shí)施方案中，步驟(1)中提供的葡聚寡糖的平均分子量為 0. 5-lOkDa。在又一實(shí)施方案中，步驟(1)中提供的葡聚寡糖的平均分子量為至少0. 5kDa或者至少I(mǎi)kDa或者至少70kD。步驟( 中提供的葡聚寡糖的平均分子量因添加α-(1-2)連接的殘基而增高。因此，分子量的變化與支化度和該側(cè)鏈中所含單元(例如葡萄糖單元)的總數(shù)直接相關(guān)。例如，步驟(1)中制得的骨架的平均分子量范圍是約0.5kDa至約IOOkDa, α-(1,2) α-(1,6)葡聚寡糖的平均分子量范圍是約0. 60kDa至約170kDa。步驟(1)中提供的葡聚寡糖可從不同的原料制備。在一實(shí)施方案中，步驟(1)中提供的葡聚寡糖可從葡聚糖獲得。所使用的葡聚糖可以是任意適合的葡聚糖(天然的、合成的或者部分水解的葡聚糖)。在一實(shí)施例中，高分子量天然葡聚糖(即分子量大于105kDa 的葡聚糖)可用來(lái)提供具有選定分子量的葡聚寡糖。高分子量葡聚糖可從微生物如明串珠球菌屬獲得。此方法是本領(lǐng)域公知的?；旧?，它包括水解高分子量天然葡聚糖以提供不同分子量的葡聚寡糖。將經(jīng)水解的組合物分級(jí)分離以提供具有不同分子量的葡聚寡糖流分， 并且純化這些流分。通過(guò)此方法獲得的葡聚寡糖是公知的，并且可商購(gòu)獲得。在又一實(shí)施方案中，淀粉可用作原料來(lái)制備葡聚寡糖。淀粉是廉價(jià)易得的原料?？赡?00%可轉(zhuǎn)化成水解產(chǎn)物，例如麥芽糖漿。在又一實(shí)施方案中，麥芽糖漿可用作原料來(lái)制備葡聚寡糖。在另一實(shí)施方案中，用于步驟O)中的步驟(1)中提供的α-(1，6)葡聚寡糖可通過(guò)能夠提供葡聚糖蔗糖酶的微生物進(jìn)行制備。葡聚糖蔗糖酶對(duì)蔗糖底物的作用提供一般分子量高于105kDa的聚合物。在又一實(shí)施方案中，用于步驟(2)中的步驟(1)中提供的葡聚寡糖可通過(guò)直接提供具有期望分子量的葡聚寡糖的合成方法獲得。例如，這可利用可產(chǎn)生修飾葡聚糖蔗糖酶的修飾微生物如明串珠球菌屬得以實(shí)現(xiàn)。適合的葡聚糖蔗糖酶可包括按照 W02007/091178(其援引加入本文)中所述獲得的葡聚糖蔗糖酶DSR-S的變異體。這些葡聚糖蔗糖酶突變體以一步法從蔗糖合成受控大小的葡聚糖。參照上述方法，含有葡萄糖的原料可用于上述方法的步驟(Ia)中，所述原料可包括淀粉或者其它材料(如葡聚糖或麥芽糖漿)。在一優(yōu)選實(shí)施方案中，淀粉用作上述方法的步驟(Ia)中的原料。至多100%的淀粉可被轉(zhuǎn)化成水解產(chǎn)物，例如麥芽糖或者麥芽糖漿。 由轉(zhuǎn)葡糖苷酶催化的轉(zhuǎn)葡萄糖基化反應(yīng)將麥芽糖轉(zhuǎn)化成聚合度(DP)主要為2-5的異麥芽糖寡糖(IMOS)，例如異麥芽糖、潘糖、異葡糖基麥芽糖(isopanose)和異麥芽三糖。在以上方法中，所述IMOS可與蔗糖和葡聚糖蔗糖酶一起用作受體。這致使IMOS延長(zhǎng)。所述IMOS的骨架由葡萄糖單元延長(zhǎng)并形成葡聚寡糖。用于此步驟中的葡聚糖蔗糖酶優(yōu)先催化α-(1，6)_鍵的形成?？捎糜诒景l(fā)明的步驟(Ib)中的葡聚糖蔗糖酶是本領(lǐng)域已知的，并且未在本文中詳細(xì)公開(kāi)。適合的實(shí)例是例如從腸膜狀明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides)B512F、腸膜狀明串珠菌B1299和/或腸膜狀明串珠菌B742獲得的葡聚糖蔗糖酶。在本發(fā)明方法的一具體實(shí)施方案中，當(dāng)麥芽糖漿用作原料時(shí)，其優(yōu)選地進(jìn)行本文所述方法的步驟(Ia)和(Ib)。在另一實(shí)施方案中，步驟(1)包括使蔗糖與葡聚糖蔗糖酶反應(yīng)，由此獲得α-(1， 6)葡聚寡糖。在一優(yōu)選實(shí)施方案中，步驟(1)包括使蔗糖與葡聚糖蔗糖酶在葡萄糖的存在下反應(yīng)，由此獲得α-(1，6)葡聚寡糖。本申請(qǐng)的申請(qǐng)人已發(fā)現(xiàn)這使得能夠直接合成具有受控的分子量(即集中于特定的麗值)的期望的骨架。本申請(qǐng)的申請(qǐng)人已發(fā)現(xiàn)，可通過(guò)在反應(yīng)介質(zhì)中向蔗糖中加入大量的葡萄糖來(lái)制備具有受控的大小的骨架。因此，蔗糖是供體，而葡萄糖起受體的作用(此反應(yīng)被稱(chēng)為“由受體進(jìn)行的合成(synthesis by acc印tor) ”反應(yīng))。加入葡萄糖受體使所述結(jié)構(gòu)中α-1，6_鍵的含量增高，產(chǎn)生更純的IMOS型產(chǎn)物，即加入葡萄糖有助于獲得純的α -1，6結(jié)構(gòu)(參見(jiàn)圖10Α)。在另一優(yōu)選實(shí)施方案中，步驟(1)還包括調(diào)整蔗糖與葡萄糖的比值，由此調(diào)整所述α -(1，6)葡聚寡糖的DP特征。降低供體/受體的比值使得能夠控制產(chǎn)物的多分散性； 例如，在供體與受體的比值為10時(shí)，聚合度遠(yuǎn)遠(yuǎn)更高，而通過(guò)將該比值降至6然后降至2，則限制了高聚合度化合物的合成(參見(jiàn)圖10Β)。通過(guò)加入葡萄糖并調(diào)整供體與受體的比值， 可在DP和漏的分布曲線(xiàn)方面控制期望的化合物的合成(參見(jiàn)圖10C)。在步驟O)中，將額外的葡萄糖單元連接到寡糖或者葡聚寡糖骨架上。它們被連接到骨架中在α-(1，2)_位的葡萄糖單元上，從而形成α-(1，2)_支鏈。所得化合物是 α-(1, -支化的α-(1，6)葡聚寡糖。所述支鏈通常隨機(jī)地分布于整個(gè)骨架。在一優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法包括其中將至少15^^20^^25^^30^^35% 或40%的α _(1，2)_糖苷側(cè)鏈引入或者接枝到所述葡聚寡糖骨架上的步驟。此步驟有利地使該制備方法能夠產(chǎn)生具有受控的可消化性和可發(fā)酵性的化合物。在一優(yōu)選實(shí)施方案中，步驟( 包括在蔗糖的存在下用適合的葡聚糖蔗糖酶將 Ci-(Id)-糖苷側(cè)鏈(優(yōu)選一個(gè)或多個(gè)吡喃葡萄糖基(葡萄糖)單元的側(cè)鏈)引入α-(1， 6)葡聚寡糖上，由此獲得α - (1，2)-支化的α - (1，6)葡聚寡糖。在此實(shí)施方案中，步驟(2) 包括使α-(1，6)葡聚寡糖與葡聚糖蔗糖酶(優(yōu)選轉(zhuǎn)葡糖苷酶GBD-CM)在蔗糖的存在下反應(yīng)?？捎糜诒景l(fā)明的步驟O)中的葡聚糖蔗糖酶是本領(lǐng)域已知的，并且未在本文中詳細(xì)公開(kāi)。在一實(shí)例中，適合的葡聚糖蔗糖酶是由天然腸膜狀明串珠菌(L. mesenteroides) NRRL B-1299菌株產(chǎn)生的葡聚糖蔗糖酶DSR-E。在另一實(shí)例中，用于步驟(2)中的適合的葡聚糖蔗糖酶在WO 02/074943、FR 2822162和FR觀(guān)22163 (其援引加入本文)中有述，并且優(yōu)選地包括葡聚糖蔗糖酶DSR-E和/或GBD-⑶2。通常，由B-1299菌株或GBD-⑶2產(chǎn)生的葡聚糖蔗糖酶可生成α-(1, -鍵。本申請(qǐng)的申請(qǐng)人發(fā)現(xiàn)，葡聚糖蔗糖酶對(duì)具有一個(gè)α-(1，6)_葡萄糖單元或者 α _(1，6)_葡萄糖單元重復(fù)序列的結(jié)構(gòu)的親和性高于對(duì)麥芽糖的親和性。因此，在步驟(2)中使用IMOS替代麥芽糖的反應(yīng)在時(shí)間和收率方面有所改善。在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供其中可通過(guò)調(diào)整受體/蔗糖的比值，特別是步驟 (2)中使用的IMOS與蔗糖的比值來(lái)控制所述化合物的支化度，優(yōu)選至少10 %至40 %的支化度的方法。因此，在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及其中調(diào)整步驟O)中使用的IMOS與蔗糖的比值的方法。在一實(shí)例中，使用轉(zhuǎn)葡糖苷酶GBD-⑶2實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的α-(1，2)_支化的α-(1，6) 葡聚寡糖化合物的合成。通過(guò)使用該酶可獲得受控量的a-(lj)-支化。GBD-CD2是由 DSR-E (由腸膜狀明串珠菌NRRL B-1299天然產(chǎn)生的葡聚糖蔗糖酶)改造(engineer)而得的a-(ld)轉(zhuǎn)葡糖苷酶。該酶催化糖苷基部分從蔗糖a-(lj)-轉(zhuǎn)葡萄糖基化到a-1， 6-葡聚糖鏈上。水解和轉(zhuǎn)葡萄糖基化可在作為受體的蔗糖和葡聚寡糖的存在下在該方法的早期進(jìn)行，其中步驟(1)中所得的葡聚寡糖可具有選定的分子量。本申請(qǐng)的申請(qǐng)人發(fā)現(xiàn)，合成的a-(1, 支鏈的量或者支化度取決于步驟O)中使用的蔗糖與a-(l，6)葡聚寡糖的比值?？赏ㄟ^(guò)調(diào)整步驟( 中使用的蔗糖與葡聚寡糖的比值獲得具有受控的分子量和受控的支化度的a-(l，2)_支化的a-(l，6)葡聚寡糖。在一實(shí)例中，支化度可為13%至40% 不等。如下文實(shí)施例中所述，在一優(yōu)選實(shí)施方案中，蔗糖與a-(l，6)葡聚寡糖的摩爾比為約0. 10-5. 00，并且a-(1，2)-鍵的百分比(即支化度)為約10%至50% ；更優(yōu)選地，蔗糖與a-(l，6)葡聚寡糖的摩爾比為約0.90-1. 00，并且α-(1，2)_鍵的百分比(即支化度) 為約30%至40%。可有利地在步驟(1)中使用可直接合成具有期望分子量的葡聚寡糖的酶，然后在步驟(2)中使用可將期望量的α-(1，2)支鏈引入線(xiàn)性骨架中的酶，從而得到針對(duì)具體需要 (例如針對(duì)具體性能或用途)而特制的a-(lj)-支化的a-(l，6)葡聚寡糖化合物庫(kù)。在一實(shí)例中，從包括以下步驟的方法獲得α-(1，2)_支化的a_(l，6)葡聚寡糖 步驟(1)，使用W02007/091178(其援引加入本文)中所述的葡聚糖蔗糖酶DSR-S的變異體； 然后步驟O)，使用WO 02/074943(其援引加入本文)中所述的酶GBD-CD2。任選地，本發(fā)明的方法還包括純化步驟以除去不需要的副產(chǎn)物。所述任選的純化步驟可包括通過(guò)過(guò)濾純化a-(1，2)-支化的a-(l，6)葡聚寡糖，其中純化的葡聚寡糖的平均分子量為約0. 5-lOOkDa。從反應(yīng)介質(zhì)中除去果糖可基于本領(lǐng)域技術(shù)的現(xiàn)有狀態(tài)。例如， 超濾可用來(lái)分離集中于70kDa的化合物，而在用于分離的任意類(lèi)型的樹(shù)脂上通過(guò)色譜法富集可用來(lái)分離0. 5kDa和/或IkDa和/或IOkDa的a-(1，2)-支化的a-(l，6)葡聚寡糖。 可使用離子交換樹(shù)脂，例如其中鈣和/或鉀作為可交換反離子的陽(yáng)離子型樹(shù)脂。在另一方面，本發(fā)明提供組合物，其包含本文所述的支化的葡聚寡糖化合物。利用上述方法，可控制支化的葡聚寡糖的a-(lj)-鍵的量和分子量二者。這有利于制備適合的a-(l，2)_支化的a-(l，6)葡聚寡糖?？衫帽疚乃龅姆椒ê铣纱笈?(1，2)_支化的α-(1，6)葡聚寡糖化合物，為新的組合物提供途徑。正如下文中更詳細(xì)的描述，本發(fā)明的另一方面提供用于改善個(gè)體健康的方法， 其包括向個(gè)體給藥對(duì)所述個(gè)體的健康發(fā)揮有益效應(yīng)的有效量的包含α-(1，2)_支化的 α-(1,6)葡聚寡糖的組合物。在一實(shí)施方案中，所述葡聚寡糖是益生元化合物，其對(duì)所述個(gè)體的腸微生物群提供有益效應(yīng)。本發(fā)明的葡聚寡糖的有益效應(yīng)可包括例如改善腸健康、 提供鎮(zhèn)痛效應(yīng)(例如改善腸舒適度)、降低脂質(zhì)含量(即脂肪量)、影響體重(例如體重增長(zhǎng))或者預(yù)防或治療胃腸道病癥、糖尿病或它們的癥狀。這樣的有益效應(yīng)的實(shí)例包括增加短鏈脂肪酸的產(chǎn)生、降低胃腸道中的氣體形成、 刺激腸有益菌(例如雙岐桿菌)的生長(zhǎng)或活性、緩解腸疼痛，及其組合。本發(fā)明的葡聚寡糖的另一有益效應(yīng)可包括例如預(yù)防或治療膽固醇相關(guān)的病癥或其癥狀。這樣的有益效應(yīng)的實(shí)例包括增加丙酸的產(chǎn)生、降低血液甘油三酯水平、降低低密度脂蛋白水平，及其組合。在本發(fā)明的一個(gè)方面，所述組合物還包含益生菌，例如乳桿菌屬、雙岐桿菌屬、腸球菌屬(Enterococcus)、埃希氏桿菌屬Escherichia)、鏈球菌屬、酵母菌屬 (Saccharomyces)，及其組合。在本發(fā)明的另一發(fā)明，所述組合物還包含膳食纖維，例如抗性麥芽糖糊精、纖維糊精、聚葡萄糖、菊糖、IM0S、線(xiàn)性和支化葡聚糖、支鏈淀粉、半纖維素，及其組合。本文限定的支化的葡聚寡糖化合物可配制成適合的組合物。術(shù)語(yǔ)“組合物”在上下文中可包括例如營(yíng)養(yǎng)組合物或者食品組合物，例如食品、食品補(bǔ)充劑或者功能性食品。其還可包括藥用組合物。本文中使用的術(shù)語(yǔ)“食品”意圖涵蓋供人類(lèi)攝取和供動(dòng)物攝取的食物。“功能性食品f指除了供給營(yíng)養(yǎng)素的基本營(yíng)養(yǎng)功能之外還聲稱(chēng)具有促進(jìn)健康和/或預(yù)防疾病和/或減輕疾病的性質(zhì)的任意新鮮食品或加工食品。功能性食品可包括例如加工食品或者用促進(jìn)健康的添加劑強(qiáng)化的食品。功能性食品的實(shí)例是用維生素強(qiáng)化的食品或者用活培養(yǎng)物發(fā)酵的食品。本發(fā)明的組合物還包含本領(lǐng)域中已知的包含于營(yíng)養(yǎng)組合物中的其它物質(zhì)，例如水或其它水溶液、脂肪、糖類(lèi)、淀粉、粘合劑、增稠劑、著色劑、矯味劑、芳香劑、酸化劑(例如乳酸或者蘋(píng)果酸等)、穩(wěn)定劑或者高強(qiáng)度甜味劑或者礦物質(zhì)等。適合的食品的實(shí)例包括面包、 早餐用谷物制品、餅干、蛋糕、甜餅、薄脆餅干(cracker)、酸乳(yogurt)、酸奶(kefir)、味噌、納豆、印尼豆豉、朝鮮泡菜、德國(guó)泡菜、水、乳、果汁、蔬菜汁、碳酸軟飲料、非碳酸軟飲料、 咖啡、茶、啤酒、葡萄酒、烈性酒、酒精飲料、點(diǎn)心、湯、速凍甜點(diǎn)、油炸食品、披薩、面食品、馬鈴薯制品、大米制品、玉米制品、小麥制品、乳制品、硬糖、營(yíng)養(yǎng)棒、谷類(lèi)食物、生面團(tuán)、加工的肉食和乳酪、酸乳酪(yoghurt)、冰淇淋甜食、乳飲料、色拉調(diào)料、調(diào)味汁、糕點(diǎn)裝飾配料、甜點(diǎn)、糖果制品、基于谷物的點(diǎn)心棒、事先準(zhǔn)備好的餐品(pr印ared dish)等。本發(fā)明的組合物還可包含期望的其它膳食纖維。例如，組合物可包含其它多糖，例如不溶性纖維和可溶性纖維?！吧攀忱w維”通常指植物食品的基本上不消化的部分，其使食物通過(guò)消化系統(tǒng)移動(dòng)，并吸收水和通便，膳食纖維包括合成而得的纖維以及源自植物或天然來(lái)源的那些纖維。根據(jù)一些定義，“膳食纖維”是指具有10個(gè)或更多個(gè)單體單元的碳水化合物聚合物(或者在一些情況中具有3-9個(gè)單體單元的碳水化合物)，其不被人小腸中的內(nèi)源酶水解，并且屬于以下類(lèi)別(1)攝取的食物中天然存在的可食用的碳水化合物聚合物，或者通過(guò)物理、酶或化學(xué)手段從原食材已得到的以及已證明具有經(jīng)公認(rèn)的科學(xué)證據(jù)證實(shí)的健康裨益的碳水化合物聚合物，和/或O)已證明具有經(jīng)公認(rèn)的科學(xué)證據(jù)證實(shí)的健康裨益的合成碳水化合物聚合物。膳食纖維可包括非淀粉類(lèi)多糖例如纖維素，以及許多其它植物組分例如糊精、 菊糖、木素、甲殼質(zhì)、果膠、葡聚糖、寡聚果糖、抗性淀粉、可溶性玉米(葡萄糖)纖維 (soluble corn (gluco) fiber)、聚葡萄糖，以及樹(shù)膠例如瓜耳膠、槐豆膠、黃原膠或者支鏈淀粉膠。已知一些膳食纖維對(duì)膽固醇和葡萄糖水平具有有益效應(yīng)。適合的可溶性和不溶性纖維來(lái)源可商購(gòu)獲得。適合的纖維的實(shí)例是菊糖或其水解產(chǎn)物。所述菊糖可以以天然提取物的形式提供，其適合于人類(lèi)攝取。適合的菊糖提取物可從Orafti NV Belgium以商標(biāo)“Raftiline” 獲得。例如，所述菊糖可以以Raftiline ST的形式提供，其是包含約90重量％至約94重量％的菊糖、至多約4重量％的葡萄糖和果糖，以及約4重量％至9重量％的蔗糖的白色細(xì)粉。所述菊糖的平均聚合度為約10至約12。菊糖的水解產(chǎn)物是果糖低聚物形式的寡聚果糖，其包含I-蔗果三糖(GM)、真菌四糖(GF!3)和IF-呋喃果糖基真菌四糖(GF4)，其中果糖基單元(F)分別通過(guò)β _(2，1)-鍵與蔗糖(GF)連接。所述寡聚果糖可從例如Orafti NV, Belgium以商標(biāo)“Raftilose”商購(gòu)獲得。在一優(yōu)選實(shí)施方案中，菊糖提取物從knsus獲得。 優(yōu)選的knsus產(chǎn)品包括Frutafit⑧HD和Frutafit TEX ！。Frutafit⑧HD是較短鏈的菊糖(約8-13個(gè)單體單元)，F(xiàn)rutafit TEX ！是較長(zhǎng)鏈的菊糖(> 22個(gè)單體)。在實(shí)施例和附圖中，它們通常由菊糖(即短鏈)或者菊糖TEX(即長(zhǎng)鏈)表示。在一優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明的組合物可包含至少兩種纖維源。在一更優(yōu)選的實(shí)施方案中，一種纖維源是本發(fā)明的α-(1，2)_支化的α _(1，6)_葡聚糖，而第二纖維源是選自抗性麥芽糖糊精、聚葡萄糖、可溶性玉米(葡萄糖)纖維、纖維糊精、支鏈淀粉、抗性淀粉、 菊糖、寡聚果糖、寡聚半乳糖、半纖維素和果糖低聚物漿或者乳果糖或者任意其它益生元化合物(包括益生元二糖例如乳果糖和塔格糖等)的寡糖或多糖。含有Ci-(Id)-支化的 α-(1,6)葡聚寡糖的纖維源的該組合的結(jié)果是益生元被供給至個(gè)體的胃腸道的較大部分， 從而所述益生元不僅在小腸的第一部分中發(fā)酵，而且在結(jié)腸的整個(gè)長(zhǎng)度中發(fā)酵。通過(guò)改變不同化合物的比值，可能可靶向從結(jié)腸的近端、中部至遠(yuǎn)端的發(fā)酵部位。因此，對(duì)所述個(gè)體遍及整個(gè)結(jié)腸長(zhǎng)度的腸微生物群生態(tài)發(fā)揮有益效應(yīng)。若使用可溶性纖維和不溶性纖維二者，則可溶性纖維與不溶性纖維的重量比優(yōu)選為約1 4至約4 1;更優(yōu)選約1 1至約 2 I0當(dāng)所述營(yíng)養(yǎng)組合物是食品或營(yíng)養(yǎng)配方(nutritional formula)的形式時(shí)，所述營(yíng)養(yǎng)組合物可包含蛋白質(zhì)源、脂質(zhì)源和/或碳水化合物源。這些來(lái)源可視需要進(jìn)行選擇，并且是本領(lǐng)域公知的。本發(fā)明的組合物也可包含維生素和礦物質(zhì)或者高強(qiáng)度/高效甜味劑。例如，可提供足夠的維生素和礦物質(zhì)，以使每1000卡的所述營(yíng)養(yǎng)組合物供給推薦的維生素和礦物質(zhì)每日規(guī)定量的約25%至約250%。本文所述的化合物和組合物可用作益生元，或者當(dāng)與下述益生菌組合使用時(shí)用作 “合生劑(synbiotics) ”?！耙嫔笔侵竿ㄟ^(guò)選擇性地刺激胃腸道特別是結(jié)腸中的有限數(shù)量的細(xì)菌的生長(zhǎng)和/或活性來(lái)有益地影響個(gè)體，由此改善宿主健康的食品成分。益生元的實(shí)例包括寡聚果糖、菊糖、聚葡萄糖、抗性淀粉、可溶性玉米(葡萄糖)纖維、寡聚葡萄糖和寡聚半乳糖、阿拉伯糖基木糖寡糖(arabinoxylan-oligosaccharide)以及乳果糖。在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明的組合物還包含益生菌?！耙嫔?probiotic organism)”是指活微生物膳食補(bǔ)充劑，其通過(guò)它們?cè)谙乐械墓δ転閭€(gè)體提供有益效應(yīng)。為了發(fā)揮效應(yīng)，所述益生微生物必須能夠在消化條件下存活，并且它們必須能夠在絕不損及所述個(gè)體的情況下至少暫時(shí)地在胃腸道中形成集落。僅有某些微生物菌株具有這些性質(zhì)。優(yōu)選地，所述益生菌選自乳桿菌屬、雙歧桿菌屬、芽孢桿菌屬(Bacillus spp.)、腸球菌屬、埃希氏桿菌屬、鏈球菌屬和酵母菌屬。具體的微生物包括但不限于枯草桿菌(Bacillus subtilis)、蠟狀芽孢桿菌(Bacillus cereus)、兩歧雙歧桿菌(Bifidobacterium bificum)、短雙歧桿菌(Bifidobacterium breve)、嬰兒雙岐桿菌(Bifidobacterium infantis)、IL雙歧桿菌(Bifidobacterium lactis)、長(zhǎng)雙歧桿菌(Bifidobacterium longum)、B譽(yù)熱雙歧桿菌(Bifidobacterium thermophilum)、尿腸 求菌(Enterococcus faecium) > 1 ! |ii> ^lif (Lactobacillus acidophilus) > 保力口利亞乳桿菌(Lactobacillus bulgaricus)、干酷乳桿菌(Lactobacillus casei)、 乳酸乳桿菌(Lactobacillus lactis)、植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum)、羅伊季L Iflif (Lactobacillus reuteri)、羅氏季L If 菌(Lactobacillus rhamnosus) > M 球菌(Streptococcus faecium)、雙乙酰乳酸鏈球菌(diacetilactus)、變異鏈球菌 (Streptococcus mutans)、嗜熱鏈球菌(Streptococcus thermophilus)、鮑氏酵母菌 (Saccharomyces boulardii. )、Torulopsia、米曲霉菌(Aspergillus oryzae)禾口鏈霉菌 (Streptomyces)等，包括它們的營(yíng)養(yǎng)性孢子、非營(yíng)養(yǎng)性孢子(芽孢桿菌屬)及合成衍生物。 根據(jù)本發(fā)明，更優(yōu)選的益生微生物包括但不限于以下三種細(xì)菌屬的成員乳桿菌屬、雙岐桿菌屬和酵母菌屬。在一優(yōu)選實(shí)施方案中，所述益生菌是雙岐桿菌屬。所述益生菌可以以其在水或另一種液體或半固體介質(zhì)中的培養(yǎng)物的形式摻入到所述組合物中，在所述培養(yǎng)物中所述益生菌仍然有活力。在另一種技術(shù)中，可將包含所述益生菌的凍干粉通過(guò)混合或摻和摻入顆粒材料或者液體或半固體材料中。在一優(yōu)選實(shí)施方案中，所述組合物所含的益生菌的量為至少1000個(gè)細(xì)胞/10g，優(yōu)選10，000個(gè)細(xì)胞/10g，更優(yōu)選100，000個(gè)細(xì)胞/10g，最優(yōu)選1，000, 000個(gè)細(xì)胞/10g。應(yīng)理解任何提及的益生菌細(xì)胞計(jì)數(shù)是指活細(xì)胞數(shù)。兩種或更多種益生菌可用于組合物中。本發(fā)明的葡聚寡糖和包含它們的組合物具有緩慢的可發(fā)酵性。這導(dǎo)致產(chǎn)生氣體的量低而且平緩，由此減輕與其相關(guān)的癥狀。菊糖快速且大量地促進(jìn)氣體生成，而與菊糖相比，本發(fā)明的葡聚寡糖較低量地逐漸釋放氣體。參見(jiàn)例如實(shí)施例10和圖8A及8B?？焖俜?(rapid peak)造成胃腸不適例如氣脹和胃氣脹，而若是逐漸且低量地產(chǎn)生氣體，則身體可更容易地應(yīng)對(duì)。依據(jù)體外消化數(shù)據(jù)(參見(jiàn)例如實(shí)施例4、圖4A和4B以及實(shí)施例12)，本發(fā)明的葡聚寡糖因α-(1, 支化而至少部分地不可消化。相信支化水平越高，則化合物的抗消化性越好，并且分子越大，則可消化性越低。支化避免被人類(lèi)酶消化，并且分子越大，則在結(jié)腸中的發(fā)酵速度(即可被細(xì)菌消化的速度)越低。不可消化性是纖維的重要特征。本發(fā)明的葡聚寡糖可依據(jù)此特征歸類(lèi)為纖維。使用本發(fā)明的化合物使得能夠產(chǎn)生短鏈脂肪酸，特別是丙酸。已知丙酸降低膽固醇。因此，本發(fā)明的化合物可降低罹患高膽固醇的風(fēng)險(xiǎn)。出人意料的是，在發(fā)酵研究中，低于IOOkD的葡聚寡糖的緩慢可發(fā)酵性刺激短鏈脂肪酸特別是丙酸的產(chǎn)生。由于丙酸的產(chǎn)生或者丙酸與乙酸的比值增高有益于控制有此需要的哺乳動(dòng)物中的膽固醇水平，故此本發(fā)明對(duì)營(yíng)養(yǎng)學(xué)家和消費(fèi)者而言具有特別意義用以預(yù)防和/或治療心血管病癥風(fēng)險(xiǎn)。故此，本發(fā)明的另一方面提供用于改善個(gè)體健康(例如用于治療膽固醇相關(guān)的疾病)的方法，其包括向個(gè)體給藥對(duì)所述個(gè)體的健康發(fā)揮有益效應(yīng)的有效量的包含a-(ld)-支化的α-(1，6) 葡聚寡糖的組合物。此外，公知短鏈脂肪酸降低腸內(nèi)的PH并且這有助于鈣吸收。故此，本發(fā)明的化合物還可影響礦物質(zhì)吸收。這意味著它們還可通過(guò)因腸中SCFA增加而降低pH，從而改善骨健康，或者預(yù)防或治療骨質(zhì)疏松?！皞€(gè)體”通常是人類(lèi)，但是本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)理解，所述個(gè)體可以是非人類(lèi)的動(dòng)物。 故此，其它個(gè)體可包括哺乳動(dòng)物，例如嚙齒類(lèi)動(dòng)物(包括小鼠、大鼠、倉(cāng)鼠和豚鼠)、貓、狗、 兔、牛、馬、山羊、綿羊、豬和靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物(包括猴、黑猩猩、猩猩和大猩猩)。本文中使用的術(shù)語(yǔ)“膽固醇相關(guān)的疾病”包括但不限于涉及血漿中膽固醇(特別是非高密度脂質(zhì)(非HDL)膽固醇)的水平升高的病癥，例如LDL膽固醇水平升高和HDL/LDL 比值升高、高膽固醇血癥以及高甘油三酯血癥等。在患有高膽固醇血癥的患者中，降低LDL 膽固醇是治療的首要目標(biāo)之一。在患有高甘油三酯血癥的患者中，降低高血清甘油三酯濃度是治療的首要目標(biāo)之一。具體而言，本文定義的膽固醇相關(guān)的疾病的治療包括通過(guò)給藥本發(fā)明的α-(1，2)_支化的α _(1，6)_葡聚糖或者包含本發(fā)明的α-(1，2)_支化的α_(1， 6)-葡聚糖的組合物來(lái)控制血液膽固醇水平、血液甘油三酯水平、血液脂蛋白水平、血糖和胰島素敏感度。“有效量”的本文所述的化合物或組合物是指在劑量下且經(jīng)所需時(shí)間有效實(shí)現(xiàn)期望的治療結(jié)果(例如降低血液膽固醇或者預(yù)防或治療胃腸道病癥)的量。例如，向個(gè)體給藥的組合物的量會(huì)取決于諸如個(gè)體的健康狀況、個(gè)體的體重、個(gè)體的年齡以及組合物是否是唯一營(yíng)養(yǎng)源等因素而變化。醫(yī)師或營(yíng)養(yǎng)師可容易地確定有效量。通常，給藥足量的所述組合物以向所述個(gè)體提供每天至多約40g的(不溶性和可溶性)膳食纖維；例如，約25g至約35g膳食纖維/天。所述個(gè)體接受的a-(lj)-支化的α _(1，6)_葡聚糖的量?jī)?yōu)選為約 0. Ig至約15g/天，或者至多約40g/天。本文限定的化合物或組合物可以多劑量攝取(例如分散在整天中的2-5次攝取或者急性(acutely)攝取)，或者可以單劑量攝取。本文限定的化合物或組合物還可在期望的時(shí)期內(nèi)持續(xù)攝取。在某些實(shí)施方案中，所述期望的時(shí)期為至少1周，或者至少2周，或者至少3周，或者至少1個(gè)月，或者至少6個(gè)月。在一優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明提供通過(guò)向有此需要的個(gè)體給藥本文限定的化合物或組合物來(lái)降低該有此需要的個(gè)體中的血液甘油三酯水平的方法。在另一優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明提供通過(guò)向有此需要的個(gè)體給藥本文限定的化合物或組合物來(lái)降低該有此需要的個(gè)體中的低密度脂蛋白水平的方法。在另一優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明提供通過(guò)向有此需要的個(gè)體給藥本文限定的化合物或組合物來(lái)增高該有此需要的個(gè)體中的高密度脂蛋白水平的方法。在另一方面，本發(fā)明提供含有至少15%的α-(1, -糖苷側(cè)鏈的葡聚寡糖。這些 α-(1-2)支鏈的存在賦予該葡聚寡糖特定的性質(zhì)；實(shí)際上人類(lèi)的消化系統(tǒng)一般不具有水解此類(lèi)鍵所需的酶途徑。這些支鏈的存在賦予葡聚寡糖部分或完全的不可消化性，因此，葡萄糖幾乎未被吸收或者較緩慢地被吸收入體內(nèi)，由此導(dǎo)致血糖反應(yīng)(glycemic response) 低。因此，本發(fā)明提供本文限定的葡聚寡糖，其用于制備導(dǎo)致血糖反應(yīng)低的食品和飲料組合物。例如，這些化合物可用來(lái)替代糖或者其它可快速消化的碳水化合物，并由此降低食品的升糖負(fù)荷(glycemic load)、降低熱量和/或降低食品的能量密度。另外，含有此類(lèi)鍵的葡聚寡糖的穩(wěn)定性使它們能夠容易地通過(guò)并進(jìn)入大腸，在其中它們可用作對(duì)結(jié)腸微生物群具有特異性的底物。因此，這些葡聚寡糖具有作為益生元的特征。在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明的化合物用于治療和/或改善腸健康。所述支化的葡聚寡糖在腸中被腸微生物群發(fā)酵，并且在體外腸模型中表現(xiàn)出與菊糖相比改善的耐受性， 即與菊糖相比，所述支化的葡聚寡糖的發(fā)酵導(dǎo)致氣體產(chǎn)生較少，并且減輕因氣體形成所致的不適，例如氣脹和胃氣脹。故此，本發(fā)明還涉及通過(guò)向有此需要的個(gè)體給藥本文限定的化合物或組合物來(lái)減輕所述個(gè)體胃腸道中的氣體形成，從而減輕由于氣脹和胃氣脹引起的腸疼痛或者腸不適的方法。在其它實(shí)施方案中，本發(fā)明的組合物為個(gè)體提供對(duì)食品發(fā)酵的改善的耐受性，并且可與纖維例如菊糖或者FOS、GOS或乳果糖組合以通過(guò)降低氣體產(chǎn)生來(lái)改善耐受性。在另一實(shí)施方案中，以影響體重增長(zhǎng)的量有效給藥本發(fā)明的化合物，例如隨著時(shí)間降低體重增長(zhǎng)(參見(jiàn)例如以下實(shí)施例9，其中相對(duì)于對(duì)照，用本發(fā)明的化合物治療的大鼠在給藥4周后表現(xiàn)出較少的體重增長(zhǎng))。這表明本發(fā)明的化合物影響體重增長(zhǎng)，并且可用來(lái)預(yù)防或治療肥胖，或者有助于控制重量。此外，由于公知一些纖維如菊糖可誘導(dǎo)GLP1，故而本發(fā)明的化合物還可影響食物攝入，由此產(chǎn)生較小的體重增長(zhǎng)(GLP1具有許多已知的生理功能，包括通過(guò)增加飽滿(mǎn)感來(lái)減少食物攝入以及增加胰腺分泌的胰島素)。在另一實(shí)施方案中，以降低個(gè)體的脂質(zhì)含量(即通過(guò)降低個(gè)體的脂肪量)的有效量給藥本發(fā)明的化合物 (參見(jiàn)例如以下實(shí)施例11)。在其它實(shí)施方案中，可以產(chǎn)生以下任一種效應(yīng)的有效量向個(gè)體給藥本發(fā)明的化合物(1)抗菌效應(yīng)(通過(guò)刺激有益菌，葡聚寡糖可有助于對(duì)抗致病菌例如沙門(mén)氏菌屬 (Salmonella)的生長(zhǎng))；(2)對(duì)食物攝入和胰島素敏感度的效應(yīng)(并由此預(yù)防或降低代謝綜合征、糖尿病和/或肥胖的風(fēng)險(xiǎn))，其是通過(guò)影響GLPl釋放以及可能地影響與食欲調(diào)節(jié)和胰島素分泌相關(guān)的其它腸激素實(shí)現(xiàn)的；(3)對(duì)發(fā)育進(jìn)程(developmental programming)的效應(yīng)，其是通過(guò)在懷孕和/或哺乳期間給藥葡聚寡糖實(shí)現(xiàn)的(這可影響胎兒和/或嬰兒，由此通過(guò)影響GLPl和/或腸內(nèi)微生物群(代謝物)來(lái)預(yù)防以后生命中的胰島素抗藥性/肥胖)；(4)通過(guò)因SCFA產(chǎn)生(發(fā)酵)降低pH而影響鈣吸收；(5)由于已證明益生菌影響孤獨(dú)癥、阿爾茨海默病、變態(tài)反應(yīng)、類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、其它免疫缺陷等，因此本發(fā)明的化合物也可具有相同效應(yīng)，因?yàn)樗羞@些疾病至少部分地起因于炎癥，而炎癥可通過(guò)使菌群轉(zhuǎn)變?yōu)闇p輕局部(腸)和全身炎癥的有益菌而得以消除；(6)預(yù)防或治療炎性腸疾病和/或腸易激綜合征，因?yàn)橐炎C明給藥本發(fā)明的化合物在克羅恩病的動(dòng)物模型中改善炎性反應(yīng)。參考以下實(shí)施例進(jìn)一步描述本發(fā)明。
實(shí)施例實(shí)施例1表1顯示平均分子量為l_70kDa并含有至少15%的α - (1，2)-糖苷側(cè)鏈的本發(fā)明的α-(1，2)_支化的α-(1，6)化合物的實(shí)施方案。表 權(quán)利要求
1.用于改善個(gè)體健康的組合物，其包含a-(ld)-支化的α-(1，6)葡聚寡糖。
2.權(quán)利要求1的組合物，其中所述葡聚寡糖是益生元化合物。
3.權(quán)利要求1的組合物，其中所述葡聚寡糖包含至少10%的Ci-(Id)-糖苷側(cè)鏈。
4.權(quán)利要求1的組合物，其中所述葡聚寡糖包含基本為線(xiàn)性的骨架，所述骨架包含至少2個(gè)由α-(1，6)_鍵連接的α-D-吡喃葡萄糖基單元。
5.權(quán)利要求4的組合物，其中所述骨架包含至少90%的α-(1，6)-D-吡喃葡萄糖苷鍵。
6.權(quán)利要求4的組合物，其中所述骨架的平均分子量為約0.5kDa至lOOkDa。
7.權(quán)利要求4的組合物，其中所述骨架的平均分子量為約IOkDa至70kDa，并且所述葡聚寡糖包含約10%至50%的α-(1，2)_糖苷側(cè)鏈。
8.權(quán)利要求1的組合物，其中所述葡聚寡糖包含少于10%的α-(1，4)-鍵。
9.用于改善個(gè)體健康的方法，其包括向個(gè)體給藥對(duì)所述個(gè)體的健康發(fā)揮有益效應(yīng)的有效量的包含α-(1，2)_支化的α-(1，6)葡聚寡糖的組合物。
10.權(quán)利要求9的方法，其中所述葡聚寡糖是益生元化合物。
11.權(quán)利要求10的方法，其中所述益生元化合物對(duì)所述個(gè)體的腸微生物群提供有益效應(yīng)。
12.權(quán)利要求9的方法，其中所述葡聚寡糖包含至少10%的a-(lj)-糖苷側(cè)鏈。
13.權(quán)利要求9的方法，其中所述葡聚寡糖包含基本為線(xiàn)性的骨架，所述骨架包含至少 2個(gè)由a-(l，6)_鍵連接的a-D-吡喃葡萄糖基單元。
14.權(quán)利要求13的方法，其中所述骨架包含至少90%的a-(1，6)-D-吡喃葡萄糖苷鍵。
15.權(quán)利要求13的方法，其中所述骨架的平均分子量為約0.5kDa至lOOkDa。
16.權(quán)利要求13的方法，其中所述骨架的平均分子量為約IOkDa至70kDa，并且所述葡聚寡糖包含約10%至50%的α-(1，2)_糖苷側(cè)鏈。
17.權(quán)利要求9的方法，其中所述葡聚寡糖包含少于10%的α-(1，4)-鍵。
18.權(quán)利要求9的方法，其中所述有益效應(yīng)選自改善腸健康、降低脂質(zhì)含量、降低體重增長(zhǎng)、減少食物攝入、減輕血糖反應(yīng)、增加葡萄糖耐量、增加胰島素分泌、增加GLPl分泌、預(yù)防或治療代謝綜合征、預(yù)防或治療糖尿病，及其組合。
19.權(quán)利要求9的方法，其中所述有益效應(yīng)選自增加短鏈脂肪酸的產(chǎn)生、降低胃腸道中的氣體形成、改善腸舒適度、預(yù)防或治療胃腸道病癥、刺激有益菌的生長(zhǎng)或活性、抑制致病菌的生長(zhǎng)、緩解腸疼痛、預(yù)防或治療炎性腸疾病、預(yù)防或治療腸易激綜合征、提供鎮(zhèn)痛效應(yīng)、 提供內(nèi)臟疼痛的緩解，及其組合。
20.權(quán)利要求9的方法，其中所述有益效應(yīng)選自預(yù)防或治療孤獨(dú)癥、預(yù)防或治療阿爾茨海默病、預(yù)防或治療變態(tài)反應(yīng)、預(yù)防或治療類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，及其組合。
21.權(quán)利要求9的方法，其中所述有益效應(yīng)選自預(yù)防或治療膽固醇相關(guān)的病癥、預(yù)防或治療肥胖、增加丙酸的產(chǎn)生、降低血液甘油三酯水平、降低脂肪量、降低低密度脂蛋白水平， 及其組合。
22.權(quán)利要求9的方法，其中所述組合物還包含選自乳桿菌屬(LactcAacillus)、雙岐桿菌屬(Bifidobacterium)、腸球菌屬(Enterococcus)、埃希氏桿菌屬(Escherichia)、鏈球菌屬(Str印tococcus)、酵母菌屬(Saccharomyces)及其組合的益生菌。
23.權(quán)利要求9的方法，其中所述組合物還包含選自抗性麥芽糖糊精、抗性淀粉、聚葡萄糖、可溶性玉米(葡萄糖)纖維、菊糖、寡聚果糖、纖維糊精、支鏈淀粉、半纖維素、寡聚半乳糖、阿拉伯糖基木糖寡糖、乳果糖、塔格糖、益生元化合物及其組合的膳食纖維。
24.權(quán)利要求9的方法，其中所述組合物是食品，并且還包含至少一種食品成分。
25.權(quán)利要求9的方法，其中所述組合物是藥物組合物，并且還包含至少一種藥學(xué)成分。
26.權(quán)利要求9的方法，其中所述有效量包括每天約0.Ig至約40g。
27.制備具有受控的大小和受控的支化度的葡聚寡糖的方法，其包括以下步驟(1)提供平均分子量為0. 5-lOOkDa的α-(1，6)葡聚寡糖；(2)將至少10%的α-(1，2)-糖苷側(cè)鏈引入所述α-(1，6)葡聚寡糖上，由此獲得α-(1，2)_支化的α_(1，6)葡聚寡糖；和(3) 任選地純化所述a-(lj)-支化的a-(l，6)葡聚寡糖。
28.權(quán)利要求27的方法，其中步驟(1)包括(Ia)使含有葡萄糖的原料進(jìn)行酶法轉(zhuǎn)葡萄糖基化反應(yīng)，由此獲得異麥芽糖寡糖(IMOS)；和(Ib)使所述IMOS與葡聚糖蔗糖酶在蔗糖的存在下反應(yīng)，由此獲得所述a-(l，6)葡聚寡糖。
29.權(quán)利要求觀(guān)的方法，其中所述含有葡萄糖的原料包括葡聚糖、淀粉、葡萄糖漿或者麥芽糖漿。
30.權(quán)利要求觀(guān)的方法，其中(Ia)和(Ib)在單一步驟中進(jìn)行。
31.權(quán)利要求觀(guān)的方法，其中步驟( 包括使所述a-(l，6)葡聚寡糖與轉(zhuǎn)葡糖苷酶 GBD-⑶2在蔗糖的存在下反應(yīng)，由此獲得a-(l，2)_支化的a-(l，6)葡聚寡糖。
32.權(quán)利要求31的方法，其中在步驟(2)中蔗糖與a-(l，6)葡聚寡糖的摩爾比為約 0. 10-5. 00，并且a-(l，2)_鍵的百分比為約10%至50%。
33.權(quán)利要求31的方法，其中在步驟(2)中蔗糖與a-(l，6)葡聚寡糖的摩爾比為約 0. 90-1. 00，并且a -(1,2)-鍵的百分比為約30%至40%。
34.權(quán)利要求27的方法，其中步驟(3)包括通過(guò)過(guò)濾純化所述a-(l，2)_支化的 a-(l,6)葡聚寡糖，其中所述被純化的葡聚寡糖的平均分子量為約0. 5-lOOkDa。
35.權(quán)利要求27的方法，其中步驟(1)包括使蔗糖與葡聚糖蔗糖酶反應(yīng)，由此獲得所述 a-(l,6)葡聚寡糖。
36.權(quán)利要求27的方法，其中步驟(1)包括使蔗糖與葡聚糖蔗糖酶在葡萄糖的存在下反應(yīng)，由此獲得所述a-(l，6)葡聚寡糖。
37.權(quán)利要求36的方法，其中步驟(1)還包括調(diào)整蔗糖與葡萄糖的比值，由此調(diào)整所述 a-(l,6)葡聚寡糖的DP特征。
38.權(quán)利要求23的方法，其中所述葡聚寡糖能夠到達(dá)所述個(gè)體的結(jié)腸的整個(gè)長(zhǎng)度。
39.權(quán)利要求16的方法，其中所述分子量越高并且a-(l，2)支化的百分比越高，則所述化合物在所述個(gè)體中的抗消化性越高。
40.權(quán)利要求9的方法，其中所述有益效應(yīng)包括增加短鏈脂肪酸的產(chǎn)生，由此降低腸中的PH，并且(i)改善礦物質(zhì)吸收，(ii)改善骨健康，或者(iii)預(yù)防或治療骨質(zhì)疏松。
41.權(quán)利要求9的方法，其中所述有益效應(yīng)包括降低所述個(gè)體中產(chǎn)生氣體的量和速度， 由此減輕氣脹和胃氣脹。
全文摘要
本發(fā)明提供用于改善個(gè)體健康的組合物，其包含α-(1，2)-支化的α-(1，6)葡聚寡糖，所述葡聚寡糖的平均分子量?jī)?yōu)選為約10kDa至70kDa，具有約10％至50％的α-(1，2)-糖苷側(cè)鏈，并且在所述個(gè)體中至少部分地不可消化。本發(fā)明還提供用于改善個(gè)體健康的方法，其包括向個(gè)體給藥有效量的所述組合物以改善腸健康，或者預(yù)防或治療胃腸道病癥、膽固醇相關(guān)的病癥、糖尿病或者肥胖。本發(fā)明還提供制備具有受控的大小和受控的支化度的葡聚寡糖的方法，其包括提供平均分子量為0.5-100kDa的α-(1，6)葡聚寡糖，并將至少10％的α-(1，2)-糖苷側(cè)鏈引入所述α-(1，6)葡聚寡糖上。
文檔編號(hào)A61K31/721GK102439048SQ201080020234
公開(kāi)日2012年5月2日 申請(qǐng)日期2010年5月7日 優(yōu)先權(quán)日2009年5月7日
發(fā)明者A·艾納漢德, M·勒莫-西梅翁, M·洛佩, P·F·E·蒙桑, S·M·波特, T·納艾 申請(qǐng)人:泰萊配料法國(guó)有限公司