專利名稱：因子viii變體及使用方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及變體因子VIII (FVIII)蛋白。本發(fā)明還涉及編碼變體FVIII蛋白的核酸及用于鑒定此類核酸的方法。本發(fā)明涉及生成和使用所述變體FVIII蛋白的方法。
背景技術(shù)：
血液凝固通過接觸激活途徑(以前稱為內(nèi)源性途徑)或組織因子途徑(以前稱為外源性途徑)來發(fā)生，由此某些血液蛋白質(zhì)在蛋白水解激活級聯(lián)中相互作用以最終將可溶性血纖蛋白原轉(zhuǎn)化成不溶性血纖蛋白。這些血纖蛋白絲交聯(lián)以形成凝塊的支架；在沒有血纖蛋白形成的情況中，不能發(fā)生凝固。接觸激活途徑由數(shù)個步驟組成(1)因子XII的蛋白水解激活；( 激活的因子 XII切割因子XI以將其激活；(3)激活的因子XI切割因子IX，由此將其激活；(4)激活的因子IX與激活的FVIII相互作用以切割并激活因子X ； (5)激活的因子X結(jié)合膜表面上激活的因子V，該復(fù)合物以蛋白水解方式切割凝血酶原以形成凝血酶；(6)凝血酶以蛋白水解方式切割血纖蛋白原以形成血纖蛋白；(7)血纖蛋白單體裝配成原纖維，其然后被因子XIII 來交聯(lián)。組織因子途徑由下列步驟組成(1)在血管破裂后，因子VII結(jié)合組織因子，即存在于血管系統(tǒng)外部的組織中的脂蛋白；(2)通過蛋白水解切割將因子VII激活成因子Vila; 及(3)因子VIIa-組織因子復(fù)合物切割并激活因子X。此后，組織因子途徑與接觸激活途徑相同，即兩種途徑共享上文所描述的最后三個步驟。FVIII的生物合成、胞內(nèi)加工、和分泌及其隨后在血漿中被激活的機制是本領(lǐng)域中公知的(參見例如 Lenting 等，Blood 92 :3983-3996,1998 ；Thompson， Seminars in Hemostasis 29 :11-22,2003 ；Graw ^, Nature Reviews =Genetics 6 :489_501，2005)。人 FVIII最初以2351個氨基酸(SEQ ID NO 1)的單鏈多肽翻譯，其中前19個氨基酸限定被 ER內(nèi)的信號肽酶除去的信號肽。如此，成熟的人FVIII由2332個氨基酸組成，具有域結(jié)構(gòu) Al-al-A2-a2-B-a3-A3-Cl-C2 (

圖1A)。FVIII被糖基化，并在分泌前通過B域羧基端附近 (Arg-1648，在B_a3連接處)的切割來胞內(nèi)加工，并且在B域內(nèi)，主要在Arg-1313后可變切割，以生成90-210kDa重鏈和SOkDa輕鏈(圖1B)。此后，F(xiàn)VIII以異二聚體糖蛋白分泌，所述糖蛋白由單一重鏈和單一輕鏈組成。血漿糖蛋白FVIII在血液中以與von Willebrand因子(vWf)緊密且非共價結(jié)合的無活性前體形式循環(huán)。通過用凝血酶或因子)(a在三個Arg-Ser肽鍵處，即在Arg-372、 Arg-740 JPArg 1689后切割來以蛋白水解方式激活FVIII，所述切割將其與vWf解離，并在級聯(lián)中激活其促凝血功能。所得的異三聚體變?yōu)镕VIIIa(圖1C)。在其活性形式(即FVIIIa)中，F(xiàn)VIII在血液凝固的接觸激活途徑中發(fā)揮因子X激活酶復(fù)合物的輔因子的功能，而且其在血友病A患者中是降低的或非功能性的。FVIII活性的降低水平與疾病的嚴(yán)重程度成正比。如此，具有FVIII缺陷或具有針對FVIII的抗體的人罹患不受控制的內(nèi)部出血，其可以引起一批重度癥狀，除非他們用FVIII治療。癥狀范圍為關(guān)節(jié)中的炎癥反應(yīng)到早期死亡。實際上，F(xiàn)VIII的經(jīng)典定義是存在于正常血漿中的改正源自患有血友病A的個體的血漿中的凝固缺陷的物質(zhì)。因為vWf是功能性FVIII的一種至關(guān)重要的構(gòu)件，所以vWf缺陷也可以引起表型血友病A。在這些病例中，F(xiàn)VIII在血漿中的循環(huán)半衰期以如下的程度降低，使得它不再能在血液凝固中執(zhí)行其特殊的功能。目前的血友病A治療包括通過施用血漿源或重組FVIII來替換缺少的蛋白質(zhì)。抑制FVIII活性的抗體(“抑制劑”或“抑制性抗體”)的形成是血友病A患者管理中的一項嚴(yán)重的并發(fā)癥。自身抗體在占響應(yīng)FVIII的治療性輸注的血友病A患者的約 20%中形成。在形成抑制劑的先前未治療的血友病A患者中，抑制劑通常在治療的一年內(nèi)形成。另外，使FVIII失活的自身抗體偶而在先前具有正常的FVIII水平的個體中形成。若抑制劑效價足夠低，則患者可以通過提高FVIII劑量來管理。然而，抑制劑效價經(jīng)常如此之高以致于它不能被FVIII壓倒。一種備選的策略是使用因子IX復(fù)合物制備物或重組人因子VIIa來繞過正常止血過程中對FVIII的需要。另外，因此豬FVIII通常具有實質(zhì)上小于人FVIII的與抑制劑的反應(yīng)性，所以可以使用部分純化的豬FVIII制備物。已經(jīng)形成針對人FVIII的抑制性抗體的許多患者已經(jīng)用豬FVIII成功得到治療，而且已經(jīng)耐受此類治療達(dá)一段較長的時間。然而，施用豬FVIII不是完整的解決辦法，因為抑制劑可以在一次或多次輸注后針對豬FVIII形成。如此，重組人FVIII或部分純化的豬FVIII的使用尚未解決所有問題。在抑制性抗體外，還出現(xiàn)了如下的問題，其在于FVIII在靜脈內(nèi)施用時具有相對較短的循環(huán)半衰期(在人中為13小時)，因此需要頻繁的輸注，這引起患者劑量給藥順應(yīng)性的困難。如此，用于每周劑量給藥或甚至每月劑量給藥的更長效的FVIII是未滿足的醫(yī)學(xué)需要(Dargaud 等，Expert Opinion on Biological Therapy 7 :651_663，2007)。更長的保護會通過延長FVIII半衰期來實現(xiàn)。正在探索許多FVIII生物工程方法，其目的在于產(chǎn)生持續(xù)較長一段時間的保護(Baru 等，Thromb. Haemost. 93 1061-1068，2005 ；Pipe, J. Thromb· Haemost. 3 :1692-1701,2005 ；Saenko 等，Haemophilia 12(增刊 3) :42-51,2006)。本發(fā)明涉及FVIII變體，其表明經(jīng)修飾的活性和/或經(jīng)修飾的藥動學(xué)特性(例如， 較長的循環(huán)半衰期)。舉例而言，F(xiàn)VIII變體可以是融合物或異二聚體(heterodimer)蛋白，其中在FVIII蛋白的B域部分中插入氨基酸序列(例如調(diào)控劑(modulator))或者用此氨基酸序列替換B域或B域的一部分。此插入/替換氨基酸序列不破壞FVIII的翻譯后加工，并且此FVIII變體具有作為凝固因子的活性?？梢允褂眠@些FVIII變體來治療血友病A，并且可以由于例如循環(huán)半衰期較長而導(dǎo)致不太頻繁的施用。通過需要不太頻繁的劑量給藥，本發(fā)明的FVIII變體可以改善患者順從性，并且降低患者由于施用FVIII而形成對 FVIII的免疫響應(yīng)的概率。發(fā)明概述本發(fā)明涉及FVIII融合蛋白及其表達(dá)產(chǎn)物(在本文中又稱為FVIII融合異二聚體)。本發(fā)明進一步涉及雜合FVIII融合異二聚體和多聚體FVIII融合異二聚體。在一個實施方案中，F(xiàn)VIII融合異二聚體包含F(xiàn)VIII蛋白或多肽和氨基酸序列(在本文中稱為調(diào)控劑)。在另一個實施方案中，將調(diào)控劑序列插入FVIII B域中。在又一個實施方案中，至
6少將B域的一部分缺失，并用調(diào)控劑序列替換。本發(fā)明還涉及編碼FVIII融合異二聚體的核酸序列。在一個實施方案中，核酸序列編碼包含F(xiàn)VIII蛋白的FVIII融合異二聚體，其中調(diào)控劑序列存在于B域中或者用調(diào)控劑序列替換B域的一些或所有氨基酸序列?？梢栽诒磉_(dá)盒中可操作連接編碼FVIII融合異二聚體的核酸序列。本發(fā)明還包括制備FVIII融合異二聚體的方法。例如，將編碼FVIII 融合異二聚體的表達(dá)盒(若還不是表達(dá)載體的一部分的話)引入表達(dá)載體中，隨后導(dǎo)入適合于FVIII融合異二聚體的重組生成的宿主細(xì)胞中。所生成的融合異二聚體具有體外和體內(nèi)FVIII活性，而且可以例如展現(xiàn)出延長的體內(nèi)循環(huán)半衰期。在本發(fā)明的又一個實施方案中，F(xiàn)VIII融合異二聚體包含與SEQ ID NO :1、3、或5 之任一項的氨基酸20-764對應(yīng)的第一氨基酸序列；與SEQ ID NO :1、3、或5之任一項的氨基酸1656-2351對應(yīng)的第二氨基酸序列；和調(diào)控劑序列，其中(1)所述調(diào)控劑序列在其氨基端共價附接于所述第一氨基酸序列的羧基端，且在其羧基端共價附接于所述第二氨基酸的氨基端，或( 所述調(diào)控劑序列在其氨基端共價附接于所述第一氨基酸序列的羧基端，且所述調(diào)控劑氨基酸序列不共價附接于所述第二氨基酸序列。在本發(fā)明的另一個實施方案中，核酸序列編碼FVIII融合異二聚體，其中所述 FVIII融合異二聚體包含與SEQ ID NO :1、3、或5之任一項的氨基酸20-764對應(yīng)的第一氨基酸序列 ’與SEQ ID NO :1、3、或5之任一項的氨基酸1656-2351對應(yīng)的第二氨基酸序列；和調(diào)控劑序列，其中所述調(diào)控劑序列在其氨基端共價附接于所述第一氨基酸序列的羧基端， 且在其羧基端共價附接于所述第二氨基酸的氨基端。另外，本發(fā)明還涉及生成融合異二聚體的載體、宿主細(xì)胞、方法及治療凝固缺陷的方法。附圖簡述圖IA顯示了全長人FVIII的結(jié)構(gòu)，其從N端到C端含有下列域S (信號肽)、Al、 al、A2、a2、B、a3、A3、CljPC2。圖IB顯示了異二聚體人因子VIII的重鏈和輕鏈的結(jié)構(gòu)。 由于B域內(nèi)的可變蛋白水解切割，重鏈的大小有所變化。圖IC顯示了活性人FVIII (即 FVIIIa)的亞基的結(jié)構(gòu)。圖2顯示了實施例部分中所描述的本發(fā)明的因子VIII融合異二聚體的三個例示性實施方案。三個實施方案表示為“BDDFc+鉸鏈”、“BDDFc-鉸鏈”、和“BDDFc” (其任選地可以包含異源肽標(biāo)簽以便于分離)。三個例示性的實施方案在其形成二聚體(經(jīng)由其Fc部分)或蛋白質(zhì)聚集體的能力方面及在其對Fcfoi的結(jié)合親和力方面不同。圖3描繪了依照實施例1和2生成的因子VIII融合蛋白的結(jié)構(gòu)域。具體地，將鼠 Fc區(qū)(具有或沒有鉸鏈)插入B域缺失型(BDD)因子VIII蛋白的特定位點(在N-745與 S-1637之間)中以替換B域的缺失部分。標(biāo)示鼠Fc區(qū)的N端和C端側(cè)的非缺失B域部分的氨基酸序列。圖4顯示了依照實施例5生成的單順反子BDD. mFc單體構(gòu)建體。圖5顯示了通過活性測定法來鑒定高表達(dá)克隆。通過FVIII aPPT凝固測定法來篩選表達(dá)BDDFc+鉸鏈的HKBll穩(wěn)定細(xì)胞系?？寺?、8、12、18、27、和33)顯示范圍為 500-3500mlU/mL的高凝固活性。圖6顯示了通過ELISA測定法來鑒定高表達(dá)克隆。通過抗-FVIII捕捉ELISA來篩選表達(dá)BDDFc+鉸鏈的HKBll穩(wěn)定細(xì)胞系。三個克隆(克隆8、18、和27)以約lug/mL表達(dá)BDDFc+鉸鏈融合物。圖7顯示了 BDDFc+鉸鏈融合蛋白的蛋白質(zhì)純化的結(jié)構(gòu)。在還原性凝膠中，BDDFc+ 鉸鏈解析為80-kDa輕鏈(L)、115-kDa重鏈(H)、和195-kDa未加工的單鏈(U)(第8道)。 在非還原性凝膠中，在80-、115-、195-kDa條帶(第8道)外，BDDFc+鉸鏈產(chǎn)生390-kDa條
帶(二聚體)。圖8表明回收血友病A (Hem Α)小鼠中的BDDFc-鉸鏈("FVII I-Fc")和BDD-FVIII。 9只HemA小鼠接受含有5%清蛋白的配制緩沖液中的50 μ g/kg (400IU/kg) ( · ) BDDFc-鉸鏈。其它HemA小鼠接受200IU/kg( □ )BDD-FVIII，即衍生BDDFc-鉸鏈的因子VIII變體。 與BDD-FVIII的衰變曲線相比，BDDFc-鉸鏈顯示具有快速的分布相的兩相衰變。BDDFc-鉸鏈的beta相半衰期在50 μ g/kg時是11. 9小時，其相對于未修飾的BDD-FVIII (對于其， beta相半衰期是6. 03小時)改善約2倍。圖9A顯示了在Western印跡分析中以115kDa條帶檢測出的BDDFc+鉸鏈的BDD-Fc 嵌合鏈。將來自瞬時轉(zhuǎn)染子(trans)和穩(wěn)定集合(sp)兩者的樣品濃縮5倍，然后在還原條件下在10% NuPAGE 凝膠上運行。道1)分子量標(biāo)志物；2)作為標(biāo)準(zhǔn)品的純化的BDD蛋白；3-5)來自分別用pSK207載體、pSK207BDD、和pSK207BDDFc+鉸鏈瞬時轉(zhuǎn)染的HKBll細(xì)胞的濃縮的條件化培養(yǎng)基；7-9)來自分別用pSK207載體、pSK207BDD、pSK207BDDFc+鉸鏈穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的HKBll細(xì)胞的穩(wěn)定集合的濃縮的條件化培養(yǎng)基。用綴合有HRP的抗小鼠IgG(H+L) 探查印跡。以195kDa條帶檢測出未加工的單鏈形式的BDDFc+鉸鏈(“sc BDD-Fc”)，而異二聚體形式的BDDFc+鉸鏈包含因子VIII重鏈和Fc的115kDa嵌合物(“重鏈Fe”)。異二聚體BDDFc+鉸鏈的輕鏈沒有出現(xiàn)條帶，因為它不被綴合有HRP的抗小鼠IgG結(jié)合。圖9B顯示了在Wfestern印跡分析中以80kDa條帶檢測出的BDDFc輕鏈。將蛋白質(zhì)樣品在還原條件下在10% NuPAGE 凝膠上運行。道1)分子量標(biāo)志物；2)作為標(biāo)準(zhǔn)品的純化的BDD蛋白； 3-5)來自分別用pSK207載體、pSK207BDD、和pSK207BDDFc+鉸鏈瞬時轉(zhuǎn)染的HKBll細(xì)胞的濃縮的條件化培養(yǎng)基。用FVIII輕鏈特異性抗體探查印跡。圖10顯示了因子VIII活性測定法的結(jié)果。將來自用pSK207BDDFc+鉸鏈(“Fe+ 鉸鏈sup”)和PSK207BDDFC-鉸鏈(“Fe-鉸鏈sup”)瞬時轉(zhuǎn)染的HKBll細(xì)胞的條件化培養(yǎng)基收集，并在Coatest 測定法及aPPT凝固測定法兩者中測試FVIII活性。作為對照， 在轉(zhuǎn)染及活性測定法中使用載體PSK207和pSK207BDD( "BDD sup”)，其編碼未修飾的因子 VIII蛋白。圖11顯示了因子VIII融合異二聚體的因子VIII活性。將來自HKBll細(xì)胞 [(BDDFc+鉸鏈瞬時轉(zhuǎn)染子(Tr)和穩(wěn)定集合(Sp)]的條件化培養(yǎng)基加載到用兔-抗-小鼠 Fc抗體預(yù)先包被的96孔板上。在于室溫溫育2小時后，用PBS/Tween -20/BSA將平板清洗三次以除去非特異性結(jié)合，之后進行Coatest⑧測定法。圖12表明BDDFc+鉸鏈形成二聚體，并且BDDFc-鉸鏈?zhǔn)菃误w。使用來自用 pSK207BDDFc+鉸鏈或pSK207BDDFc-鉸鏈表達(dá)載體轉(zhuǎn)染的HKB 11細(xì)胞的5倍濃縮的條件化培養(yǎng)基來實施^festern印跡分析。將樣品在還原和非還原條件下在4_12 % NuPAGE 凝膠上運行。用兔單克隆抗-FVIII輕鏈抗體(Epitomics，Burlingame, CA)，接著用綴合有HRP 的抗兔IgG 二抗探查印跡。分別以170-kDa和195-kDa條帶檢測出未加工的單鏈BDD和 BDDFc。道BDD 純化的 BDD 蛋白；+H =BDDFc+ 鉸鏈；-H =BDDFc-鉸鏈；及 V 單獨的 pSK207載體。圖13顯示了測量BDDFc+鉸鏈和BDDFc-鉸鏈(“BDDFc-H”)(其摻入小鼠Fcfoi結(jié)合表位)結(jié)合固定化的小鼠Fcfoi的能力的Biacore 研究的結(jié)果。BDDFc+鉸鏈(“BDDFc+H”)、 BDDFc-鉸鏈(“BDDFc-H” )、BDD、和全長重組因子VIII (FVIII)。在BDD或全長因子VIII 的情況中沒有看到可檢出的結(jié)合。BDDFc+鉸鏈和BDDFc-鉸鏈融合蛋白以nM親和力顯示對 mFcRn的強結(jié)合。圖14顯示了測量BDDFc+鉸鏈和BDDFc-鉸鏈結(jié)合固定化的人von Willebrand因子(vWF)的能力的Biacore 研究的結(jié)果。通過胺偶聯(lián)來將小鼠Fcfoi固定化到CM-5芯片上。 BDDFc+鉸鏈(“BDDFc+H”)、BDDFc-鉸鏈(“BDDFc-H”)、BDD、和全長重組因子 VIII (FVIII) 對vWF顯示亞納摩爾親和力。圖15顯示了 BDDFc-鉸鏈在HemA小鼠的尾靜脈橫斷出血模型中是有效的。為了測定BDDFc-鉸鏈在治療體內(nèi)出血中是否為功能性的，經(jīng)由尾靜脈給HemA小鼠注射BDDFc-鉸鏈、BDD-FVIII、或媒介物對照，48小時后橫斷(transection) —個側(cè)尾靜脈(lateral tail vein) 0與僅10%在損傷后存活M小時的媒介物-對照組(▲)相比，12個IU/kg(·) 和60個IU/kg( ■ )BDDFc-鉸鏈分別實現(xiàn)25%和80%存活。FVIII-Fc-鉸鏈的功效評估為與BDD-FVIII (其在40IU/kg( )時導(dǎo)致60%存活)的功效相當(dāng)。發(fā)明詳述應(yīng)當(dāng)理解的是，本發(fā)明不限于所描述的具體方法、方案、細(xì)胞系、動物種或?qū)佟?gòu)建體、和試劑，并且因此可以有所變化。還應(yīng)當(dāng)理解的是，本文中所使用的術(shù)語是僅為了描繪具體的實施方案，而且并不意圖限制本發(fā)明的范圍，其僅會被所附權(quán)利要求書限制。必須注意到，如本文中和所附權(quán)利要求書中所使用的，除非上下文另有明確規(guī)定， 單數(shù)形式“一個”、“一種”、和“所述”包括復(fù)數(shù)提及物。如此，例如，提及“蛋白質(zhì)”指提及一個/種或多個/種蛋白質(zhì)，包括本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其等同物等。除非另有定義，本文中所使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語與本發(fā)明所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員的通常理解具有相同的意義。雖然可以在本發(fā)明的實踐或測試中使用與本文中所描述的那些方法、裝置、和材料相似或等同的任何方法、裝置、和材料，但是現(xiàn)在描述優(yōu)選的方法、裝置和材料。在此為了描述和公開而將本文中所提及的所有出版物和專利收入本文，例如，可結(jié)合目前所描述的發(fā)明使用的出版物中所描述的構(gòu)建體和方法。上文所討論的和遍及整個文本的出版物僅提供用于本申請的申請日前的其公開內(nèi)容。本文中的任何文字都不應(yīng)解釋為承認(rèn)本發(fā)明沒有資格早于憑借在先發(fā)明的所述公開。如本文中所使用的，下文描述了多個術(shù)語?！昂怂帷敝该撗鹾颂呛塑账峄蚝颂呛塑账峒捌鋯捂溁螂p鏈形式的聚合物。除非明確限制，該術(shù)語涵蓋含有與參照核酸具有相似結(jié)合特性，并且以與天然存在的核苷酸類似的方式代謝的天然核苷酸的已知類似物的核酸。除非另有指明，特定的核酸序列還明確涵蓋其保守修飾的變體(例如簡并密碼子取代)和互補序列以及明確指示的序列。簡并密碼子取代可以通過生成用混合堿基和/或脫氧肌苷殘基取代一個或多個選定的(或所有)密碼子的第三位的序列來實現(xiàn)。根據(jù)上下文，該術(shù)語核酸與基因、cDNA、和由基因編碼的mRNA可互換使用。
“源自基因的核酸”指基因或其亞序列最終已經(jīng)為其合成充當(dāng)模板的核酸。如此， mRNA、自mRNA逆轉(zhuǎn)錄的cDNA、自所述cDNA轉(zhuǎn)錄的RNA、自cDNA擴增的DNA、自擴增的DNA轉(zhuǎn)錄的RNA等源自基因。并且此類衍生產(chǎn)物的檢測指示樣品中的初始基因和/或基因轉(zhuǎn)錄物的存在和/或豐度。核酸序列在將其放入與另一核酸序列的功能關(guān)系中時是“可操作連接的”或“可操作插入的”。例如，啟動子或增強子可以與編碼序列可操作連接?？刹僮鬟B接的核酸序列可以是連續(xù)的和/或連接兩個蛋白質(zhì)編碼區(qū)。一些核酸序列可以是可操作連接的但不是連續(xù)的。核酸序列的連接可以通過在限制性位點處的連接來實現(xiàn)。若不存在此類位點，則可以依照常規(guī)的實踐使用合成的寡核苷酸銜接頭或接頭。具有生物學(xué)活性的第一多肽在將其放入與第二多肽的功能關(guān)系時與具有生物學(xué)活性的第二多肽“可操作連接”，從而第一多肽和第二多肽兩者至少保留最低水平的生物活性。在多肽的上下文中，可操作連接不必暗示第一和第二多肽是連續(xù)的。如本領(lǐng)域技術(shù)人員領(lǐng)會的，可以通過納入肽接頭來便于生物學(xué)活性的維持。多肽、核酸、或其它組分在它與其通常關(guān)聯(lián)的組分(其它肽、多肽、蛋白質(zhì)(包括復(fù)合物，例如聚合酶和核糖體，其可以伴隨天然的序列)、核酸、細(xì)胞、合成的試劑、細(xì)胞污染物、細(xì)胞組分等)，例如諸如與其通常在其最初來源的細(xì)胞中關(guān)聯(lián)的其它組分部分或完全分開時是“分離的”。多肽、核酸、或其它組分在它自其天然環(huán)境的其它組分部分或完全回收或分離，使得它是各組分的組合物、混合物、或集合中存在的主要種類(即，按摩爾計，它比組合物中的任何其它個別種類更豐富)時是分離的。在一些情況中，制備物由超過約60%、 70 %或75 %，通常超過約80 %，或超過約90 %的分離的種類組成?！盎旧霞兊摹焙怂?例如RNA或DNA)、多肽、蛋白質(zhì)、或組合物也指其中目標(biāo)種類 (例如核酸或多肽)包含存在于組合物中的所有大分子種類的至少約50、60、70、80、90、或 95% (按重量計)。目標(biāo)種類也可以以實質(zhì)同質(zhì)性純化(通過常規(guī)的檢測方法不能在組合物中檢出污染物種類)，其中組合物基本上由單一大分子種類的衍生物組成。術(shù)語“純化的”一般指核酸、多肽、或蛋白質(zhì)是至少約50%純的、60%純的、70%純的、75%純的、85%純的、和99%純的。術(shù)語“重組”在提及例如細(xì)胞、多核苷酸、載體、蛋白質(zhì)、或多肽使用時通常指細(xì)胞、 多核苷酸、或載體已經(jīng)通過導(dǎo)入異源(或外來)核酸或改變天然的核酸進行過修飾，或者蛋白質(zhì)或多肽已經(jīng)通過引入異源氨基酸進行過修飾，或者細(xì)胞源自如此修飾的細(xì)胞。重組細(xì)胞表達(dá)不可在天然(非重組)形式的細(xì)胞中找到的核酸序列或者表達(dá)在其它情況中會異常表達(dá)、表達(dá)不足、或根本不表達(dá)的天然核酸序列。術(shù)語“重組”在提及細(xì)胞使用時指明細(xì)胞復(fù)制異源核酸，或者表達(dá)由異源核酸編碼的多肽。重組細(xì)胞可以含有在天然(非重組)形式的細(xì)胞內(nèi)找不到的編碼序列。重組細(xì)胞還可以含有在天然形式的細(xì)胞中找到的編碼序列， 其中通過人工手段將編碼序列修飾并再導(dǎo)入細(xì)胞中。該術(shù)語還涵蓋含有對于細(xì)胞而言內(nèi)源的在不從細(xì)胞取出核酸的情況中進行過修飾的核酸的細(xì)胞；此類修飾包括那些通過基因替換、位點特異性突變、重組、及相關(guān)技術(shù)獲得的。術(shù)語“重組生成的”指通常通過化學(xué)合成手段、核酸區(qū)段的遞歸(recursive)序列重組或其它核苷酸多樣性產(chǎn)生方法(諸如例如改組)、或核酸的分離的區(qū)段的操作，例如通過本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的遺傳工程技術(shù)來實現(xiàn)的人工重組。“重組表達(dá)的”通常指用于在體外生成重組核酸，并將重組核酸轉(zhuǎn)移到可以將其表達(dá)或增殖的體內(nèi)、體外、或離體細(xì)胞中的技術(shù)?！爸亟M表達(dá)盒”或僅“表達(dá)盒”意指用能夠在與此類序列相容的宿主中實現(xiàn)編碼結(jié)構(gòu)蛋白的核酸的表達(dá)的核酸元件重組或合成生成的核酸構(gòu)建體。表達(dá)盒必須包括要轉(zhuǎn)錄的核酸(例如，編碼期望的多肽的核酸)和啟動子。如本文中所描述的，也可以使用在實現(xiàn)表達(dá)中必需的或有幫助的其它構(gòu)件。例如，表達(dá)盒還可以包含編碼指導(dǎo)表達(dá)的蛋白質(zhì)從宿主細(xì)胞分泌的分選信號(例如信號肽或分泌前導(dǎo)序列)的核苷酸序列。轉(zhuǎn)錄終止信號、增強子、和影響基因表達(dá)的其它核酸序列也可以包含在表達(dá)盒中。出于本發(fā)明的目的，“包含因子VIII融合基因的表達(dá)盒”指示由表達(dá)盒表達(dá)的期望的蛋白質(zhì)是“因子VIII融合蛋白”， 如該術(shù)語在下文進一步定義的。根據(jù)上下文，術(shù)語“載體”可以指克隆載體、表達(dá)載體、或這兩者。術(shù)語載體和術(shù)語 “質(zhì)?！笨苫Q使用。術(shù)語“表達(dá)載體”或“表達(dá)質(zhì)粒”指可以將表達(dá)盒導(dǎo)入宿主細(xì)胞中，從而轉(zhuǎn)化宿主并促進導(dǎo)入的序列表達(dá)(例如轉(zhuǎn)錄和翻譯)的媒介物。術(shù)語“表達(dá)”指容許或引起基因或DNA序列中的信息變得明顯，例如通過激活相應(yīng)基因或DNA序列的轉(zhuǎn)錄和翻譯中涉及的細(xì)胞功能來生成蛋白質(zhì)。DNA序列在細(xì)胞中或由細(xì)胞表達(dá)以形成“表達(dá)產(chǎn)物”諸如蛋白質(zhì)。表達(dá)產(chǎn)物自身例如所得的蛋白質(zhì)也可以說成“表達(dá)的”。表達(dá)產(chǎn)物可以表征為胞內(nèi)、胞外、或分泌的?！鞍被嵝揎棥敝割A(yù)定的氨基酸序列的氨基酸序列的變化。例示性的修飾包括氨基酸取代、插入和/或缺失?！鞍被岵迦搿敝笇⒅辽僖粋€氨基酸摻入預(yù)定的氨基酸序列中。插入可以由插入的一個或兩個氨基酸殘基或更大的插入物組成。插入的殘基可以是天然存在的或非天然存在的，如上文所公開的?！鞍被崛笔А敝笍念A(yù)定的氨基酸序列除去至少一個氨基酸殘基?！鞍被崛〈敝笇㈩A(yù)定氨基酸序列中的至少一個存在的氨基酸殘基用另一個不同的“替換”氨基酸殘基替換。替換殘基可以是“天然存活的氨基酸殘基”(即，由遺傳密碼編碼的)，并且選自下組丙氨酸(Ala)；精氨酸(Arg)；天冬酰胺(Asn)；天冬氨酸(Asp)； 半胱氨酸(Cys)；谷氨酰胺(Gln)；谷氨酸(Glu)；甘氨酸(Gly)；組氨酸(His)；異亮氨酸 (Ile)；亮氨酸(Leu)；賴氨酸(Lys)；甲硫氨酸(Met)；苯丙氨酸(Phe)；脯氨酸(Pro)；絲氨酸(Ser)；蘇氨酸(Thr)；色氨酸(Trp)；酪氨酸(Tyr)；和纈氨酸(Val)。本文中的氨基酸取代的定義還涵蓋用一個或多個非天然存在的氨基酸殘基的取代。“非天然存在的氨基酸殘基”指與上文所列的那些天然存在的氨基酸殘基不同的殘基，其能夠共價結(jié)合多肽鏈中的相鄰氨基酸殘基。非天然存在的氨基酸殘基的例子包括正亮氨酸、鳥氨酸、正纈氨酸、高絲氨酸、和其它氨基酸殘基類似物諸如那些記載于Ellman等(Meth. Enzym. 202 =301-336, 1991)的。為了生成此類非天然存在的氨基酸殘基，可以使用Noren等(Science 244:182， 1989)及Ellman等，1991的規(guī)程。簡言之，這些規(guī)程涉及用非天然存在的氨基酸殘基化學(xué)激活抑制型tRNA，接著進行RNA的體外轉(zhuǎn)錄和翻譯。最后，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)認(rèn)可，可以在一個步驟中，或者在兩個步驟中(例如通過氨基酸缺失，接著是氨基酸插入或者反之亦然) 來實現(xiàn)例如蛋白質(zhì)區(qū)域的氨基酸取代。
規(guī)定的多肽或蛋白質(zhì)的“變體”包含由于如本文中所定義的至少一處“氨基酸修飾”而與規(guī)定的多肽或蛋白質(zhì)的氨基酸序列不同的氨基酸序列?！白凅w”包括展現(xiàn)出期望的活性的多肽或蛋白質(zhì)的片段，諸如IgG的Fc區(qū)中結(jié)合Fcto，由此在與凝固因子偶聯(lián)時改善循環(huán)半衰期的片段?！叭诤隙嚯摹敝赴窗l(fā)現(xiàn)在相同多肽中天然存在的至少兩個離散的肽部分的多肽?！叭诤系鞍住敝赴辽僖环N融合多肽的蛋白質(zhì)。如此，多亞基蛋白質(zhì)稱為融合蛋白，即使僅其亞基之一是融合多肽。術(shù)語“FVIII”、“因子VIII”、或“因子VIII蛋白”意圖涵蓋擁有因子VIII的生物學(xué)活性的野生型因子VIII蛋白，包括功能性等位變體，或其任何衍生物、變體、或類似物。出于此定義的目的，“因子VIII的生物學(xué)活性”指其參與血液凝固的內(nèi)源性途徑的能力。一般而言，可以使用商品化因子 VIII 測定法(Coatest 、diaPharma 、West Chester, Ohio) 或本領(lǐng)域中的其它測定法通過參照源自血漿的因子VIII標(biāo)準(zhǔn)品來測定此生物學(xué)活性。在提及因子VIII域的情況中，使用“域”來表示本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的因子VIII 的合適的區(qū)域。就人因子VIII而言，圖1中顯示了不同因子VIII域的氨基酸編號?！耙蜃覸III融合基因”指編碼如下文進一步定義的“因子VIII融合蛋白”，而且可以通過將編碼調(diào)控劑的核酸在因子VIII蛋白編碼序列內(nèi)與B域編碼部分對應(yīng)的位置處可操作插入編碼因子VIII蛋白的核酸中來生成的非天然存在的核酸構(gòu)建體。舉例而言，至少可以將B域編碼序列的一部分缺失，并用編碼調(diào)控劑的核酸替換。如本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)領(lǐng)會的，“可操作插入”僅意圖涵蓋編碼調(diào)控劑的核酸的那些插入，其生成編碼調(diào)控劑的核酸的一部分和在編碼調(diào)控劑的核酸的上游和下游的編碼因子VIII的一部分的核酸均在適當(dāng)?shù)淖x碼框中的核酸構(gòu)建體。因子VIII融合基因可以進一步包含編碼肽接頭或多聚化序列的其它核酸序列。最后，出于上述定義的目的，“基因”并不意圖暗示存在在其它情況中會是實現(xiàn)轉(zhuǎn)錄、翻譯、或適當(dāng)?shù)姆g后加工所需要的任何核酸序列(即啟動子、增強子、信號肽、分泌前導(dǎo)序列等)?！耙蜃覸III融合蛋白”指通過因子VIII融合基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯生成，但是其尚未經(jīng)歷翻譯后加工的全長多肽。在翻譯后加工過程中，因子VIII融合蛋白轉(zhuǎn)化成“因子VIII 融合異二聚體”，如下文所定義的?！耙蜃覸III融合異二聚體”指具有因子VIII的生物學(xué)活性，并且由于因子VIII融合基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯，及由此生成的因子VIII融合蛋白的翻譯后修飾(包括蛋白水解加工)而生成的異二聚體蛋白質(zhì)。如此，因子VIII融合異二聚體與發(fā)現(xiàn)在血漿中循環(huán)的異二聚體形式的野生型因子VIII類似(即包含重鏈和輕鏈)。本發(fā)明的因子VIII融合異二聚體與其來源的異二聚體形式的因子VIII蛋白的不同之處可以在于其由例如“經(jīng)修飾的重鏈”(即包含調(diào)控劑，而且還可以具有B域的至少一部分的缺失的因子VIII重鏈)組成。 與衍生融合異二聚體的因子VIII蛋白相比，本發(fā)明的因子VIII融合異二聚體可以展現(xiàn)出例如，延長的循環(huán)半衰期?！耙蜃覸III融合異二聚體”還可以涵蓋“多聚體”和“雜合”因子 VIII融合異二聚體，如下文進一步定義的?！岸嗑垠w因子VIII融合異二聚體”指包含至少兩個因子VIII融合異二聚體的蛋白質(zhì)。若存在于第一因子VIII融合異二聚體中的調(diào)控劑的氨基酸、肽、或多肽部分能夠介
12導(dǎo)與存在于第二因子VIII融合異二聚體中的調(diào)控劑的同源或異源部分的非共價或共價關(guān)聯(lián)，則可以出現(xiàn)多聚體因子VIII融合異二聚體。例如，IgG的Fc部分的鉸鏈區(qū)能夠介導(dǎo)兩個因子VIII融合異二聚體間的共價關(guān)聯(lián)，不管因子VIII融合異二聚體是否具有相同的氨基酸序列(在該情況中，多聚體因子VIII融合異二聚體可以稱為“同-多聚體因子VIII融合異二聚體”)或不同氨基酸序列(在該情況中，多聚體因子VIII融合異二聚體可以稱為 “異-多聚體因子VIII融合異二聚體”)。若在編碼調(diào)控劑的核酸外，因子VIII融合基因包含可操作連接的編碼氨基酸、肽、或多肽的核酸，則也可以出現(xiàn)多聚體因子VIII融合異二聚體，所述氨基酸、肽、或多肽能夠介導(dǎo)與同源氨基酸、肽、或多肽(下文稱為“同-多聚化序列”)或異源肽或多肽(下文稱為“異-多聚化序列”)的非共價或共價關(guān)聯(lián)。熟練技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)領(lǐng)會，在第一因子VIII融合基因僅含有異-多聚化序列時，可以需要獨特的第二因子VIII融合基因來生成多聚體因子VIII融合異二聚體。例如，熟練技術(shù)人員會認(rèn)可，為了利用美國專利No. 5，807，706中所描述的“凸出-進入-空穴”方法，會需要兩種因子VIII 融合基因。關(guān)于多聚體因子VIII融合異二聚體的重組生成，熟練技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)領(lǐng)會，同-多聚體形式可以通過單一重組宿主細(xì)胞生成，而異-多聚體形式可以通過在單一宿主細(xì)胞內(nèi)的共表達(dá)或在多個宿主細(xì)胞中分開表達(dá)(在相同或不同細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)中)來生成。雖然并不意圖受限于目前已知的方法，但是下列非限制性參考文獻(xiàn)中教導(dǎo)的用于生成多聚體多肽的通用方法可以進行改編以用于生成多聚體因子VIII融合異二聚體美國專利申請公開文本No. 2007/0287170 ；美國專利No. 7，183，076中所披露的“多聚化域”方法，例如那些采用免疫球蛋白模塊的；使用Fos和Jim亮氨酸拉鏈，如美國專利No. 5，932，448中所采用的； 及美國專利No. 6，833，441中所采用的“異二聚體化序列”方法?！半s合因子VIII融合異二聚體”指僅包含與至少一個其它多肽共價或非共價關(guān)聯(lián)的單一因子VIII融合異二聚體的本發(fā)明的任何重組蛋白。熟練技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)領(lǐng)會，在調(diào)控劑能夠形成二聚體或多聚體(例如免疫球蛋白的二聚Fc區(qū))的情況中，有可能生成多聚體因子VIII融合異二聚體(如上文所定義的)。然而，熟練技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)認(rèn)可，不是多聚體半衰期調(diào)控劑的每個多肽都需要以因子VIII融合蛋白表達(dá)。例如，在使用Fc區(qū)作為調(diào)控劑的情況中，可以將僅編碼Fc區(qū)(或與親和標(biāo)簽或非因子VIII肽、蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)片段可操作連接的Fc區(qū))的表達(dá)盒導(dǎo)入包含含有因子VIII融合基因的表達(dá)盒的相同或不同宿主細(xì)胞中。熟練技術(shù)人員還應(yīng)當(dāng)領(lǐng)會，即使在調(diào)控劑不能形成二聚體或多聚體時，也可以設(shè)計雜合因子VIII融合異二聚體。具體地，同-或異二聚體序列可以位于因子VIII融合基因內(nèi)， 在編碼調(diào)控劑的核酸的5’(表達(dá)時關(guān)系為N-端)或3’(即，表達(dá)時關(guān)系為C-端)。術(shù)語“調(diào)控劑”指在插入或取代到蛋白質(zhì)(例如因子VIII)中時修飾例如蛋白質(zhì)的活性和/或藥動學(xué)特性的任何多肽、蛋白質(zhì)、蛋白質(zhì)片段、或其變體(其由一個或多個多肽亞基組成)。舉例而言，與其來源的蛋白質(zhì)相比，“半衰期調(diào)控劑”可以延長或縮短蛋白質(zhì) (例如因子VIII融合異二聚體、雜合因子VIII融合異二聚體、或由于所述插入或取代而生成的多聚體因子VIII融合異二聚體)的循環(huán)半衰期。半衰期調(diào)控劑可以例如將蛋白質(zhì)(例如因子VIII融合異二聚體、雜合因子VIII融合異二聚體、或多聚體因子VIII融合異二聚體)的循環(huán)半衰期延長至少10 %、至少20 %、至少30 %或至少40 %、至少50 %、至少60 %、 至少70%、至少80%、至少90%、或至少100%。在一個實施方案中，與其來源的因子VIII 蛋白相比，半衰期調(diào)控劑可以將因子VIII融合異二聚體、雜合因子VIII融合異二聚體、或多聚體因子VIII融合異二聚體的循環(huán)半衰期延長至少約2倍，并且在又一些實施方案中， 將循環(huán)半衰期延長至少約2. 5倍、至少約3倍，或更多。在另一個實施方案中，半衰期調(diào)控劑不包括因子VIII蛋白的任何內(nèi)源元件，諸如但不限于B域。如本文中所使用的，術(shù)語“循環(huán)半衰期”、“血漿半衰期”、“血清半衰期”、或 “ttlA]”在對患者施用肽藥物的上下文中可以定義為藥物在患者中的血漿濃度降低一半所需要的時間。根據(jù)多種清除機制、再分布、和本領(lǐng)域中公知的其它機制，可以有超過一個與肽藥物有關(guān)的半衰期。通常，alpha和beta半衰期定義為使得alpha相與再分布有關(guān)， 而beta相與清除有關(guān)。然而，在很大程度上局限于血流的蛋白質(zhì)藥物的情況中，可以有至少兩個清除半衰期。出于本發(fā)明的目的，可以通過在施用后適當(dāng)選定的時間點時測量血漿蛋白質(zhì)水平(使用例如抗原ELISA來進行)，或者通過在適當(dāng)選定的時間點時測量凝結(jié)劑活性(使用例如Coatest測定法來進行)來計算beta半衰期。關(guān)于半衰期的進一步解釋可以參見 Pharmaceutical Biotechnology (1997, DFA Crommelin 禾口 RD Sindelar 編，Harwood Publishers，Amsterdam，第 101 頁-第 120 頁)。因子VIII融合基因的構(gòu)建本發(fā)明的一個方面涉及因子VIII融合基因。因子VIII融合基因可以是RNA或 DNA。如先前所述，因子VIII融合基因是編碼因子VIII融合蛋白的核酸分子。因子VIII 融合基因源自因子VIII編碼序列、編碼調(diào)控劑的核酸、和任選地編碼同或異-多聚化序列的核酸，其與編碼調(diào)控劑的核酸不同。雖然在下文進一步詳述了因子VIII融合基因的這些構(gòu)件，但是熟練技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)領(lǐng)會，可以使用公知的規(guī)程從編碼這些離散的構(gòu)件的核酸合成因子VIII融合基因的構(gòu)建?？梢栽诒景l(fā)明中得到應(yīng)用的多種方法記載于Molecular Cloning-Α Laboratory Manual，第 3 片反(Maniatis， Cold Spring Harbor Laboratory Press，New York，2001)，及 Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley & Sons) ο編碼因子VIII的核酸的選擇本發(fā)明的重組因子VIII融合蛋白和異二聚體可以通過修飾核酸來制備，所述核酸編碼野生型因子VIII、可以存在并從一個個體到另一個發(fā)生的因子VIII的天然等位變體、嵌合因子VIII (例如人/豬)、或已經(jīng)在其它方面進行過修飾，但仍保留促凝血功能的變體因子VIII，諸如已經(jīng)進行過修飾以影響野生型因子VIII或因子VIIIa蛋白的特性，諸如糖基化位點和樣式、抗原性、比活性、循環(huán)半衰期、蛋白質(zhì)分泌、對因子Ma和/或因子X的親和力、改變的因子VIII-失活切割位點、激活的因子VIIIa形式的穩(wěn)定性、免疫原性、保存期等的變體。可以依照本發(fā)明修飾的合適的突變體因子VIII序列可以包括具有與野生型因子VIII有關(guān)的促凝固功能的任何先前已知的或后來鑒定的變體因子VIII序列。可以依照本發(fā)明修飾的合適的野生型因子VIII可以來自多種動物，包括但不限于哺乳動物諸如人(參見例如GenBank登錄號AAA52484(氨基酸)(SEQ ID NO 1)和 KO1740 (核苷酸)(SEQ ID NO 2)、GenBank 登錄號 AAA5M85 (氨基酸)(SEQ ID NO 3)和 M14113(核苷酸)(SEQ ID NO :4)、和 GenBank 登錄號 AAA5M2O (氨基酸)(SEQ ID NO:5))； 大鼠(參見例如GenBank登錄號AAQ21580(氨基酸)和AY362193 (核苷酸))；小鼠(參見例如GenBank登錄號AAA37385 (氨基酸)和L05573 (核苷酸))；犬(參見例如GenBank 登錄號AAB87412(氨基酸)和AF016234(核苷酸))；蝙蝠(參見例如GenBank登錄號ACC68917(氨基酸)和DP000725(核苷酸))；雞(參見例如GenBank登錄號AA033367 (氨基酸)和AF465272 (核苷酸))；黑猩猩(參見例如GenBank登錄號XP_529212 (氨基酸)和 XM_5^212(核苷酸))；豬(參見例如GenBank登錄號NP_999332(氨基酸)和NM_214167(核苷酸))；兔(參見例如GenBank登錄號ACA42556(氨基酸)和EU447260 (核苷酸))；貓、 猴、豚鼠、猩猩、母牛、馬、綿羊、山羊、或其它哺乳動物物種。來自人、豬、鼠和犬的序列還經(jīng)由血友病A突變、結(jié)構(gòu)、測試和來源網(wǎng)址(或HAMSTeRQ (其進一步提供了人、豬、鼠、和犬因子VIII蛋白的比對)以電子形式可獲得。如本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)領(lǐng)會，哺乳動物因子VIII 蛋白間的保守和同源性是公知的?？梢砸勒毡景l(fā)明修飾的合適的突變體因子VIII的一個非限制性例子是B域缺失型因子VIII(BDD因子VIII)，其特征在于具有含有天然存在的人FVIII的B域的幾乎14個氨基酸(SFSQNPPVLKRHQR，SEQ ID NO :6)的缺失的氨基酸序列。(Lind等，Eur. J. Biochem. 232 19-27，1995)。此 BDD 因子 VIII 具有氨基酸序列 SEQ ID NO -J0可以依照本發(fā)明修飾的合適的突變體因子VIII的另一個非限制性例子是嵌合人 /動物因子VIII，其含有作為負(fù)責(zé)人因子VIII的抗原性的人氨基酸殘基的取代的一個或多個動物氨基酸殘基(參見例如美國專利No. 5，364，771 ；5, 663，060 ’及5，888，974)。例如， 動物(例如豬)殘基取代可以包括但不限于下列一處或多處R484A、R488G、P485A、L486S、 Y487L、Y487A、S488A、S488L、R489A、R489S、R490G、L491S、P492L、P492A、K493A、G494S、 V495A、K496M、H497L、L498S、K499M、D500A、F501A、P502L、1503M、L504M、P505A、G506A、 E507G、1508M、1508A、M2199I、F2200L、L2252F、V2223A、K2227E、和 / 或 L2251 (參見例如美國專利No. 5，859，204和6，770, 744及美國專利申請公開文本No. 2003/0166536)?？梢砸勒毡景l(fā)明修飾的合適的突變體因子VIII的另一個非限制性例子是特征在于由于融合的A2和A3域引起的激活的因子VIII的穩(wěn)定性更大的因子VIII。例如，可以如下修飾因子VIII，即取代第664位和第1擬6位的半胱氨酸殘基，產(chǎn)生包括共價連接A2 和 A3 域的 Cys664-Cysl^6 二硫化物鍵的突變體因子 VIII (Gale 等，J. Thromb. Haemost. 1 1966-1971，2003)。可以依照本發(fā)明修飾的合適的突變體因子VIII的別的非限制性例子是具有改變的失活切割位點的因子VIII (參見例如Amano等，Thromb. Haemost. 79 =557-63,1998 ； Thornburg等，Blood 102:299,2003)?？梢允褂眠@些變化來降低突變體因子VIII對切割酶的易感性，所述切割酶通常使野生型因子VIII失活?？梢砸勒毡景l(fā)明修飾的合適的突變體因子VIII的另一個非限制性例子是具有增強的對因子 IXa(參見例如 Fay 等，J. Biol. Chem. 269 :20522-20527,1994) ；Bajaj 等， J. Biol. Chem. 276 16302-16309，2001 ；及 Lenting 等，J. Biol. Chem. 271 :1935-1940,1996) 和/或因子X(參見例如Lapan等，J. Biol. Chem. 272 =2082-2088,1997)的親和力的因子 VIII?？梢砸勒毡景l(fā)明修飾的合適的突變體因子VIII的另一個非限制性例子是修飾為增強因子VIII的分泌的因子VIII (參見例如Swaroop等，J.Biol. Chem. 272 :24121-24124, 1997)。可以依照本發(fā)明修飾的合適的突變體因子VIII的別的非限制性例子是具有延長的循環(huán)半衰期的因子VIII。這些突變體因子VIII蛋白可以表征為具有但不限于降低的與硫酸乙酰肝素的相互作用(Sarafanov 等，J.Biol. Chem. 276 :11970-11979,2001)和 / 或降低的與低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白(“LRP”)的相互作用(參見例如WO 00/28021 ； WO 00/71714 ；Saenko 等，J. Biol. Chem. 274 :37685-37692,1999 ；及 Lenting 等，J. Biol. Chem. 274 :23734-23739,1999)?？梢砸勒毡景l(fā)明修飾的合適的突變體因子VIII的另一個非限制性例子是由修飾為編碼在已知的、現(xiàn)有的表位內(nèi)的氨基酸以生成天冬酰胺殘基處的糖基化識別序列的核苷酸序列編碼的經(jīng)修飾的因子VIII (參見例如美國專利No. 6，759，216)。此例子的突變體因子VIII在提供經(jīng)修飾的因子VIII中可以是有用的，所述經(jīng)修飾的因子VIII逃脫現(xiàn)有抑制性抗體的檢測(低抗原性因子VIII)，而且其降低形成抑制性抗體的概率(低免疫原性因子 VIII)。在一個實施方案中，可以依照本發(fā)明修飾的此類突變體因子VIII是突變成具有N連接的糖基化的共有氨基酸序列的因子VIII。此類共有序列的例子是N-X-S/T，其中N是天冬酰胺，X是任何氨基酸，且S/T代表絲氨酸或蘇氨酸(參見例如美國專利No. 6，759，216)?？梢砸勒毡景l(fā)明修飾的合適的突變體因子VIII的另一個非限制性例子是具有多處突變的促凝固活性因子VIII (參見例如美國專利No. 6，838，437和美國專利申請公開文本No. 2004/0092442) 0此實施方案的一個例子涉及突變體因子VIII，其已經(jīng)修飾為(i)缺失von Willebrand因子結(jié)合位點，(ii)添加Arg 740處的突變，并(iii)在A2-和A3-域間添加氨基酸序列間隔物，其中氨基酸間隔物具有足夠的長度，從而在激活后，促凝血活性因子VIII蛋白變?yōu)楫惗垠w(參見例如美國專利申請公開文本No. 2004/0092442 ；Pittman 等，PNAS 85 =2429-2433,1988 披露了 Arg740處的切割對生成輔因子活性不是至關(guān)重要的)?？梢砸勒毡景l(fā)明修飾的合適的突變體因子VIII的另一個非限制性例子是由具有一個或多個位置中插入的截短的因子IX內(nèi)含子1的核苷酸序列編碼的突變體因子 VIII (參見例如美國專利No. 6，800，461和6，780，614)?？梢允褂么送蛔凅w因子VIII來產(chǎn)生體外及在供基因療法用的轉(zhuǎn)移載體中的重組因子VIII的更大的產(chǎn)量(參見例如美國專利No. 6，800, 461)。在此實施方案的一個例子中，突變體因子VIII可以由如下的核苷酸序列編碼，所述核苷酸序列具有兩個位置中插入的截短的因子IX內(nèi)含子1，而且具有適合于在造血細(xì)胞系中以及在血小板中驅(qū)動表達(dá)的啟動子(參見例如美國專利No. 6，780，614)。可以依照本發(fā)明修飾的合適的突變體因子VIII的別的非限制性例子是展現(xiàn)出抑制性抗體的抑制降低的突變體因子VIII (參見例如美國專利No. 5，859，204 ；6, 180，371 ； 6，458，563 ；和 7，122，634)。可以依照本發(fā)明修飾的合適的突變體因子VIII的另一個非限制性例子是如下的突變體因子VIII，其在A2域中具有一處或多處氨基酸取代，該取代具有提高因子VIII的半衰期和/或比活性的效果(參見例如美國專利No. 7，211，559)?？梢砸勒毡景l(fā)明修飾的合適的突變體因子VIII的別的非限制性例子是展現(xiàn)出升高的比活性的突變體因子VIII (參見例如美國專利申請公開文本No. 2007/0265199)?？梢砸勒毡景l(fā)明修飾的合適的突變體因子VIII的另一個非限制性例子是已經(jīng)在預(yù)定的位點處被一個或多個生物相容性聚合物共價結(jié)合的FVIII突變蛋白質(zhì)(參見例如美國專利申請公開文本No. 2006/0115876)。編碼調(diào)控劑的核酸的選擇
本發(fā)明的因子VIII融合基因包括編碼調(diào)控劑的核酸。例如，多種蛋白質(zhì)(和編碼它們的核酸)是本領(lǐng)域中已知的，其在與治療性蛋白質(zhì)融合時與未融合的治療性蛋白質(zhì)相比具有延長血清半衰期的效果。可以潛在地使用編碼這些參考文獻(xiàn)中教導(dǎo)的任何調(diào)控劑的核酸來構(gòu)建本發(fā)明的因子VIII融合基因。選擇可以例如潛在地延長因子VIII融合異二聚體的循環(huán)半衰期(與其來源的因子VIII蛋白相比)的候選調(diào)控劑的考慮因素包括(1)調(diào)控劑的循環(huán)半衰期應(yīng)當(dāng)大于為修飾選定的因子VIII蛋白的循環(huán)半衰期；及( 融合蛋白的免疫原性。關(guān)于第二項考慮因素，可以優(yōu)選使用天然表達(dá)的或源自在意圖用因子VIII融合異二聚體治療的群體(例如人)中天然表達(dá)的蛋白質(zhì)的調(diào)控劑。例如，調(diào)控劑天然存在于意圖要治療的群體的血清中(例如，使用人Fc區(qū)，其中人是意圖的治療群體)。在本發(fā)明的一個實施方案中，免疫球蛋白恒定區(qū)可以作為調(diào)控劑使用。因而，在構(gòu)建本發(fā)明的因子VIII融合基因中使用的調(diào)控劑編碼核酸序列可以是編碼免疫球蛋白(Ig) 的R區(qū)或其片段和/或變體的多核苷酸，和編碼FcfoI結(jié)合肽或其變體的多核苷酸。在一個實施方案中，所使用的核酸編碼調(diào)控劑，其是自人IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、IgE、IgD、或IgM、 或小鼠IgGl、IgGh、IgG2b、IgG3、IgA、或IgM獲得的免疫球蛋白的Fc區(qū)或其片段和/或變體。在另一個實施方案中，所使用的核酸編碼調(diào)控劑，其是人或小鼠IgG的Fc區(qū)、具有非功能性鉸鏈(通過所述鉸鏈區(qū)中的半胱氨酸殘基的取代或缺失來得到)的人或小鼠IgGWi^c 區(qū)的變體、或人或小鼠IgG的Fc區(qū)的非鉸鏈部分。在別的實施方案中，所使用的核酸編碼調(diào)控劑，其是小鼠IgGl或人IgGl的Fc區(qū)、或人IgGl或小鼠IgGl的Fc區(qū)的非鉸鏈部分。 在又一個實施方案中，所使用的核酸編碼調(diào)控劑，其是人IgGl的Fc區(qū)、具有非功能性鉸鏈 (通過半胱氨酸殘基的取代或缺失來得到)的人IgGl的變體Fc區(qū)、或人IgGl的Fc區(qū)的非鉸鏈部分。對于免疫球蛋白的Fc區(qū)的片段，編碼調(diào)控劑的核酸可以至少編碼Fc區(qū)中限定被新生兒Fc受體(Fcfoi)結(jié)合的表位的氨基酸區(qū)段，而且可以進一步編碼與Fc區(qū)的鉸鏈部分對應(yīng)的區(qū)段?；蛘?，編碼調(diào)控劑的核酸可以至少編碼Fcfoi結(jié)合肽。不受限制，合適的Fcfoi 結(jié)合肽的例子包括序列PKNSSMISNTP(SEQ ID NO :24)，而且可以進一步包含選自下組的序歹Ij :HQSLGTQ(SEQ ID NO 25)、HQNLSDGK(SEQ ID NO 26)、HQNISDGK(SEQ ID NO 27)、或 VISSHLGQ(SEQ ID NO 28)(參見例如美國專利 No. 5，739，277)。在本發(fā)明的一個實施方案中，調(diào)控劑可以由如下的核酸序列編碼，所述核酸序列編碼與 SEQ ID NO :9 (人 IgGl 的 Fc 區(qū))、SEQ ID NO :11 (人 IgG2 的 Fc 區(qū))、SEQ ID NO 13 (人 IgG3 的 Fc 區(qū))、SEQ ID NO :15(人 IgG4 的 Fc 區(qū))、SEQ ID NO :29(小鼠 IgGl 的 Fc 區(qū))、SEQ ID NO :17(人IgGl的Fc區(qū)的非鉸鏈部分)、SEQ ID NO :19(人IgG2的Fc區(qū)的非鉸鏈部分)、SEQ ID NO :21 (人IgG3的Fc區(qū)的非鉸鏈部分)、SEQ ID NO :23 (人IgG4的 Fc區(qū)的非鉸鏈部分)、或SEQ ID NO :30(小鼠IgGl的Fc區(qū)的非鉸鏈部分)相同或共享至少約70 %、至少約75 %、至少約80 %、至少約85 %、至少約90 %、或至少約95 %氨基酸同一性的氨基酸序列。編碼上述之一的核酸的具體例子包括SEQ ID NO :8 (人IgGl的Fc區(qū))、 SEQ ID NO 10 (人 IgG2 的 Fc 區(qū))、SEQ ID NO 12 (人 IgG3 的 Fc 區(qū))、SEQ ID NO 14 (人 IgG4 的 Fc 區(qū))、SEQ ID NO :47 QjnIlIgGl 的 Fc 區(qū))、SEQ ID NO :16(人 IgGl 的 Fc 區(qū)的非鉸鏈部分)、SEQ ID NO :18 (人IgG2的Fc區(qū)的非鉸鏈部分)、SEQ ID NO :20 (人IgG3的Fc 區(qū)的非鉸鏈部分)、SEQ ID NO 22 (人IgG4的Fc區(qū)的非鉸鏈部分)、和SEQ ID NO 48 (小鼠IgGl的Fc區(qū)的非鉸鏈部分)。用于鑒定編碼調(diào)控劑的核酸的方法可以通過使用本文中所描述的方法來將其它多肽或蛋白質(zhì)鑒定為合適的調(diào)控劑。 候選調(diào)控劑(例如，可以潛在地用于創(chuàng)建因子VIII融合基因和因子VIII融合蛋白的多肽) 包括那些已經(jīng)顯示出通過與治療性蛋白質(zhì)融合來延長非因子VIII治療性蛋白質(zhì)或肽的血清半衰期的肽和蛋白質(zhì)。例如，一種用于鑒定因子VIII蛋白的調(diào)控劑的方法是檢查包含調(diào)控劑的因子VIII融合異二聚體在血友病A動物模型諸如血友病A(HemA)小鼠中的藥動學(xué)。編碼調(diào)控劑的核酸的插入位點本發(fā)明的因子VIII融合基因包括編碼調(diào)控劑的核酸。可以將編碼調(diào)控劑的核酸插入因子VIII基因的B域部分內(nèi)。例如，可以在插入編碼調(diào)控劑的核酸前或后，至少缺失編碼因子VIII基因的B域的核酸的一部分(例如至少缺失編碼N-745至S-1637的B域部分的因子VIII基因的一部分)?；蛘?，可以使用位點特異性重組來同時插入編碼調(diào)控劑的核酸并缺失B域區(qū)編碼核酸的一部分。用于實現(xiàn)插入、缺失、和位點特異性重組的重組方法是本領(lǐng)域中公知的。在一個實施方案中，因子VIII融合基因包含編碼因子VI11融合蛋白的核酸序列， 其中因子VIII融合蛋白包含因子VIII蛋白，其中調(diào)控劑的氨基酸序列存在于B域中，或者用調(diào)控劑的氨基酸序列替換B域的一些或所有氨基酸序列。在第二個實施方案中，因子 VIII融合基因包含編碼因子VIII融合蛋白的核酸序列，所述因子VIII融合蛋白包含與SEQ ID NOS :1或5之任一項的氨基酸20-764對應(yīng)的第一氨基酸序列、與SEQ ID NOS :1或5之任一項的氨基酸1656-2351對應(yīng)的第二氨基酸序列、和調(diào)控劑氨基酸序列，其中半衰期調(diào)控劑氨基酸序列在其氨基端共價附接于所述第一氨基酸序列的羧基端，且在其羧基端共價附接于所述第二氨基酸的氨基端。在分泌前，B域在Arg1648 (即，B_a3連接)處切割，并且在B域中，主要在Arg1313后可變切割(參見例如 Thompson, Semin. Thromb. Hemost. 29 11-22，2003)。如此，熟練技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)認(rèn)可，對于B域區(qū)中的插入、缺失和/或取代，應(yīng)當(dāng)維持存在于B-a3域連接處的切割位點以將因子VIII融合蛋白適當(dāng)翻譯后加工成因子VIII融合異二聚體。同樣地，對于在B域區(qū)中的插入，應(yīng)當(dāng)將編碼調(diào)控劑的核酸在編碼B域的核酸內(nèi)在編碼Arg1313的核酸5’ 的位點處插入；或者，可以將B域內(nèi)的切割位點(除B-a3連接處的切割位點外)突變以阻止在因子VIII融合蛋白的翻譯后加工過程中調(diào)控劑從N端(重鏈)部分的切割(并且因此分離)。已知a2_B域連接處的切割對于產(chǎn)生因子VIII的輔因子活性不是至關(guān)重要的 (Pittman 等，PNAS 85 :2429-2433,1988)。在人因子 VIII 中，a2_B 域連接存在于 Arg740 處。 本發(fā)明的因子VIII融合基因包括編碼在a2-B域連接處經(jīng)歷切割的因子VIII融合蛋白的基因及編碼在a2-B域連接處具有阻止切割的氨基酸修飾的因子VIII融合蛋白的基因。舉例而言，可以將a2-B域連接切割位點完整保留，因為在激活本發(fā)明的因子VIII融合異二聚體后在此連接處的切割導(dǎo)致形成與在激活衍生因子VIII融合異二聚體的因子VIII蛋白后生成的因子VIIIa蛋白相同的因子VIIIa蛋白(并且因此具有與其相同的生物學(xué)活性)。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)領(lǐng)會，若因子VIII融合異二聚體中在a2_B域連接處的切割程度或速率小于在其來源的因子VIII蛋白中看到的，則最有可能是由于調(diào)控劑的位阻。如此，可以期望包括在a2_B域連接與半衰期調(diào)控劑之間的肽接頭(即間隔物)形成中的額外氨基酸諸如肽接頭 DDDDK (SEQ ID NO 49)和 GGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO :50)。編碼同-或異-多聚化序列的核酸的選擇和插入位點任選地，本發(fā)明的因子VIII融合基因包括與編碼調(diào)控劑的核酸不同的編碼同-或異-多聚化序列的核酸。可以期望納入編碼同-或異-多聚化序列的核酸以在第一因子 VIII融合異二聚體中采用的調(diào)控劑不能介導(dǎo)與存在于第二因子VIII融合異二聚體中的調(diào)控劑的同源或異源部分的非共價或共價關(guān)聯(lián)時生成多聚因子VIII融合異二聚體。或者，可以期望納入編碼同-或異-多聚化序列的核酸以在第一因子VIII融合異二聚體中采用的調(diào)控劑由單一多肽組成時生成雜合因子VIII融合異二聚體。如本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)領(lǐng)會，會通過所利用的特定多聚化方法來規(guī)定編碼同-或異-多聚化序列的核酸的選擇。可以將下列非限制性參考文獻(xiàn)中教導(dǎo)的用于生成多聚體多肽的通用方法中所采用的編碼同-或異-多聚化序列的核酸序列摻入本發(fā)明的因子VIII 融合基因中美國專利申請公開文本No. 2007/0287170 ；美國專利No. 7，183,076中所披露的“多聚化域”方法，例如那些采用免疫球蛋白模塊的；使用Fos和Jim亮氨酸拉鏈，如美國專利No. 5，932，448中所采用的；及美國專利No. 6，833，441中所采用的“異二聚體化序列” 方法；及美國專利No. 5，807，706中所描述的“凸出-進入-空穴”方法。熟練技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)領(lǐng)會，可以需要獨特的第二因子VIII融合基因以在第一因子 VIII融合基因僅含有異-多聚化序列時生成多聚體因子VIII融合異二聚體或雜合因子 VIII融合異二聚體。例如，熟練技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)認(rèn)可，為了利用美國專利No. 5，807，706中所描述的“凸出-進入-空穴”方法，會需要兩種因子VIII融合基因，其各自包含獨特的異-多聚化序列。熟練技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)認(rèn)可，因子VIII融合基因內(nèi)編碼同-或異-多聚化序列的核酸可以位于因子VIII融合基因內(nèi)在調(diào)控劑的5’(表達(dá)時關(guān)系為N-端)或3’(S卩，表達(dá)時關(guān)系為C-端)，只要其位置不干擾在其它情況中是因子VIII融合異二聚體形成所需要的轉(zhuǎn)錄、翻譯、或翻譯后修飾。可以至少將編碼多聚化序列的核酸，如編碼調(diào)控劑的核酸插入編碼B域的因子VIII基因區(qū)域的一部分內(nèi)或替換編碼B域的因子VIII基因區(qū)域的一部分。表達(dá)盒和表達(dá)載體本發(fā)明的又一方面涉及包含因子VIII融合基因的表達(dá)盒或表達(dá)載體。對于包含因子VIII融合基因的表達(dá)盒的重組生成，將因子VIII融合基因分離，并與啟動子可操作連接。任選地，可以將因子VIII融合基因與轉(zhuǎn)錄終止信號、編碼信號肽的核酸、或其它影響基因表達(dá)或翻譯后加工的核酸序列(例如常規(guī)定位的限制性位點、增強子、分泌前導(dǎo)序列等)進一步可操作連接。若表達(dá)盒的期望的構(gòu)件(與因子VIII融合基因不同)已經(jīng)包含在可復(fù)制的克隆載體或表達(dá)載體內(nèi)，則僅需要通過本領(lǐng)域中公知的重組技術(shù)將因子VIII 融合基因在合適的位置中可操作插入。許多克隆載體是商品化的，而且一般包括下列一種或多種信號序列、復(fù)制起點、增強子元件、啟動子、轉(zhuǎn)錄終止序列、和一種或多種選擇基因或標(biāo)志物。許多表達(dá)載體也是商品化的，并且可以使用本領(lǐng)域中公知的方法和試劑來實現(xiàn)因子VIII融合基因的插入(參見例如Sambrook等，Molecular Cloning :A Laboratory Manual,第二版，Cold Spring Harbor Press, NY(1989) ；Ausubel 等，Current Protocols in Molecular Biology, New York, N. Y. John Wiley & Sons (1989)。表達(dá)載體的選擇會
19取決于優(yōu)選的轉(zhuǎn)化技術(shù)和供轉(zhuǎn)化用的靶宿主?？捎糜诒景l(fā)明的表達(dá)載體包括但不限于染色體、附加體、和病毒來源的載體， 例如源自細(xì)菌質(zhì)粒、噬菌體、酵母附加體、酵母染色體元件(bacteriophages，yeast episomes)、病毒諸如桿狀病毒、乳多泡病毒、痘苗病毒、腺病毒、雞痘病毒、偽狂犬病病毒 (baculoviruses,papova viruses,vaccinia viruses, adenoviruses,fowl pox viruses, pseudorabies viruses)和逆轉(zhuǎn)錄病毒的載體，和源自其組合的載體，諸如粘粒和噬菌粒。適合于在動物細(xì)胞中重組表達(dá)的病毒載體是本領(lǐng)域中公知的(參見例如美國專利 No. 5，871，986 和 6，448，046)。適合于實施本發(fā)明的載體包括但不限于下列病毒載體諸如lambda載體系統(tǒng) gtll、gtffES. tB、Charon 4、和質(zhì)粒載體諸如 pCMV、pBR322、pBR325、pACYC177、pACYC184、 pUC8、pUC9、pUC18、pUC19、pLG339、pR290、pKC37、pKC101、SV 40、pBluescript II SK+/-或 KS+/"(Stratagene, LaJoIIa, CA)、pQE、pIH821、pGEX、pET 系列(Studier 等，Methods Enzymo 1. 185 :60_89，1990)、及其任何衍生物。合適于在細(xì)菌中使用的載體包括pQE70、 pQE60、禾口 pQE_9 (Qiagen, Valencia, CA) ；pBS 載體、Phagescript 載體、Bluescript 載體、pNH8A、pNH16a、pNH18A、禾Π pNH46A (Stratagene, LaJoIIa, CA) ；pcDNA3 (Invitrogen, Carlsbad, CA)；禾口 pGEX、ptrxfus、ptrc99a、pET_5、pET_9、pKK223_3、pKK233_3、pDR540、 和 pRIT5。合適的真核載體是 pWLNEO、PSV2CAT、pOG44、pXTl、pBK、禾口 pSG(Stratagene， La Jo 11 a, CA)；和pSVK3、pBPV、pMSG、和pSVL。其它合適的載體會是熟練技術(shù)人員容易顯而易見的。使用包含編碼合適的標(biāo)志物的基因的表達(dá)載體，所述標(biāo)志物賦予可選擇表型，諸如藥物抗性、營養(yǎng)營養(yǎng)缺陷型、對細(xì)胞毒劑的抗性或表面蛋白的表達(dá)。可以使用的選擇標(biāo)志基因的例子包括neo、gpt、dhfr、ada、pac (嘌呤霉素)、hyg、和hisD。可以通過本領(lǐng)域中公知的重組技術(shù)來容易地測定因子VIII融合基因的成功連接 (或插入載體中)(例如使用常規(guī)的規(guī)程來分離并測序或者使用能夠特異性結(jié)合連接位點的寡核苷酸探針)。宿主細(xì)胞本發(fā)明的又一方面涉及包含因子VIII融合基因的宿主細(xì)胞。因子VIII融合基因可以存在于克隆載體、表達(dá)載體內(nèi)，或者在宿主細(xì)胞基因組中整合。在一個實施方案中，宿主細(xì)胞以穩(wěn)定的質(zhì)粒或以對宿主細(xì)胞基因組的穩(wěn)定插入或整合形式含有DNA分子形式的必需的核酸構(gòu)建體。在另一個實施方案中，宿主細(xì)胞可以含有表達(dá)系統(tǒng)中的DNA分子。在一個實施方案中，將本發(fā)明的因子VIII融合基因以有義方向摻入合適的載體中，從而將可讀框適當(dāng)定向以在選定的啟動子的控制下表達(dá)編碼的蛋白質(zhì)。這牽涉將合適的調(diào)節(jié)元件納入表達(dá)載體中。這些可以包括例如，載體的非翻譯區(qū)、有用的啟動子、和5’和 3’非翻譯區(qū)，其與宿主細(xì)胞蛋白質(zhì)相互作用以實施轉(zhuǎn)錄和翻譯。此類元件在其強度和特異性方面可以有所變化。根據(jù)所利用的載體系統(tǒng)和宿主，可以使用許多合適的轉(zhuǎn)錄和翻譯元件，包括組成性和誘導(dǎo)型啟動子。組成性啟動子是在生物體的整個發(fā)育和生命中指導(dǎo)基因表達(dá)的啟動子。誘導(dǎo)型啟動子是能夠響應(yīng)誘導(dǎo)物而直接或間接激活一種或多種DNA序列或基因轉(zhuǎn)錄的啟動子。在沒有誘導(dǎo)物的情況中，不會轉(zhuǎn)錄DNA序列或基因。本發(fā)明的表達(dá)載體還可以包含與編碼選定的蛋白質(zhì)的DNA分子可操作連接的可操作的3’調(diào)節(jié)區(qū)，其選自那些能夠提供正確轉(zhuǎn)錄終止和在選定的宿主細(xì)胞中表達(dá)的mRNA 的多腺苷酸化的調(diào)節(jié)區(qū)。為了在宿主細(xì)胞中重組生成因子VIII融合異二聚體，可以將因子VIII融合基因摻入宿主細(xì)胞中?？梢允褂帽绢I(lǐng)域中公知的重組技術(shù)經(jīng)由例如轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)導(dǎo)、接合、轉(zhuǎn)移 (mobilization)、或電穿孔來將克隆載體、表達(dá)載體和質(zhì)粒導(dǎo)入細(xì)胞中。宿主細(xì)胞可以包括但不限于哺乳動物細(xì)胞、細(xì)菌細(xì)胞(例如大腸桿菌)、昆蟲細(xì)胞(例如Sf9細(xì)胞)、真菌細(xì)胞、酵母細(xì)胞(例如酵母(Saccharomyces)或裂殖酵母屬 (Schizosaccharomyces))、植物細(xì)胞(例如擬南芥屬(Arabidopsis)或煙草細(xì)胞)、或藻細(xì)胞。適合于實施本發(fā)明的哺乳動物細(xì)胞包括但不限于COS(例如ATCC No. CRL 1650或 1651)、幼侖鼠腎(“BHK”)(例如 ATCC No. CRL 6281)、中國倉鼠卵巢(“CHO”)(ATCC No. CCL 61)、HeLa(例如ATCC No. CCL 2)、293(ATCC No. 1573)、NS0骨髓瘤、CH0P、NS_1、和HKBll (參見例如美國專利No. 6，136，599)。適合于在哺乳動物細(xì)胞中指導(dǎo)表達(dá)的表達(dá)載體一般包含啟動子及本領(lǐng)域中已知的其它轉(zhuǎn)錄和翻譯控制序列。常見的啟動子包括SV40、MMTV、金屬硫蛋白-1、腺病毒Ela、 CMV、立即早期、免疫球蛋白重鏈啟動子和增強子、和RSV-LTR。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以基于其作為啟動子的強度來容易地選擇合適的哺乳動物啟動子。或者，在期望特定蛋白質(zhì)的表達(dá)或阻抑時，可以為了控制而采用誘導(dǎo)型啟動子。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以容易地從本領(lǐng)域中已知的啟動子選擇合適的誘導(dǎo)型哺乳動物啟動子。不論為了本發(fā)明的因子VIII融合異二聚體的重組生成而選擇的宿主細(xì)胞，可以通過用更常見的密碼子替換因子VIII融合基因中的不常見密碼子來實現(xiàn)蛋白質(zhì)表達(dá)的升高(參見例如美國專利No. 6，924，365)。熟練技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)領(lǐng)會，決定特定的因子VIII融合基因密碼子是否“不常見”或“常見”取決于為重組生成而選擇的宿主細(xì)胞的特定密碼子選擇。因子VIII融合蛋白和異二聚體的生成鑒于本文中所討論的重組技術(shù)，本發(fā)明的另一方面涉及生成本發(fā)明的因子VIII 融合異二聚體的方法。此方法牽涉在宿主細(xì)胞表達(dá)因子VIII融合蛋白的條件下培養(yǎng)本發(fā)明的宿主細(xì)胞。在因子VIII融合蛋白的翻譯后修飾后，然后可以將重組因子VIII融合異二聚體純化并分離。本發(fā)明的一個方面是用于生成因子VIII融合蛋白或因子VIII融合異二聚體的方法，包括(a)提供經(jīng)編碼因子VIII融合蛋白或因子VIII融合異二聚體的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞；(b)培養(yǎng)細(xì)胞；并(C)分離因子VIII融合蛋白或因子VIII融合異二聚體。在又一個實施方案中，宿主細(xì)胞可以是哺乳動物細(xì)胞，并且調(diào)控劑的氨基酸序列可以是糖基化的。關(guān)于多聚體因子VIII融合異二聚體的重組生成，熟練技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)領(lǐng)會，同-多聚體形式可以通過單一重組宿主細(xì)胞生成，而異-多聚體形式可以通過在單一宿主細(xì)胞內(nèi)的共表達(dá)或在多個宿主細(xì)胞中分開表達(dá)(在相同或不同細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)中)來生成。與異-多聚體形式相似，熟練技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)領(lǐng)會，雜合因子VIII融合異二聚體可以通過在單一宿主細(xì)胞內(nèi)的共表達(dá)或在多個宿主細(xì)胞中分開表達(dá)(在相同或不同細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)中)來生成。在利用不同培養(yǎng)系統(tǒng)的情況中，可以將來自每種培養(yǎng)物的重組蛋白質(zhì)產(chǎn)物分離，然后使用本領(lǐng)域中公知的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)來再結(jié)合。對于多聚體因子VIII融合異二聚體和雜合因子VIII融合異二聚體的重組生成，可以選擇能夠以期望的方式裝配多聚體或雜合因子VIII 融合異二聚體的鏈的宿主細(xì)胞。作為共表達(dá)不同基因的備選，可以生成編碼所有需要的多肽鏈的單順反子基因。 關(guān)于可以如何設(shè)計此類基因的具體例子，參見下文實施例5?？梢砸曰旧霞兊男问缴芍亟M因子VIII融合異二聚體?？梢允褂帽绢I(lǐng)域中公知的方法來純化并鑒定純化的因子VIII融合異二聚體。藥物組合物本發(fā)明的另一方面涉及包含因子VIII融合異二聚體和藥學(xué)可接受載體的藥物組合物。藥學(xué)可接受載體是可以添加至活性成分以幫助配制或穩(wěn)定化制備物，而且不對患者引起顯著不利的毒物學(xué)效果的物質(zhì)。此類載體的例子是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的，并且包括水、糖諸如麥芽糖或蔗糖、清蛋白、鹽諸如氯化鈉等。其它載體記載于例如E.W.Martin的 Remington's Pharmaceutical Sciences。此類組合物會含有有效量的至少一種因子VIII 融合異二聚體。藥學(xué)可接受載體包括無菌水溶液或分散體和和供即時制備無菌可注射溶液或分散體用的無菌粉劑。對藥學(xué)活性物質(zhì)使用此類介質(zhì)和藥劑是本領(lǐng)域中已知的。優(yōu)選地， 組合物配制用于胃腸外注射。組合物可以配制為溶液、微乳、脂質(zhì)體、或其它適合于高藥物濃度的有序結(jié)構(gòu)。載體可以是溶劑或分散介質(zhì)，其含有例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇、及液態(tài)聚乙二醇等)、及其合適的混合物。組合物可以包含等張劑，例如糖、多元醇諸如甘露醇、山梨醇、或氯化鈉。因子VIII的藥物組合物的例子披露于例如美國專利 No. 5，047，249 ；5，656，289 ；5，665，700 ；5，690，954 ；5，733，873 ；5，919，766 ；5，925，739 ； 6，835，372 ；及 7，087，723。可以如下制備無菌可注射溶液，即根據(jù)需要在具有上文所列舉的一種成分或成分組合的合適溶劑中摻入需要量的活性化合物，接著無菌微濾。一般而言，通過將活性化合物摻入無菌媒介中來制備分散體，所述無菌媒介含有基礎(chǔ)分散介質(zhì)及需要的其它成分。在供制備無菌可注射溶液用的無菌粉劑的情況中，制備方法包括自其先前無菌過濾的溶液產(chǎn)生活性成分和任何其它想要成分的粉末的真空干燥和冷凍干燥(凍干)。治療方法本發(fā)明的另一方面涉及一種治療遺傳性和獲得性凝固缺陷諸如血友病(例如血友病A)的方法。此方法牽涉對展現(xiàn)出血友病A的患者施用有效量的本發(fā)明的因子VIII融合異二聚體(包括雜合或多聚體形式)，由此患者在血管損傷后展現(xiàn)出有效的血液凝固。因子VIII融合異二聚體的合適的有效量包括但不限于約10-約50個國際單位/kg體重?；颊呖梢允侨魏尾溉閯游?例如人)?？梢造o脈內(nèi)、皮下、或肌肉內(nèi)施用本發(fā)明的因子VIII融合異二聚體。某些調(diào)控劑可以容許口服施用。可以使用本發(fā)明的因子VIII融合異二聚體來在具有和沒有抑制性抗體的血友病患者中及在由于形成抑制性抗體而患有獲得性因子VIII缺陷的患者中治療由于因子VIII 缺陷所致的不受控制的出血(例如動脈內(nèi)、顱內(nèi)、或胃腸出血)的方法。在一個實施方案中， 依照輸注人或動物因子VIII使用的相同規(guī)程來將單獨的或藥物組合物形式(即與穩(wěn)定劑、 投遞媒介、和/或載體組合)的因子VIII融合異二聚體靜脈內(nèi)輸注到患者中。
或者/另外，可以通過施用包含因子VIII融合基因表達(dá)構(gòu)建體的病毒載體諸如腺伴隨病毒(參見例如Gnatenko等，Br. J. Haematol. 104 =27-36,1999)，或者通過移植遺傳工程化改造成生成因子VIII融合異二聚體的細(xì)胞通常經(jīng)由植入含有此類細(xì)胞的裝置來施用因子VIII融合異二聚體。此類移植可以牽涉使用重組皮膚成纖維細(xì)胞(參見例如Roth等，New Engl. J. Med. 344 1735-1742, 2001)；骨髓基質(zhì)細(xì)胞(參見例如美國專利 No. 6，991，787)、或造血祖宿主細(xì)胞(參見例如美國專利No. 7，198，950)。適合于在血友病A基因療法(使用編碼因子VIII的核酸進行)的病毒載體及其在基因療法中的用途是本領(lǐng)域中已知的(參見例如美國專利No. 6，200，560 ；6，544，771 ；6，649，375 ；6，697，669 ； 6，773，709 ；6，797，505 ；6，808，905 ；6，818，439 ；6，897，045 ；6，939，862 ；7，198，950 ；及 7，238，346)。應(yīng)當(dāng)對需要此類治療的患者施用的因子VIII融合異二聚體的治療劑量會隨因子 VIII缺陷的嚴(yán)重程度而有所變化。一般而言，與每名患者的出血事件的嚴(yán)重程度和持續(xù)時間一致地在頻率、持續(xù)時間、和單位上調(diào)節(jié)劑量水平。因此，因子VIII融合異二聚體可以以足以對患者投遞治療有效量的蛋白質(zhì)以使出血停止的量包含在藥學(xué)可接受載體、投遞媒介、或穩(wěn)定劑中，如通過標(biāo)準(zhǔn)的凝固測定法所測量的。通常，要經(jīng)由施用因子VIII融合異二聚體在患者中達(dá)到的期望的血漿因子VIII 活性水平范圍為正常水平的30-100%。在一個實施方案中，可以以范圍為約5至約50個單位/kg體重、范圍為約10至約50個單位/kg體重的劑量，并且以約20至約40個單位/ kg體重的劑量靜脈內(nèi)給予治療性因子VIII融合異二聚體的施用；時間間隔頻率范圍可以為8至對小時(在嚴(yán)重受累的血友病患者中)；并且按天計的治療持續(xù)時間范圍可以是 1-10天或者直至解決出血事件或者因子VIII融合異二聚體的施用可以是預(yù)防性的(參見例如 Roberts 等，第 1453 頁-第 1474 頁，第 1460 頁，于 Hematology，Williams，W. J.等編 (1990))。與在用人或血漿來源因子VIII治療中一樣，可以通過一階段因子VIII凝固測定法來限定輸注的治療性重組因子VIII的量，并且在選定的情況中，可以通過測量輸注后的患者血漿中的因子VIII來測定體內(nèi)回收。應(yīng)當(dāng)理解，對于任何特定的患者，應(yīng)當(dāng)依照個體需要和施用或監(jiān)督組合物的施用的人的專業(yè)判斷隨時間調(diào)節(jié)特定的劑量方案，并且本文中所列的濃度范圍僅是例示性的，并且不意圖限制所要求保護的因子VIII融合異二聚體的范圍或?qū)嵤?。根?jù)需要，治療可以采用單次施用或在延長的一段時間里的周期性或連續(xù)施用的形式，或者可以為了預(yù)防性目的而施用治療。與其來源的因子VIII蛋白相比，本發(fā)明的因子VIII融合異二聚體展現(xiàn)出延長的循環(huán)半衰期。具有更大的循環(huán)半衰期的因子VIII蛋白可用于治療血友病，因為會需要不太頻繁的劑量給藥以改正患者的因子VIII缺陷。此施用簡易性的升高可以改善治療方案的患者順從性，并且由此降低凝固病癥的癥狀。還有，因為施用較少的抗原，預(yù)期降低的施用頻率降低形成對因子VIII的免疫應(yīng)答的可能性。上述公開內(nèi)容一般描述了本發(fā)明?？梢酝ㄟ^參考以下實施例來獲得更完整的理解，所述實施例僅為了例示而并不意圖限制本發(fā)明的范圍而提供。
實施例
為了本發(fā)明可以得到更好的理解，列出了以下實施例。這些實施例僅為了例示，而不應(yīng)以任何方式解釋為限制本發(fā)明的范圍。通過提及而完整收錄本文中所提及的所有出版物。實施例1以下實施例描述了使用編碼因子VIII B域缺陷型(BDD)蛋白的核酸和編碼鼠Fc 區(qū)(稱為“mFc+鉸鏈”)的核酸來構(gòu)建包含因子VIII融合基因(稱為“BDDmFc+鉸鏈”)的哺乳動物表達(dá)載體(稱為“ρΜΙΙΟ”或“pSK207BDDFc+鉸鏈” )。BDDmFc+鉸鏈的重組表達(dá)導(dǎo)致因子VIII融合異二聚體(稱為“BDDFc+鉸鏈”)的生成，如圖2中所顯示的。由于存在功能性免疫球蛋白鉸鏈區(qū)，BDDFc+鉸鏈的兩個分子經(jīng)由二硫化物鍵合來共價結(jié)合以形成多聚體因子VIII融合異二聚體。此型式的優(yōu)點是二聚體Fc導(dǎo)致融合蛋白對Fcfoi的高親和力結(jié)合，導(dǎo)致循環(huán)半衰期延長。使用位點定向誘變試劑盒來突變質(zhì)粒pSK207，其含有以RiieI和NheI位點為邊界的因子VIII B域缺陷型(BDD)基因(稱作“PSK207BDD”)。使用誘變引物CES16 (5’-caa tgccattgaacctaggagcttctcccagaacccaccagtccttaagcgccatcaacggg-3') (SEQ ID NO :34) 禾口 CES17 (5‘-cccgttgatggcgcttaaggactggtgggttctgggagaagctcctaggttcaatggcattg-3‘) (SEQ ID NO 35)來將兩個限制性位點(在bp 4490處的AvrII和在bp 4520處的AflII) 弓 I 入分子中。使用誘變寡聚物 CES 18 (5，-cagtggtcattacactcaagaacatggcttccca tcc_3，) (SEQ ID NO 36)禾口 CES19 (5，_gg￡itggg￡i￡igcc￡itgttcttg￡ig tgtaatgaccactg-3' ) (SEQ ID NO 37)來消除bp2537處的AflII位點。所得的質(zhì)粒稱作pM109。這些誘變事件均是沉默的，未對BDD導(dǎo)致氨基酸變化。作為鼠Fc區(qū)的來源，使用含有針對人表皮生長因子受體的全長鼠 IgGl 抗體的質(zhì)粒 pGT2!34。使用引物 CES 36 (5‘-agcttcctaggagcttctcccagaacgtgccc agggattg tggttg-3') (SEQ ID NO 38)禾口 CES39(5，—agctacttaaggactggtgggttctgggattt accaggagagtgggagag-3，)(SEQ ID NO :39)用 pGT234作為模板來PCR擴增鼠Fc+鉸鏈部分。 將所得的片段用Aflll/Avrll消化，并克隆到經(jīng)AfΙΙΙ/AvrII消化的pM109中以生成質(zhì)粒 PM117。為了恢復(fù)bp2537處的初始4打11位點，在？] 117中插入pSK207+BDD的Nhel/Bglll 片段以替換其等同區(qū)，從而生成質(zhì)粒pM115，其含有bp2537處的AflII位點。將pM115的 BDD. mFc+鉸鏈基因(包含在5077bp NheI/PmeI片段內(nèi))克隆到表達(dá)載體pSS207的RneI/ NheI位點中以生成質(zhì)粒ρΜΙΙΟ或pSK207BDDFc+鉸鏈。pSK207BDDFc+鉸鏈的因子VIII融合基因構(gòu)件(即BDDmFc+鉸鏈)具有核酸序列SEQ. ID NO :31。由BDDmFc+鉸鏈所編碼的蛋白質(zhì)具有圖3中所顯示的結(jié)構(gòu)域(其中小鼠Fc標(biāo)示mFc+鉸鏈的位置)和SEQ. ID NO 32的氨基酸序列。實施例2以下實施例描述了使用編碼因子VIII B域缺失型(BDD)蛋白的核酸和幾乎編碼鼠Fc區(qū)的鉸鏈部分(稱為“mFc-鉸鏈”)的核酸來構(gòu)建包含因子VIII融合基因(稱為 “BDDmFc-鉸鏈”)的哺乳動物表達(dá)載體(稱為“pM118”或“pSS207BDDFc_鉸鏈”)。BDDmFc-鉸鏈的重組表達(dá)導(dǎo)致因子VIII融合異二聚體(稱為“BDDFc-鉸鏈”)的生成，如圖2中所顯示的。由BDDmFc-鉸鏈編碼的蛋白質(zhì)具有圖3中所顯示的結(jié)構(gòu)域(其中“小鼠Fe”標(biāo)示 mFc-鉸鏈的位置)和SEQ. ID NO 33的氨基酸序列。由于缺乏功能性免疫球蛋白鉸鏈區(qū)， BDDFc-鉸鏈不形成多聚體因子VIII融合異二聚體。此型式的缺點是非二聚化的Fc區(qū)具有
24降低的Fcfoi結(jié)合親和力。BDDmFc-鉸鏈的構(gòu)建與BDDmFc+鉸鏈的上述構(gòu)建非常相似。使用PCR引物CES 37 (5，-agcttcctaggagcttctccca gaacgtcccagaagtatcatctgtc-3，)(SEQ ID NO :40)和 CES39 (SEQ ID NO 39)來從質(zhì)粒pGD34 PCR擴增mFc-鉸鏈區(qū)，將其用AvrII/Af III消化， 并克隆到經(jīng)Avrll/Aflll消化的pM109質(zhì)粒中。所得的質(zhì)粒稱作pM114 (又稱作“pSK207. BDD. mFc-鉸鏈”)。然后，將含有BDD. mFc-鉸鏈基因的pM114的Nhel/Rnel片段克隆到表達(dá)載體pSS207中以生成質(zhì)粒pM118 (即pS S207BDDFc-鉸鏈)。實施例3以下實施例描述了構(gòu)建質(zhì)粒(稱作“pM130”)以表達(dá)在其氨基端末端具有Flag標(biāo)簽的鼠Fc區(qū)(稱作“mFc+鉸鏈”)。在同一宿主細(xì)胞中共表達(dá)此質(zhì)粒與pSS207BDDFc+鉸鏈生成BDDFc+鉸鏈二聚體、mFc+鉸鏈二聚體、和BDDFc+鉸鏈和mFc+鉸鏈的異二聚體的混合物。納入Flag標(biāo)簽便于在序貫分離步驟中使用抗Flag抗體和抗因子VIII抗體通過親和層析來分離異二聚體(稱為“BDDFc”)，如圖2中所顯示的。然而，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)領(lǐng)會，即使沒有提供肽標(biāo)簽，會有可能使用本領(lǐng)域中公知的技術(shù)，例如大小排阻層析來分離異二聚體形式。使用 ρΜΙΙΟ 作為模板,使用弓丨物 CES49(5，-atatgatatcgcggccgccgccaccatggtgt tgcagacccaggtcttcatttctctgttgctctggatctctggtgcctacggggactacaaagacgatgacgacaagg tgcccagggattgtggttg-3')(SEQ ID NO :41)禾口 CES 50(5' -ttcgatctcgagtcatttaccaggaga gtgggagagg-3' ) (SEQ ID NO :42)來PCR擴增在其5，(氨基端)末端具有Flag標(biāo)簽的鼠 Fc區(qū)(具有鉸鏈)。將此片段用NotIAhoI消化，并連接到經(jīng)NotIAhoI消化的表達(dá)載體 PAGE16，以生成質(zhì)粒pM119 (即pAGE16. mFc+鉸鏈· Flag)。隨后，將含有mFc+鉸鏈· Flag區(qū)的pM119的Hindlll/Xhol片段亞克隆到經(jīng)Hindlll/Xhol消化的表達(dá)質(zhì)粒pEAK flCMV W/ GFP中，并稱作pM130。實施例4以下實施例描述了使用編碼因子VIII B域缺失型(BDD)蛋白的核酸和編碼IgGl、 IgG2、IgG3、或IgG4的人Fc區(qū)之任一、或IgGU IgG2、IgG3、或IgG4的人Fc區(qū)的非鉸鏈部分之任一的核酸來構(gòu)建因子VIII融合基因(稱為“BDD.人Fe”)。舉例而言，可以通過將源自IgGl Fc的227個氨基酸殘基或214個氨基酸殘基插入因子FVIII的特定位點(例如在N-745和S-1637之間)以模擬B域來生成小鼠因子VIII融合異二聚體。BDD.人Fc(來自IgGl、IgG2、IgG3、或IgG4抗體)表達(dá)載體的構(gòu)建遵循與BDD-鼠 Fc表達(dá)構(gòu)建體的上述策略相同的策略。將pM109質(zhì)粒用Avrll/Aflll消化，并將以AvrII/ AflII為邊界的Fc+鉸鏈和Fc-鉸鏈插入相應(yīng)的位點中。然后，將所得的質(zhì)粒(其具有pSK 主鏈)用NheI和RiieI消化，并將BDDFc片段連接到pSS207以創(chuàng)建穩(wěn)定的細(xì)胞克隆。類似地，構(gòu)建PCEP4.人Fc單體質(zhì)粒。例示性的人IgG Fc區(qū)核酸編碼序列包括SEQ ID NO :8 (人IgGl的Fc區(qū))、SEQ ID NO :10(人 IgG2 的 Fc 區(qū))、SEQ ID NO :12(人 IgG3 的 Fc 區(qū))、禾口 SEQ IDNO :14(人 IgG4 的 Fc區(qū))?；蛘?，可以使用編碼與SEQ ID NO :9(人IgGl的Fc區(qū))、SEQ ID NO :11(人IgG2 的 Fc 區(qū))、SEQ ID NO :13(人 IgG3 的 Fc 區(qū))、和 SEQ ID NO :15 (人 IgG4 的 Fc 區(qū))相同的氨基酸序列(或具有至少90%同一性的氨基酸序列)的核酸序列。例示性非鉸鏈部分人IgG Fc區(qū)核酸編碼序列包括SEQ ID NO 16 (人IgGl的Fc區(qū)的非鉸鏈部分)、SEQ ID NO 18 (人IgG2的Fc區(qū)的非鉸鏈部分)、SEQ ID NO 20 (人IgG3的Fc區(qū)的非鉸鏈部分)、和 SEQ ID而22(人1864的？(區(qū)的非鉸鏈部分)。或者，可以使用編碼與SEQ ID NO :17(人 IgGl的Fc區(qū)的非鉸鏈部分)、SEQ ID NO :19 (人IgG2的Fc區(qū)的非鉸鏈部分)、SEQ ID NO 21 (人IgG3的Fc區(qū)的非鉸鏈部分)、和SEQ ID NO 23 (人IgG4的Fc區(qū)的非鉸鏈部分)相同的氨基酸序列(或具有至少90%同一性的氨基酸序列)的核酸序列。實施例5以下實施例描述了編碼雜合因子VIII融合異二聚體的單順反子因子VIII融合基因的構(gòu)建。翻譯的因子VIII融合蛋白含有替換全長FVIII的B域的兩個串聯(lián)的mFc+鉸鏈區(qū)。如下構(gòu)建表達(dá)質(zhì)粒使用pM117(pSK207+BDD.mFc+鉸鏈)作為模板，用兩組寡聚物的 PCR 來進行第一組是 CES36/CES51，其創(chuàng)建以 AvrII (CES36 :5，-agcttcctaggagcttctcc cagaacgtgcccagggattgtggttg-3‘) (SEQ ID NO :30)禾口 SacII(CES51 :5'-cagttgccgcgggct ttaccaggagagtgggagagg-3，)(SEQ ID NO :35)為邊界的 mFc 片段，而第二組引物是 CES52/ CES39, ^^lJMlii, SacII (CES52 5' -ttcgcccgcggcaagagagactacaaagacgatgacgacaaggtgcc cagggattgtggttg-3，)(SEQ ID NO :35)禾口AflII(CES39 :5，_agctacttaaggactggtgggttctgg gatttaccaggagagtgggagag-3，)(SEQ ID NO 31)為邊界的mFc片段。在適當(dāng)消化并連接時， 這兩個所得的PCR片段給出單順反子BDD基因，其按次序含有Al、al、A2、a2域、B域的前 5個N端氨基酸、然后是mFc+鉸鏈區(qū)、弗林蛋白酶(furin)共有序列(KARGKR(SEQ ID NO 36)，其中第一個賴氨酸(K)是 Fc 區(qū)的末端)、Flag 標(biāo)簽(DYKDDDDK) (SEQ ID NO 37) ,mFc+ 鉸鏈、B域的最后12個C端氨基酸、和最后FVIII的a3、A3、Cl和C2域(圖4)。為了構(gòu)建上述單體基因，將兩個PCR片段用Avrll/SacII或SacII/Aflll消化，并經(jīng)由三重連接，將其克隆入經(jīng)Avrll/Aflll消化的pM109(pSK207.BDD)中。將成功的克隆測序，然后將一個從 (pM109的)pSK207主鏈經(jīng)由Nhel/Pmel克隆到表達(dá)載體，即經(jīng)Nhel/Pmel消化的pSK207。 在蛋白質(zhì)的合成和分泌期間，最初在Flag-mFc區(qū)上游的弗林蛋白酶位點處及剛好在a3上游的蛋白酶位點處切割分子。分子會以成熟的FVIII 二聚體(其中用mFc替換B域)循環(huán)， 所述成熟的FVIII 二聚體具有經(jīng)由Fc-Fc 二硫化物相互作用與FVIII分子的mFc區(qū)結(jié)合的 Flag mFc分子(BDDFc)，如圖2中所顯示的。使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法來自存在于上清液中的任何同二聚體產(chǎn)物分離異二聚體產(chǎn)物。實施例6以下實施例描述了可用于瞬時轉(zhuǎn)染哺乳動物宿主細(xì)胞及其細(xì)胞培養(yǎng)的通用規(guī)程。 將HKBll細(xì)胞在軌道搖動器(100-125rpm)上在5% CO2培養(yǎng)箱中于37°C在無蛋白質(zhì)培養(yǎng)基中以懸浮培養(yǎng)物培養(yǎng)，并以0. 25-1. 5x IO6個細(xì)胞/mL的密度維持。通過以1，OOOrpm離心5 分鐘來收集供轉(zhuǎn)染用的HKBll細(xì)胞，然后將其在Fre必tyle 293表達(dá)培養(yǎng)基anvitrogen Corporation，CarIskid，CA)中以1. Ix IO6個細(xì)胞/mL重懸。將細(xì)胞在6孔板中接種 (4. 6mL/孔)，并在軌道旋轉(zhuǎn)儀(125rpm)上在37°C CO2培養(yǎng)箱中溫育。對于每個孔，將5 μ g 質(zhì)粒 DNA 與 0. 2ml Opti-MEM I 培養(yǎng)基(Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA)混合。 對于每個孔，將 7 μ 1 2931^(^in 試齊[J (Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA)與 0. 2ml. Opti-MEM I培養(yǎng)基溫和地混合，并于室溫溫育5分鐘。將稀釋的^3FeCtinTM添加至稀釋的DNA溶液，溫和地混合，于室溫溫育20-30分鐘，然后添加至已經(jīng)用切IO6個(4. 6mL) HKBll細(xì)胞接種的每孔。然后，將細(xì)胞在軌道旋轉(zhuǎn)儀(125rpm)上在CO2培養(yǎng)箱中于37°C溫育3天，之后通過以IOOOrpm離心5分鐘來使細(xì)胞沉淀，然后收集上清液，并于_80°C貯存。實施例7以下實施例描述了可用于通過Western印跡來驗證因子VIII融合異二聚體的重組生成的通用規(guī)程。將細(xì)胞培養(yǎng)物上清液通過Centricon (Millipore Corporation, Billerica, ΜΑ)來濃縮10倍(此時不使用二抗來探查)或使用純的(此時使用二抗來探查)。將50 μ 1上清液與20 μ 1具有DTT(還原性)或沒有DTT(非還原性)的虹 SDS-PAGE上樣染料混合，于95°C加熱5分鐘，然后加載到10% NuPAGE 凝膠Gnvitrogen Corporation, Carlsbad, CA)上(在還原性條件下)或到 4-20 % NuPAGE 凝膠 (Bis-Tris-MOPs)上(在非還原性條件下)。將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜。在用5%乳/ PBS封閉60分鐘后，將膜與針對小鼠IgG(H+L)的經(jīng)辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的兔多克隆抗體或綴合有HRP的抗因子VIII C域抗體一起溫育。還有，可以使用抗人因子VIII兔單克隆抗體(Epitomics，CA)來檢測因子VIII的輕鏈。然后，將膜與抗兔IgG-HRP 二抗于室溫一起溫育60分鐘。在用PBS/0. 1% Tween -20(聚氧乙烯失水山梨糖醇單月桂酸酯) 清洗印跡后，使用化學(xué)發(fā)光底物(ECL) (Pierce, Rockford, IL)及暴露于χ-射線膠片來檢測來自HRP的信號。實施例8以下實施例描述了可用于通過ELISA來測量細(xì)胞培養(yǎng)物上清液中的因子VIII抗原濃度的通用規(guī)程。將細(xì)胞培養(yǎng)物上清液在PBS/BSA/Tween -20緩沖液中稀釋以達(dá)到標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍內(nèi)的信號。例如，可以使用在PBS/BSA/Tween -20中稀釋的純化的因子VIII BDD蛋白(比活性9，700個IU/mg)來創(chuàng)建lOOng/mL-O. 2ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)曲線。將稀釋的樣品和標(biāo)準(zhǔn)品添加至用多克隆抗因子VIII捕捉抗體C2預(yù)包被的ELISA板。在添加生物素化的C2作為檢測抗體后，將平板于室溫溫育1小時，廣泛清洗，然后使用TMB底物(3，3’，5， 5’ -四甲基聯(lián)苯胺)來顯現(xiàn)，如由試劑盒制造商(Pierce，Rockford, IL)所描述的?？梢?il!用 SpectraMax 讀ISi義(Spectra Max 340pc, MolecularDevices, Sunnyvale, CA) VX 450nM測量信號。將標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合至四參數(shù)模型，并從曲線外推未知物的數(shù)值。作為上述規(guī)程(其對完整的因子VIII融合異二聚體不是特異的)的備選，使用利用抗因子VIII抗體作為捕捉抗體(或檢測抗體)和對半衰期調(diào)控劑特異性的抗體作為檢測抗體(或捕捉抗體)的ELISA測定法。實施例9以下實施例描述了可用于以96孔格式使用商業(yè)生色測定試劑盒(Coatest SP4 FVIII，Chromogenix, Lexington, ΜΑ)來測量細(xì)胞培養(yǎng)物上清液和純化的級分中的因子VIII融合異二聚體的活性的通用規(guī)程。將一式三份樣品在試劑盒測定緩沖液(50mM Tris, pH 7. 3,10mg/L ciprofloxin 和 1· 0% BSA)中稀釋至 25 μ 1，并添加至各孔。然后， 將50 μ L磷脂、因子IXa、因子X溶液添加至每孔，并于37°C在水平搖動器上溫育4分鐘。 將25μ1 CaCl2溶液Q5mM)立即添加至各孔，并以相同的方式溫育10分鐘。添加生色底物溶液(50yL/孔)，并如前述那樣將平板溫育10分鐘，之后通過添加25μ1 20%乙酸來使顏色顯現(xiàn)停止。在 96 孔讀板儀(SpectraMax 340pc，Molecular Devices, Sunnyvale,CA)上以405nm吸光度測量個別的孔。相對于范圍為在與未知物相同的緩沖液中稀釋的 500-0. 5mlU/mL純化的因子VIII B域缺失型(BDD)標(biāo)準(zhǔn)品定量因子VIII活性，并將其擬合至四參數(shù)模型。從Coates 和因子VIII ELISA的結(jié)果計算比活性(IU/mg FVIII)。實施例10以下實施例描述了可用于使用aPTT測定法來測量細(xì)胞培養(yǎng)物上清液和純化的級分中的因子VIII融合異二聚體的凝固活性的通用規(guī)程。可以使用因子VIII缺陷的人血漿中的aPTT測定法通過Electra 1800C自動化凝固分析儀(Beckman Coulter Inc., Fullerton,CA)來測定因子VIII凝固活性。簡言之，通過儀器創(chuàng)建凝固稀釋劑中的上清液樣品的三個稀釋物，然后將100 μ 1與100 μ 1因子VIII缺陷的血漿和100 μ 1自動化aPTT 試劑(兔腦磷脂和微粉化硅土，bioMerieux，Inc. , Durham, NC)混合。在添加100 μ 1 25mM CaCl2溶液后，記錄凝塊形成前時間。使用在ELISA測定法中用作標(biāo)準(zhǔn)品的相同的純化的因子VIII BDD的系列稀釋來對每次運行產(chǎn)生標(biāo)準(zhǔn)曲線。標(biāo)準(zhǔn)曲線是線性的，具有0.95或更好的相關(guān)系數(shù)，并用于測定未知樣品的因子VIII活性。實施例11以下實施例描述了使用實施例1和2中所描述的載體進行的細(xì)胞系的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染和創(chuàng)建。使用293 ^(^ ηΤΜ試劑用質(zhì)粒DNA、pSK207BDDFc+鉸鏈、或pSK207BDDFc_鉸鏈轉(zhuǎn)染HKBll細(xì)胞，如實施例6中所描述的。將經(jīng)轉(zhuǎn)染的細(xì)胞以多個稀釋(1 100 ；1 1000 ； 1 10, 000)分成100-mm培養(yǎng)皿，并在補充有5 % FBS和200 μ g/mL潮霉素Qnvitrogen Corporation, Carlsbad, CA)的DMEM-F12培養(yǎng)基中維持約2周。將個別的單集落挑出，并使用無菌克隆盤(Scienceware Bel-Art Products, Pequannock, NJ)來將其轉(zhuǎn)移到 6 孔板中。將超過50個用pSK207BDDFc+鉸鏈轉(zhuǎn)染的HKBll細(xì)胞克隆建立并儲存。如圖5中所顯示通過因子VIII活性測定法(上文所描述的Coatest⑧和aPTT測定法)，如圖6中所顯示通過因子VIII ELISA(上文所描述的)，及通過生長測定法來對這些克隆篩選因子VIII 融合異二聚體的高表達(dá)。圖6中顯示了具有最高表達(dá)水平的6個細(xì)胞系。BDDFc+鉸鏈的最高克隆，即克隆8在粘附培養(yǎng)時表達(dá)約1 μ g/mL融合蛋白。來自克隆8條件化培養(yǎng)基的 BDDFc+鉸鏈的比活性是約5，000-8, 000個IU/mg，這與其來源的BDD因子VIII蛋白相當(dāng)。 使用相似的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染和選擇規(guī)程，BDDFc-鉸鏈的克隆(克隆t)測定為在粘附培養(yǎng)時表達(dá)約1 μ g/mL融合蛋白。實施例12以下實施例描述了使用 10L WAVE 生物反應(yīng)器 (GE Healthcare, Piscataway, NJ) 來放大穩(wěn)定轉(zhuǎn)化子的蛋白質(zhì)表達(dá)。將克隆8和克隆t細(xì)胞在補充有5% FBS和200 μ g/mL 潮霉素的DMEM-F12培養(yǎng)基中維持。將細(xì)胞每3天以1 4從T75分到T225燒瓶。對于細(xì)胞適應(yīng)，將來自12個T225燒瓶的約10億個細(xì)胞轉(zhuǎn)移到2L或3L-Erlenmyer燒瓶中無血清的補充有2. 5% FBS的IL懸浮培養(yǎng)基中。2天后，將細(xì)胞擴充到補充有1. 25% FBS的無血清懸浮培養(yǎng)基中。然后，將細(xì)胞轉(zhuǎn)移到補充有5%人血漿蛋白質(zhì)溶液(HPPQ的無血清懸浮培養(yǎng)基中。將約100-150億個細(xì)胞以約1百萬/ml的密度在10L WAVE生物反應(yīng)器 袋中在培養(yǎng)基中接種。3天后，細(xì)胞密度已經(jīng)達(dá)到5-6百萬/mL，并收獲條件化培養(yǎng)基。首先，通過用 Contifuge Stratos (Thermo Fisher Scientific, ffaltham, MA)以 6，OOOrpm 且以 150mL/分鐘的流速(如由蠕動泵控制的)的連續(xù)離心來將粗培養(yǎng)基澄清以除去細(xì)胞碎片。將澄清的培養(yǎng)基與Triton X-100 (聚乙二醇叔-辛基苯基醚)(多至0. 05% )混合，并通過在IOkDa Pellicon切向流膜(Millipore,Billerica,MA)上的超濾來將其濃縮約10倍。 將蔗糖添加至濃縮物至1%，之后于_80°C冷凍。純化前的重組生成的因子VIII融合異二聚體的比活性測定為對于由克隆8生成的BDDFc+鉸鏈為10，629個IU/mg，及由克隆t所生成的BDDFc-鉸鏈為11，122個IU/mg。實施例13以下實施例描述了從克隆8的放大培養(yǎng)物純化因子VIII融合異二聚體。使用抗因子VIII單克隆抗體親和柱(C7F7)，接著用陰離子交換Q-kpharose 柱(GE Healthcare, Piscataway，NJ)來從HKB 11細(xì)胞條件化培養(yǎng)基純化因子VIIIBDDFc+鉸鏈?？偦厥章式咏?0%。將來自IOL WAVE生物反應(yīng)器""袋的冷凍濃縮物融化，并使用AKTA 純化儀系統(tǒng)(Amersham Pharmacia, Uppsala, SW)以ImL/分鐘加載到免疫親和柱上，然后用緩沖液 (20mM咪唑、0. OlM CaCl2、0. 5M NaCl、0. 01 % Tween -80 (聚氧乙烯失水山梨糖醇單油酸酯)，pH 7.0)洗柱。用含有1.0M CaCl2的緩沖液洗脫結(jié)合的因子VIII BDDFc+鉸鏈。通過 Coatest 測定法來對級分測定因子VIII活性，并將活性級分合并，在HiTrapTM26/10脫鹽柱G25M(Amersham Biosciences, Uppsala, Sff)上緩沖液更換成離子交換上樣緩沖液QOmM 咪唑、IOmM CaCl2,200mM NaCl、0. 01% Tween _80，pH 7· 0)。將蛋白質(zhì)加載到 Iml Hi Trap Q HP 柱(Amersham Biosciences, Uppsala, Sff)上，并用 NaCl 梯度 QOOmM-lOOOmM)洗脫。 通過Coatest 測定法來對級分測定因子VIII活性，并合并峰級分。測定蛋白質(zhì)濃度和比活性。最好的級分(即，圖7的第8道中的級分5)的純度是約80%，如通過SDS-PAGE和 SimplyBlue 染色anvitrogen，Carl skid，CA)所評估的。純化的融合蛋白含有Fc域，因為它們在Western印跡分析中通過抗Fc抗體檢出。純化的材料的比活性是約10，000個IU/ mg。此比活性與因子VIII BDD (其衍生BDDFc+鉸鏈)非常相當(dāng)，這提示了 BDDFc+鉸鏈?zhǔn)峭耆钚缘?。實施?4以下實施例描述了對重組生成的因子VIII融合異二聚體的內(nèi)毒素測試。使用動力學(xué)生色鱟阿米巴狀細(xì)胞溶胞物測定法(Endosafe 試劑盒)以0. 005個EU/mL的靈敏度測定純化的蛋白質(zhì)溶液的內(nèi)毒素水平。發(fā)現(xiàn)BDDFc+鉸鏈中的內(nèi)毒素水平是1. 3-2. 0個EU/ mL，其剛好在5個EU/劑下。實施例15以下實施例描述了使用純化的BDDFc+鉸鏈、純化的BDDFc-鉸鏈、和衍生這些因子 VIII融合異二聚體的因子VIII蛋白(“BDD-FVIII”)進行的正常小鼠中的藥動學(xué)研究。 以50 μ g/kg體重給正常的C57雄性小鼠靜脈內(nèi)注射單劑BDD和融合蛋白(BDDFc+鉸鏈或 BDDFc-鉸鏈)。在注射后的 t = 0,0. 083,0. 5、2、4、6、8、24、28、32、48、和 72 小時時收集血液樣品(每個時間點5只小鼠)。對于藥動學(xué)分析，測定血液樣品中的蛋白質(zhì)水平(通過抗原ELISA)和凝固活性(通過Coatest 測定法)兩者。表1中報告了結(jié)果。表1
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權(quán)利要求
1.一種包含因子VIII蛋白或多肽的因子VIII融合蛋白或因子VIII融合異二聚體，其中調(diào)控劑的氨基酸序列存在于B域中，或者用調(diào)控劑的氨基酸序列替換B域的一些或所有氨基酸序列。
2.權(quán)利要求1的因子VIII融合蛋白或因子VIII融合異二聚體，其中所述調(diào)控劑是半衰期調(diào)控劑。
3.權(quán)利要求1的因子VIII融合蛋白或因子VIII融合異二聚體，其中所述調(diào)控劑的氨基酸是糖基化的。
4.權(quán)利要求1的因子VIII融合蛋白或因子VIII融合異二聚體，其中所述調(diào)控劑是免疫球蛋白的Fc區(qū)或其變體，或Fcfoi結(jié)合肽或其變體。
5.權(quán)利要求1的因子VIII融合蛋白或因子VIII融合異二聚體，其中所述調(diào)控劑是自人IgG、IgE、IgD或IgM或其變體、或小鼠IgG、IgA、IgM獲得的免疫球蛋白的Fc區(qū)或其變體。
6.權(quán)利要求1的因子VIII融合蛋白或因子VIII融合異二聚體，其中所述因子VIII蛋白或多肽缺失一些或整個所述B域。
7.權(quán)利要求1的因子VIII融合蛋白或因子VIII融合異二聚體，其包含與SEQID NO=I 的氨基酸20-764相同的第一氨基酸序列、與SEQ ID NO :1的氨基酸1656-2351相同的第二氨基酸序列和調(diào)控劑氨基酸序列，其中(1)所述調(diào)控劑氨基酸序列在其氨基端共價附接于所述第一氨基酸序列的羧基端，且在其羧基端共價附接于所述第二氨基酸的氨基端或(2) 所述調(diào)控劑氨基酸序列在其氨基端共價附接于所述第一氨基酸序列的羧基端，且所述調(diào)控劑氨基酸序列不共價附接于所述第二氨基酸序列。
8.權(quán)利要求6的因子VIII融合蛋白或因子VIII融合異二聚體，其中所述調(diào)控劑是免疫球蛋白的Fc區(qū)或其變體，或Fcfoi結(jié)合肽或其變體。
9.權(quán)利要求6的因子VIII融合蛋白或因子VIII融合異二聚體，其中所述調(diào)控劑是自人IgG、IgE、IgD或IgM、或小鼠IgG、IgA、IgM獲得的免疫球蛋白的Fc區(qū)或其變體。
10.編碼因子VIII融合蛋白的核酸，其中所述因子VIII融合蛋白包含因子VIII蛋白， 其中調(diào)控劑的氨基酸序列存在于B域中，或者用調(diào)控劑的氨基酸序列替換B域的一些或所有氨基酸序列。
11.權(quán)利要求10的核酸，其中所述調(diào)控劑是免疫球蛋白的Fc區(qū)或其變體，或Fcfoi結(jié)合肽或其變體。
12.權(quán)利要求10的核酸，其中所述調(diào)控劑是自人IgG、IgE、IgD或IgM、或小鼠IgG、IgA、 IgM獲得的免疫球蛋白的Fc區(qū)或其變體。
13.權(quán)利要求10的核酸，其中所述因子VIII蛋白缺失一些或整個B域。
14.權(quán)利要求10的核酸，其中所述因子VIII融合蛋白包含與SEQID NO 1的氨基酸 20-764相同的第一氨基酸序列、與SEQ ID NO :1的氨基酸1656-2351相同的第二氨基酸序列和調(diào)控劑氨基酸序列，其中所述調(diào)控劑氨基酸序列在其氨基端共價附接于所述第一氨基酸序列的羧基端，且在其羧基端共價附接于所述第二氨基酸的氨基端。
15.權(quán)利要求14的核酸，其中所述調(diào)控劑是免疫球蛋白的Fc區(qū)或其變體，或Fcfoi結(jié)合肽或其變體。
16.權(quán)利要求15的核酸，其中所述調(diào)控劑是自人IgG、IgE、IgD或IgM、或小鼠IgG、IgA、IgM獲得的免疫球蛋白的Fc區(qū)或其變體。
17.包含權(quán)利要求10的核酸的載體。
18.包含權(quán)利要求10的核酸的宿主細(xì)胞。
19.用于生成權(quán)利要求1的因子VIII融合蛋白或因子VIII融合異二聚體的方法，包括(a)提供經(jīng)編碼因子VIII融合蛋白或因子VIII融合異二聚體的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞；(b)培養(yǎng)該細(xì)胞；并(c)分離所述因子VIII融合蛋白或因子VIII融合異二聚體。
20.權(quán)利要求19的方法，其中所述宿主細(xì)胞是哺乳動物宿主細(xì)胞，且所述調(diào)控劑的氨基酸序列是糖基化的。
21.權(quán)利要求19的方法，其中所述調(diào)控劑是免疫球蛋白的Fc區(qū)或其變體，或Fcfoi結(jié)合肽或其變體。
22.權(quán)利要求19的方法，其中所述因子VIII融合蛋白或因子VIII融合異二聚體包含與SEQ ID NO :1的氨基酸20-764相同的第一氨基酸序列、與SEQ ID N0:1的氨基酸 1656-2351相同的第二氨基酸序列和調(diào)控劑氨基酸序列，其中(1)所述調(diào)控劑氨基酸序列在其氨基端共價附接于所述第一氨基酸序列的羧基端，且在其羧基端共價附接于所述第二氨基酸的氨基端或( 所述調(diào)控劑氨基酸序列在其氨基端共價附接于所述第一氨基酸序列的羧基端，且所述調(diào)控劑氨基酸序列不共價附接于所述第二氨基酸序列。
23.藥物組合物，其包含權(quán)利要求1的因子VIII融合蛋白或因子VIII融合異二聚體和藥學(xué)可接受載體。
24.治療遺傳性和獲得性凝固缺陷的方法，包括對有此需要的患者施用治療有效量的權(quán)利要求23的藥物組合物。
25.權(quán)利要求M的方法，其中所述遺傳性和獲得性凝固缺陷是血友病A。
26.權(quán)利要求5的因子VIII融合蛋白或因子VIII融合異二聚體，其中所述調(diào)控劑是人或小鼠IgG的Fc區(qū)、具有非功能性鉸鏈(通過所述鉸鏈區(qū)中的半胱氨酸殘基的取代或缺失得到)的人或小鼠IgG的Fc區(qū)變體、或人或小鼠IgG的Fc區(qū)的非鉸鏈部分。
27.權(quán)利要求沈的因子VIII融合蛋白或因子VIII融合異二聚體，其中所述調(diào)控劑具有選自下組的氨基酸序列SEQ ID NO :9、11、13、15、29、17、19、21、23、30，和與 SEQ ID NO: 9、11、13、15、29、17、19、21、23、30之任一項具有至少95%氨基酸同一性的序列。
28.權(quán)利要求9的因子VIII融合蛋白或因子VIII融合異二聚體，其中所述調(diào)控劑是人或小鼠IgG的Fc區(qū)、具有非功能性鉸鏈(通過所述鉸鏈區(qū)中的半胱氨酸殘基的取代或缺失得到)的人或小鼠IgG的Fc區(qū)變體、或人或小鼠IgG的Fc區(qū)的非鉸鏈部分。
29.權(quán)利要求觀的因子VIII融合蛋白或因子VIII融合異二聚體，其中所述調(diào)控劑具有選自下組的氨基酸序列SEQ ID NO :9、11、13、15、29、17、19、21、23、30，和與 SEQ ID NO: 9、11、13、15、29、17、19、21、23、30之任一項具有至少95%氨基酸同一性的序列。
30.權(quán)利要求12的核酸，其中所述調(diào)控劑是人或小鼠IgG的Fc區(qū)、具有非功能性鉸鏈 (通過所述鉸鏈區(qū)中的半胱氨酸殘基的取代或缺失得到)的人或小鼠IgG的Fc區(qū)變體、或人或小鼠IgG的Fc區(qū)的非鉸鏈部分。
31.權(quán)利要求30的核酸，其中所述調(diào)控劑具有選自下組的氨基酸序列SEQID NO :9、 11、13、15、29、17、19、21、23、30，和與 SEQ ID NO :9、11、13、15、29、17、19、21、23、30之任一項具有至少95%氨基酸同一性的序列。
32.權(quán)利要求16的核酸，其中所述調(diào)控劑是人或小鼠IgG的Fc區(qū)、具有非功能性鉸鏈 (通過所述鉸鏈區(qū)中的半胱氨酸殘基的取代或缺失得到)的人或小鼠IgG的Fc區(qū)變體、或人或小鼠IgG的Fc區(qū)的非鉸鏈部分。
33.權(quán)利要求32的核酸，其中所述調(diào)控劑具有選自下組的氨基酸序列SEQID NO :9、 11、13、15、29、17、19、21、23、30，和與 SEQ ID NO :9、11、13、15、29、17、19、21、23、30之任一項具有至少95%氨基酸同一性的序列。
34.包含權(quán)利要求31的核酸的載體。
35.包含權(quán)利要求31的核酸的宿主細(xì)胞。
36.包含權(quán)利要求33的核酸的載體。
37.包含權(quán)利要求33的核酸的宿主細(xì)胞。
38.權(quán)利要求21的方法，其中所述調(diào)控劑是人或小鼠IgG的Fc區(qū)、具有非功能性鉸鏈 (通過所述鉸鏈區(qū)中的半胱氨酸殘基的取代或缺失得到)的人或小鼠IgG的Fc區(qū)變體、或人或小鼠IgG的Fc區(qū)的非鉸鏈部分。
39.權(quán)利要求38的方法，其中所述調(diào)控劑具有選自下組的氨基酸序列SEQID NO :9、 11、13、15、29、17、19、21、23、30，和與 SEQ ID NO :9、11、13、15、29、17、19、21、23、30之任一項具有至少95%氨基酸同一性的序列。
40.權(quán)利要求21的方法，其中所述調(diào)控劑是人或小鼠IgG的Fc區(qū)、具有非功能性鉸鏈 (通過所述鉸鏈區(qū)中的半胱氨酸殘基的取代或缺失得到)的人或小鼠IgG的Fc區(qū)變體、或人或小鼠IgG的Fc區(qū)的非鉸鏈部分。
41.權(quán)利要求22的方法，其中所述調(diào)控劑是人或小鼠IgG的Fc區(qū)、具有非功能性鉸鏈 (通過所述鉸鏈區(qū)中的半胱氨酸殘基的取代或缺失得到)的人或小鼠IgG的Fc區(qū)的變體、 或人或小鼠IgG的Fc區(qū)的非鉸鏈部分。
42.權(quán)利要求40的方法，其中所述調(diào)控劑具有選自下組的氨基酸序列SEQID NO :9、 11、13、15、29、17、19、21、23、30，和與 SEQ ID NO :9、11、13、15、29、17、19、21、23、30之任一項具有至少95%氨基酸同一性的序列。權(quán)利要求20的方法，其中所述調(diào)控劑是人或小鼠IgG 的Fc區(qū)、具有非功能性鉸鏈(通過所述鉸鏈區(qū)中的半胱氨酸殘基的取代或缺失得到)的人或小鼠IgG的Fc區(qū)的變體、或人或小鼠IgG的Fc區(qū)的非鉸鏈部分。
43.權(quán)利要求3-8中任一項的因子VIII融合蛋白或因子VIII融合異二聚體，其中所述調(diào)控劑是半衰期調(diào)控劑。
44.權(quán)利要求10的核酸，其中所述調(diào)控劑是半衰期調(diào)控劑。
45.權(quán)利要求19的方法，其中所述調(diào)控劑是半衰期調(diào)控劑。
全文摘要
公開了一種包含因子VIII的因子VIII融合蛋白或因子VIII融合異二聚體，其中調(diào)控劑的氨基酸序列存在于B域中，或用調(diào)控劑的氨基酸序列替換B域的一些或所有氨基酸序列。還公開了編碼發(fā)明性融合蛋白和融合異二聚體的核酸，也公開了用于生成融合蛋白和融合異二聚體、藥物組合物的方法及用發(fā)明性融合分子治療凝固缺陷的方法。
文檔編號A61K35/14GK102427823SQ201080021410
公開日2012年4月25日 申請日期2010年3月24日 優(yōu)先權(quán)日2009年3月24日
發(fā)明者D.W.施耐德, J.E.墨菲, P.J.克雷奇默, T.E.湯普森, 趙曉燕 申請人:拜耳醫(yī)藥保健有限公司