專利名稱：增加肝臟增殖的方法
增加肝臟增殖的方法相關(guān)申請(qǐng)本申請(qǐng)要求于2009年7月14日提交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)?zhí)?1/225，388的權(quán)益。將上述申請(qǐng)的全部傳授內(nèi)容通過(guò)弓I用結(jié)合在此。政府支持本發(fā)明全部地或部分地由來(lái)自國(guó)家糖尿病和消化及腎臟疾病研究所(National Institute of Diabetes and Digestive and Kidney Diseases)的資助金 K08 支持。政府對(duì)本發(fā)明具有一定的權(quán)利。
背景技術(shù)：
再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域已經(jīng)在努力改善在肝臟損傷或切除手術(shù)之后患有肝衰竭或不充足的肝臟質(zhì)量的病人的存活率。在很少臨床案例中當(dāng)對(duì)具有這些情形的病人進(jìn)行治療時(shí)成功與失敗之間的分隔線是明顯的損傷后的成功的肝臟恢復(fù)通常隨之帶來(lái)完全的健康恢復(fù)， 然而失敗的恢復(fù)導(dǎo)致需要肝臟移植或死亡。在肝臟再生或修復(fù)方面甚至微小增加的改進(jìn)對(duì)改變從死亡到健康的完全恢復(fù)的結(jié)果都可能是充足的。在患有急性肝衰竭的病人中，增強(qiáng)修復(fù)的能力可以將不可恢復(fù)的肝臟的情況轉(zhuǎn)換成受影響的肝臟可以完全恢復(fù)健康的情況。在美國(guó)每年患有泰諾 (撲熱息痛)過(guò)量、急性病毒性肝炎或其他的有傳染性的起因、代謝紊亂或毒性刺激的群體包括兩萬(wàn)(20000)病人(Hoofnagle等人，19%)。遭受這些疾病痛苦的病人通常是年輕的并且具有很少其他的醫(yī)學(xué)癥狀，從而如果受影響的肝臟可以被誘導(dǎo)恢復(fù)或再生，很可能產(chǎn)生完全恢復(fù)。經(jīng)受肝臟手術(shù)的病人群體可能經(jīng)歷小肝綜合征。當(dāng)使用完整的器官、分割的器官或肝臟供體時(shí)這發(fā)生在癌癥切除術(shù)或移植之后。在許多這種情形中，該剩余的肝臟質(zhì)量不足以支撐生命。此小肝綜合征顯示為移植體功能異常并且可能導(dǎo)致死亡(Tucker和 Heaton,2005)。由于難以預(yù)測(cè)切除術(shù)后的肝臟質(zhì)量，患有肝癌的病人通常不是對(duì)于肝臟切除術(shù)的候選人。每年全球診斷出患有肝癌的病人多于五十萬(wàn)(500000) (Parkin等人，2002)，幾乎他們的80%在診斷的時(shí)候被確定為不可切除的(Zhu等人，2006)。然而如果進(jìn)行了切除術(shù)， 這些病人很可能將發(fā)展成高膽紅素血癥(即，黃疸病)并且最終發(fā)展成肝衰竭。由于對(duì)于癌癥病人其他的選擇是非常有限的，對(duì)于更多的患有否則不可切除的肝癌的病人，用于增強(qiáng)或增加肝臟再生或修復(fù)的潛在治療將會(huì)大大地增加肝臟切除術(shù)的可能性。開發(fā)將使更多的這些病人是可切除的藥物療法在肝癌的治療中具有深遠(yuǎn)的影響。在活供體肝臟移植過(guò)程中一個(gè)關(guān)鍵性的考慮因素是剩余的供體肝臟的大小連同被移植到接受者的移植體的大小。在成人向兒童的肝臟捐贈(zèng)中，供體手術(shù)是一種左側(cè)段切除術(shù)，已知該手術(shù)是一種安全的手術(shù)。相比之下，在成人向成人的活供體肝臟移植過(guò)程中， 由于該剩余肝臟可能不足以支撐生命，一種完全右或左葉切除術(shù)的必要的使用對(duì)該供體造成了極大的風(fēng)險(xiǎn)(Pomposelli等人，2006)。因此通過(guò)允許使用更小尺寸的移植體來(lái)增強(qiáng)肝臟再生將會(huì)引起成人向成人的活供體肝臟移植的革命。
盡管肝臟移植作為一種用于肝衰竭的療法的巨大成就以及在肝臟內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定中涉及的分子途徑的科學(xué)知識(shí)，一種用于增強(qiáng)肝臟修復(fù)和再生的藥物治療和方法仍然非常需要開發(fā)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明闡明了支持肝臟修復(fù)和再生的過(guò)程的生化反應(yīng)并且在各種臨床背景下對(duì)于各種各樣病人群體提供了用于增強(qiáng)肝細(xì)胞增殖、增加肝臟再生并且預(yù)防和治療肝臟損傷的方法。本發(fā)明基于一種發(fā)現(xiàn)，即骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP)信號(hào)傳導(dǎo)途徑是肝細(xì)胞增殖的一種活性抑制劑并且使用該途徑的一種拮抗劑的治療導(dǎo)致了肝細(xì)胞增殖的增強(qiáng)以及在體內(nèi)的肝臟損傷之后增強(qiáng)的肝臟再生。在一個(gè)第一方面，本發(fā)明提供了通過(guò)將肝細(xì)胞與有效量的骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP) 信號(hào)傳導(dǎo)途徑的一種拮抗劑接觸來(lái)增加肝細(xì)胞增殖的方法。在一個(gè)實(shí)施方案中，該骨形態(tài)發(fā)生蛋白BMP信號(hào)傳導(dǎo)途徑的拮抗劑抑制或下調(diào)了一種組成上有活性的BMP信號(hào)傳導(dǎo)途徑。例如，該BMP信號(hào)傳導(dǎo)途徑是一種BMP2或BMP4-介導(dǎo)的信號(hào)傳導(dǎo)途徑。在又一個(gè)實(shí)施方案中，該BMP信號(hào)傳導(dǎo)途徑的拮抗劑抑制了 I型BMP受體信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。在一個(gè)實(shí)施方案中， 該BMP信號(hào)傳導(dǎo)途徑的拮抗劑通過(guò)結(jié)合到該I型受體上抑制了 I型BMP受體信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，該I型受體包括ALK2、ALK3或ALK6。在另一個(gè)實(shí)施方案中，該BMP信號(hào)傳導(dǎo)途徑的拮抗劑抑制了 SMAD 1、5或8的磷酸化。在一個(gè)實(shí)施方案中，該BMP信號(hào)傳導(dǎo)途徑的拮抗劑抑制了 BMP2或BMP4結(jié)合到一個(gè)BMP受體上或一種II型BMP受體與一種I 型BMP受體的相互作用。在另一個(gè)實(shí)施方案中，該BMP信號(hào)傳導(dǎo)途徑的拮抗劑是一種化學(xué)試劑。該化學(xué)試劑可以是dorsomorphin、LDN193189或它們的類似物。在一個(gè)第二方面中，本發(fā)明是針對(duì)在對(duì)其有需要的哺乳動(dòng)物受試者中在肝臟的部分損失或損傷之后通過(guò)對(duì)該受試者給予有效量的骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP)信號(hào)傳導(dǎo)途徑的一種拮抗劑來(lái)增加肝臟再生的方法。在一個(gè)實(shí)施方案中，對(duì)肝臟的部分損失或損傷是由一種外科或移植操作(例如肝臟切除術(shù))引起的。在另一個(gè)實(shí)施方案中，有需要的受試者遭受了在切除性肝臟手術(shù)后的肝臟功能不全的痛苦。在一個(gè)實(shí)施方案中，有需要的受試者是一種哺乳動(dòng)物，例如人類。例如，有需要的受試者是一種肝臟移植受體或移植供體。在又一個(gè)實(shí)施方案中，該骨形態(tài)發(fā)生蛋白BMP信號(hào)傳導(dǎo)途徑的拮抗劑抑制或下調(diào)了一種組成上有活性的BMP信號(hào)傳導(dǎo)途徑。在一個(gè)實(shí)施方案中，該BMP信號(hào)傳導(dǎo)途徑是一種BMP2或BMP4-介導(dǎo)的信號(hào)傳導(dǎo)途徑。在一個(gè)實(shí)施方案中，該BMP信號(hào)傳導(dǎo)途徑的拮抗劑抑制了 I型BMP受體信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。在一個(gè)實(shí)施方案中，該BMP信號(hào)傳導(dǎo)途徑的拮抗劑通過(guò)結(jié)合到該I型受體上抑制了該I型BMP受體的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，該I型BMP 受體包括ALK2、ALK3或ALK6。在一個(gè)實(shí)施方案中，該BMP信號(hào)傳導(dǎo)途徑的拮抗劑抑制了 SMAD 1、5或8的磷酸化。在又一個(gè)實(shí)施方案中，該BMP信號(hào)傳導(dǎo)途徑的拮抗劑抑制了 BMP2 或BMP4結(jié)合到一個(gè)BMP受體上或一種II型BMP受體與一種I型BMP受體的相互作用。該 BMP信號(hào)傳導(dǎo)途徑的拮抗劑是一種化學(xué)試劑?；瘜W(xué)試劑可以包括，但不限于，dorsomorphin、 LDN193189或它們的類似物。在另一方面，本發(fā)明包括預(yù)防或治療受試者體內(nèi)的肝臟損傷的方法，通過(guò)給予有效量的該骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP)信號(hào)傳導(dǎo)途徑的拮抗劑，這些受試者將會(huì)受益。如上面所描述的，該骨形態(tài)發(fā)生蛋白BMP信號(hào)傳導(dǎo)途徑的拮抗劑抑制或下調(diào)了一種組成上有活性的 BMP信號(hào)傳導(dǎo)途徑。該肝臟損傷可以由一種肝毒性化學(xué)試劑引起。該肝毒性化學(xué)試劑可以包括撲熱息痛。在一個(gè)實(shí)施方案中，該肝臟損傷可以由一種肝臟疾病引起，該肝臟疾病包括，例如肝炎病毒感染、自身免疫性肝炎、肝硬化、急性或慢性肝衰竭、或癌癥。在又一個(gè)方面，本發(fā)明提供了在對(duì)其有需要的受試者體內(nèi)通過(guò)對(duì)該受試者給予有效量的該骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP)信號(hào)傳導(dǎo)途徑的拮抗劑來(lái)增強(qiáng)肝臟再生的方法，其中該拮抗劑抑制了肝臟中的SMAD 1、5或8的BMP2或BMP4-介導(dǎo)的磷酸化。在一個(gè)實(shí)施方案中， 在肝臟的部分損失或損傷之前，將該拮抗劑給予該受試者。在又一個(gè)方面，本發(fā)明涉及通過(guò)將肝細(xì)胞與有效量的dorsomorphin或UM193189 接觸來(lái)增加肝細(xì)胞增殖的一種方法，dorsomorphin或UM193189抑制了肝細(xì)胞中的SMAD 1、5或8的BMP2或BMP4-介導(dǎo)的磷酸化。在過(guò)去，確定肝臟如何應(yīng)答損傷的基本因素是困難的。盡管在肝臟內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定中牽涉了眾多的分子途徑，對(duì)于在切除術(shù)后具有肝臟損傷或不充足的肝臟質(zhì)量的病人而言沒(méi)有有效的療法，尤其通過(guò)增強(qiáng)肝臟再生和修復(fù)。如在此所描述的一種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，該途徑的功能在于通過(guò)在組成上抑制肝細(xì)胞增殖來(lái)負(fù)控制肝臟的生長(zhǎng)，將幫助解決肝臟如何感知其大小并且調(diào)節(jié)其生長(zhǎng)的基礎(chǔ)的謎題，并且能夠提供一種使用潛在療法的獨(dú)特的機(jī)會(huì)。更重要的是，這樣一種信號(hào)傳導(dǎo)途徑可以充當(dāng)一種對(duì)于潛在試劑有用的靶標(biāo)，從而導(dǎo)致了對(duì)于在切除術(shù)后具有肝臟損傷或不充足的肝臟質(zhì)量的病人的一種有效療法的成功開發(fā)。


圖1描述了在小鼠中骨形態(tài)發(fā)生蛋白4(BMP4)的表達(dá)水平，如在三分之二(“2/3”) 肝切除術(shù)后通過(guò)實(shí)時(shí)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)所定量的。顯示了相比于對(duì)照物(即，甘油醛3-磷酸脫氫酶(GAPDH))的BMP4的相對(duì)表達(dá)水平(對(duì)于12- 小時(shí)時(shí)間點(diǎn)P < 0. 05)。圖2描述了在0小時(shí)和36小時(shí)時(shí)間點(diǎn)處在小鼠中相對(duì)于對(duì)照物(GAPDH)BMP4的 RT-PCR產(chǎn)物的有效量。圖3描述了 ALK3蛋白質(zhì)、一種對(duì)于BMP2和BMP4配體的I型BMP受體在小鼠的肝臟中的表達(dá)類型(PV 門靜脈，HN:肝細(xì)胞細(xì)胞核)，如通過(guò)免疫組織化學(xué)使用針對(duì)ALK3蛋白質(zhì)的一種單克隆抗體所顯示的。圖4描述了在暴露于Cre重組酶的被IoxP位點(diǎn)側(cè)翼的BMP4轉(zhuǎn)基因小鼠的肝臟中的BMP4蛋白表達(dá)的蛋白質(zhì)印跡分析(即，“BMP4缺乏”)，如相對(duì)于在野生型肝臟中的BMP4 蛋白表達(dá)。圖5描述了在對(duì)BMP4缺乏小鼠和野生型同窩出生的幼仔2/3肝切除后的KI67增殖指數(shù)(P < 0. 05)。圖6描述了在對(duì)用dorsomorphin (10mg/kg)或鹽水(作為對(duì)照)處理過(guò)的八周齡的小鼠2/3肝切除后的BrdU增殖指數(shù)。圖7描述了作為該總體重的百分比的剩余的肝臟，如在肝切除術(shù)后36小時(shí)和48 小時(shí)處所測(cè)量的。圖8描述了 dorsomorphin類似物的一個(gè)示意性圖示。
具體實(shí)施例方式發(fā)明詳細(xì)說(shuō)明現(xiàn)在已經(jīng)發(fā)現(xiàn)骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP)信號(hào)傳導(dǎo)途徑在哺乳動(dòng)物的肝臟中在組成上是活性的，并且發(fā)現(xiàn)當(dāng)該BMP信號(hào)傳導(dǎo)途徑是活性吋，該途徑的功能是阻止或抑制肝臟中的肝細(xì)胞増殖。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)該BMP信號(hào)傳導(dǎo)途徑的ー種拮抗劑(例如ー種BMP信號(hào)傳導(dǎo)的藥物抑制劑)的給藥在肝臟損傷后能夠增強(qiáng)肝細(xì)胞増殖并且增加肝臟修復(fù)和再生。骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP)是蛋白質(zhì)家族的ー員，最初通過(guò)它們?cè)隗w內(nèi)促使軟骨和骨形成的能力對(duì)它們進(jìn)行鑒定和表征(Reddi, A.H. (1992)Curr, Opin. Cell Biol. 4， 850-855)。迄今為止已經(jīng)對(duì)超過(guò)二十個(gè)BMP進(jìn)行了鑒定和報(bào)道，它們通過(guò)兩個(gè)不同的絲氨酸-蘇氨酸激酶受體被識(shí)別1型以及II型BMP受體。至少三種不同的I型絲氨酸-蘇氨酸激酶受體以及至少三種不同的II型絲氨酸-蘇氨酸激酶受體已經(jīng)被鑒定。這三種經(jīng)鑒定的I型BMP受體是活化素受體樣激酶-2 (ALK2)(也被稱為活化素受體I)，ALK3 (也被稱為BMPR-IA)，以及ALK6 (也被稱為BMPR-IB)并且這些其他的三種經(jīng)鑒定的II型BMP受體包括 BMPRII、ActRIIa 以及 ActRIIb。I型和II型BMP受體都能夠?qū)⒓?xì)胞外的BMP信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)到目標(biāo)細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中，這些目標(biāo)細(xì)胞在它們的細(xì)胞膜上表達(dá)這些受體。已知ニ聚體的BMP配體有助于I型和II型受體的組合以形成ー種異源ニ聚體并且這些受體的此異ニ聚作用允許II型受體來(lái)對(duì)該I 型受體進(jìn)行磷酸化。當(dāng)被磷酸化吋，該I型BMP受體被顯示以對(duì)BMP應(yīng)答的SMAD效應(yīng)物進(jìn)行磷酸化，例如SMAD1、SMAD5以及SMAD8。這些效應(yīng)物的磷酸化以與SMAD4的復(fù)合物反過(guò)來(lái)導(dǎo)致了這些效應(yīng)物的核易位。在該靶細(xì)胞的細(xì)胞核中，磷酸化的SMAD上調(diào)了一組對(duì)這些 BMP信號(hào)(包括，但不限于Id-I)應(yīng)答的基因的表達(dá)。這些BMP通過(guò)II型BMP受體也能夠誘導(dǎo)不依賴于SMAD的信號(hào)，該II型BMP受體基干與BMP的結(jié)合能夠獨(dú)立地激活該絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)p38介導(dǎo)的應(yīng)答。所有的BMP在它們的羧基末端部分中包含特有的七個(gè)高度保守的半胱氨酸并且， 因此屬于轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β (TGF-β)超家族，例如TGF-β、活化素、抑制素以及苗勒氏抑制物質(zhì)(Massague, J. (1990)Annu. Rev. Cell Biol. 6,597-641) 在這些 BMP 之中，BMP2、 BMP3、BMP4、BMP5、BMP6以及BMP7已經(jīng)成為研究的焦點(diǎn)。存在著這些BMP的幾個(gè)代表性成員。BMP2和BMP4通過(guò)具有大約90%的氨基酸一致性彼此是密切相關(guān)的。然而，它們的序列與BMP3、BMP5、BMP6以及BMP7的那些不同的。第二組(BMP5、BMP6以及BMP7)相互顯示大約80%氨基酸一致性，從而留下BMP3以及其他的作為此蛋白質(zhì)家族的第三組。已知這些BMP用于結(jié)合I型和II型BMP受體兩者。例如，BMP2對(duì)I型和II型 BMP 受體兩者都展現(xiàn)了高度特異性(Keller，S. et al. (2004)Nature Structural and Molecular Biology, 11 :481-488)。盡管，II 型受體利用在 BMP2 或 BMP4 與 BMP6 或 BMP7 之間顯著不同。對(duì)BMP2或BMP4相對(duì)于BMP6或BMP7而言觀察到對(duì)BMPRII的較大的依賴性，然而ActRIIa對(duì)通過(guò)BMP6或BMP7比BMP2或BMP4的信號(hào)是更加關(guān)鍵性的(Lavery， K. et al.，(2008) J. Biol. Chem. 283 =20948-20958)。對(duì)于這些I型受體而言還觀察到顯著性差異。ALK3和ALK6被BMP2和BMP4更頻繁地利用，然而ALK2對(duì)于BMP6或BMP7是優(yōu)選的 I 型受體(Lavery, K. et al.，(2008) J. Biol. Chem. 283 :20948-20958 ；Ro et al.，(2004)Oncogen, 23 :3024-3032)。本發(fā)明涉及使用該BMP信號(hào)傳導(dǎo)途徑的ー種拮抗劑通過(guò)抑制BMP信號(hào)來(lái)增強(qiáng)肝細(xì)胞增殖的方法。本發(fā)明涉及使用該BMP信號(hào)傳導(dǎo)途徑的ー種拮抗劑通過(guò)抑制BMP信號(hào)來(lái)增強(qiáng)哺乳動(dòng)物的肝臟再生的方法。本發(fā)明涉及使用該BMP信號(hào)傳導(dǎo)途徑的ー種拮抗劑通過(guò)抑制BMP信號(hào)來(lái)增強(qiáng)肝臟修復(fù)的方法。本發(fā)明涉及通過(guò)給予有效量的在肝臟中骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP)信號(hào)傳導(dǎo)途徑的ー種拮抗劑，在對(duì)其有需要的受試者中預(yù)防并且治療肝臟損傷的方法。如在此使用的，ー種“肝臟損傷”包括，但不限干，肝切除術(shù)、肝臟切除術(shù)、肝臟移植、或由外科移除一部分肝臟引起的其他的身體創(chuàng)傷或狀況。與急性肝臟機(jī)能不全相關(guān)的肝臟損傷可以由肝細(xì)胞癌切除術(shù)、肝臟移植、或由外科移除一部分肝臟引起的其他的急性身體創(chuàng)傷或狀況引起。在此使用的ー種“肝臟損傷”還包括，但不限干，通過(guò)凋亡、壞死或由 ー種肝毒性試劑或化合物引起的其他的身體狀況肝組織損傷或損壞，或肝組織細(xì)胞或組織的損失。與急性肝臟功能不全相關(guān)的肝臟損傷還可能是由于ー種或多種藥物試劑的配藥過(guò)量(例如，撲熱息痛/對(duì)乙酰氨基酚)或攝食中毒量的ー種或多種肝毒性化學(xué)試劑。可替代地，如在此使用的ー種“肝臟損傷”還包括，但不限干，通過(guò)凋亡、壞死或由ー種肝臟疾病引起的其他身體狀況組織損傷或損壞，或肝組織細(xì)胞或組織的損失，該肝臟疾病包括，但不限干，甲型肝炎、乙型肝炎、丙型肝炎、其他的肝炎病毒感染、自身免疫性肝炎、肝硬化、膽汁性肝硬化、急性肝衰竭、急性肝臟毒性、慢性肝衰竭、急性肝臟感染、肝臟癌癥、血銅藍(lán)蛋白缺乏癥、吉耳伯特綜合征、雷氏綜合征、Alagille綜合征、血色素沉著癥、苯丙酮尿癥以及其他的氨基酸代謝病、血友病以及其他的凝血因子缺乏病、家族性血膽固醇過(guò)多以及其他的脂類代謝紊亂、尿素循環(huán)障礙、果糖血癥、糖原病、酪氨酸血癥、半乳糖血癥、蛋白質(zhì)和碳水化合物代謝缺乏病、有機(jī)酸尿癥、線粒體疾病、過(guò)氧化物酶體以及溶酶體失調(diào)、蛋白質(zhì)合成異常、肝細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白缺陷癥、糖基化缺陷癥、急性化學(xué)毒性、膽管炎、α-1-抗胰蛋白酶缺陷癥、膽道閉鎖、肝臟的囊性病、脂肪肝、半乳糖血癥、膽結(jié)石、P卜啉癥、原發(fā)性硬化性膽管炎、肉樣瘤病、酪氨酸血癥、或1型糖原貯積病。如此處所使用的，術(shù)語(yǔ)“受試者”指的是ー種哺乳動(dòng)物，該哺乳動(dòng)物包括，但不限干，人類、靈長(zhǎng)類、家養(yǎng)的哺乳動(dòng)物、或?qū)嶒?yàn)室哺乳動(dòng)物。ー種“受試者”優(yōu)選地是人類，但也可以是需要使用ー種BMP信號(hào)的拮抗劑的治療的ー種動(dòng)物，例如伴侶動(dòng)物，例如狗、貓等， 農(nóng)場(chǎng)動(dòng)物例如牛、豬、馬等以及實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物例如大鼠、小鼠、豚鼠等。如此處所使用的，術(shù)語(yǔ)“治療”和“預(yù)防”指的是預(yù)防、阻塞、阻止、抑制、減少、減弱、 緩解或逆轉(zhuǎn)肝臟損傷的任何或所有的狀況、效應(yīng)或原因、連同與肝臟損傷相關(guān)的癥狀或疾病；增大狀況、癥狀或效應(yīng)的消失與其復(fù)發(fā)之間的時(shí)間；穩(wěn)定與肝臟損傷相關(guān)的ー種不良癥狀；或減少、減慢或穩(wěn)定ー種狀況相關(guān)的肝臟損傷的進(jìn)展。如此處所使用的，術(shù)語(yǔ)“移植”指的是對(duì)ー種或多種取自或衍生自另ー個(gè)或該受試者自身的肝臟的部分的肝組織或細(xì)胞進(jìn)行移植。如此處所使用的，術(shù)語(yǔ)“切除木”指的是切除ー個(gè)器官或其他結(jié)構(gòu)的一部分或全部。例如，肝臟切除術(shù)指的是一部分肝臟的外科移除并且通常是為了移除肝臟的患病的部分而進(jìn)行，例如位于肝臟的切除部分的肝臟腫瘤。如此處所使用的，術(shù)語(yǔ)“拮抗劑”指的是對(duì)抗該BMP信號(hào)傳導(dǎo)途徑的生理效應(yīng)的一
8種化學(xué)試劑、藥物試劑、一種藥物、ー種化合物、ー種小分子、ー種蛋白質(zhì)、一種肽或ー種抗體。例如，ー種化學(xué)試劑能夠?qū)供`種或多種BMP受體相關(guān)的應(yīng)答，這些應(yīng)答通常通過(guò)ー種或多種BMP結(jié)合到ー種或多種BMP受體來(lái)誘導(dǎo)。如此處所使用的，術(shù)語(yǔ)“蛋白質(zhì)”指的是任何長(zhǎng)度的氨基酸的一種聚合物的形式， 這些氨基酸可以包括天然發(fā)生的或合成的氨基酸以及編碼的和非編碼的氨基酸、肽、酯肽、 具有環(huán)、ニ環(huán)、酯環(huán)(d印sicyclic)或酯ニ環(huán)(d印sibicyclic)肽骨架的多肽、單鏈蛋白質(zhì)、 連同多聚體、以及完整的蛋白質(zhì)分子的任何片段或部分。如此處所使用的，“肽”是意味著由氨基酸、氨基酸類似物用化學(xué)方法束縛在一起組成的任何分子。一般而言，這些氨基酸通過(guò)酰胺連接(CONH)用化學(xué)方法束縛在一起；然而，這些氨基酸可以通過(guò)本領(lǐng)域中已知的其他化學(xué)鍵被束縛在一起。例如，這些氨基酸可以通過(guò)胺連接被束縛。如此處所使用的肽包括氨基酸的低聚物、氨基酸類似物、或小的和大的肽，包括多肽。如此處所使用的，術(shù)語(yǔ)“抗體”指的是ー種免疫球蛋白或它的ー個(gè)片段或衍生物， 并且包含包括ー個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)的任何多肽，不管是否在體外或在體內(nèi)產(chǎn)生的。該術(shù)語(yǔ)包括多克隆的、單克隆的、單特異性的、多特異性的、人源化的、單鏈的、嵌合體的、合成的、重組體的、雜交的、突變的以及移植的抗體。術(shù)語(yǔ)“抗體”還包括抗體片段，例如Fab、F(ab’)2、 Fv、scFv、Fd、dAb，以及保留抗原結(jié)合功能的其他抗體片段(即，與一種特異抗原結(jié)合的能力)。典型地，這樣的片段包括ー個(gè)抗原結(jié)合域(即，包括造成該抗體與該抗原之間的特異性連接的氨基酸的ー種抗體分子的一部分)。ー個(gè)抗原結(jié)合域典型地包括ー個(gè)抗體輕鏈可變區(qū)以及ー個(gè)抗體重鏈可變區(qū)(Vh)，然而，沒(méi)有必要必須包括兩者。如此處所使用的，術(shù)語(yǔ)“類似物”是ー種分子，其結(jié)構(gòu)與相應(yīng)的拮抗劑的結(jié)構(gòu)是相關(guān)的，但并不完全相同。一種類似物具有該相應(yīng)的拮抗劑的ー種相似的或類似的化學(xué)和生物性質(zhì)。例如，ー種化學(xué)的類似物保留了一種相應(yīng)的拮抗劑的化學(xué)性質(zhì)，而且具有一種或多種化學(xué)的修飾。一種多肽類似物保留了一種相應(yīng)的拮抗劑的生物活性，而且具有來(lái)自該多肽拮抗劑的某些生物化學(xué)的修飾。這些修飾可以増大例如該拮抗劑的穩(wěn)定性或半衰期，而沒(méi)有改變例如到該BMP信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中包含的ー種或多種生物分子上的結(jié)合特異性。ー種類似物可以包括ー種合成的化學(xué)試劑或多肽。如此處所使用的，術(shù)語(yǔ)“有效量”指的是一定量的BMP信號(hào)的活性拮抗劑，該拮抗劑足以影響肝臟損傷的病程和嚴(yán)重性，從而導(dǎo)致預(yù)防、減少、抑制、弱化或緩和肝臟損傷。例如，該BMP拮抗劑的ー個(gè)有效量是在肝細(xì)胞中足以抑制BMP信號(hào)的ー個(gè)量，從而導(dǎo)致預(yù)防、 減少、抑制、弱化或緩和肝臟損傷。如對(duì)本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員顯而易見的是，對(duì)于ー個(gè)給定的有需要的受試者的有效量可以根據(jù)治療的受試者的尺寸、年齢、體重、狀況以及應(yīng)答性而變化。該有效量還將依據(jù)給藥途徑以及有需要的受試者的狀況。如此處所使用的，術(shù)語(yǔ)“劑量”指的是在某一時(shí)刻將要給藥的量，例如BMP信號(hào)的拮抗劑的ー個(gè)特定的和有效的量。如此處所使用的，術(shù)語(yǔ)“調(diào)整”或“調(diào)節(jié)”指的是ー種變化，例如減少或増加。例如， 該變化可以指的是ー種生物活性。令人希望地，該變化是生物活性的至少10%、20%、30%、 40 %、50 %、60 %、70 %、80 %、90 %或95 %的增加亦或減少，相對(duì)于ー個(gè)參比活性或相對(duì)于對(duì)照物活性，例如ー種或多種SMAD、ー種或多種BMP或ー種或多種BMP受體的生物活性。
根據(jù)本發(fā)明，BMP信號(hào)的ー種拮抗劑的給藥能夠通過(guò)抑制ー種或多種BMP受體來(lái)增強(qiáng)肝細(xì)胞増殖。這ー種或多種BMP受體的抑制可以通過(guò)結(jié)合到ー種或多種I型BMP受體或ー種或多種II型BMP受體上而實(shí)現(xiàn)。這ー種或多種BMP受體的抑制可以通過(guò)同時(shí)結(jié)合到 ー種或多種I型BMP受體或ー種或多種II型BMP受體上而實(shí)現(xiàn)。本發(fā)明的拮抗劑能夠特定地抑制ー種I型BMP受體，包括，但不限于，ALK2、ALK3以及ALK6。該I型BMP受體包括，但不限干，活化素受體樣激酶-2 (ALK2)(也被稱為活化素受體-I)、ALK3 (也被稱為BMPR-IA) 以及ALK6(也被稱為BMPR-IB)。該II型BMP受體包括，但不限于，BMPRII, Act RIIa以及 ActRIIb0 I型和II型BMP受體將細(xì)胞外BMP信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)到這些目標(biāo)細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中。BMP 配體能夠促進(jìn)這些I型和II型受體的組合以形成一種異源ニ聚體并且這些受體的異ニ聚作用允許II型受體來(lái)磷酸化該I型受體。當(dāng)被激活(“被磷酸化”)時(shí)，該I型BMP受體使BMP應(yīng)答的SMAD效應(yīng)物(例如SMAD1、SMAD5以及SMAD8)磷酸化。然而當(dāng)該I型BMP受體不被磷酸化吋，ー種BMP與該II型BMP受體的特定的結(jié)合通過(guò)激活這些細(xì)胞內(nèi)的效應(yīng)物 (包括，但不限于，絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)p38)誘導(dǎo)不依賴于SMAD的信號(hào)。該BMP途徑的拮抗劑通過(guò)直接地結(jié)合到ー種或多種BMP (特別地，BMP2、BMP3、 BMP4、BMP5、BMP6以及BMP7)上能夠抑制BMP信號(hào)。該BMP途徑的拮抗劑通過(guò)直接地結(jié)合到BMP2或BMP4上能夠抑制BMP信號(hào)。該BMP信號(hào)途徑的拮抗劑通過(guò)抑制BMP2或BMP4與 ー種BMP受體的相互作用能夠抑制BMP信號(hào)。因?yàn)楗司垠w的BMP配體能夠促進(jìn)這些I型和II型受體的組合以形成一種異源ニ 聚體并且這些受體的異ニ聚作用允許II型受體來(lái)磷酸化該I型受體，該BMP信號(hào)的拮抗劑通過(guò)阻止ー種或多種BMP與這些I型和II型受體的結(jié)合相互作用能夠抑制ー種II型BMP 受體與ー種I型BMP受體的相互作用。該BMP信號(hào)的拮抗劑也可以通過(guò)該II型受體阻礙該I型受體的磷酸化來(lái)抑制ー種II型BMP受體與ー種I型BMP受體的相互作用。該BMP信號(hào)的拮抗劑也可以通過(guò)特定地結(jié)合到BMP2或BMP4或通過(guò)結(jié)合到ー種 BMP2或BMP4特異性BMP受體上來(lái)抑制ー種BMP2或BMP4介導(dǎo)的信號(hào)傳導(dǎo)途徑。該BMP信號(hào)傳導(dǎo)途徑的拮抗劑抑制一種或多種BMP的活性。優(yōu)選地，BMP信號(hào)的拮抗劑通過(guò)直接結(jié)合到ー種或多種BMP上來(lái)抑制ー種或多種BMP的活性。本發(fā)明包括使用ー種抑制ー種或多種I型受體的試劑的方法。BMP信號(hào)的拮抗劑可以通過(guò)ー種I型BMP受體抑制ー種或多種SMAD的磷酸化來(lái)抑制BMP信號(hào)。該I型受體使一種或多種受體調(diào)節(jié)的SMAD (R-SMAD)磷酸化，包括但不限于，SMAD1、SMAD2、SMAD3、SMAD4、 SMAD5.SMAD8以及SMAD9。優(yōu)選地，本發(fā)明的拮抗劑抑制一種或多種SMAD的磷酸化，包括但不限于，SMADU SMAD5 或 SMAD8。BMP信號(hào)的拮抗劑可以是ー種藥物試劑、ー種化學(xué)試劑、ー種蛋白質(zhì)、一種肽或一種抗體。優(yōu)選地，該BMP信號(hào)的拮抗劑是ー種直接結(jié)合到ー種或多種BMP受體上的化學(xué)試劑。在WO 2008/033408中描述了適合的拮抗劑的實(shí)例，其全部傳授內(nèi)容通過(guò)引用結(jié)合在此。本發(fā)明中使用的化學(xué)試劑包括，但不限于，dorsomorphin, UM193189或它們的ー種類似物或衍生物。在本發(fā)明中考慮了通過(guò)在WO 2008/033408中傳授的這些方法鑒定的并且對(duì)它們抑制BMP信號(hào)途徑的能力評(píng)估了的任何BMP特定的抑制劑化合物或化學(xué)試劑。將WO 2008/033408的全部傳授內(nèi)容通過(guò)引用結(jié)合在此。Dorsomorphin是ー種抑制劑AMP激酶信號(hào)傳導(dǎo)途徑(Zhou et al.，(2001)J.Clin. Invest. 108 :1167-1174)。Dorsomorphin在斑馬魚胚胎中還顯示出反作用于 BMP信號(hào)并且在斑馬魚胚胎中有效地促進(jìn)了背部化(WO 2008/033408)。在斑馬魚中， dorsomorphin顯示出抑制在體外由BMP4或BMP6誘導(dǎo)的成骨性分化，比用頭發(fā)生素、 BMP信號(hào)的ー種天然抑制劑處理所看到的更有效的ー種抑制作用(W0 2008/033408)。 Dorsomorphin已經(jīng)被描述用于通過(guò)選擇性地抑制I型BMP受體(即ALK2、ALK3以及ALK6) 來(lái)抑制BMP2、BMP4、BMP6、BMP7以及BMP9的活性(W0 2008/033408)，并且阻礙BMP介導(dǎo)的 SMAD 1、SMAD 5以及SMAD 8的磷酸化，在不影響MAPK p38的活化的情況下(Yu et al.， (2007) Nature Chemical Biology，4 :33-41)。Dorsomorphin 包含如下面在結(jié)構(gòu)式 I 中所示的化學(xué)結(jié)構(gòu)結(jié)構(gòu)式I.由 Zhou 等人(Zhou et al. (2001) J. Clin. Invest. 108 :1167-1174)以及 Yu 等人(Yu et al. (2007)Nature Chemical Biology, 4 :33-41) M dorsomorphin>6-[4-(2- U 啶-1-基-乙氧基)-苯基)]-3-吡啶-4-基-吡唑[1，5-a]-嘧啶的生物功能和結(jié)構(gòu)進(jìn)行了詳細(xì)的描述，其全部傳授內(nèi)容通過(guò)弓I用結(jié)合在此。LDN193189是吡唑[1，5_a]_嘧啶的ー種衍生物，它在懸垂的苯環(huán)3_位或4_位上包含一個(gè)胺。在圖8中顯示了并且在WO 2008/033408中也描述了 dorsomorphin的ー些藥學(xué)上可接受的類似物，其全部傳授內(nèi)容通過(guò)引用結(jié)合在此。合成LDW93189及其類似物的方法、包括它們的分子結(jié)構(gòu)由Cuny等人詳細(xì)描述(Cuny et al.，Bioorganic&Medicinal Chemistry Letters, 18 :4388-4392 Q008))，其全部傳授內(nèi)容通過(guò)引用結(jié)合在此。還理解的是本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員可以通過(guò)使用本領(lǐng)域中已知的方法容易地制備這些類似物。ー種化學(xué)試劑對(duì)肝臟再生的生物學(xué)影響，該化學(xué)試劑調(diào)整BMP信號(hào)，例如 dorsomorphin或UM193189連同其他潛在的拮抗劑候選物的潛在的類似物，可以通過(guò)確定該試劑對(duì)SMAD U SMAD 5或SMAD 8的磷酸化的影響來(lái)進(jìn)行評(píng)估。BMP介導(dǎo)的SMAD磷酸化可以通過(guò)，例如使用抗磷酸化-SMAD U SMAD 5或SMAD 8的免疫印跡分析來(lái)確定 (CELL SIGNALING )?？商娲兀珺MP介導(dǎo)的SMAD磷酸化可以通過(guò)使用滲透性的肝細(xì)胞的免疫沉淀反應(yīng)和酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法(ELISA)來(lái)確定。通過(guò)，例如，使用冰冷的甲醇的甲醇處理10-15分鐘來(lái)沉淀肝細(xì)胞蛋白質(zhì)。通過(guò)引入0. 25%至2%的戊ニ醛并且用ー種胺 (例如賴氨酸、乙ニ胺或phynylenediamine)對(duì)其進(jìn)行淬火，使肝細(xì)胞蛋白質(zhì)與例如戊ニ醛進(jìn)行交聯(lián)。在WO 2008/033408中對(duì)磷酸化測(cè)定的詳細(xì)的方案進(jìn)行了描述，其全部傳授內(nèi)容通過(guò)引用結(jié)合在此。如在此使用的，SMAD的增強(qiáng)的磷酸化的檢測(cè)表明該試劑激活BMP信號(hào)， 然而SMAD的減弱的磷酸化的檢測(cè)表明該試劑抑制BMP信號(hào)?？商娲?，一種調(diào)節(jié)BMP信號(hào)的化學(xué)試劑對(duì)肝臟再生的潛在影響可以通過(guò)使用如在此描述的5-溴代-2-脫氧尿嘧啶核甙(BrdU)標(biāo)記或Ki-67標(biāo)記測(cè)量肝細(xì)胞増殖來(lái)確定。
BMP信號(hào)的這些拮抗劑可以以藥學(xué)上可接受的鹽形式存在。藥學(xué)上可接受的鹽形式包括藥學(xué)上可接受的酸性的/陰離子的或堿性的/陽(yáng)離子的鹽。藥學(xué)上可接受的酸性的 /陰離子的鹽包括，乙酸鹽、苯磺酸鹽、苯甲酸鹽、重碳酸鹽、酒石酸氫鹽、溴化物、依地酸鈣、 右旋樟腦磺酸鹽、碳酸鹽、氯化物、檸檬酸鹽、ニ氫氯化物、依地酸鹽、乙ニ磺酸鹽、丙酸酯月桂硫酸鹽、乙磺酸鹽、富馬酸鹽、葡庚糖酸鹽(glyc印tate)、葡萄糖酸鹽、谷氨酸鹽、對(duì)羥乙酰氨基苯胂酸鹽、己基間苯ニ酚鹽、氫溴化物、鹽酸鹽、羥萘甲酸鹽、碘化物、羥乙磺酸鹽、乳酸鹽、乳糖醛酸鹽、蘋果酸鹽、馬來(lái)酸鹽、丙ニ酸鹽、扁桃酸鹽、甲磺酸鹽、甲基硫酸鹽、粘酸鹽、萘磺酸鹽、硝酸鹽、撲酸鹽、泛酸鹽、磷酸鹽/ ニ磷酸鹽、聚半乳糖醛酸鹽、水楊酸鹽、硬脂酸鹽、堿式乙酸鹽、琥珀酸鹽、硫酸鹽、硫酸氫鹽、鞣酸鹽、酒石酸鹽、茶氯酸鹽、甲苯磺酸鹽、以及三乙基碘鹽。藥學(xué)上可接受的堿性的/陽(yáng)離子的鹽包括，鈉、鉀、鈣、鎂、ニ乙醇胺、 N-甲基-D-葡糖胺、L-賴氨酸、L-精氨酸、銨鹽、乙醇胺、哌嗪以及三乙醇胺鹽。該BMP拮抗劑在肝臟損傷之前、之中或之后被給予有需要的受試者。該BMP拮抗劑在肝臟損傷之前被給藥。該BMP拮抗劑在肝臟損傷進(jìn)行過(guò)程中的任何時(shí)間被給藥。該BMP 拮抗劑在肝臟損傷之后被給藥。該BMP拮抗劑在多個(gè)間隔處以多次給藥的方式被給藥。該 BMP拮抗劑可以在肝臟損傷開始之前在1、2、3、4、5、6、12、M和/或48小時(shí)的時(shí)間處被給藥。該BMP拮抗劑可以在肝臟損傷開始的1、2、3、4、5、6、12、M和/或48小時(shí)的時(shí)間處和/ 或在這些時(shí)間之內(nèi)被給藥。該BMP拮抗劑可以在肝臟損傷之后M、36、48、60、72或96小時(shí)的時(shí)間處和/或在這些時(shí)間之內(nèi)被給藥。該BMP拮抗劑可以在肝臟損傷開始之后3、4、5、6、 7、8、9或10天的時(shí)間處和/或在這些時(shí)間之內(nèi)被給藥。可替代地，該BMP拮抗劑可以在肝臟損傷之后的0小時(shí)與48小時(shí)之間、1天與3天之間、2天與4天之間、3天與7天之間、5天與8天之間或7天與10天之間被給藥。該BMP拮抗劑可以在這些時(shí)間周期中被給藥一次， 或可替代地，兩次、三次、四次、五次、六次、七次、八次或甚至更多次(在這些時(shí)間周期內(nèi))。 在一個(gè)實(shí)施方案中，在這些時(shí)間周期之后用BMP信號(hào)的ー種拮抗劑的治療結(jié)束；可替代地， 治療可以在該時(shí)間周期結(jié)束后繼續(xù)，例如一直到在肝臟損傷開始之后的1、2、3、4、5或6月。BMP信號(hào)的ー種拮抗劑可以通過(guò)任何合適的路徑以ー個(gè)有效量給予ー個(gè)有需要的受試者。例如，有效量的BMP信號(hào)的拮抗劑可以由靜脈內(nèi)給藥。有效量的BMP信號(hào)的拮抗劑可以通過(guò)ロ服被給藥。BMP信號(hào)的拮抗劑可以通過(guò)局部引入到肝臟(例如通過(guò)肝臟導(dǎo)管插入木)被給藥。BMP信號(hào)的拮抗劑可以通過(guò)輸液進(jìn)入門靜脈或到門靜脈的其他支流(例如脾靜脈、腸系膜上靜脈以及幽門靜脈)被局部給藥?？商娲?，BMP信號(hào)的拮抗劑可以通過(guò)注射被局部給藥到肝臟組織?！巴ㄟ^(guò)注射被給藥到肝臟組織”意思是被輸送到肝臟的內(nèi)表面或外表面。在局部給藥或注射中，該BMP拮抗劑的輸送點(diǎn)可以與肝臟充分接近以致該BMP 拮抗劑在肝臟中可以擴(kuò)散并且與至少ー種或多種具有激活的BMP信號(hào)途徑的肝細(xì)胞接觸。 優(yōu)選地，在肝臟中，該BMP拮抗劑可以擴(kuò)散并且與至少多數(shù)(50%或更多)的能夠增殖的肝細(xì)胞接觸。該BMP拮抗劑能以一種持續(xù)釋放的配制品的方式被給藥到受試者，或可以通過(guò)一種泵或一種可植入的裝置被輸送，或通過(guò)ー種載體(例如下面討論的聚合物)。該BMP信號(hào)的拮抗劑可以與ー種可接受的藥物載體結(jié)合作為藥物組合物的一部分而被給藥到受試者。根據(jù)選擇的給藥模式該藥物組合物的配方將會(huì)變化。合適的藥物載體可以包括ー些不與該BMP拮抗劑相互作用的惰性成分。這些載體應(yīng)該是生物相容的，也就是在該給藥位點(diǎn)處非毒性的、非炎癥性的、非免疫性的并且沒(méi)有其他不希望的反應(yīng)。藥學(xué)上可接受的載體的實(shí)例包括，例如鹽水、可商購(gòu)的惰性凝膠劑、或添加了白蛋白、甲基纖維素或一種膠原基質(zhì)的液體。進(jìn)ー步的實(shí)例包括無(wú)菌水、生理鹽水、抑菌鹽水(包含0. 9%mg/ ml苯甲醇的鹽水)、磷酸鹽緩沖鹽水、漢克斯氏溶液(Hank’ s solution)、林格氏乳酸鹽溶液(Ringer' s-lactate)等等?？刹捎枚喾N標(biāo)準(zhǔn)藥物配制技術(shù)，如以上在Remington' s Pharmaceutical Sciences 中描；tdi的那些技木(Remington' s Pharmaceutical Sciences. XVIII，Mack出版公司，伊斯頓，賓夕法尼亞州(1990))。BMP信號(hào)的這些拮抗劑能以一種持續(xù)釋放的配制品被給藥。聚合物通常被用于形成持續(xù)釋放的配制品。這些聚合物的實(shí)例包括聚α -羥基酷，例如聚乳酸/聚乙醇酸均聚物和共聚物、聚磷腈(PPH0Q、聚酸酐以及聚(富馬酸丁ニ醇酷)。聚乳酸/聚乙醇酸(PLGA) 均聚物和共聚物作為持續(xù)釋放的運(yùn)載體在本領(lǐng)域中是熟知的。熟練的技術(shù)人員通過(guò)改變聚乳酸與聚乙醇酸比例以及該聚合物的分子量可以調(diào)節(jié)釋放的速率(參見Anderson等人 (1997) Adv. Drug Deliv. Rev. 28 :5，全部傳授內(nèi)容通過(guò)引用結(jié)合在此)。將聚乙ニ醇結(jié)合到該聚合物中作為ー種用于形成微顆粒載體的共混物允許該活性成分的釋放曲線的進(jìn)一歩改變(參見Cleek等人，J. Control Release 48 :259 (1997)，全部傳授內(nèi)容通過(guò)引用結(jié)合在此)。陶瓷(例如磷酸鈣以及羥基磷灰石)也可以被結(jié)合到該配制品中以改善機(jī)械特性。通過(guò)以下實(shí)例來(lái)對(duì)本發(fā)明進(jìn)行示例性說(shuō)明，而不是旨在以任何方式進(jìn)行限制。實(shí)例1I.實(shí)驗(yàn)步驟本發(fā)明基于ー種發(fā)現(xiàn)，即骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP)信號(hào)傳導(dǎo)途徑是肝細(xì)胞増殖的 ー種有活性的抑制劑并且使用該途徑的ー種拮抗劑的治療導(dǎo)致了肝細(xì)胞増殖的增強(qiáng)以及在體內(nèi)的肝臟損傷之后增強(qiáng)的肝臟再生。A.用于肝部分切除術(shù)的實(shí)驗(yàn)步驟使用動(dòng)物來(lái)檢測(cè)損傷后在肝臟質(zhì)量的回復(fù)中BMP信號(hào)的各種成員的作用。對(duì)小鼠進(jìn)行三分之ニ( “2/3”)或大量的百分之八十(80% )肝切除。手術(shù)在至少八周齡的成年小鼠上進(jìn)行。為了手木，用向腹腔內(nèi)注射的100mg/kg氯胺酮和10mg/kg甲苯噻嗪對(duì)小鼠進(jìn)行麻酔。在該受試者沒(méi)有變得失去知覺(jué)的情況下，以相似的方式注射額外的25mg/kg氯胺酮和2.5mg/kg甲苯噻嗪。重復(fù)此步驟直到該受試者失去知覺(jué)。使用一把剪刀將毛發(fā)從手術(shù)部位去除并且使用無(wú)菌技術(shù)以及聚乙烯吡咯酮碘(betadyne)對(duì)該皮膚進(jìn)行消毒。用 70%酒精對(duì)該洗滌的區(qū)域進(jìn)行沖洗。為了避免體溫過(guò)低，該動(dòng)物沒(méi)有必要被弄濕。在朝向臍大約一公分的劍狀軟骨的層次上用一把無(wú)菌的剪刀做開ー個(gè)切ロ。使用一把剪刀進(jìn)入該腹膜并且切除該劍狀軟骨的尖端。對(duì)于2/3的肝切除，通過(guò)在以前準(zhǔn)備好的面積上的右側(cè)面上的溫和壓カ通過(guò)該切ロ將肝臟由腹部取出。在該肝臟的由腹部取出的部分周圍放置一種4-0結(jié)扎線結(jié)并且打結(jié)。然后切除遠(yuǎn)離于該結(jié)的該肝臟的前面部分。以角質(zhì)層下的方式 4-0脯氨酸被用于封閉該繃帶并且4-0尼龍被用于封閉該皮膚。對(duì)于80%的肝切除，使用一個(gè)更大的切ロ并且用ー種4-0結(jié)扎線結(jié)結(jié)扎這些單獨(dú)的圓形突出部，從而僅僅留下該有尾狀附屬物。然后切除遠(yuǎn)離于該結(jié)的該肝臟的這些前面部分。以角質(zhì)層下的方式4-0脯氨酸被用于封閉該繃帶并且4-0尼龍被用于封閉該皮膚。B.受試者的基因分型以及選擇通過(guò)去除大約2mm尾部在兩周齡用于基因分型的小鼠上進(jìn)行尾部活體解剖。消毒設(shè)備被用于所有的步驟。用70%酒精擦拭該尾部的遠(yuǎn)側(cè)部分并且使用剪刀剪斷該尾部的遠(yuǎn)側(cè)部分。對(duì)該切ロ應(yīng)用強(qiáng)大的壓カ至少30秒。在將該小鼠返回到籠子之前記錄出血終止的確認(rèn)。在出血發(fā)生的情形中，一滴NEXABAND 液體被應(yīng)用于切掉尾末端。雄性成年小鼠被用于這些實(shí)驗(yàn)中，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)用五個(gè)動(dòng)物。近交的小鼠品系被用來(lái)降低實(shí)驗(yàn)的可變性。C.在肝臟中BMP mRNA和蛋白質(zhì)的表達(dá)水平的確定在肝部分切除之后在肝臟中BMP mRNA和蛋白質(zhì)的表達(dá)被顯著地降低。首先，通過(guò)測(cè)定mRNA的表達(dá)水平確定內(nèi)源基因表達(dá)(例如目標(biāo)BMP4基因的表達(dá)水平)。使用例如聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)、連接酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(LCR)、或雜交分析(如RNA雜交、斑點(diǎn)印跡以及RNA酶保護(hù)作用)對(duì)基因表達(dá)的水平進(jìn)行測(cè)定。特別地，利用定量的實(shí)時(shí)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)來(lái)定量肝切除術(shù)之后BMP4mRNA的水平。使用直接標(biāo)記或間接標(biāo)記的檢測(cè)試劑對(duì)蛋白質(zhì)或mRNA的水平進(jìn)行檢測(cè)，例如熒光標(biāo)記或放射性標(biāo)記的核酸、放射性標(biāo)記或酶法標(biāo)記的抗體等。在授予Gelfand的美國(guó)專利號(hào)5，210，015、授予Livak等人的美國(guó)專利號(hào)5，538，848以及授予Haaland的美國(guó)專利號(hào)5，863，736，連同Heid, C. A.等人，Genome Research，6 :986-994(1996) ；Gibson, U.E.M 等人，Genome Research 6:995-1001(1996)； Holland,P. Μ.等人，Proc. Natl. Acad. ki. USA 88 :7276-7280, (1991)；以及 Livak，K. J.等人，PCR Methods and Applications 357-362(1995)中描述了用于檢測(cè)蛋白質(zhì)和 mRNA 的水平的方法。這些參考文獻(xiàn)的全部傳授內(nèi)容通過(guò)引用結(jié)合在此。D.在肝臟中表現(xiàn)有條件的BMP4缺失的ー種轉(zhuǎn)基因小鼠的創(chuàng)建BMP4的完全缺失已經(jīng)被熟知為是胚胎致命的。因此，采用了用于BMP的肝臟特異性有條件的基因缺失(“敲除”)的ー種策略。一般地，在該敲除系統(tǒng)中，該靶基因的改變基于該動(dòng)物暴露到ー種促進(jìn)靶基因改變的物質(zhì)上而發(fā)生，例如在該靶基因位點(diǎn)處促進(jìn)重組的一種酶的引入(例如在cre-flox系統(tǒng)中的Cre)。在本發(fā)明中，在白蛋白以及α-胎兒球蛋白啟動(dòng)子(Alfp-Cre)的控制下通過(guò)ー種AAV-8-MUP-cre (Ho等人，2008)亦或表達(dá)Cre-重組酶的ー種轉(zhuǎn)基因小鼠提供了ー種被IoxP位點(diǎn)側(cè)翼的ΒΜΡ4小鼠并且釋放了 cre-重組酶。 作為ー種研究技木，使用病毒載體來(lái)研究肝臟具有很大的實(shí)用性。不幸地，由于給藥中的困難、炎癥或肝臟毒性，慢病毒以及腺病毒具有有限的實(shí)用性(Mahasreshti等人，200 。為了克服此問(wèn)題，開發(fā)并且采用了具有一個(gè)小鼠尿蛋白啟動(dòng)子(AAV-8-MUP)的ー種腺病毒伴隨病毒8，該病毒感染了肝臟，具有很小損壞并且對(duì)損傷后的修復(fù)沒(méi)有影響。Ε. Ki-67的抗體標(biāo)記為了檢測(cè)BMP4信號(hào)損失的功能后果，采用Ki-67標(biāo)記指示物以在缺乏的BMP小鼠中相對(duì)于野生型確定肝細(xì)胞増殖。如以上描述的8-10周齡的成年雄性小鼠經(jīng)歷了 2/3肝切除并且在2/3肝切除之后在不同的時(shí)間點(diǎn)(例如0、24、48、72、96、120、144、168以及192 小吋)處檢測(cè)肝細(xì)胞増殖。作為對(duì)于増殖的ー種細(xì)胞標(biāo)志物，Ki-67蛋白質(zhì)與細(xì)胞增殖以及分裂是強(qiáng)相關(guān)的。在間期時(shí)，該Ki-67蛋白質(zhì)(抗原)在該細(xì)胞核內(nèi)被唯一地檢測(cè)到，然而在有絲分裂時(shí)大多數(shù)蛋白質(zhì)集中到該染色體上。在該細(xì)胞周期(GpSW2以及有絲分裂) 的所有活動(dòng)期中對(duì)Ki-67蛋白質(zhì)進(jìn)行檢測(cè)，但是完全沒(méi)有靜息細(xì)胞(Gtl)15因此，Ki-67作為用于確定給定的細(xì)胞群體的生長(zhǎng)部分的一種優(yōu)秀的標(biāo)志物起作用。Ki-67陽(yáng)性細(xì)胞的部分 (Ki-67標(biāo)記指數(shù))與細(xì)胞分裂和生長(zhǎng)的過(guò)程是相關(guān)的。在這些從該小鼠提取的肝細(xì)胞中采用單克隆抗體(MIB-I)以檢測(cè)該Ki-67抗原。如通過(guò)Suzuki等人描述的進(jìn)行了包括免疫染色的 Ki-67 抗原標(biāo)記指數(shù)(Suzuki et al. (1992) J. Clin. Gastroenterol. 15 :317-20)， 其全部的傳授內(nèi)容通過(guò)引用結(jié)合在此。進(jìn)行了多種對(duì)照物實(shí)驗(yàn)，包括Alfp-Cre/BMP4M以及Alfp-Cre+BMP4+/f小鼠，以及接受AAV-8-MUP綠色熒光蛋白(GFP)對(duì)照物病毒的小鼠。F. 5-溴代-2-脫氧尿嘧啶核甙(BrdU)標(biāo)記以及免疫組織化學(xué)肝臟和肝細(xì)胞是從如以上描述的小鼠中提取的并且在具有10% FBS的傳統(tǒng)的 DMEM中在T型燒瓶中生長(zhǎng)。使用胰蛋白酶/EDTA溶液對(duì)細(xì)胞進(jìn)行分離，并且在M孔板或容器載玻片中在ImL的適當(dāng)介質(zhì)中或，可替代地，在聚賴氨酸包覆的蓋玻片(在PBS中 0. 05% -0. 1%，使用150K-300K mol. wt過(guò)夜)中將這些細(xì)胞轉(zhuǎn)移到具有12mm蓋玻片的殼管瓶中。在37°C下對(duì)細(xì)胞進(jìn)行孵育兩小時(shí)以允許回收。添加BrdU到每個(gè)殼管瓶中至最終濃度為10 μ M并且在37°C下孵育兩小吋。從這些介質(zhì)殼管瓶中抽吸出介質(zhì)并且在PBS中沖洗這些蓋玻片三次。添加ImL卡若氏固定劑(Carnoy’ s fixative) (3份甲醇1份冰醋酸)到每個(gè)殼管瓶中并且抽吸出該固定劑。立即添加額外的ImL卡若氏固定劑。這些殼管瓶被固定在-20°C下20分鐘。從這些殼管瓶中抽吸出該固定劑并且在PBS中沖洗這些蓋玻片三次。通過(guò)在水中將0. 2mL的2M HCl添加到每個(gè)殼管瓶并且通過(guò)在37°C下孵育1小時(shí)使細(xì)胞變性。從這些酸殼管瓶中抽吸出酸并且在PH 8. 5的硼酸鹽緩沖劑中通過(guò)沖洗三次中和這些蓋玻片。在PBS+0.05%吐溫20[PBS/T20]中對(duì)這些殼管瓶沖洗三次并且存儲(chǔ)在 20C _8°C下。免疫染色,在本領(lǐng)域中如通常熟知的進(jìn)行了免疫染色。特定地，通過(guò)將0. 2mL的PBS/T20/2% 標(biāo)準(zhǔn)山羊血清添加到每個(gè)殼管瓶中并且在37°C下孵育10分鐘到30分鐘阻塞這些細(xì)胞。 抽吸出溶液并且添加稀釋在PBS/T20/2%標(biāo)準(zhǔn)山羊血清(Millipore 目錄號(hào)MAB3424、 MAB4072)中的0. 2mL抗BrdU單克隆抗體。在37°C下對(duì)這些殼管瓶孵育30分鐘(BrdU儲(chǔ)備溶液IOmM溶解在PBS中、0. 2 μ m經(jīng)過(guò)濾器滅菌的并且存儲(chǔ)在-20°C下)。在培養(yǎng)液中將 BrdU儲(chǔ)備溶液稀釋1/100以產(chǎn)生ー種100 μ M的溶液(IOX)。將該IOX的溶液添加到每個(gè)小瓶中至最終濃度為10 μ Μ。在PBS/T20中對(duì)這些小瓶沖洗三次，并且添加0. 2mL的山羊抗小鼠的FITC(Millipore 目錄號(hào)AP124F)。在黑暗中在37°C下對(duì)這些小瓶孵育30分鐘并且在PBS/T20中沖洗3次。使用用于熒光的固定介質(zhì)(Millipore 目錄號(hào)5013)，將蓋玻片從這些小瓶中移除，浸泡在去離子水中并且被封固在玻璃載玻片上。使用熒光顯微鏡對(duì)蓋玻片進(jìn)行評(píng)價(jià)。II.結(jié)果A.通過(guò)該成年人的肝臟組成性地表達(dá)了 BMP4，并且BMP4作為關(guān)于肝臟再生的抑制物起作用并且使用多種方法移除此抑制作用增強(qiáng)了肝臟再生。一種大規(guī)模的遺傳篩選鑒定的骨形態(tài)發(fā)生蛋白信號(hào)在損傷后的肝臟修復(fù)過(guò)程中被高度地抑制。這包括拮抗劑的誘導(dǎo)作用以及拮抗劑的抑制作用。這些分子作為潛在靶標(biāo)起作用以理解在肝臟再生中ー種新的范例，在該范例中増殖的抑制劑的拮抗作用對(duì)損傷后的正常的肝臟修復(fù)是必需的。因?yàn)锽MP是分泌的信號(hào)分子并且因此潛在地能夠被操縱，這是ー種特別有吸引力的治療目標(biāo)。在圖1中顯示了在肝切除術(shù)后用于BMP4的實(shí)時(shí)PCR。截止肝切除術(shù)之后的18個(gè)小吋，相對(duì)于該未受損傷的肝臟，該水平下降到25%。BMP4蛋白水平以相似的方式降低，并且在肝切除術(shù)之后36小時(shí)顯著地下降(圖2)。對(duì)于BMP2RNA獲得了相似的結(jié)果。B.在肝臟中BMP4受體的表達(dá)為了確定對(duì)于BMP的受體存在于肝臟中，對(duì)ALK2和ALK3 (被BMP4利用的兩個(gè)受體)進(jìn)行了免疫組織化學(xué)。如上面所描述的，ALK2主要被BMP6和BMP7利用，然而ALK3主要被BMP2和BMP4利用。如在圖3中顯示的，ALK3表達(dá)在靠近門靜脈的肝臟中(紅色染色法)。對(duì)于ALK2獲得了相似的結(jié)果。C.在小鼠肝臟中BMP4的有條件的基因缺失的創(chuàng)建BMP4的完全缺失已經(jīng)被熟知為是胚胎致命的。因此，采用了用于BMP的肝臟特異性有條件的基因缺失(“敲除”)的ー種策略。特別地，具有ere-重組酶的ー種被IoxP位點(diǎn)側(cè)翼的BMP4小鼠，該ere-重組酶在白蛋白和α-胎兒球蛋白促進(jìn)子(Alfp-Cre)的控制下通過(guò)ー種AAV-8-MUP(Ho等人，2008)亦或通過(guò)表達(dá)Cre-重組酶的ー種轉(zhuǎn)基因小鼠釋放。 為了證實(shí)在肝臟中BMP4的有效的有條件的缺失，在重組后進(jìn)行了對(duì)于BMP4蛋白的蛋白質(zhì)印跡分析。如圖4中所描述的，通過(guò)ere-重組酶在被IoxP位點(diǎn)側(cè)翼的小鼠中觀察到BMP4 蛋白的急劇降低的水平(圖4)。D.通過(guò)BMP4的損失增強(qiáng)了肝臟再生接下來(lái)，通過(guò)使用Ki-67標(biāo)記指示物檢測(cè)了 BMP4信號(hào)的損失的功能上的后果。如以上描述的8-10周齡的成年雄性小鼠經(jīng)歷了 2/3肝切除并且在2/3肝切除之后在不同的時(shí)間點(diǎn)(例如0、M、48、72、96、120、144、168以及192小時(shí))處檢測(cè)肝細(xì)胞増殖。如在圖 5中所顯示的，如相對(duì)于如通過(guò)Ki-67標(biāo)記(圖5)測(cè)量的對(duì)照物，在該轉(zhuǎn)基因小鼠中BMP4 的肝臟特異性缺失導(dǎo)致48小時(shí)下肝細(xì)胞増殖的大于兩倍的量(ρ <0.05)。進(jìn)行了具有相似結(jié)果的多種對(duì)照物實(shí)驗(yàn)，包括Alfp-Cre/BMP4M以及Alfp_Cre+BMP4Vf小鼠，以及接受 AAV-8-MUP綠色熒光蛋白(GFP)對(duì)照物病毒的小鼠(不是所有顯示的數(shù)據(jù))。因此，肝臟中的BMP4的損失通過(guò)釋放用于肝臟再生的ー種組成塊顯著地增強(qiáng)肝臟再生。E.在肝臟損傷后用于正常的肝臟修復(fù)的BMP4表達(dá)的減少為了證實(shí)BMP4信號(hào)的減少或抑制對(duì)于肝臟損傷后正常的肝臟修復(fù)是ー個(gè)必要條件，維持肝切除術(shù)后的BMP4表達(dá)水平是必要的。為了實(shí)現(xiàn)此目的，開發(fā)了ー種 AAV-8-MUP-BMP4。當(dāng)在肝切除術(shù)過(guò)程中并且在肝切除術(shù)(P < 0. 05)之后表達(dá)BMP4病毒時(shí)， 相對(duì)于運(yùn)載體(鹽水)或AAV-8-MUP-GFP對(duì)照物病毒觀察到肝細(xì)胞増殖70%的減少。為了證實(shí)BMP4的肝臟特異性損失沒(méi)有產(chǎn)生將影響肝臟再生的系統(tǒng)作用，將該 BMP4病毒(S卩，AAV-8-MUP-BMP4)注射到肝臟特異性缺乏BMP4的小鼠中。如所預(yù)料的，肝臟中的BMP4的表達(dá)將肝細(xì)胞増殖回復(fù)到該野生型小鼠中所看到的這些較低的、正常的水平。這些結(jié)果強(qiáng)有力地證實(shí)了 BMP信號(hào)的減少對(duì)于肝臟切除術(shù)后正常的肝細(xì)胞増殖是必要的。此外，這些結(jié)果對(duì)BMP信號(hào)的程度控制著肝臟切除術(shù)后肝細(xì)胞増殖的速度提供了強(qiáng)有力的證據(jù)。這些結(jié)果與觀察結(jié)果也是一致的，即如在圖5中所顯示的抑制途徑的釋放對(duì)于損傷后的肝臟更新是ー個(gè)關(guān)鍵性機(jī)制。因?yàn)锽MP4是ー種分泌的信號(hào)分子，它作為一種用于治療靶標(biāo)的優(yōu)秀的候選物起作用。F.在肝部分切除后通過(guò)藥理學(xué)抑制BMP信號(hào)來(lái)增強(qiáng)肝臟再生為了提供用于這些以上討論的發(fā)現(xiàn)的臨床相關(guān)性，用BMP信號(hào)的ー種拮抗劑對(duì)八周齡的小鼠進(jìn)行注射。在2/3肝切除之前、之中以及之后注射dorsomorphin 48小吋。特別地，在肝切除術(shù)之前M小時(shí)和12小時(shí)、在肝切除術(shù)時(shí)以及在肝切除術(shù)之后12、24以及36 小時(shí)多次注射dorsomorphin。在圖6中，在2/3肝切除之后36小時(shí)和48小時(shí)測(cè)量了 BrdU 結(jié)合。如在圖6中所證實(shí)的，dorsomorphin的給藥導(dǎo)致了肝細(xì)胞増殖的顯著增加。對(duì)于達(dá)到60天的dorsomorphin給藥沒(méi)有產(chǎn)生全身的毒性。特別地，這對(duì)骨髄、生長(zhǎng)或白細(xì)胞計(jì)數(shù)沒(méi)有影響。實(shí)例2I.在肝切除術(shù)和泰諾過(guò)量之后評(píng)價(jià)肝臟再生的一般方法將采用三種實(shí)驗(yàn)的技術(shù)來(lái)檢測(cè)這些遺傳學(xué)的或藥理學(xué)的介入的作用2/3肝切除術(shù)、大量的肝切除術(shù)或泰諾過(guò)量。對(duì)于2/3肝切除木，如以上描述的以及其他人(Otu等人， 2007)描述的將進(jìn)行包括該膽囊的左側(cè)和中間的圓形突出部的去除。對(duì)于大量的肝切除術(shù) (80% )，該右側(cè)的圓形突出部也將會(huì)被切除。對(duì)于泰諾過(guò)量，300mg/kg將通過(guò)靜脈內(nèi)灌注被給藥。為了分析這些2/3肝切除的動(dòng)物，在肝切除術(shù)之后的6、12、24、36、48以及72小時(shí)、以及7天時(shí)將收獲肝臟。在動(dòng)物處死之前2小時(shí)將注射BrdU并且BrdU結(jié)合連同Ki_67 標(biāo)記將被用于確定肝細(xì)胞増殖。在處死的時(shí)候?qū)?huì)分析肝臟重量并且將會(huì)確定肝臟/體重比例以評(píng)估再生的速度。RNA和蛋白質(zhì)樣品將會(huì)被收集用于實(shí)時(shí)PCR分析以及蛋白質(zhì)印跡法。一般而言，將會(huì)評(píng)估肝臟切除術(shù)之后増殖的開始是被延時(shí)或被加速。還將確定再生的步伐在它開始之后是否被改變以及用于該最終肝臟尺寸的設(shè)定點(diǎn)是否被改變。組織學(xué)也將被檢測(cè)以在肝臟中尋找脂肪累積、空泡形成、壞死、或構(gòu)造變化。為了進(jìn)一步評(píng)估肝細(xì)胞健康和功能，在基線處以及在這些處死的動(dòng)物中將檢測(cè)包括AST、ALT以及膽紅素的肝臟功能檢驗(yàn)。為了評(píng)估程序性細(xì)胞死亡(凋亡)的潛在水平或應(yīng)答于肝臟損傷的壞死，末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶dUTP切ロ末端標(biāo)記法(TUNEL)將會(huì)被進(jìn)行以分析DNA碎裂。如以上所討論的， 盡可能使用同窩出生的幼仔作為對(duì)照物，在所有的實(shí)驗(yàn)中將采用8-10周齡的雄性小鼠。對(duì)于存活實(shí)驗(yàn)，將產(chǎn)生卡普蘭-邁耶存活曲線。基于功率計(jì)算將22個(gè)實(shí)驗(yàn)小鼠與22個(gè)對(duì)照物小鼠進(jìn)行比較。實(shí)例3I.用來(lái)確定哪些BMP配體和受體影響損傷后的肝臟修復(fù)并且解釋它們的分子作用機(jī)制的體內(nèi)研究A.在肝臟特異性缺乏BMP的小鼠中確定在損傷后增強(qiáng)的肝臟修復(fù)的機(jī)制上面描述了具有野生型小鼠的對(duì)照物、具有該病毒的野生型小鼠、接受一種對(duì)照物AAV-8-MUP-EGFP病毒的轉(zhuǎn)基因的被IoxP位點(diǎn)側(cè)翼的小鼠以及接受ー種AAV-8-MUP-BMP 病毒的實(shí)驗(yàn)的轉(zhuǎn)基因的被IoxP位點(diǎn)側(cè)翼的小鼠。在圖5中描述了在肝臟特異性缺乏BMP4 的小鼠中在肝切除術(shù)后該增強(qiáng)的肝細(xì)胞増殖的時(shí)間標(biāo)記。為了進(jìn)一步確定在肝臟特異性缺乏BMP4的小鼠中在損傷后增強(qiáng)的肝臟修復(fù)的更加特異的機(jī)制并且為了評(píng)價(jià)BMP4抑制増殖的機(jī)制，將會(huì)進(jìn)行以下的研究。很可能對(duì)于作為多種拮抗劑存在的BMP表達(dá)存在ー個(gè)反饋環(huán)。為了確定是否存在對(duì)于BMP信號(hào)的ー個(gè)反饋環(huán)，通過(guò)使用RT-PCR以及蛋白質(zhì)印跡法將要確定的是在不存在 BMP4 下該 BMP 途徑(例如 BMP2、BMP6 或 BMP7)、I 型 BMP 受體(例如 ALK2、ALK3、ALK6)以及拮抗劑(例如頭發(fā)生素和Cer樣1)的其他組分如何隨時(shí)間改變。BMP4很可能増大細(xì)胞周期蛋白的表達(dá)并且作為這些蛋白質(zhì)的ー種上游效應(yīng)物。為了評(píng)價(jià)BMP4的損失如何影響細(xì)胞周期的進(jìn)展，細(xì)胞周期蛋白A和D將會(huì)通過(guò)例如RT-PCR 和蛋白質(zhì)印跡法被研究。盡管有可能c-jun和C-EBP-α不是ΒΜΡ4的轉(zhuǎn)錄目標(biāo)，它對(duì)證實(shí)該關(guān)系將是重要的。為了檢測(cè)ΒΜΡ4的損失如何影響正調(diào)控途徑的轉(zhuǎn)錄調(diào)控，c-jun和C-EBP-α的表達(dá)將通過(guò)例如RT-PCR和蛋白質(zhì)印跡法被確定。很有可能細(xì)胞因子以及生長(zhǎng)因子不是ΒΜΡ4的靶標(biāo)。為了確定ΒΜΡ4是否調(diào)控肝細(xì)胞增殖的其他的刺激物、細(xì)胞因子IL-6和生長(zhǎng)因子的表達(dá)，表皮生長(zhǎng)因子和肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子將通過(guò)例如RT-PCR和蛋白質(zhì)印跡法被檢測(cè)。通過(guò)RT-PCR或RNA印跡分析還將檢測(cè)是否 ΒΜΡ4信號(hào)轉(zhuǎn)錄地調(diào)控這些反向調(diào)控的蛋白質(zhì)p21和p53。通過(guò)使用蛋白質(zhì)印跡法還將檢測(cè)包括SMAD 1、5以及8的BMP信號(hào)的細(xì)胞內(nèi)介質(zhì)的定位和它們的磷酸化狀態(tài)。Tobl可以作為BMP4的一種轉(zhuǎn)錄靶標(biāo)起作用。在ErbB2. I(Tobl)(ー種與BMP信號(hào)相互作用的抗增殖的分子)的轉(zhuǎn)導(dǎo)物的變化將確定是否BMP信號(hào)調(diào)節(jié)了 Tobl表達(dá)。B.確定在損傷之后是否BMP2的肝臟特異性移除增強(qiáng)了肝臟修復(fù)因?yàn)锽MP2的傳統(tǒng)的敲除是胚胎致命的，與上面描述的用于BMP4的策略相似將會(huì)采用ー種策略使用“被IoxP位點(diǎn)側(cè)翼的”BMP2(BMP2f/f)小鼠。使用ー種病毒性或轉(zhuǎn)基因的方法以兩種単獨(dú)的方法可以在該BMP2f/f中進(jìn)行ΒΜΡ2的失活。該AAV-8-MUP-Cre是優(yōu)選的因?yàn)橹亟M只在該小鼠的注射中發(fā)生，并且不是在出生之前?？梢杂迷摬《緦?shí)現(xiàn)的時(shí)間特異性意味著該動(dòng)物更少的暴露于低ΒΜΡ2水平，這些水平可能使分析復(fù)雜化。用于該基于病毒的方法的對(duì)照物將與用于ΒΜΡ4并且基于BMP2f/f和ー種eGFP病毒的那些是相似的以排除該被IoxP位點(diǎn)側(cè)翼的但非重組的等位基因或該病毒本身影響該小鼠的可能性。在単獨(dú)的PCR分析中將會(huì)進(jìn)行成功的基因缺失的確認(rèn)以尋找重組事件。通過(guò)本領(lǐng)域中的一位普通技術(shù)人員按常規(guī)進(jìn)行了這些分析。蛋白質(zhì)印跡分析作為ー個(gè)附加的對(duì)照物將被進(jìn)行以確保與圖4中顯示的分析相似的BMP2的缺失。為了確定在沒(méi)有肝臟切除術(shù)的情況下該條件性缺乏的小鼠是否具有ー個(gè)基因型。肝臟重量將確定BMP2是否調(diào)節(jié)肝臟尺寸。對(duì)于任何可能的對(duì)肝臟以及骨髄的影響， 肝臟功能測(cè)試和血細(xì)胞計(jì)數(shù)將被確定。由于SMAD介導(dǎo)BMP信號(hào)，并且SMAD4通過(guò)鐵調(diào)素 (hepcidin)表達(dá)已經(jīng)顯示出在鐵代謝中具有ー種作用(Wang等人，2005)，如在Yu等人中所描述的將對(duì)這些小鼠的鐵、轉(zhuǎn)鐵蛋白以及鐵蛋白的水平進(jìn)行附加的研究(Yu et al. (2007) Nature Chemical Biology，4 :33-41)，其全部傳授內(nèi)容通過(guò)引用結(jié)合在此。用以上描述的對(duì)照物通過(guò)用AAV-8-Cre感染被IoxP位點(diǎn)側(cè)翼的BMP2小鼠將產(chǎn)生肝臟特異性缺乏BMP2的小鼠。在2/3肝臟切除之后將會(huì)在6小時(shí)與7天之間對(duì)這些小鼠進(jìn)行肝細(xì)胞増殖的檢測(cè)。為了確定該作用機(jī)制，使用實(shí)時(shí)PCR和蛋白質(zhì)印跡法將對(duì)缺乏BMP2 的小鼠進(jìn)行與該缺乏BMP4的小鼠的相似分析。為了進(jìn)一步確定BMP2的缺失在肝臟切除術(shù)之后是否導(dǎo)致增強(qiáng)的肝細(xì)胞増殖，使用缺乏BMP2的小鼠BrdU結(jié)合和Ki_67染色法也被進(jìn)行。在BMP2與BMP4小鼠之間增殖的任何差異將指向BMP2對(duì)BMP4的特異的功能，從而表明該途徑的不同成員如何造成不同的功能。
C.確定ALK2/ALK3的肝臟特異性移除在損傷后是否增強(qiáng)肝臟修復(fù)ALK3的移除在肝臟切除術(shù)之后是否增加了肝細(xì)胞増殖并且導(dǎo)致肝臟質(zhì)量的更快速的恢復(fù)，這將在肝臟特異性缺乏Alk3的小鼠中被確定。其目標(biāo)在于表征ALK3、ー種BMP 受體的損失在損傷之后對(duì)肝臟修復(fù)的影響。在鑒定ー種高特異性的藥物拮抗劑中，確定這些BMP受體中的哪ー個(gè)正在介導(dǎo)該相關(guān)的信號(hào)是關(guān)鍵性的。如上面所描述的將產(chǎn)生ー種 “被IoxP位點(diǎn)側(cè)翼的”ALK3(AU3f/f)小鼠。為了確定該缺乏條件的小鼠在沒(méi)有肝臟切除的情況下是否具有ー個(gè)基因型，這些小鼠的一種廣泛的調(diào)查將被進(jìn)行以確定鐵、轉(zhuǎn)鐵蛋白、鐵蛋白、血細(xì)胞比容的水平以及貧血或異常紅色細(xì)胞形態(tài)學(xué)的證據(jù)。與BMP4相似，ALK3的失活可以以兩種不同的方式進(jìn)行病毒的方法以及轉(zhuǎn)基因的方法。用于該基于病毒的方法的對(duì)照物將使用具有ー種eGFP病毒的ALK3f/f以排除該被 IoxP位點(diǎn)側(cè)翼的但非重組的等位基因具有可能使該分析復(fù)雜化的系統(tǒng)影響的可能性，或該病毒本身影響再生的可能性。使用PCR分析基因缺失將被驗(yàn)證以尋找重組事件和蛋白質(zhì)印跡以確保蛋白質(zhì)去除。通過(guò)用AAV-8-MUP-Cre感染產(chǎn)生的肝臟特異性缺乏Alk3的小鼠將與接受 AAV-8-MUP-GFP對(duì)照物病毒的被IoxP位點(diǎn)側(cè)翼的Alk3小鼠進(jìn)行比較。在2/3肝臟切除之后將會(huì)在6小時(shí)與7天之間將對(duì)這些小鼠進(jìn)行2/3肝臟切除之后肝細(xì)胞増殖的檢測(cè)。為了確定該作用機(jī)制，使用實(shí)時(shí)PCR和蛋白質(zhì)印跡法將進(jìn)行與該缺乏BMP4小鼠的相似分析。如果該肝臟質(zhì)量仍然與7天之后的對(duì)照物不同，這將表明Alk3可能被包括在肝臟尺寸的更長(zhǎng)期的調(diào)整中。類似地，使用已采用的相似的方法將采用肝臟特異性Alk2單敲除連同Alk2/AU3 雙敲除(“缺乏”)小鼠以確定這些組分在肝臟再生中的這些特異的分子機(jī)制。實(shí)例4I確定ー種抑制BMP信號(hào)的藥物或化學(xué)試劑在肝部分切除術(shù)之后是否可以改善肝細(xì)胞増殖、在損傷后增強(qiáng)肝臟修復(fù)，并且在大量肝切除或撲熱息痛(泰i若 )過(guò)量給藥之后改善了存活。A.確定ー種抑制BMP信號(hào)的藥物或化學(xué)試劑在損傷之后0/3肝切除)是否可以增強(qiáng)肝臟修復(fù)C57B6小鼠將經(jīng)歷一系列配量方案，使用dorsomorphin或0^193189，BMP信號(hào)的選擇性抑制劑。也將采用在WO 2008/033408中描述的其他的化合物或通過(guò)在WO 2008/033408中描述的方法鑒定的化合物。首先，將產(chǎn)生用于這些化合物的肝臟的ー種劑量響應(yīng)曲線。由于BMP信號(hào)的抑制對(duì)影響Id-I和鐵調(diào)素的表達(dá)是已知的，實(shí)時(shí)PCR和蛋白質(zhì)印跡法作為ー種獨(dú)立的輸出將被進(jìn)行以評(píng)估該藥物阻塞的效率。為了確定是否存在這些化合物的系統(tǒng)性影響，還將檢測(cè)肝臟功能測(cè)試、鐵、鐵蛋白水平。這些適當(dāng)?shù)膭┝繉⒈淮_定為最低的劑量，該劑量在2/3肝切除(“肝部分切除”)后產(chǎn)生了肝細(xì)胞増殖的最大的增強(qiáng)。一旦這個(gè)被確定，小鼠在用dorsomorphin或UM193189給藥后將經(jīng)歷2/3肝切除。 肝臟將會(huì)在6、M、36、48、72、96以及168小時(shí)處被收獲。將單獨(dú)用鹽水處理對(duì)照物小鼠。 Dorsomorphin影響肝細(xì)胞增殖的機(jī)制通過(guò)如上面描述的BrdU結(jié)合以及Ki_67標(biāo)記分析將被評(píng)價(jià)。類似地，如上面描述的還將進(jìn)行實(shí)時(shí)PCR和蛋白質(zhì)印跡法以確定BMP表達(dá)的水平。B.確定dorsomorphin或ΠΜ193189是否在大量肝切除后增強(qiáng)存活(80%肝切除)
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使用如所描述的多種給藥方案，C57/B6小鼠如上面描述的將經(jīng)歷80%肝切除。將用dorsomorphin或UM193189給藥的小鼠與作為ー種對(duì)照物的接受鹽水的小鼠進(jìn)行比較。 將產(chǎn)生卡普蘭-邁耶曲線。在48小時(shí)和96小時(shí)處在存活者中將收獲肝臟，然后在7天時(shí)用于評(píng)估肝細(xì)胞健康的組織學(xué)以及評(píng)價(jià)肝細(xì)胞增殖的BrdU結(jié)合。TUNEL標(biāo)記將被用于評(píng)價(jià)凋亡的水平?；谙惹暗挠^察在沒(méi)有干渉的情況下30%的存活率是預(yù)期的。功率計(jì)算表明 22個(gè)對(duì)照物小鼠和22個(gè)接受藥物將是足夠的。C.確定dorsomorphin或LDM93189是否在撲熱息痛(泰諾 )配藥過(guò)量后增強(qiáng)存活在接受dorsomorphin或UM193189之后將以300mg/kg撲熱息痛(泰諾 )對(duì)小鼠進(jìn)行給藥。在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中該劑量將被調(diào)整以產(chǎn)生70%的死亡率。接受鹽水的對(duì)照物動(dòng)物將作為對(duì)照物起作用。采用至少22個(gè)對(duì)照物小鼠和22個(gè)實(shí)驗(yàn)小鼠。將產(chǎn)生用于存活率的劑量響應(yīng)曲線。在48小時(shí)和96小時(shí)處將進(jìn)行組織學(xué)，并且在7天時(shí)再次評(píng)估肝細(xì)胞健康并且通過(guò)BrdU分析將評(píng)價(jià)肝細(xì)胞増殖。使用TUNEL染色法將對(duì)凋亡進(jìn)行評(píng)價(jià)。盡管很有可能的是增強(qiáng)肝細(xì)胞增殖能夠使存活率的平衡傾斜，來(lái)自撲熱息痛(泰 i若 )肝細(xì)胞壞死可以使這些肝細(xì)胞不能對(duì)增殖性刺激物應(yīng)答。在人類中，肝細(xì)胞在撲熱息痛(泰i若 )毒性之后増殖，但在沒(méi)有用于該小鼠的生命支撐的情況下，這可能是不可行的。在此引用的所有專利、公開申請(qǐng)以及參考文獻(xiàn)的傳授的內(nèi)容都通過(guò)引用以其全部?jī)?nèi)容結(jié)合在此。雖然通過(guò)參考其實(shí)例性的實(shí)施方案本發(fā)明已經(jīng)進(jìn)行了具體的展示和說(shuō)明，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解的是在不偏離由所附權(quán)利要求所包括的本發(fā)明的范圍下其中可以在形式和細(xì)節(jié)方面進(jìn)行多種改變。
權(quán)利要求
1.一種骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP)信號(hào)傳導(dǎo)途徑的拮抗劑，用于在肝臟的治療中使用。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種拮抗劑，用于在治療肝臟損傷或疾病中使用。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或權(quán)利要求2所述的一種拮抗劑，用于其中描述的用途；其中所述治療是預(yù)防性治療。
4.如在任何以上權(quán)利要求中描述的一種拮抗劑，用于其中描述的用途；其中該拮抗劑增加了肝細(xì)胞的增殖。
5.如在任何以上權(quán)利要求中描述的一種拮抗劑，用于其中描述的用途；其中該拮抗劑抑制或下調(diào)了一種組成上有活性的BMP信號(hào)傳導(dǎo)途徑。
6.如在權(quán)利要求5中描述的一種拮抗劑，用于其中描述的用途；其中所述BMP信號(hào)傳導(dǎo)途徑是一種BMP2或BMP4-介導(dǎo)的信號(hào)傳導(dǎo)途徑。
7.如在權(quán)利要求5中描述的一種拮抗劑，用于其中描述的用途；其中所述BMP信號(hào)傳導(dǎo)途徑的所述拮抗劑抑制了 I型BMP受體信號(hào)傳導(dǎo)。
8.如在權(quán)利要求7中描述的一種拮抗劑，用于其中描述的用途；其中所述BMP信號(hào)傳導(dǎo)途徑的所述拮抗劑通過(guò)結(jié)合到所述I型受體上抑制了 I型BMP受體信號(hào)傳導(dǎo)。
9.如在權(quán)利要求7或8中描述的一種拮抗劑，用于其中描述的用途；其中所述I型BMP 受體是 ALK2、ALK3 或 ALK6。
10.如在權(quán)利要求9中描述的一種拮抗劑，用于其中描述的用途；其中所述I型BMP受體是ALK2或ALK3。
11.如在權(quán)利要求5中描述的一種拮抗劑，用于其中描述的用途；其中所述BMP信號(hào)傳導(dǎo)途徑的所述拮抗劑抑制了 smad-l、5或8的磷酸化。
12.如在權(quán)利要求5中描述的一種拮抗劑，用于其中描述的用途；其中所述BMP信號(hào)傳導(dǎo)途徑的所述拮抗劑抑制了 BMP2或BMP4結(jié)合到一種BMP受體上或一種II型BMP受體與一種I型BMP受體的相互作用。
13.如在任何以上權(quán)利要求中描述的一種拮抗劑，用于其中描述的用途；其中該拮抗劑是一種化學(xué)試劑。
14.如在權(quán)利要求13中描述的一種拮抗劑，用于其中描述的用途；其中該化學(xué)試劑是 dorsomorphin, LDN193189或任何上述物質(zhì)的一種類似物。
15.如權(quán)利要求1至14中任何一項(xiàng)所描述的一種拮抗劑，用于在肝臟再生中的使用。
16.如權(quán)利要求1至14中任何一項(xiàng)所描述的一種拮抗劑，用于在對(duì)肝臟的部分損失或損傷的治療中。
17.如在權(quán)利要求16中描述的一種拮抗劑，用于其中描述的用途；其中所述損失或損傷由一種外科或移植操作引起。
18.如在權(quán)利要求17中描述的一種拮抗劑，用于其中描述的用途；其中所述外科操作是肝臟切除術(shù)。
19.如在權(quán)利要求17中描述的一種拮抗劑，用于其中描述的用途；其中該損失或損傷是肝臟功能不全。
20.根據(jù)權(quán)利要求16至19中任何一項(xiàng)所述的一種拮抗劑，用于其中描述的用途；其中所述治療先于所述損傷。
21.如在任何以上權(quán)利要求中描述的一種拮抗劑，用于其中描述的用途；其中所述用途是關(guān)于一種哺乳動(dòng)物的治療。
22.如在任何以上權(quán)利要求中描述的一種拮抗劑，用于其中描述的用途；其中所述用途是關(guān)于人類的治療。
23.如權(quán)利要求1至22中任何一項(xiàng)所描述的一種拮抗劑，用于其中描述的用途；其中所述用途是關(guān)于肝臟移植供體的治療。
24.如權(quán)利要求1至22中任何一項(xiàng)所描述的一種拮抗劑，用于其中描述的用途；其中所述用途是關(guān)于肝臟移植接受者的治療。
25.如權(quán)利要求2或它的任何從屬權(quán)利要求所述的一種拮抗劑，用于其中描述的用途； 其中所述肝臟損傷由一種肝毒性化學(xué)試劑引起。
26.如在權(quán)利要求25中描述的一種拮抗劑，用于其中描述的用途；其中所述肝毒性化學(xué)試劑是撲熱息痛。
27.如在任何以上權(quán)利要求中所描述的一種拮抗劑，用于由一種肝臟疾病引起的肝臟損傷的治療中，該肝臟疾病選自下組，該組由以下各項(xiàng)組成甲型肝炎、乙型肝炎、丙型肝炎、其他的肝炎病毒感染、自身免疫性肝炎、肝硬化、膽汁性肝硬化、急性肝衰竭、慢性肝衰竭、急性肝衰竭、急性肝臟感染、癌癥、血銅藍(lán)蛋白缺乏癥、吉耳伯特綜合征、雷氏綜合征、 Alagille綜合征、血色素沉著癥、苯丙酮尿癥以及其他的氨基酸代謝病、血友病以及其他的凝血因子缺乏病、家族性血膽固醇過(guò)多以及其他的脂類代謝紊亂、尿素循環(huán)障礙、果糖血癥、糖原病、酪氨酸血癥、半乳糖血癥、蛋白質(zhì)和碳水化合物代謝缺乏病、有機(jī)酸尿癥、線粒體疾病、過(guò)氧化物酶體以及溶酶體失調(diào)、蛋白質(zhì)合成異常、肝細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白缺陷癥、糖基化缺陷癥、急性化學(xué)毒性、膽管炎、α-1-抗胰蛋白酶缺陷癥、膽道閉鎖、肝臟的囊性病、脂肪肝、半乳糖血癥、膽結(jié)石、卟啉癥、原發(fā)性硬化性膽管炎、肉樣瘤病、酪氨酸血癥以及1型糖原貯積病。
28.一種在人類或動(dòng)物體外部進(jìn)行的方法，該方法包括對(duì)肝臟、對(duì)肝臟的一部分、或?qū)Ω渭?xì)胞給予一種拮抗劑；其中所述拮抗劑是如任何以上的權(quán)利要求中描述的一種拮抗劑。
29.—種包括肝臟、肝臟的一部分或肝細(xì)胞的組合物，所述組合物進(jìn)一步包括一種拮抗劑；其中所述拮抗劑是如任何以上權(quán)利要求中所描述的一種拮抗劑并且其中所述肝臟、肝臟的一部分或肝細(xì)胞不是位于該人類或動(dòng)物體內(nèi)。
30.根據(jù)權(quán)利要求四所述的一種組合物；用在移植中。
全文摘要
本發(fā)明是針對(duì)肝臟在損傷、切除或移植后使用肝臟中的骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP)信號(hào)傳導(dǎo)途徑的拮抗劑增強(qiáng)肝臟修復(fù)的方法。
文檔編號(hào)A61P1/16GK102596188SQ201080037123
公開日2012年7月18日 申請(qǐng)日期2010年7月9日 優(yōu)先權(quán)日2009年7月14日
發(fā)明者杜芮, 西斯·J·卡爾普, 馬丁·狄伯 申請(qǐng)人:貝思以色列女教會(huì)醫(yī)學(xué)中心