專利名稱：用于治療癌癥的組合免疫療法的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明大體涉及用于治療癌癥的采用T細(xì)胞抑制性受體阻斷與ICOS刺激相結(jié)合的方法和組合物。
背景技術(shù)：
最佳T細(xì)胞活化需要同時通過T細(xì)胞受體和協(xié)同刺激分子的信號。原型協(xié)同刺激分子⑶28在與其配體B7-1和B7-2相互作用后在初始T細(xì)胞啟動中起關(guān)鍵作用。Sharpe等，Nat. Rev. Immunol. 2:203-209(2002)。CD28 介導(dǎo)的 T 細(xì)胞擴(kuò)增由另一 B7-1, 2 反受體細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞相關(guān)抗原4(CTLA-4)抵消，從而減弱新近活化的T細(xì)胞的增殖。Krummel等,J.Exp.Med. 183:2533-2540(1996) ；Leach 等,Science 271:1734-1736(1996)。CD28和CTLA-4表達(dá)的時序調(diào)控在活化信號和抑制信號之間保持平衡，并且確保產(chǎn)生有效免疫 反應(yīng)，同時提防出現(xiàn)自體免疫。CTLA-4介導(dǎo)的抑制信號的阻斷在多種動物模型中顯示增強(qiáng)T細(xì)胞反應(yīng)并誘導(dǎo)腫瘤排斥反應(yīng)，并且人CTLA-4的單克隆抗體已在正在進(jìn)行的人臨床試驗(yàn)中獲得適度成功，包括在一小部分患有轉(zhuǎn)移性疾病的患者中的持久完全反應(yīng)。參見，例如Korman 等，Adv. Tmmuno1. 90:297-339(2006)。其它⑶28和B7家族成員ro-i (程序化死亡-I)、ro-Ll (程序化死亡配體-I或B7-H1)和TO-L2 (B7-DC)的鑒別和表征進(jìn)一步增加人中T細(xì)胞活化和周邊耐受性的過程的復(fù)雜性。類似于B7-1，2/CTLA-4相互作用，PD-I與TO-Ll和TO-L2的相互作用下調(diào)中樞和周邊免疫反應(yīng)。Fife等，Immunol. Rev. 224:166-82(2008)。因此，基于抗體阻斷I3D-I (如CTLA-4)也在關(guān)于治療癌癥的人臨床試驗(yàn)中進(jìn)行探查。參見,例如Berger等Clin. CancerRes. 14:3044-3051 (2008) o然而，如同CTLA-4—樣，仍需要改良的療法。誘導(dǎo)性協(xié)同刺激物(ICOS)是在結(jié)構(gòu)上與⑶28和CTLA-4相關(guān)的T細(xì)胞特異性表面分子。Hutloff 等，Nature 397:263-266(1999) ;Dong 等，Nature 409:97-101(2001)。最初，ICOS在免疫反應(yīng)中的作用與Th2細(xì)胞因子的產(chǎn)生強(qiáng)烈相關(guān)，表明表達(dá)ICOS的T細(xì)胞可能在抑制免疫反應(yīng)中起作用。缺乏ICOS的小鼠顯示Th2細(xì)胞因子白介素10的產(chǎn)生減少，并且已發(fā)現(xiàn)通過調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的IL-10產(chǎn)生與以細(xì)胞外源性方式抑制效應(yīng)T細(xì)胞反應(yīng)相關(guān)。Yoshinaga 等，Nature 402:827-832 (1999) ;Kohyama 等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA101:4192-97 (2004)。然而，相反，最近的數(shù)據(jù)表明表達(dá)ICOS的T細(xì)胞還可能參與自體免疫反應(yīng)，并且膀胱癌患者中的CTLA-4阻斷顯示使⑶4+T細(xì)胞上的ICOS表達(dá)增加，所述細(xì)胞接著產(chǎn)生 IFN-Y 并識別腫瘤抗原。Yu 等 Nature 450:299-303(2007) ;Liakou 等，Proc.Natl. Acad. Sci. USA 105:14987-992(2008)。此外，還顯示 I COS 與效應(yīng)記憶和調(diào)節(jié)性 T細(xì)胞存活增加相關(guān)，表明其功能相關(guān)性可能并不局限于調(diào)節(jié)性T細(xì)胞。Burmeister等，J.Immunol. 180:774-782(2008)。因而，T細(xì)胞活化過程中ICOS信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的生理學(xué)作用仍未闡明。由于這種持續(xù)的不確定性，因此當(dāng)前尚未知在癌癥療法的情形中調(diào)節(jié)ICOS信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的可能影響。發(fā)明概述本發(fā)明通過證明同時施用ICOS激動劑與T細(xì)胞抑制性受體阻斷相結(jié)合可進(jìn)一步增強(qiáng)所述阻斷的抗腫瘤作用來闡明ICOS信號轉(zhuǎn)導(dǎo)在癌癥的發(fā)展或治療中的作用。因此，提供組合T細(xì)胞抑制性受體(例如CTLA-4和/或ro-1)阻斷與激動劑誘導(dǎo)的ICOS信號轉(zhuǎn)導(dǎo)用于治療癌癥的組合物和方法。提供功能活化型ICOS抗體以及表達(dá)ICOS配體的疫苗，其適用于本發(fā)明的組合物和方法中。附圖簡述圖I示出在抗⑶3抗體不存在或存在的情況下抗ICOS抗體(7E. 17G或C398. 4)對鼠類CD4+T細(xì)胞的激動作用。圖2示出在未治療動物或用抗CTLA-4抗體治療的動物中三周后腫瘤體積(mm3 ；y-軸)與⑶4+FoXp3_細(xì)胞(x-軸)的ICOS表達(dá)百分比(％)之間存在反相關(guān)。圖3示出未治療的帶有B16腫瘤的IC0S+/IC0SL+動物、用GVAX和抗CTLA-4抗體(9H10)治療的IC0S+/IC0SL+_動物、未治療的IC0S7IC0SL+動物、用GVAX和抗CTLA-4抗體 (9H10)治療的IC0S7IC0SL+動物、未治療的IC0S+/IC0SL_a物和用GVAX和抗CTLA-4抗體(9H10)治療的IC0S+/IC0SL_動物的存活百分比。圖4示出在用GVAX和抗CTLA-4抗體(a CTLA4)治療的動物或用GVAX、抗CTLA-4抗體(a CTLA4)和抗ICOS抗體(a ICO)治療的動物中腫瘤激發(fā)0_50天后(x_軸)的腫瘤尺寸(mm3，y-軸)。圖5示出未治療、用GVAX治療、用GVAX和抗CTLA-4抗體治療或用GVAX、抗CTLA-4抗體和抗ICOS抗體治療的帶有B16/BL6腫瘤的動物的存活百分比。圖6示出未治療、用GVAX和抗ICOS (7E. 17G9)抗體治療、用GVAX和抗TO-Ll抗體(10F. 9G2)治療或用GVAX、抗TO-Ll抗體和抗ICOS抗體治療的帶有B16/BL6腫瘤的動物的存活百分比。圖7示出用GVAX和經(jīng)過轉(zhuǎn)導(dǎo)以表達(dá)Thyl. I的B16/BL6細(xì)胞(B16_Thyl. I)或經(jīng)過轉(zhuǎn)導(dǎo)以表達(dá)膜結(jié)合ICOSL的B16/BL6細(xì)胞(B16_mIC0SL)治療的動物的各動物的個別腫瘤生長曲線(左欄)、各治療組的平均腫瘤體積(右上圖)和各治療組的存活曲線(右下圖)。個別腫瘤生長曲線中的數(shù)字指示實(shí)驗(yàn)結(jié)束時無腫瘤小鼠的百分比。對于存活曲線，當(dāng)腫瘤體積達(dá)到300mm3時小鼠視為死亡。圖8示出用GVAX和抗CTLA-4抗體(9H10)單獨(dú)或與經(jīng)過轉(zhuǎn)導(dǎo)以表達(dá)膜結(jié)合ICOSL (mICOSL)的B16/BL6細(xì)胞組合治療的動物的各動物的個別腫瘤生長曲線(左欄)、各治療組的平均腫瘤體積(右上圖)和各治療組的存活曲線(右下圖)。個別腫瘤生長曲線中的數(shù)字指示實(shí)驗(yàn)結(jié)束時無腫瘤小鼠的百分比。對于存活曲線，當(dāng)腫瘤體積達(dá)到300mm3時小鼠視為死亡。圖9示出在未治療或在抗CTLA-4抗體(9H10)不存在或存在下用經(jīng)過轉(zhuǎn)導(dǎo)以表達(dá)Thy I. I的B16/BL6細(xì)胞(B16_Thyl. I)治療或在抗CTLA-4抗體(9H10)不存在或存在下用經(jīng)過轉(zhuǎn)導(dǎo)以表達(dá)膜結(jié)合ICOSL的B16/BL6細(xì)胞(B16_mIC0SL)治療的小鼠中由第一 B16/BL6實(shí)驗(yàn)獲得的個別腫瘤生長曲線。數(shù)字指示實(shí)驗(yàn)結(jié)束時無腫瘤小鼠的百分比。

圖10示出在未治療或在抗CTLA-4抗體(9H10)不存在或存在下用經(jīng)過轉(zhuǎn)導(dǎo)以表達(dá)Thy I. I的B16/BL6細(xì)胞(B16_Thyl. I)治療或在抗CTLA-4抗體(9H10)不存在或存在下用經(jīng)過轉(zhuǎn)導(dǎo)以表達(dá)膜結(jié)合ICOSL的B16/BL6細(xì)胞(B16_mIC0SL)治療的小鼠中由第二 B16/BL6實(shí)驗(yàn)獲得的個別腫瘤生長曲線。數(shù)字指示實(shí)驗(yàn)結(jié)束時無腫瘤小鼠的百分比。
圖11示出在未治療或在抗CTLA-4抗體(9H10)不存在或存在下用經(jīng)過轉(zhuǎn)導(dǎo)以表達(dá)Thy I. I的B16/BL6細(xì)胞(B16_Thyl. I)治療或在抗CTLA-4抗體(9H10)不存在或存在下用經(jīng)過轉(zhuǎn)導(dǎo)以表達(dá)膜結(jié)合ICOSL的B16/BL6細(xì)胞(B16_mIC0SL)治療的小鼠中B16/BL6的各治療組的存活曲線。圖12A示出在未治療或用經(jīng)過轉(zhuǎn)導(dǎo)以表達(dá)膜結(jié)合ICOSL的B16/BL6細(xì)胞(B16-mIC0SL)和/或抗CTLA-4抗體(9H10)治療的小鼠中B16/BL6的平均腫瘤生長曲線。圖12B示出在未治療或用經(jīng)過轉(zhuǎn)導(dǎo)以表達(dá)膜結(jié)合ICOSL的B16/BL6細(xì)胞(B16_mIC0SL)和/或抗CTLA-4抗體(9H10)治療的小鼠中B16/BL6的各治療組的存活曲線。對于存活曲線，當(dāng)腫瘤體積達(dá)到300mm3時小鼠視為死亡。詳細(xì)描述本文描述通過例如ICOS配體或激動劑抗體刺激ICOS介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)增強(qiáng)T細(xì)胞抑制性受體(如CTLA-4和ro-1)阻斷劑的抗腫瘤作用的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。因此，本文提供包含T細(xì)胞抑制性受體阻斷劑和ICOS刺激劑的組合物和使用所述組合物治療罹患癌癥的患者的 方法。T細(xì)胞抑制性受體阻斷劑/ICOS刺激劑誘導(dǎo)性T細(xì)胞協(xié)同刺激物(ICOS)也稱為“AIUM”、“CD278”和“MGC39850”。ICOS的完整cDNA序列的GENBANK登錄號為NM_012092. 3并且人ICOS的氨基酸序列的GENBANK登錄號為NP_036224。ICOS屬于⑶28和CTLA-4細(xì)胞表面受體家族。其形成同源二聚體并且在細(xì)胞-細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、免疫反應(yīng)和細(xì)胞增殖調(diào)節(jié)中起重要作用。然而，當(dāng)前尚未知ICOS信號轉(zhuǎn)導(dǎo)在介導(dǎo)抗腫瘤反應(yīng)中的作用。ICOS 配體(ICOSL)也稱為“B7H2”、“GL50”、“B7-H2”、“B7RP1”、“CD275”、“ IC0SLG”、“LIC0S”、“B7RP-1”、“IC0S-L” 和 “KIAA0653”。ICOSL 的完整 cDNA 序列的 GENBANK 登錄號為NM_015259. 4并且人ICOSL的氨基酸序列的GENBANK登錄號為NP_056074。ICOS的刺激劑是通常結(jié)合ICOS的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域的分子(例如ICOSL)。阻斷劑的結(jié)合親和力通常為至少約100 U Mo刺激劑實(shí)質(zhì)上不與ICOS的相關(guān)分子(如⑶28和免疫球蛋白超家族的其它成員)反應(yīng)。如本文所證明，適合刺激劑活化ICOS的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)并使T細(xì)胞活化(例如增殖)相應(yīng)增加。參見，例如圖I。候選ICOS刺激劑根據(jù)其符合此標(biāo)準(zhǔn)的能力進(jìn)行篩選。測定結(jié)合的親和力和特異性的測定法在本領(lǐng)域中是已知的，包括競爭性和非競爭性測定法。目標(biāo)測定法包括ELISA、RIA、流式細(xì)胞測量術(shù)等。結(jié)合測定可使用經(jīng)過純化或半純化的IC0S，或者可使用表達(dá)ICOS的T細(xì)胞，例如用ICOS的表達(dá)構(gòu)建體轉(zhuǎn)染的細(xì)胞；通過交聯(lián)CD3和CD28刺激過的T細(xì)胞；添加受過輻照的同種異體細(xì)胞等。作為結(jié)合測定法的一實(shí)例，可使經(jīng)過純化的ICOS結(jié)合于不溶性載體，例如微量滴定板、磁性珠粒等。將候選刺激劑和經(jīng)過標(biāo)記的可溶性ICOS配體添加至細(xì)胞中，并且接著洗去未結(jié)合的組分。接著可通過定量所結(jié)合的標(biāo)記配體測定刺激劑與天然配體競爭ICOS結(jié)合的能力?？墒褂脵z測T細(xì)胞活化的功能性測定法證實(shí)所述藥劑是ICOS的刺激劑。例如，可在抗CD3存在或不存在下用候選刺激劑刺激T細(xì)胞群體，如本文和圖I中所例示。刺激ICOS的藥劑將使T細(xì)胞活化增加，如通過例如CD4+T細(xì)胞增殖和/或細(xì)胞周期進(jìn)程、IL-2釋放、⑶25和⑶69上調(diào)等所測量。本領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)了解，表達(dá)于細(xì)胞表面上、包裝于脂質(zhì)體中、粘附于粒子或孔等將增加分子的有效價數(shù)。如本文所使用的T細(xì)胞抑制性受體包括表達(dá)于T細(xì)胞表面上的當(dāng)受配體活化或結(jié)合時下調(diào)T細(xì)胞活化的任何受體。換句話說，阻斷T細(xì)胞抑制性受體將增加T細(xì)胞活化和/或效應(yīng)T細(xì)胞反應(yīng)。T細(xì)胞抑制性受體和其配體在本領(lǐng)域中是熟知的。非限制性和示例性T細(xì)胞抑制性受體包括CTLA-4和H)-l。熟練技術(shù)人員將認(rèn)識到，CTLA-4的配體包括⑶80和⑶86。此外，熟練技術(shù)人員將認(rèn)識到，PD-I的配體包括I3D-Ll和TO-L2。人CTLA-4的完整cDNA序列具有GENBANK登錄號L15006。氨基酸區(qū)1_37是前導(dǎo)肽；38-161是細(xì)胞外V樣結(jié)構(gòu)域；162-187是跨膜結(jié)構(gòu)域；并且188-223細(xì)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域。核苷酸序列的變體已有報導(dǎo)，包括位置49處的G至A轉(zhuǎn)換、位置272處的C至T轉(zhuǎn)換和位置439處的A至G轉(zhuǎn)換。小鼠CTLA-4的完整DNA序列具有EMBL登錄號X05719 (Brunet等(1987)Nature 328:267-270)。氨基酸區(qū) 1_35 是前導(dǎo)肽。人TO-I的完整cDNA序列具有GENBANK登錄號NM_005018并且人I3D-I的氨基酸 序列具有GENBANK登錄號NP_005009. I。氨基酸區(qū)1_20是信號肽，并且成熟肽存在于氨基酸 21-288。T細(xì)胞抑制性受體的阻斷劑通常是特異性結(jié)合T細(xì)胞抑制性受體的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域或T細(xì)胞抑制性受體配體的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域從而通過阻斷T細(xì)胞抑制性受體與其配體(例如⑶80、⑶86、PD-L1、PD-L2等)的結(jié)合而阻止T細(xì)胞抑制性受體活化的分子。阻斷劑的結(jié)合親和力通常為至少約100 u M0阻斷劑實(shí)質(zhì)上不與T細(xì)胞抑制性受體的相關(guān)分子(如⑶28和免疫球蛋白超家族的其它成員)反應(yīng)。此外，阻斷劑不活化T細(xì)胞抑制性受體的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。適宜的是，此將通過使用單價或二價結(jié)合分子實(shí)現(xiàn)。本領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)了解，不同分子之間的交叉反應(yīng)性和競爭的以下論述欲指具有相同物種來源的分子，例如人T細(xì)胞抑制性受體結(jié)合人T細(xì)胞抑制性受體配體等。候選阻斷劑根據(jù)其符合此標(biāo)準(zhǔn)的能力進(jìn)行篩選。測定結(jié)合的親和力和特異性的測定法在本領(lǐng)域中是已知的，包括競爭性和非競爭性測定法。相關(guān)測定法包括ELISA、RIA、流式細(xì)胞測量術(shù)等。結(jié)合測定可使用經(jīng)過純化或半純化的T細(xì)胞抑制性受體蛋白，或者可使用表達(dá)T細(xì)胞抑制性受體的T細(xì)胞，例如用T細(xì)胞抑制性受體的表達(dá)構(gòu)建體轉(zhuǎn)染的細(xì)胞；通過交聯(lián)CD3和CD28刺激過的T細(xì)胞；添加受過輻照的同種異體細(xì)胞等。作為結(jié)合測定法的一實(shí)例，可使經(jīng)過純化的T細(xì)胞抑制性受體蛋白結(jié)合于不溶性載體，例如微量滴定板、磁性珠粒等。將候選阻斷劑和經(jīng)過標(biāo)記的可溶性T細(xì)胞抑制性受體配體添加至細(xì)胞中，并且接著洗去未結(jié)合的組分。接著可通過定量所結(jié)合的標(biāo)記配體測定阻斷劑與配體競爭T細(xì)胞抑制性受體結(jié)合的能力。一般來說，可溶性單價或二價結(jié)合分子將活化T細(xì)胞抑制性受體信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。可使用檢測T細(xì)胞活化的功能性測定法進(jìn)行證實(shí)。例如，可在候選阻斷劑存在或不存在下用經(jīng)過輻照的表達(dá)T細(xì)胞抑制性受體配體的同種異體細(xì)胞刺激T細(xì)胞群體。阻斷T細(xì)胞抑制性受體信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的藥劑將使T細(xì)胞活化增加，如通過增殖和細(xì)胞周期進(jìn)程、I L-2釋放、CD25和CD69上調(diào)等所測量。本領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)了解，表達(dá)于細(xì)胞表面上、包裝于脂質(zhì)體中、粘附于粒子或孔等將增加分子的有效價數(shù)。T細(xì)胞抑制性受體阻斷劑或ICOS刺激劑各自可個別地為肽、小有機(jī)分子、肽模擬物、可溶性配體、抗體等?？贵w為優(yōu)選阻斷劑或刺激劑。抗體可為多克隆或單克?。煌暾蚪囟?，例如F(ab' )2、Fab、Fv;異種、同種異體、同基因，或其經(jīng)過修飾的形式，例如人源化、
嵌合等。在許多情況下，T細(xì)胞抑制性受體阻斷劑或ICOS刺激劑將為寡肽，例如抗體或其片段等，但還可采用提供相對較高特異性和親和力的其它分子。組合文庫提供具有必需結(jié)合特征的除寡肽以外的化合物。一般來說，親和力為至少約10_6m，更通常約10_8M，即通常在特異性單克隆抗體的情況下所觀察到的結(jié)合親和力。多種篩選測定法可用于T細(xì)胞抑制性受體阻斷劑或ICOS刺激劑。所述測定法的組分通常分別包括T細(xì)胞抑制性受體(和任選地T細(xì)胞抑制性受體活化劑，例如T細(xì)胞抑制性受體配體)或IC0S。測定混合物還將包含候選藥理學(xué)劑。一般來說，利用不同藥劑濃度平行操作多種測定混合物以獲得對各種濃度的不同反應(yīng)。通常，這些濃度之一用作陰性對照，即0濃度或低于檢測水平。 適宜的是，在這些測定中，一種或多種分子將聯(lián)接于標(biāo)記，其中所述標(biāo)記可直接或間接提供可檢測信號。各種標(biāo)記包括放射性標(biāo)記、熒光體、化學(xué)發(fā)光體、酶、特異性結(jié)合分子、粒子(例如磁性粒子)等。特異性結(jié)合分子包括分子對，如生物素與抗生蛋白鏈菌素、地高辛與抗地高辛等。對于特異性結(jié)合分子，通常將互補(bǔ)成員用可供根據(jù)已知程序進(jìn)行檢測的分子標(biāo)記。一種相關(guān)篩選測定法是針對通過同源配體干擾T細(xì)胞抑制性受體活化或活化ICOS信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的藥劑?；罨亩靠赏ㄟ^本領(lǐng)域中已知的多種方法來實(shí)現(xiàn)。例如，可通過定量細(xì)胞增殖、細(xì)胞因子釋放等來測定T細(xì)胞活化。其它相關(guān)測定法是針對阻斷T細(xì)胞抑制性受體與其反受體或配體的結(jié)合的藥劑。測定混合物將包含天然反受體的至少一部分，或共享足夠序列相似性以提供特異性結(jié)合的寡肽，以及候選藥理學(xué)劑。寡肽可具有適于測定條件和要求的任何長度，通常長至少8個氨基酸，并且直至全長蛋白質(zhì)或其融合物。T細(xì)胞抑制性受體可結(jié)合于不溶性基材?；目梢远喾N材料和形狀制成，例如微量滴定板、微珠粒、纖維素試紙、樹脂粒子等?；慕?jīng)過選擇以使背景最少并使信噪比達(dá)到最大。結(jié)合可通過本領(lǐng)域中已知的多種方法定量。在足以允許結(jié)合達(dá)到平衡的孵育期后，洗滌不溶性載體，并對剩余標(biāo)記進(jìn)行定量。干擾結(jié)合的藥劑將使所檢測到的標(biāo)記減少。候選阻斷劑或刺激劑涵蓋眾多化學(xué)類別，不過其通常為有機(jī)分子，優(yōu)選為分子量大于50并小于2，500道爾頓的小有機(jī)化合物。候選阻斷劑或刺激劑包含與蛋白質(zhì)發(fā)生結(jié)構(gòu)相互作用(尤其為氫鍵結(jié))所必需的官能團(tuán)，并且通常至少包括氨基、羰基、羥基、巰基或羧基，優(yōu)選包括所述化學(xué)官能團(tuán)中的至少兩者。候選阻斷劑或刺激劑通常包含經(jīng)過以上官能團(tuán)中的一個或多個取代的環(huán)碳或雜環(huán)結(jié)構(gòu)和/或芳香族或聚芳香族結(jié)構(gòu)。候選阻斷劑或刺激劑也在生物分子中發(fā)現(xiàn)，包括肽、糖、脂肪酸、固醇、嘌呤、嘧啶、其衍生物、結(jié)構(gòu)類似物或組合。候選阻斷劑或刺激劑從多種來源獲得，包括合成或天然化合物文庫。例如，眾多方式可用于隨機(jī)和定向合成多種有機(jī)化合物和生物分子，包括表達(dá)隨機(jī)寡核苷酸?；蛘?，可獲得或容易地產(chǎn)生呈細(xì)菌、真菌、植物和動物提取物形式的天然化合物文庫。另外，天然或合成產(chǎn)生的文庫和化合物可容易地通過常規(guī)化學(xué)、物理和生物化學(xué)方法進(jìn)行修飾。已知的藥理學(xué)劑可進(jìn)行定向或隨機(jī)化學(xué)修飾，如?；?、烷基化、酯化、酰胺化以產(chǎn)生結(jié)構(gòu)類似物。
篩選測定中可包括多種其它試劑。其包括如鹽、中性蛋白質(zhì)等試劑，例如白蛋白、清潔劑等，所述試劑可用于促進(jìn)最佳蛋白質(zhì)-DNA結(jié)合和/或減少非特異性或背景相互作用。還可使用以其它方式提高測定效率的試劑，如蛋白酶抑制劑、核酸酶抑制劑、抗微生物劑等。適用作阻斷劑或刺激劑的抗體可通過分別用包含T細(xì)胞抑制性受體或ICOS蛋白的全部或一部分的肽免疫宿主動物來獲得。適合宿主動物包括小鼠、大鼠、綿羊、山羊、倉鼠、兔等。蛋白質(zhì)免疫原的來源可為小鼠、人、大鼠、猴等。宿主動物通常為與免疫原不同的物種，例如使用小鼠T細(xì)胞 抑制性受體免疫倉鼠、使用人T細(xì)胞抑制性受體免疫小鼠等。人和小鼠T細(xì)胞抑制性受體在細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域中含有高度保守的延伸段(Harper等(1991)J. Immunol. 147:1037-1044)。由這些高度保守的區(qū)獲得的肽可用作產(chǎn)生交叉特異性抗體的免疫原。免疫原可包含完整蛋白質(zhì)或其片段和衍生物。優(yōu)選免疫原包含人T細(xì)胞抑制性受體(例如人CTLA-4的氨基酸殘基38-161)或ICOS蛋白的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域的全部或一部分，其中這些殘基含有發(fā)現(xiàn)于天然T細(xì)胞抑制性受體上的翻譯后修飾，如糖基化。包含細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域的免疫原以本領(lǐng)域中已知的多種方式產(chǎn)生，例如使用常規(guī)重組方法表達(dá)克隆的基因，從T細(xì)胞、表達(dá)高水平免疫原的分選細(xì)胞群體分離等。在希望表達(dá)重組或修飾蛋白質(zhì)以制備免疫原的情況下，將使用編碼T細(xì)胞抑制性受體或ICOS蛋白的期望部分的載體。一般來說，表達(dá)載體設(shè)計成使得T細(xì)胞抑制性受體或ICOS蛋白的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域位于轉(zhuǎn)染細(xì)胞表面上或者細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域從所述細(xì)胞分泌。當(dāng)欲分泌細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域時，將使細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域的編碼序列與允許分泌的序列(包括信號肽)同框融合。信號肽可為外源的或原生的。用于免疫的相關(guān)融合蛋白聯(lián)接T細(xì)胞抑制性受體的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域與免疫球蛋白的恒定區(qū)。例如，可使用包含鼠類T細(xì)胞抑制性受體或ICOS蛋白的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域聯(lián)接于人Cgl (鉸鏈-CH2-CH3)結(jié)構(gòu)域的融合蛋白來免疫倉鼠。當(dāng)欲使T細(xì)胞抑制性受體或ICOS蛋白免疫原表達(dá)于細(xì)胞表面上時，使細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域的編碼序列與編碼使細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域錨定于膜中的肽的序列和信號序列同框融合。這些錨定序列包括原生T細(xì)胞抑制性受體或ICOS蛋白跨膜結(jié)構(gòu)域或來自其它細(xì)胞表面蛋白(例如⑶4、⑶8、slg等)的跨膜結(jié)構(gòu)域?？墒褂媒?jīng)過人T細(xì)胞抑制性受體基因或人ICOS基因轉(zhuǎn)染的小鼠細(xì)胞來免疫小鼠和產(chǎn)生分別對于人T細(xì)胞抑制性受體蛋白或ICOS蛋白具有特異性的抗體。單克隆抗體通過常規(guī)技術(shù)產(chǎn)生。一般來說，經(jīng)過免疫的宿主動物的脾和/或淋巴結(jié)提供漿細(xì)胞來源。通過與骨髓瘤細(xì)胞融合使?jié){細(xì)胞永生化以產(chǎn)生雜交瘤細(xì)胞。使用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)篩選來自個別雜交瘤的培養(yǎng)物上清液以鑒別產(chǎn)生具有期望特異性的抗體的雜交瘤。適用于產(chǎn)生人蛋白質(zhì)的單克隆抗體的動物包括小鼠、大鼠、倉鼠等。為產(chǎn)生針對小鼠蛋白質(zhì)的抗體，動物通常為倉鼠、天竺鼠、兔等?？贵w可通過常規(guī)技術(shù)，例如使用結(jié)合于不溶性載體的T細(xì)胞抑制性受體的親和色譜、蛋白質(zhì)A瓊脂糖等從雜交瘤細(xì)胞上清液或腹水純化。抗體可以單鏈形式產(chǎn)生，替代正常多聚結(jié)構(gòu)。單鏈抗體描述于Jost等(1994)J. B. C. 269:26267-73和其它文獻(xiàn)中。將編碼重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)的DNA序列連接于編碼小中性氨基酸(例如甘氨酸和/或絲氨酸)的至少4個氨基酸的間隔子。由此融合物編碼的蛋白質(zhì)允許組裝保留原始抗體的特異性和親和力的功能性可變區(qū)。
對于體內(nèi)使用，尤其對于注射至人體內(nèi)，需要降低阻斷劑或刺激劑的抗原性。接受者針對阻斷劑的免疫反應(yīng)將可能減少療法有效的時間。產(chǎn)生嵌合抗體的方法在本領(lǐng)域中是已知的。人源化抗體可為具有轉(zhuǎn)基因人免疫球蛋白恒定區(qū)基因的動物的產(chǎn)物(參見，例如國際專利申請WO 90/10077和WO 90/04036)?；蛘撸赏ㄟ^重組DNA技術(shù)對相關(guān)抗體進(jìn)行工程改造以用相應(yīng)人序列取代CHI、CH2、CH3、鉸鏈結(jié)構(gòu)域和/或框架結(jié)構(gòu)域(參見WO92/02190)。使用Ig cDNA來構(gòu)建嵌合免疫球蛋白基因在本領(lǐng)域中是已知的(Liu等(1987)P. N. A. S. 84:3439 (1987) J. Immunol. 139:3521)。從雜交瘤或其它產(chǎn)生抗體的細(xì)胞分離mRNA并用于產(chǎn)生cDNA。相關(guān)cDNA可使用特定引物通過聚合酶鏈反應(yīng)進(jìn)行擴(kuò)增(美國專利No. 4，683，195和4，683，202)?；蛘?，制備文庫并進(jìn)行篩選以分離相關(guān)序列。接著使編碼抗體可變區(qū)的DNA序列與人恒定區(qū)序列融合。人恒定區(qū)基因的序列可見于Kabat等(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest, N. I. H.出版物 no. 91-3242 中。人 C區(qū)基因可容易地從已知克隆獲得。同種型的選擇將受期望效應(yīng)功能影響，如補(bǔ)體固定或抗體依賴性細(xì)胞毒性中的活性。優(yōu)選同種型是IgGl、IgG3和IgG4。可使用人輕鏈恒定區(qū)K或入中的任一者。接著通過常規(guī)方法表達(dá)嵌合、人源化抗體?？贵w片段(如Fv、F(ab' )2和Fab)可通過裂解完整蛋白質(zhì)，例如通過蛋白酶或化學(xué)裂解來制備?；蛘撸O(shè)計截短基因。例如，編碼一部分F(ab' )2片段的嵌合基因包括編碼H鏈的CHl結(jié)構(gòu)域和鉸鏈區(qū)、接著為翻譯終止密碼子的DNA序列以產(chǎn)生截短分子?？墒褂肏和L J區(qū)的共有序列來設(shè)計用作引物的寡核苷酸以將適用限制性位點(diǎn)引入J區(qū)中，以供隨后將V區(qū)區(qū)段連接于人C區(qū)區(qū)段。可通過定點(diǎn)誘變對C區(qū)CDNA進(jìn)行修飾以在人序列中的類似位置安置限制性位點(diǎn)。表達(dá)載體包括質(zhì)粒、逆轉(zhuǎn)錄病毒、YAC、EBV來源的附加體等。適宜載體為編碼功能上完整的人CH或CL免疫球蛋白序列的載體，其中工程改造有適當(dāng)限制性位點(diǎn)以便可容易地插入和表達(dá)VH或VL序列。在所述載體中，拼接通常發(fā)生于所插入J區(qū)中的拼接供體位點(diǎn)與人C區(qū)前方的拼接受體位點(diǎn)之間以及發(fā)生于存在于人CH外顯子內(nèi)部的拼接區(qū)。聚腺苷酸化和轉(zhuǎn)錄終止發(fā)生于編碼區(qū)下游的原生染色體位點(diǎn)。所得嵌合抗體可聯(lián)接于任何強(qiáng)啟動子，包括逆轉(zhuǎn)錄病毒LTR，例如SV-40早期啟動子(Okayama等(1983) Mo I.Cell.Bio. 3:280)、勞斯肉瘤病毒(Rous sarcoma virus)LTRCGorman^ (1982)P. N. A. S. 79:6777)和莫洛尼鼠白血病病毒(moloney murine leukemia virus) LTR(Grosschedl 等(1985) Cell41:885);天然Ig啟動子等。在一個實(shí)施方案中，T細(xì)胞抑制性受體阻斷劑是結(jié)合CTLA-4的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域并抑制抗CTLA-4信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的抗CTLA-4抗體。適用于人的抗CTLA-4抗體包括例如伊匹單抗(ipilimumab) (MDX-010)和特利姆單抗(tremelimumab) (CP 675,206)。在另一實(shí)施方案中，T細(xì)胞抑制性受體阻斷劑是阻斷ro-i與ro-Ll的結(jié)合并抑制ro-i信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的抗ro-i抗體。適用于人的抗體包括例如MDX-1106/0N0-4538和CT-011。在另一實(shí)施方案中，T細(xì)胞抑制性受體阻斷劑是阻斷ro-1與ro-iL的結(jié)合并抑制ro-i信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的抗B7-H1 (pd-il)抗體。在另一實(shí)施方案中，T細(xì)胞抑制劑的阻斷劑是抗CTLA-4抗體和/或抗ro-1抗體和/或抗B7-H1抗體的組合。在另一實(shí)施方案中，ICOS刺激劑是結(jié)合ICOS的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域并活化ICOS信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的抗ICOS抗體，所述信號轉(zhuǎn)導(dǎo)導(dǎo)致T細(xì)胞活化增加，例如增殖。在另一實(shí)施方案中，ICOS刺激劑是重組IC0SL，其可溶或表達(dá)于遺傳修飾細(xì)胞的表面上。編碼阻斷劑或刺激劑的病毒載體和其表達(dá)細(xì)胞在一個實(shí)施方案中，一種或多種T細(xì)胞抑制性受體的阻斷劑和/或ICOS刺激劑是由病毒載體和轉(zhuǎn)化細(xì)胞表達(dá)。例如，本文所述的病毒載體和轉(zhuǎn)化人細(xì)胞可表達(dá)阻斷通過T細(xì)胞抑制性受體進(jìn)行的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的抗T細(xì)胞抑制性受體抗體和/或活化ICOS介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的ICOS刺激劑(例如ICOS配體)。在一優(yōu)選實(shí)施方案中，表達(dá)候選阻斷劑和/或刺激劑的病毒載體和人細(xì)胞能夠接近于腫瘤(尤其浸潤淋巴細(xì)胞的腫瘤)表達(dá)所述藥劑。可使用的人細(xì)胞包括腫瘤細(xì)胞、抗原呈遞細(xì)胞(例如樹突狀細(xì)胞)、B細(xì)胞和T細(xì)胞。當(dāng)前公開的細(xì)胞可供由細(xì)胞接近于腫瘤局部表達(dá)阻斷劑和/或刺激劑。細(xì)胞可在體內(nèi)修飾，或者可將離體修飾的細(xì)胞通過多種方法(如通過注射)施用于患者。在一個實(shí)施方案中，細(xì)胞是腫瘤細(xì)胞。對于離體轉(zhuǎn)化，可如本領(lǐng)域中所已知對所述腫瘤細(xì)胞進(jìn)行輻照以消除細(xì)胞復(fù)制的能力，同時維持施用后阻斷劑和/或刺激劑的瞬時表達(dá)。對于體內(nèi)轉(zhuǎn)化，可優(yōu)選非整合型表達(dá)載體。在某些優(yōu)選實(shí)施方案中，腫瘤細(xì)胞是自體的或內(nèi)源性的。在前一種情況下，從患者取出腫瘤細(xì)胞，用編碼阻斷劑和/或刺激劑的構(gòu)建體轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)導(dǎo)，并在例如輻照后再引入患者體內(nèi)。在后一種情況下，通過局部施用本文所述的適當(dāng)構(gòu)建體在體內(nèi)轉(zhuǎn)化腫瘤細(xì)胞。在一替代實(shí)施方案中，經(jīng)過修飾的腫瘤細(xì)胞是同種異體的。同種異體腫瘤細(xì)胞因此可在細(xì)胞系中維持。在此情況下，腫瘤細(xì)胞可選自經(jīng)過輻照或引入患者體內(nèi)的細(xì)胞系。在另一替代實(shí)施方案中，經(jīng)過修飾的人細(xì)胞是抗原呈遞細(xì)胞(如樹突狀細(xì)胞)或單核細(xì)胞。在另一替代實(shí)施方案中，經(jīng)過修飾的人細(xì)胞是T細(xì)胞。能夠產(chǎn)生阻斷劑和/或刺激劑的經(jīng)過修飾的人細(xì)胞可通過用編碼阻斷劑和/或刺激劑的表達(dá)載體轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞來制備。用于表達(dá)阻斷劑、刺激劑或阻斷劑和/或刺激劑的組合的表達(dá)載體可通過本領(lǐng)域中熟知的方法制備。在各種實(shí)施方案中，阻斷劑和/或刺激劑可以一種或多種核酸構(gòu)建體形式施用于患者。在一個實(shí)施方案中，構(gòu)建體包含逆轉(zhuǎn)錄病毒載體。逆轉(zhuǎn)錄病毒載體能夠?qū)⒕幋a阻斷劑和/或刺激劑的DNA永久整合至細(xì)胞基因組中。因此，在離體操縱自體或同種異體細(xì)胞的情況下，可制備組成性產(chǎn)生阻斷劑和/或刺激劑的穩(wěn)定細(xì)胞系。在一優(yōu)選實(shí)施方案中，細(xì)胞在施用于患者之前進(jìn)行輻照。經(jīng)過輻照的細(xì)胞產(chǎn)生阻斷劑和/或刺激劑持續(xù)有限時間。在一個實(shí)施方案中，表達(dá)構(gòu)建體包含在哺乳動物細(xì)胞中顯示高水平瞬時表達(dá)的SFV 載體。SFV 載體描述于例如 Lundstrom, Expert Opin. Biol. Ther. 3:771-777 (2003)中，所述文獻(xiàn)以引用的方式整體并入本文。因此，在患者中體內(nèi)操縱內(nèi)源性細(xì)胞的情況下，可實(shí)現(xiàn)阻斷劑和/或刺激劑的高水平瞬時表達(dá)。此舉用于防止體內(nèi)T細(xì)胞的組成性表達(dá)和永久活化。能夠在體內(nèi)表達(dá)重組蛋白質(zhì)的系統(tǒng)在本領(lǐng)域中是已知的。舉例來說并且不加限制，所述系統(tǒng)可使用Fang等，Nature Biotech. 23 (5) 2005和美國專利公布2005/0003506中公開的2A介導(dǎo)的抗體表達(dá)系統(tǒng)，所述文獻(xiàn)明確以引用的方式整體并入本文。預(yù)期本領(lǐng)域中已知的其它系統(tǒng)，并且也可適于產(chǎn)生如本文所述的阻斷劑和/刺激劑。、
可將施用本文公開的表達(dá)阻斷劑和/或刺激劑的細(xì)胞與施用刺激抗原呈遞細(xì)胞的細(xì)胞因子(如粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞群落刺激因子(GM-CSF)、巨噬細(xì)胞群落刺激因子(M-CSF)、粒細(xì)胞群落刺激因子(G-CSF)、白介素3 (IL-3)、白介素12 (IL-12)等)或能夠表達(dá)所述細(xì)胞因子的細(xì)胞疫苗進(jìn)行組合。在優(yōu)選實(shí)施方案中，對阻斷劑和/或刺激劑表達(dá)細(xì)胞進(jìn)行進(jìn)一步修飾以表達(dá)所述細(xì)胞因子。已知增強(qiáng)T細(xì)胞增殖和分泌的其它蛋白質(zhì)和/或細(xì)胞因子(如IL-1、IL-2、B7、抗⑶3和抗⑶28)可與阻斷劑同時或依序使用以增強(qiáng)免疫反應(yīng)。本療法還可與任何分子組合，或如美國專利No. 6，051，227中所述進(jìn)行，所述文獻(xiàn)以引用的方式整體并入本文。載體和轉(zhuǎn)化方法編碼阻斷劑和/或刺激劑的表達(dá)載體可為病毒或非病毒載體。病毒載體對于體內(nèi)使用為優(yōu)選的。本發(fā)明的表達(dá)載體包含編碼T細(xì)胞抑制性受體阻斷劑的核酸或編碼ICOS刺激劑的核酸或其互補(bǔ)序列可操作地連接于在哺乳動物中具有功能的表達(dá)控制區(qū)或其互補(bǔ)序列。表達(dá)控制區(qū)能夠驅(qū)動可操作地連接的阻斷劑和/或刺激劑編碼核酸的表達(dá)以使得所述阻斷劑和/或刺激劑在經(jīng)過所述表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的人細(xì)胞中產(chǎn)生。表達(dá)控制區(qū)為影響可操作地連接的核酸的表達(dá)的調(diào)節(jié)性聚核苷酸(在本文中有時稱為元件)，如啟動子和增強(qiáng)子。本發(fā)明表達(dá)載體的表達(dá)控制區(qū)能夠使可操作地連接的編碼核酸在人細(xì)胞中表達(dá)。在一個實(shí)施方案中，細(xì)胞是腫瘤細(xì)胞。在一個實(shí)施方案中，細(xì)胞是非腫瘤細(xì)胞。在一個實(shí)施方案中,表達(dá)控制區(qū)使得可操作地連接的核酸的表達(dá)可調(diào)節(jié)。信號(有時稱為刺激物)可增加或減少可操作地連接于這一表達(dá)控制區(qū)的核酸的表達(dá)。回應(yīng)于信號 增加表達(dá)的所述表達(dá)控制區(qū)通常稱為誘導(dǎo)性?；貞?yīng)于信號減少表達(dá)的所述表達(dá)控制區(qū)通常稱為阻遏性。通常，由所述元件所賦予的增加或減少量與所存在信號的量成比例；信號量越大，表達(dá)增加或減少越多。本發(fā)明尤其優(yōu)選使用能夠瞬時回應(yīng)于信號實(shí)現(xiàn)高水平表達(dá)的誘導(dǎo)性啟動子。當(dāng)與腫瘤細(xì)胞接近時，通過使轉(zhuǎn)化細(xì)胞暴露于適當(dāng)信號誘導(dǎo)經(jīng)過包含這一表達(dá)控制序列的阻斷劑和/或刺激劑表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的細(xì)胞瞬時產(chǎn)生高水平的ICOS配體。優(yōu)選誘導(dǎo)性表達(dá)控制區(qū)包括包含以如小分子化合物等信號刺激的誘導(dǎo)性啟動子的誘導(dǎo)性表達(dá)控制區(qū)。特定實(shí)例可見于例如美國專利No. 5，989，910,5, 935，934,6, 015，709和6，004，941中，所述專利各自以引用的方式整體并入本文。表達(dá)控制區(qū)包括全長啟動子序列，如原生啟動子和增強(qiáng)子元件，以及保留全部或部分全長或非變異型功能的子序列或聚核苷酸變體。如本文所用，術(shù)語“功能性”和其語法變體當(dāng)在提及核酸序列、子序列或片段的情況下使用時，意謂所述序列具有原生核酸序列(例如非變異型或未修飾序列)的一種或多種功能。如本文所用，“可操作地連接”是指所述組分的實(shí)體并置關(guān)系允許其以預(yù)定方式起作用。在表達(dá)控制元件與核酸可操作地連接的實(shí)例中，所述關(guān)系使得控制元件可調(diào)節(jié)所述核酸的表達(dá)。通常，調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄的表達(dá)控制區(qū)并置于所轉(zhuǎn)錄核酸的5'端附近(目卩“上游”)。表達(dá)控制區(qū)還可位于所轉(zhuǎn)錄序列的31端(即“下游”)或在轉(zhuǎn)錄物內(nèi)(例如在內(nèi)含子中)。表達(dá)控制元件可位于離所轉(zhuǎn)錄序列一定距離處(例如離所述核酸100至500、500至1000、2000至5000或更多個核苷酸)。表達(dá)控制元件的特定實(shí)例是啟動子，其通常位于所轉(zhuǎn)錄序列的5'。表達(dá)控制元件的另一實(shí)例是增強(qiáng)子，其可位于所轉(zhuǎn)錄序列的5'或3'，或在專利序列內(nèi)部。在人細(xì)胞中具功能性的表達(dá)系統(tǒng)在本領(lǐng)域中是已知的，且包括病毒系統(tǒng)。一般來說，在人細(xì)胞中具功能性的啟動子是能夠結(jié)合哺乳動物RNA聚合酶并起始下游(3' )IC0S配體編碼序列轉(zhuǎn)錄成mRNA的任何DNA序列。啟動子將具有轉(zhuǎn)錄起始區(qū)，其通常接近編碼序列5'端安置，并且TATA盒通常位于轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游25-30個堿基對處。認(rèn)為TATA盒引導(dǎo)RNA聚合酶II在正確位點(diǎn)開始RNA合成。啟動子通常還含有上游啟動子元件(增強(qiáng)子元件)，其通常位于TATA盒上游100至200個堿基對以內(nèi)。上游啟動子元件決定轉(zhuǎn)錄起始速率并且可以任何方向起作用。來自哺乳動物病毒基因的啟動子特別適用作啟動子，因?yàn)椴《净蛲ǔ８咚奖磉_(dá)并且具有廣泛宿主范圍。實(shí)例包括SV40早期啟動子、小鼠哺乳動物腫瘤病毒LTR啟動子、腺病毒主要晚期啟動子、單純皰疹病毒啟動子和CMV啟動子。通常，由哺乳動物細(xì)胞識別的轉(zhuǎn)錄終止和聚腺苷酸化序列是位于轉(zhuǎn)錄終止密碼子3/的調(diào)節(jié)區(qū)并且因此連同啟動子元件一起側(cè)接編碼序列。成熟mRNA的31末端由位點(diǎn)特異性翻譯后裂解和聚腺苷酸化形成。轉(zhuǎn)錄終止子和聚腺苷酸化信號的實(shí)例包括來源于SV40 者。表達(dá)構(gòu)建體中還可包括內(nèi)含子。存在多種可用于將核酸引入不同細(xì)胞中的技術(shù)。適于在體外將核酸轉(zhuǎn)移至哺乳動物細(xì)胞中的技術(shù)包括使用脂質(zhì)體、電穿孔、微注射、細(xì)胞融合、基于聚合物的系統(tǒng)、DEAE-葡聚糖、病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)、磷酸鈣沉淀法等。對于體內(nèi)基因轉(zhuǎn)移，也可使用多種技術(shù)和試齊U，包括脂質(zhì)體；基于天然聚合物的遞送載體，如殼聚糖和明膠；病毒載體對于體內(nèi)轉(zhuǎn)導(dǎo)也是優(yōu)選的(例如 Dzau 等，Trends in Biotechnology 11，205-210 [1993])。在一些情況下，希望提供靶向劑，如對于腫瘤細(xì)胞表面膜蛋白具有特異性的抗體或配體。在采用脂質(zhì)體的情況下，結(jié)合與內(nèi)吞作用相關(guān)的細(xì)胞表面膜蛋白的蛋白質(zhì)可用于靶向和/或促進(jìn)攝取，例如親近特定細(xì)胞類型的衣殼蛋白或其片段、在循環(huán)中進(jìn)行內(nèi)化的蛋白質(zhì)的抗體、靶向細(xì)胞內(nèi)定位并增強(qiáng)細(xì)胞內(nèi)半衰期的蛋白質(zhì)。受體介導(dǎo)的內(nèi)吞作用的技術(shù)描述于例如 Wu 等，J. Biol. Chem. 262, 4429-4432 (1987)；和 Wagner 等,Proc. Natl. Acad. Sci.USA 87,3410-3414(1990)中。關(guān)于基因療法方案的綜述，請參見Anderson等，Science256，808-813(1992)。適當(dāng)時，還可采用基因遞送劑，如整合序列。眾多整合序列在本領(lǐng)域中是已知的(參見，例如 Nunes-Duby 等,Nucleic Acids Res. 26:391-406，1998 ；Sadwoski, J.Bacteriol.，165:341-357，1986 ；Bestor,Cell, 122(3):322-325, 2005 ；Plasterk 等，TIG15:326-332，1999 ；Kootstra 等，Ann. Rev. Pharm. Toxicol.，43:413-439，2003)。其包括重組酶和轉(zhuǎn)座酶。實(shí)例包括 Cre(Sternberg 和 Hamilton, J. Mol. Biol.，150:467-486，1981)、入(Nash,Nature, 247，543-545，1974)、FIp (Broach 等，Cel1，29:227-234，1982)R(Matsuzaki 等，J. Bacteriology, 172:610-618，1990)、C31 (參見，例如 Groth 等，J.Mol. Biol. 335:667-678, 2004)、睡美人(sleeping beauty)、水手家族的轉(zhuǎn)座酶(Plasterk等，同上)和整合型病毒的組分，如具有可供病毒整合的組分的AAV、逆轉(zhuǎn)錄病毒和抗病毒，如逆轉(zhuǎn)錄病毒或滿病毒的LTR序列和AAV的ITR序列(Kootstra等，Ann. Rev. Pharm.Toxicol.，43:413-439，2003)。病毒載體
在一個方面，本發(fā)明提供用于表達(dá)阻斷劑和/或刺激劑的表達(dá)載體，其為病毒載體。已知許多適用于基因療法的病毒載體(參見，例如Lundstrom, TrendsBiotechnol. , 21:117, 122, 2003。優(yōu)選病毒載體包括選自由抗病毒(LV)、逆轉(zhuǎn)錄病毒(RV)、腺病毒(AV)、腺相關(guān)病毒(AAV)和a病毒組成的組的載體，不過也可使用其它病毒載體。對于體內(nèi)使用，優(yōu)選不整合至宿主基因組中的病毒載體，如a病毒和腺病毒，其中a病毒尤其優(yōu)選。a病毒的優(yōu)選類型包括辛德畢斯病毒(Sindbis virus)、委內(nèi)瑞拉馬腦炎(Venezuelan equineencephalitis ；VEE)病毒和塞姆利基森林病毒(Semliki Forest virus ;SFV),其中 SFV 尤其優(yōu)選。參見，例如 Lundstrom, Expert Opin. Biol. Then 3:771-777，2003 ;Afanasieva 等Gene Then, 10:1850-59，2003。對于體外使用，優(yōu)選整合至宿主基因組中的病毒載體，如逆轉(zhuǎn)錄病毒、AAV和抗病毒。在一優(yōu)選實(shí)施方案中，病毒載體供在經(jīng)過轉(zhuǎn)導(dǎo)的人細(xì)胞中瞬時高水平表達(dá)。
在一個實(shí)施方案中，病毒載體并不用于將阻斷劑和/或刺激劑編碼核酸整合至經(jīng)過轉(zhuǎn)導(dǎo)的人細(xì)胞的基因組中。在另一實(shí)施方案中，病毒載體用于將阻斷劑和/或刺激劑編碼核酸整合至經(jīng)過轉(zhuǎn)導(dǎo)的人細(xì)胞的基因組中。在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明提供體內(nèi)轉(zhuǎn)導(dǎo)人細(xì)胞的方法，其包括在體內(nèi)使實(shí)體腫瘤與本發(fā)明的病毒載體接觸。在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供離體轉(zhuǎn)導(dǎo)人細(xì)胞的方法，其包括離體使人細(xì)胞與本發(fā)明的阻斷劑和/或刺激劑病毒載體接觸。在一個實(shí)施方案中，人細(xì)胞是腫瘤細(xì)胞。在一個實(shí)施方案中，人細(xì)胞是同種異體細(xì)胞。在一個實(shí)施方案中，腫瘤細(xì)胞是來源于患者。在一個實(shí)施方案中，人細(xì)胞是非腫瘤細(xì)胞，如抗原呈遞細(xì)胞(APC)或T細(xì)胞。病毒粒子包膜可經(jīng)過修飾以改變特異性和改良細(xì)胞/組織靶向，如本領(lǐng)域中所熟知。病毒載體還可于其它媒劑中遞送，例如脂質(zhì)體。脂質(zhì)體還可具有靶向部分連接于其表面以改良細(xì)胞/組織靶向。本申請是涉及表達(dá)阻斷劑和/或刺激劑的人細(xì)胞。在一優(yōu)選實(shí)施方案中，人細(xì)胞表達(dá)ICOS刺激劑(例如IC0SL，其可分泌或以細(xì)胞表面蛋白形式表達(dá))，其特異性結(jié)合ICOS的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域并且活化ICOS介導(dǎo)的負(fù)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。在某些實(shí)施方案中，人細(xì)胞接近例如癌癥患者的腫瘤細(xì)胞表達(dá)ICOS配體。因此，人細(xì)胞能夠在腫瘤細(xì)胞或腫瘤細(xì)胞塊處局部表達(dá)配體。ICOS配體可活化接近所述腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞中的ICOS信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和/或破壞針對腫瘤相關(guān)自體抗原的免疫耐受性并且刺激針對所述腫瘤細(xì)胞的自體反應(yīng)性T細(xì)胞反應(yīng)。在一優(yōu)選實(shí)施方案中，ICOS配體的局部表達(dá)減少或抑制不當(dāng)不良免疫反應(yīng)。理解作用機(jī)制對于本發(fā)明的實(shí)施來說并不必要。本文所述的細(xì)胞和方法提供接近于腫瘤細(xì)胞或腫瘤細(xì)胞塊的人細(xì)胞。接近于腫瘤細(xì)胞表達(dá)ICOS刺激劑和任選地T細(xì)胞抑制性蛋白阻斷劑或其它細(xì)胞因子增強(qiáng)抗腫瘤免疫反應(yīng)。治療方法本文描述治療罹患癌癥的患者的方法，其包括向所述患者施用包含藥理學(xué)有效量的T細(xì)胞抑制性受體阻斷劑和ICOS刺激劑的藥物組合物。本文所述的方法是針對治療癌癥，例如白血病和實(shí)體腫瘤(例如黑素瘤、癌瘤、肉瘤、淋巴瘤等)。更多常見實(shí)體癌癥包括膀胱癌、骨癌(骨肉瘤)、結(jié)腸直腸癌、腦癌、乳癌、子宮頸癌、食道癌、霍奇金氏淋巴瘤(Hodgkin/ s lymphoma)、腎癌、肝癌、肺癌、間皮瘤、多發(fā)性骨髓瘤、非霍奇金氏淋巴瘤、卵巢癌、胰腺癌、陰莖癌、前列腺癌、皮膚癌(黑素瘤和非黑素瘤)、軟組織癌瘤、胃癌、睪丸癌、甲狀腺癌和子宮內(nèi)膜癌。適當(dāng)時，所施用的藥物組合物通常更包含一種或多種緩沖劑(例如中性緩沖鹽水或磷酸鹽緩沖鹽水)、碳水化合物(例如葡萄糖、甘露糖、蔗糖或葡聚糖)、甘露糖醇、蛋白質(zhì)、多肽或氨基酸(如甘氨酸)、抗氧化劑(例如抗壞血酸、偏亞硫酸氫鈉、丁基化羥基甲苯、丁基化羥基苯甲醚等)、抑菌劑、螯合劑(如EDTA或谷胱甘肽)、使制劑與接受者的血液等滲、低滲或微弱高滲的溶質(zhì)、懸浮劑、增稠劑、防腐劑、調(diào)味劑、甜味劑和著色化合物。雖然可在組合物中使用本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員已知的任何適合載劑，但載劑的類型通常將根據(jù)施用模式而變化。治療組合物可根據(jù)任何適當(dāng)施用模式進(jìn)行配制，包括例如口服、經(jīng)鼻、粘膜、直腸、陰道、局部外用、靜脈內(nèi)、腹膜內(nèi)、皮內(nèi)、皮下和肌肉內(nèi)施用。對于胃腸外施用，組合物可以可注射劑量的一種或多種T細(xì)胞抑制性受體阻斷 齊U、ICOS刺激劑的溶液或懸浮液、表達(dá)一種或多種T細(xì)胞抑制性受體阻斷劑和/或ICOS刺激劑的表達(dá)載體、經(jīng)過表達(dá)一種或多種T細(xì)胞抑制性受體阻斷劑和/或ICOS刺激劑的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的細(xì)胞或其組合形式于具有藥用載劑的生理學(xué)上可接受的稀釋劑中施用，所述載劑可為無菌液體，如無菌無熱原質(zhì)水、油、鹽水、甘油、聚乙二醇或乙醇。另外，組合物中可存在輔助物質(zhì)，如濕潤劑或乳化劑、表面活性劑、PH值緩沖物質(zhì)等。藥物組合物的其它組分為石油、動物、植物或合成來源的組分，例如花生油、大豆油、玉米油、棉籽油、油酸乙酯和豆蘧酸異丙酯的非水性溶液。本文所述的阻斷劑和/或刺激劑(包括表達(dá)所述阻斷劑和/或刺激劑的表達(dá)載體和/或轉(zhuǎn)化細(xì)胞)可存在于單位劑量或多劑量容器中，如密封輸注袋、安瓿或小瓶。所述容器的密封方式通常在使用前保持制劑的無菌性和穩(wěn)定性。一般來說，制劑可如上文所述以懸浮液、溶液或乳液形式于油性或水性媒劑中保存?；蛘?，藥物組合物可在冷凍干燥條件下保存，僅需要在臨使用前添加無菌液體載劑。施用于宿主的量將根據(jù)施用何物、施用目的(如預(yù)防或治療)、宿主狀態(tài)、施用方式、施用次數(shù)、施用之間的間隔時間等而變化。其可由本領(lǐng)域的技術(shù)人員憑經(jīng)驗(yàn)確定且可根據(jù)治療反應(yīng)的程度進(jìn)行調(diào)整。確定適當(dāng)劑量時的考慮因素包括但不限于患者的體型和體重、患者的年齡和性別、癥狀嚴(yán)重性、疾病病期、藥劑的遞送方法、藥劑半衰期和藥劑功效。所考慮的疾病病期包括疾病為急性還是慢性、復(fù)發(fā)期或減輕期和疾病的進(jìn)展。確定治療有效量的劑量和施用時間完全在本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員的技能范圍內(nèi)。例如，初始有效劑量可根據(jù)細(xì)胞培養(yǎng)或其它體外測定法進(jìn)行估算。接著可在動物模型中配制劑量以產(chǎn)生循環(huán)濃度或組織濃度，包括如通過細(xì)胞培養(yǎng)測定法所測定的IC50的濃度。另外，毒性和治療功效通常通過細(xì)胞培養(yǎng)測定法和/或使用實(shí)驗(yàn)動物，通常通過測定LD50 (測試群體的50%致死劑量)和ED5tl (在50%測試群體中具有治療有效性)加以確定。指南見于標(biāo)準(zhǔn)參考著作中，例如Goodman和Gilman' s The Pharmacological Basisof Therapeutics,第 10 版(Hardman, J. G.等編著)McGraw_Hill, New York, N. Y. (2001)。出于本發(fā)明的目的，根據(jù)所治療的病狀和藥物組合物選擇施用方法。阻斷劑和/或刺激劑的施用可以多種方式進(jìn)行，包括但不限于皮下、靜脈內(nèi)、腹膜內(nèi)、肌肉內(nèi)和可能直接注射至指定器官或腫瘤，不過優(yōu)選全身性注射。藥物組合物的施用可通過單一路徑或同時通過若干路徑進(jìn)行。組合物可根據(jù)所治療的適應(yīng)癥和開處方醫(yī)師的判斷以及其它因素每天施用一次、每天施用數(shù)次或若干次或甚至每天施用多次。實(shí)現(xiàn)治療效果所需要的阻斷劑和/或刺激劑的量可出于特定目的根據(jù)常規(guī)程序憑經(jīng)驗(yàn)確定。一般來說，對于出于治療目的施用細(xì)胞，細(xì)胞以藥理學(xué)有效劑量給予?！八幚韺W(xué)有效量”或“藥理學(xué)有效劑量”是指足以產(chǎn)生期望生理作用的量或能夠?qū)崿F(xiàn)期望結(jié)果，尤其用于治療病癥或疾病病狀，包括減少或消除所述病癥或疾病的一種或多種癥狀或表現(xiàn)的量。作為說明，向罹患癌癥的患者施用細(xì)胞不僅在基本病狀得到根除或改善時，而且也在患者報告與所述疾病相關(guān)的癥狀的嚴(yán)重性或持續(xù)時間減少，例如腫瘤負(fù)荷(包括播散性腫瘤細(xì)胞(DTC))減少、循環(huán)腫瘤細(xì)胞減少、無進(jìn)展存活增加時提供治療效益。治療效益還包括 基本疾病或病癥的進(jìn)展停止或減緩，而不論是否實(shí)現(xiàn)改善。如上文所定義的藥理學(xué)有效劑量還適用于與細(xì)胞組合使用的治療化合物，如下文進(jìn)一步描述。優(yōu)選地，所述作用將產(chǎn)生至少約10%、優(yōu)選至少20%、30%、50%、70%或甚至90%或更
高的可定量變化。治療效益還包括基本疾病或病癥的進(jìn)展停止或減緩，而不論是否實(shí)現(xiàn)改善。當(dāng)T細(xì)胞抑制性受體阻斷劑和ICOS刺激劑的組合用于其它治療方案時，有效量是組分組合的比率并且作用不僅限于個別組分。用于治療癌癥的有效量將調(diào)節(jié)癥狀達(dá)至少約10% ;通常至少約20% ;優(yōu)選至少約30% ;或更優(yōu)選至少約50%。此將使受影響細(xì)胞的數(shù)量產(chǎn)生例如統(tǒng)計上顯著并且可定量的變化。其可為遠(yuǎn)端器官中微轉(zhuǎn)移灶的數(shù)量減少、復(fù)發(fā)性轉(zhuǎn)移疾病的減少等。本文所述的阻斷劑和刺激劑可與其它抗腫瘤治療組合，例如手術(shù)切除、輻射療法、化學(xué)療法、免疫療法和支持療法(例如止痛劑、利尿劑、抗利尿劑、抗病毒劑、抗生素、營養(yǎng)補(bǔ)充劑、貧血治療劑、凝血治療劑、骨治療劑以及精神病和心理治療劑)。所述其它抗腫瘤治療(包括用一種或多種T細(xì)胞抑制性受體的一種或多種阻斷劑治療)可與I COS刺激劑的施用依序(例如之前或之后)或同時提供。
實(shí)施例實(shí)施例I :IC0S刺激劑增強(qiáng)抗CTLA-4抗體和抗I3D-Ll抗體的抗腫瘤作用。實(shí)施例I. I =ICOS抗體刺激劑對⑶4+T細(xì)胞增殖的影響。⑶4+T細(xì)胞是利用Dynal鼠類⑶4+T細(xì)胞陰性選擇試劑盒根據(jù)制造商的說明從C57BL/6小鼠脾臟制備。在用或未用抗CD3 mAb (0. 5 y g/ml)和2 y g/ml抗CD28、5 y g/ml抗ICOS mAb (克隆C398. 4A和7E. 17G9)預(yù)先涂布的96孔板中刺激五萬個⑶4+T細(xì)胞。細(xì)胞在37°C下，5%C02中孵育72小時并且在培養(yǎng)結(jié)束前8小時向各孔中添加I y ci 3H-胸苷。收集板并分析3H-胸苷并入。如圖I中所示，抗ICOS抗體在抗⑶3抗體存在下增強(qiáng)⑶4+T細(xì)胞的增殖。實(shí)施例I. 2 :抗CTLA-4誘導(dǎo)的ICOS表達(dá)與腫瘤生長之間的間接相關(guān)性小鼠用2X104個B16/F10腫瘤細(xì)胞激發(fā)。不治療或治療小鼠。經(jīng)過治療的動物在第3天接受200 ii g抗CTLA-4抗體并在腫瘤激發(fā)后6、9、12、15、18和21天時接受100 u g抗CTLA-4抗體。每三天監(jiān)測腫瘤生長和血液中⑶4+F0XP3-效應(yīng)T細(xì)胞上ICOS的水平。
如圖2中所示，從經(jīng)過治療的動物分離的⑶4+F0XP3_細(xì)胞的ICOS表達(dá)水平增加。另外，I COS的表達(dá)增加與腫瘤負(fù)荷間接相關(guān)(圖2)。實(shí)施例I. 3 :IC0S_或IC0SL_小鼠顯示由抗CTLA-4抗體介導(dǎo)的抗腫瘤反應(yīng)減少。帶有B16/BL6 腫瘤的野生型 C57BL/6、IC0S 缺乏 C57BL/6 和 ICOS 配體(ICOSL)缺乏C57BL/6小鼠不進(jìn)行治療或用I X IO6個經(jīng)過輻照的產(chǎn)GM-CSF的B16 (GVAX)皮下治療(腫瘤植入后3天時)和以抗CTLA-4(9H10)分別在第3、5和7天以0. 2,0. I和0. Img劑量腹膜內(nèi)治療。檢測腫瘤生長并在第80天計算存活百分比。帶有腫瘤的野生型、ICOS缺乏或ICOSL缺乏小鼠和未治療動物在腫瘤植入后的25天至41天死亡(分別為空心圓圈、空心三角和空心方塊)。相反，當(dāng)將野生型表述用GVAX和抗CTLA-4組合療法治療時觀察到90%存活(實(shí)心圓圈)。值得注意的是，ICOS缺乏小鼠(實(shí)心三角)和ICOSL缺乏小鼠(實(shí)心方塊)在用GVAX和抗CTLA-4抗體治療后顯示顯著較低的 保護(hù)，表明此配體/受體對相互作用在GVAX/抗CTLA-4組合療法期間具有關(guān)鍵作用。實(shí)施例I. 4 :使用GVAX、抗CTLA-4抗體和抗ICOS抗體增強(qiáng)抗腫瘤作用。用5X104個B16/BL6腫瘤細(xì)胞激發(fā)的小鼠(I)未治療，(2)僅用I X IO6個經(jīng)過輻照的產(chǎn)GM-CSF的B16治療(GVAX ;皮下，植入后3、6和9天)，(2)用IX IO6個經(jīng)過輻照的GVAX (皮下，植入后3、6和9天)、200 ii g抗CTLA-4抗體(腫瘤植入后3天)和100 y g抗CTLA-4抗體(腫瘤植入后6、9、13和17天)治療，或(3)用I X IO6個經(jīng)過輻照的GVAX (植入后3、6和9天)、200 ii g抗CTLA-4抗體(腫瘤植入后3天)、100 y g抗CTLA-4抗體(腫瘤植入后6、9、13和17天)和200iig抗ICOS抗體(腫瘤植入后3、6、9、13和17天)治療。檢測腫瘤生長并在第80天計算存活率。如圖4中所示，用GVAX、抗CTLA-4抗體和抗I COS抗體的組合治療動物與僅用GVAX和抗CTLA-4抗體治療動物相比使得腫瘤生長延緩。此發(fā)現(xiàn)結(jié)果與用GVAX同抗CTLA-4和抗I COS抗體治療的小鼠與僅用GVAX和抗CTLA-4抗體治療的小鼠相比顯示較高存活率的發(fā)現(xiàn)結(jié)果一致(圖5)。實(shí)施例I. 5 :使用抗ICOS和抗I3D-Ll抗體增強(qiáng)抗腫瘤作用帶有B16/BL6的三日齡小鼠未治療或用I X IO6個經(jīng)過輻照的產(chǎn)GM-CSF的B16(GVAX)皮下治療(腫瘤植入后3天時)和用抗ICOS抗體(7E. 17G9)、抗TO-Ll抗體(10F. 9G2)或組合分別在第3、5和7天時以0. 2,0. I和0. Img的劑量腹膜內(nèi)治療。檢測腫瘤生長并在第80天計算存活百分比。用GVAX與抗ICOS抗體或GVAX與抗TO-Ll抗體的組合治療的小鼠顯示較低存活率(圖6)。相反，施用抗ro-Ll抗體、抗ICOS抗體和GVAX的組合療法得到50%存活率，表明用抗ICOS抗體(7E. 17G9)與抗I3D-Ll抗體(10F. 9G2)和GVAX的組合獲得有效協(xié)同效應(yīng)。實(shí)施例2 :使用表達(dá)ICOS配體的腫瘤細(xì)胞作為抗腫瘤疫苗實(shí)施例2. I實(shí)施例2. I. I:抗體抗CTLA4 (克隆 9H10)是購自 Bio X Cell。實(shí)施例2. I. 2:細(xì)胞系使用高致瘤性且低免疫原性的黑素瘤細(xì)胞系B16/BL6進(jìn)行腫瘤激發(fā)。使用表達(dá)GM-CSF的B16/BL6 (此處稱為GVAX)治療帶有腫瘤的小鼠。通過用載體MSCV-IRES-Thyl. I對B16/BL6細(xì)胞進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)產(chǎn)生B16-Thyl. 1，所述載體是來自康涅狄格大學(xué)(University of Connecticut)的Leo Iefrancois博士的饋贈。通過用表達(dá)全長小鼠ICOSL 的載體 MSCV-ICOSL (來自加州大學(xué)伯克利(University of California, Berkeley)的William Sha博士的饋贈)對B16/BL6細(xì)胞進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)產(chǎn)生B16-mIC0SL。GVAX細(xì)胞也用MSCV-ICOSL載體轉(zhuǎn)導(dǎo)以產(chǎn)生GVAX-mlCOSL。實(shí)施例2. I. 3 :腫瘤激發(fā)和治療實(shí)驗(yàn)。小鼠在第0天于右側(cè)腹皮內(nèi)注射50，000個B16/BL6黑素瘤細(xì)胞并且在第3、6、9和12天在左側(cè)腹用7. 5 X IO5個經(jīng)過輻照(150Gy)的GVAX與7. 5 X IO5個經(jīng)過輻照(150Gy)的 B16/BL6-Thyl. I (n=10)或 B16_mIC0SL (n=10)的混合物與腹膜內(nèi) 100 y g 抗 CTLA4 (第 3天200 u g)組合治療。隨時間監(jiān)測腫瘤生長和排斥反應(yīng)。小鼠在第0天于右側(cè)腹皮內(nèi)注射20，000個B16/BL6黑素瘤細(xì)胞并且在第3、6、9和12天在左側(cè)腹用I X IO6個經(jīng)過輻照(150Gy)的GVAX(n=10)或GVAX_mI COSL (n=10)與 腹膜內(nèi)100 y g抗CTLA4 (第3天200 y g)組合治療或不治療。隨時間監(jiān)測腫瘤生長和排斥反應(yīng)。小鼠在第0天于右側(cè)腹皮內(nèi)注射20，000個B16/BL6黑素瘤細(xì)胞并且在第3、6、9和12天在左側(cè)腹用IXlO6個經(jīng)過輻照(150Gy)的B16/BL6_Thyl. I (n=10)或B16_mlCOSL (n=10)在有或沒有腹膜內(nèi)100 ii g抗CTLA4 (第3天200 y g)的情況下治療或不治療。隨時間監(jiān)測腫瘤生長和排斥反應(yīng)。小鼠在第0天于右側(cè)腹皮內(nèi)注射20，000個B16/F10黑素瘤細(xì)胞并且在第3、6、9和12天在左側(cè)腹用I X IO6個經(jīng)過輻照(150Gy)的B16_mIC0SL (n=5)在有或沒有腹膜內(nèi)10(^8抗(1'1^4 (第3天200 yg)的情況下治療或不治療。隨時間監(jiān)測腫瘤生長和排斥反應(yīng)。實(shí)施例2. 2:結(jié)果表達(dá)ICOSL的B16細(xì)胞疫苗在不存在或存在GVAX的情況下并未使腫瘤保護(hù)率增加超過GVAX與CTLA-4阻斷的先前組合療法(圖7和8)。在沒有GM-CSF的環(huán)境中，表達(dá)ICOSL的B16細(xì)胞疫苗連同CTLA-4阻斷一起具有使腫瘤生長延緩和/或總體有利于腫瘤排斥的協(xié)同效應(yīng)(圖9-12)。本文提及的所有專利和專利公布據(jù)此以引用的方式并入。本領(lǐng)域的技術(shù)人員在閱讀前述描述后將進(jìn)行某些修改和改良。應(yīng)了解，所有所述修改和改良在本文中出于簡潔和可讀性的原因均被刪除，但完全落在上述權(quán)利要求書的范圍內(nèi)。
權(quán)利要求
1.一種治療患者的癌癥的方法，其包括向所述患者同時或依序施用包含T細(xì)胞抑制性受體阻斷劑和ICOS激動劑的組合物。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其中所述T細(xì)胞抑制性受體阻斷劑是選自由阻斷性抗CTLA-4抗體、阻斷性抗ro-1抗體和其組合組成的組。
3.根據(jù)權(quán)利要求I或權(quán)利要求2所述的方法，其中所述ICOS激動劑是抗ICOS抗體。
4.根據(jù)權(quán)利要求I或權(quán)利要求2所述的方法，其中所述ICOS激動劑是ICOS配體。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其中所述ICOS配體是可溶性的。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其中所述ICOS配體表達(dá)于細(xì)胞的表面上。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其中所述細(xì)胞是腫瘤細(xì)胞。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其中所述腫瘤細(xì)胞是經(jīng)過輻照的。
9.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其中所述腫瘤細(xì)胞是從所述患者手術(shù)移除的。
全文摘要
本文證明ICOS激動劑與T細(xì)胞抑制性受體(例如CTLA-4、PD-I等)阻斷劑的組合適用于治療腫瘤。
文檔編號A61P35/00GK102740887SQ201080051552
公開日2012年10月17日 申請日期2010年9月30日 優(yōu)先權(quán)日2009年9月30日
發(fā)明者J·埃里森, P·沙爾馬, S·A·蓋扎達(dá), T·傅 申請人:得克薩斯大學(xué)體系董事會, 斯隆凱特林防癌紀(jì)念中心