專利名稱：來源于胎盤的貼壁細(xì)胞及其在疾病治療中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明，在其一些實施例中，涉及來源于胎盤的貼壁細(xì)胞(粘附細(xì)胞，adherentcell)及其在疾病治療中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
近年來，大量的研究工作集中在間充質(zhì)基質(zhì)細(xì)胞(MSC)在各種醫(yī)學(xué)應(yīng)用包括損傷器官例如腦、心臟、骨骼和肝臟的組織修復(fù)以及支持骨髓移植(BMT)中的治療潛力。間充質(zhì)基質(zhì)細(xì)胞，一種從例如骨髓、脂肪組織、胎盤和血液中獲得的異種細(xì)胞群，基于各種生物活性因子的影響，能夠分化成不同類型的細(xì)胞，例如網(wǎng)狀內(nèi)皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、成骨前體細(xì)胞。因此，在再生醫(yī)學(xué)中已對作為建造用于修復(fù)損傷或取代病理組織的新組織如骨骼、軟骨和脂肪的基礎(chǔ)以及遺傳性疾病和獲得性疾病的治療方法的間充質(zhì)基質(zhì)細(xì)胞進(jìn)行了廣泛研究[Fibbe and Noort, Ann N Y AcadSci (2003)996:235-44;Horwitz et al.,Cytotherapy(2005)7(5) :393-5 ；Zimmet andHare, Basic Res Cardiol (2005) 100 (6) :471-81]。此外，間充質(zhì)基質(zhì)細(xì)胞的多向能力、其簡單的分離和培養(yǎng)、及其高離體擴(kuò)增潛能使其成為一種有吸引力的治療工具[Fibbe andNoort, supra;MinguelI et al, Exp Biol Med(Maywood)(2001)226(6):507-20]。最新出現(xiàn)的資料表明間充質(zhì)基質(zhì)細(xì)胞逃脫了同種異體反應(yīng)細(xì)胞的識別，并且被認(rèn)為是免疫豁免的[Le Blanc et al，Exp Hematol (2003) 31 (10) : 890-6]。因為具有低免疫原性，所以間充質(zhì)基質(zhì)細(xì)胞不被患者的免疫系統(tǒng)排斥，因此認(rèn)為不要求做人白細(xì)胞抗原配型。來源于胎盤的間充質(zhì)基質(zhì)細(xì)胞呈現(xiàn)許多對從其他組織中分離出的間充質(zhì)基質(zhì)細(xì)胞來說是常見的標(biāo)記物，例如⑶105、⑶73、⑶90和⑶29，并且沒有造血細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞的和滋養(yǎng)細(xì)胞-特異性細(xì)胞標(biāo)記物的表達(dá)。在適當(dāng)條件下培養(yǎng)來源于胎盤的間充質(zhì)基質(zhì)細(xì)胞，已實現(xiàn)脂肪形成、骨形成、和神經(jīng)元分化[Yen et al, Stem Cells (2005) 23 (I) : 3-9]。此外，已顯示從胎盤中分離并在體外培養(yǎng)的間充質(zhì)基質(zhì)細(xì)胞與間充質(zhì)基質(zhì)細(xì)胞類似，是免疫豁免的[Li et al, Cell Res (2005) 15 (7) : 539—47]。因此，胎盤提供不會引起倫理學(xué)爭議且易于獲得的、用于實驗應(yīng)用和臨床應(yīng)用的間充質(zhì)基質(zhì)細(xì)胞的來源[Zhang et al, ExpHematol(2004)32(7):657-64]。

發(fā)明內(nèi)容
根據(jù)本發(fā)明一些實施方式的一個方面提供來源于胎盤的純化的貼壁細(xì)胞群、由本文中所述的可用于治療可以收益于細(xì)胞或器官移植的疾病的任何貼壁細(xì)胞群所制備的條件培養(yǎng)基(conditioned media)。根據(jù)本發(fā)明的一些實施方式，貼壁細(xì)胞包含選自⑶73、⑶90、⑶29、⑶105和D7-fib的陽性標(biāo)記物表達(dá)；亦即，在一些實施方式中，貼壁細(xì)胞表達(dá)⑶73、⑶90、⑶29、CD105或D7-fib中的一種或多種。根據(jù)本發(fā)明的一些實施方式，貼壁細(xì)胞包含選自⑶3、⑶4、⑶45、⑶80、HLA-DR、⑶lib、⑶14、⑶19、⑶34、⑶31、⑶200、KDR、和⑶79的陰性標(biāo)記物表達(dá)；亦即，在一些實施方式中，貼壁細(xì)胞不表達(dá) CD3、CD4、CD45、CD80、HLA-DR、CD I Ib、CD 14、CD 19、CD34、CD31、CD200、KDR、或 CD79。根據(jù)本發(fā)明的一些實施方式,在三維(3D)培養(yǎng)中培養(yǎng)貼壁細(xì)胞。根據(jù)本發(fā)明的一些實施方式，三維(3D)培養(yǎng)包括三維生物反應(yīng)器。根據(jù)本發(fā)明的一些實施方式，在灌注下實施貼壁細(xì)胞在三維培養(yǎng)中的培養(yǎng)。根據(jù)本發(fā)明的一些實施方式，實施貼壁細(xì)胞的培養(yǎng)達(dá)至少3天。根據(jù)本發(fā)明的一些實施方式，實施貼壁細(xì)胞的培養(yǎng)直到至少10%的貼壁細(xì)胞在增殖。根據(jù)本發(fā)明的一些實施方式,在二維(2D)培養(yǎng)中培養(yǎng)貼壁細(xì)胞。根據(jù)本發(fā)明的一些實施方式，至少10%的貼壁細(xì)胞處于增殖狀態(tài)；亦即至少10%的貼壁細(xì)胞在增殖。根據(jù)本發(fā)明的一些實施方式，貼壁細(xì)胞與從生長骨髓中獲得的貼壁細(xì)胞相比較少成為成骨譜系并且能夠在相同條件下分化。根據(jù)本發(fā)明的一些實施方式，貼壁細(xì)胞與從生長的骨髓中獲得的貼壁細(xì)胞相比較少成為脂肪形成譜系并且能夠在相同條件下分化。根據(jù)本發(fā)明一些實施方式的一個方面，提供一種來源于胎盤的貼壁細(xì)胞群，其中該細(xì)胞群包含至少70%的來自胎盤母體部分的貼壁細(xì)胞。根據(jù)本發(fā)明的一些實施方式，胎盤的母體部分包括基蛻膜、壁蛻膜，或者同時包括基蛻膜和壁蛻膜。根據(jù)本發(fā)明一些實施方式的一個方面，提供一種來源于胎盤的貼壁細(xì)胞群，其中所述細(xì)胞群包含至少70%的來源于胎盤胚胎部分(fetal portion)的貼壁細(xì)胞。根據(jù)本發(fā)明的一些實施方式，胎盤的胚胎部分包括羊膜。根據(jù)本發(fā)明的一些實施方式，胎盤的胚胎部分是由羊膜構(gòu)成。根據(jù)本發(fā)明的一些實施方式，胎盤的胚胎部分包括絨毛膜絨毛(chorionicvilli)。根據(jù)本發(fā)明的一些實施方式，胎盤的胚胎部分是由絨毛膜絨毛構(gòu)成。根據(jù)本發(fā)明的一些實施方式，細(xì)胞群是如下的細(xì)胞群其中不多于3.5%、不多于3%、不多于2%、或者不多于1%的來自母體部分的貼壁細(xì)胞群表達(dá)CD200，正如由流式細(xì)胞儀并采用確定陰性表達(dá)的同種型對照所測量的。根據(jù)本發(fā)明的一些實施方式，所述貼壁細(xì)胞具有小于來源于胎盤胚胎部分的貼壁細(xì)胞的細(xì)胞直徑。根據(jù)本發(fā)明的一些實施方式，所述貼壁細(xì)胞具有高于來源于胎盤胚胎部分的貼壁細(xì)胞的細(xì)胞增殖能力。、
根據(jù)本發(fā)明的一些實施方式，當(dāng)在混合淋巴細(xì)胞培養(yǎng)中進(jìn)行測試時，所述貼壁細(xì)胞能夠抑制免疫反應(yīng)的程度低于來源于胎盤胚胎部分的貼壁細(xì)胞。根據(jù)本發(fā)明一些實施方式的一個方面，提供一種從包含任何上述細(xì)胞群的培養(yǎng)物中分離出的條件培養(yǎng)基。根據(jù)本發(fā)明一些實施方式的一個方面，提供一種藥物組合物，其包括作為活性成分的本文中所述任何細(xì)胞群或任何本文中所述條件培養(yǎng)基、以及藥學(xué)上可接受載體。根據(jù)本發(fā)明一些實施方式的一個方面，提供一種治療受益于細(xì)胞或器官移植的醫(yī)學(xué)疾病的方法，該方法包括向需要其的受試者給予治療有效量的任何本文中所述的藥物組合物，因此治療受試者。根據(jù)本發(fā)明一些實施方式的一個方面，提供本文中所述的任何細(xì)胞群或條件培養(yǎng)基的應(yīng)用，其是用于治療可以受益于細(xì)胞或器官移植的疾病的藥物的制造。 根據(jù)本發(fā)明的一些實施方式，所述疾病是選自缺血、外周動脈疾病(PAD)、嚴(yán)重肢體缺血(CLI)、下肢缺血、中風(fēng)、缺血性血管病、腎臟的血管病、缺血性心臟病、心肌缺血、冠狀動脈疾病(CAD)、動脈粥樣硬化性心血管疾病、左主冠狀動脈疾病、動脈阻塞性疾病、外周缺血、外周血管疾病、動脈硬化、視網(wǎng)膜病變、視網(wǎng)膜修復(fù)、重構(gòu)紊亂(重塑紊亂，remodeling disorder)、林島綜合征、遺傳性出血性毛細(xì)血管擴(kuò)張、缺血性血管病、伯格氏病(Buerger’ s disease)、缺血性腎病、胎盤缺血、與生殖相關(guān)的疾病、移植物抗宿主病、實體器官移植、造血干細(xì)胞移植、糖尿病、結(jié)締組織損傷、癌癥、癌前期、骨癌、骨肉瘤、骨轉(zhuǎn)移、骨折、燒傷、關(guān)節(jié)軟骨缺陷、深部傷、傷口延遲愈合、潰瘍延遲愈合、軟骨下骨囊腫、骨質(zhì)疏松、骨關(guān)節(jié)炎、骨退化、軟骨損傷、關(guān)節(jié)軟骨缺陷、腱損傷、自身免疫性疾病、代謝紊亂、銀屑病、神經(jīng)病理性疼痛、周圍神經(jīng)損傷、神經(jīng)退行性疾病、腎移植的支持(support of kidneytransplantation )、和炎癥性疾病。根據(jù)本發(fā)明的一些實施方式，所述疾病是選自心力衰竭、心肌梗塞、神經(jīng)病理性疼痛、骨骼肌缺陷、中風(fēng)、和缺血性心臟病。根據(jù)本發(fā)明一些實施方式的一個方面，所述方法是治療骨骼肌缺陷的方法，包括向需要其的受試者給予治療有效量的包含來源于胎盤的貼壁基質(zhì)細(xì)胞的組合物，因此治療骨骼肌缺陷。根據(jù)本發(fā)明一些實施方式的一個方面，所述方法是治療神經(jīng)病理性疼痛的方法，包括向需要其的受試者給予治療有效量的包括來源于胎盤的貼壁基質(zhì)細(xì)胞的組合物，因此治療神經(jīng)病理性疼痛。根據(jù)本發(fā)明的一些實施方式，神經(jīng)病理性疼痛與炎性疼痛、糖尿病多發(fā)性神經(jīng)病變、人類免疫缺陷病毒(HIV)感覺神經(jīng)病變、中風(fēng)后綜合征、缺血、或多發(fā)性硬化有關(guān)。根據(jù)本發(fā)明一些實施方式的一個方面，所述方法是治療心肌梗塞的方法，包括向需要其的受試者給予治療有效量的包含來源于胎盤的貼壁基質(zhì)細(xì)胞的組合物，因此治療心肌梗塞。根據(jù)本發(fā)明一些實施方式的一個方面，提供一種包含來源于胎盤的貼壁基質(zhì)細(xì)胞的組合物的應(yīng)用，其是用于治療骨骼肌缺陷、神經(jīng)病理性疼痛、心肌梗塞的藥物的制造。根據(jù)本發(fā)明一些實施方式的一個方面，提供一種藥物組合物，其包括作為活性成分的用于治療骨骼肌缺陷、神經(jīng)病理性疼痛或心肌梗塞的來源于胎盤的貼壁基質(zhì)細(xì)胞。
根據(jù)本發(fā)明的一些實施方式，所述藥物組合物是一種用于治療與炎性疼痛、糖尿病多發(fā)性神經(jīng)病變、人類免疫缺陷病毒(HIV)感覺神經(jīng)病變、中風(fēng)后綜合征、缺血、或多發(fā)性硬化有關(guān)的神經(jīng)病理性疼痛的藥物組合物。根據(jù)本發(fā)明的一些實施方式，貼壁細(xì)胞表達(dá) ⑶73、⑶90、⑶29、⑶105或D7_fib中的一種或多種。根據(jù)本發(fā)明的一些實施方式，貼壁細(xì)胞不表達(dá)⑶3、⑶4、⑶45、⑶80、HLA-DR、CDllb, CD14、CD19、CD34、CD31、CD200、CD271、KDR、或 CD79。根據(jù)本發(fā)明的一些實施方式，貼壁細(xì)胞表達(dá)￠-內(nèi)啡肽、強(qiáng)啡肽A、亮氨酸-腦啡肽、或甲硫氨酸-腦啡肽中的一種或多種。根據(jù)本發(fā)明的一些實施方式，貼壁細(xì)胞抑制T細(xì)胞活性。根據(jù)本發(fā)明的一些實施方式，貼壁細(xì)胞包含至少70%的來自胎盤母體部分的貼壁細(xì)胞。根據(jù)本發(fā)明的一些實施方式，不多于3. 5%、不多于3%、不多于2%、或不多于1%的來自母體部分的貼壁細(xì)胞表達(dá)CD200，正如利用流式細(xì)胞儀并使用確定陰性表達(dá)的同種型對照所測量的。根據(jù)本發(fā)明的一些實施方式，胎盤的母體部分包括基蛻膜、壁蛻膜、或者同時包括基蛻膜和壁蛻膜。根據(jù)本發(fā)明的一些實施方式，通過采用三維培養(yǎng)條件進(jìn)行培養(yǎng)而獲得貼壁細(xì)胞。根據(jù)本發(fā)明的一些實施方式，三維(3D)培養(yǎng)包括三維生物反應(yīng)器。根據(jù)本發(fā)明一些實施方式的一個方面，在灌注下實施三維培養(yǎng)。根據(jù)本發(fā)明一些實施方式的一個方面，實施貼壁細(xì)胞的培養(yǎng)達(dá)至少3天。根據(jù)本發(fā)明一些實施方式的一個方面，實施貼壁細(xì)胞的培養(yǎng)直到至少10%的所述貼壁細(xì)胞在增殖。除非另有規(guī)定，本文中使用的所有技術(shù)和/或科學(xué)術(shù)語具有與本發(fā)明所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員所一般理解含義相同的含義。盡管在本發(fā)明實施方式的實施中可以使用類似于或等同于本文中所述的方法和材料，但下面將對示例性方法和/或材料加以描述。在發(fā)生矛盾的情況下，包括定義在內(nèi)的本專利說明書將起支配作用。另外，這些材料、方法和例子僅僅是說明性的，并非意圖一定是限制性的。


本文中僅通過例子并參照附圖來描述本發(fā)明的一些實施方式?，F(xiàn)在詳細(xì)參照附圖，應(yīng)強(qiáng)調(diào)的是通過例子來揭示詳細(xì)內(nèi)容，并且目的是說明性地描述本發(fā)明實施方式。在這方面，通過描述以及附圖本領(lǐng)域技術(shù)人員將明了如何實施本發(fā)明的實施方式。在附圖中圖I是胎盤結(jié)構(gòu)及各部分的示意圖。圖2A-圖2C是顯示從胎盤、基蛻膜(A)、絨毛間質(zhì)⑶和羊膜(C)中所獲得貼壁細(xì)胞的形態(tài)的顯微照片。圖3是顯示細(xì)胞直徑與從不同胎盤部分中所得細(xì)胞的傳代數(shù)的關(guān)系圖。圖4是顯示細(xì)胞群加倍與從不同胎盤部分中所得細(xì)胞的傳代數(shù)的關(guān)系圖。
圖5A-圖5B是顯示各種胎盤部分的體外免疫調(diào)節(jié)特征的直方圖。圖5A示出了四個不同實驗的結(jié)果，而圖5B示出了圖5A中所得結(jié)果的平均值，包括標(biāo)準(zhǔn)差。圖6A-圖6C是顯示從各種胎盤部分中所得貼壁細(xì)胞的條件培養(yǎng)基對內(nèi)皮細(xì)胞增殖的效果的棒圖。圖7示出了經(jīng)PLX處理(“PLX”)和空白對照(“Sham”)大鼠中的收縮力值?！癐”-創(chuàng)傷后的立即移植；“DEL”_創(chuàng)傷7天后移植；“FT”_快速抽動收縮力；“TET”_巨大收縮力。
圖8A和圖8B示出了爪壓力測試中PLX細(xì)胞對炎性疼痛的效果。圖8A繪出了在發(fā)炎的爪中作為時間函數(shù)的爪壓閾值。圖8B示出了對側(cè)爪的相同信息。圖9A和圖9B示出了在給予PLX細(xì)胞后在發(fā)炎的爪(圖9A)和對側(cè)的爪(圖9B)中作為時間函數(shù)的標(biāo)出的爪體積(paw volume)。圖IOA和圖4B顯示了 PLX細(xì)胞對神經(jīng)病理性疼痛中的同側(cè)爪(圖10A)和對側(cè)爪(圖10B)的機(jī)械敏感性(von Frey測試)的影響。圖IlA和圖5B繪出了在神經(jīng)病理性疼痛中PLX細(xì)胞對同側(cè)爪(圖11A)和對側(cè)爪(圖11B)熱敏感性的影響(Hargreaves測試)。圖12A-圖12E繪出了 P -內(nèi)啡肽(圖12A)、強(qiáng)啡肽A (圖12B)、亮氨酸-腦啡肽(圖12C)、甲硫氨酸-腦啡肽(圖12D)、以及9種不同的PLX批次的總水平(圖12E)。
具體實施例方式本發(fā)明，在一些實施方式中涉及來源于胎盤的貼壁細(xì)胞及其在疾病治療中的應(yīng)用。在詳細(xì)說明至少本發(fā)明的一個實施方式之前，應(yīng)理解的是本發(fā)明不必將其應(yīng)用限制在以下說明中所展示或由實施例所示例的詳細(xì)內(nèi)容。本發(fā)明可以采用其他實施方式或者用各種方式實施。胎盤代表了被賦予獨(dú)特的免疫抑制特性及組織再生特性的細(xì)胞容易獲得的來源。來源于胎盤的經(jīng)純化貼壁細(xì)胞群或者對這些細(xì)胞群進(jìn)行調(diào)整所獲得的細(xì)胞對于治療可以受益于細(xì)胞或器官移植的疾病是有價值的。另外，本發(fā)明人已發(fā)明出從胎盤不同部分中分離出經(jīng)高度純化的細(xì)胞群的方法(見下面的實施例部分)。出人意料地發(fā)現(xiàn)從胎盤母體部分中分離的細(xì)胞群的特點(diǎn)是具有明顯不同于從胚胎胎盤部分中分離的其他細(xì)胞群的獨(dú)特形態(tài)特性和功能特性(參見下面的實施例部分)。這些細(xì)胞對于大量醫(yī)學(xué)疾病的治療是有價值的。因此，根據(jù)本發(fā)明的一方面，提供一種貼壁細(xì)胞群，其包含至少大約70%、75%、80%、85%、90%、92%、94%、95%、96%、98%、99%或者甚至100%的從胎盤母體部分中獲得的細(xì)胞。根據(jù)本發(fā)明的另一個方面，提供一種細(xì)胞群，其包含至少大約70%、75%、80%、85%、90%、92%、94%、95%、96%、98%、99%或者甚至100%的從胎盤胚胎部分中獲得的貼壁細(xì)胞。根據(jù)具體實施方式
，胎盤的胚胎部分包括羊膜。根據(jù)具體實施方式
，胎盤的胚胎部分是由羊膜構(gòu)成。根據(jù)具體實施方式
，胎盤的胚胎部分包括絨毛膜絨毛。根據(jù)具體實施方式
，胎盤的胚胎部分是由絨毛膜絨毛構(gòu)成。
本文中使用的術(shù)語“胎盤”是指將正在發(fā)育的胚胎與子宮壁相連的哺乳動物器官。出生后胎盤被排出(并且稱為產(chǎn)后胎盤)。優(yōu)選地對胎盤進(jìn)行充分時間的灌注以除去殘留的細(xì)胞(例如，血液)。
本文中使用的“胎盤的胚胎部分”是指胎盤中不是母體的任何部分(參見圖I的結(jié)構(gòu)說明)。本文中使用的“胎盤的母體部分”是指胎盤中不是胚胎的任何部分(參見圖I的結(jié)構(gòu)說明)，例如從基蛻膜或壁蛻膜中獲得的胎盤的部分。胎盤的胚胎部分包括羊膜、絨毛、或者絨毛膜絨毛，參見圖I。切開胎盤以獲得細(xì)胞的方法，對于本領(lǐng)域技術(shù)人員是熟知的。在下面的實施例部分中將對一些方法加以描述。將組織標(biāo)本在生理緩沖溶液例如磷酸鹽緩沖的生理鹽水(PBS)或者Hank氏緩沖液中清洗。通過用消化酶處理組織(見下文)或者/并且切碎再沖洗組織部分經(jīng)過尼龍過濾器、或者通過輕緩的移液(Falcon, Becton, Dickinson, San Jose, CA)再清洗培養(yǎng)基,而制作單細(xì)胞懸浮液。通過用消化酶例如膠原酶、胰蛋白酶和/或分散酶、和/或有效濃度的透明質(zhì)酸酶或DNA酶、和乙二胺四乙酸(EDTA)，于25_50°C的溫度下對組織進(jìn)行10分鐘到3小時的處理，因此可獲得從胎盤各種部分中分離的貼壁細(xì)胞。然后，可使細(xì)胞通過孔徑為20微米到I毫米的尼龍或紗布過濾器。以IOOXg到3000Xg的轉(zhuǎn)速于4-50°C的溫度下對細(xì)胞進(jìn)行I分鐘到I小時的離心(參見美國專利第7，078，230號)。優(yōu)選地在無菌條件下實施細(xì)胞恢復(fù)。一旦獲得了分離細(xì)胞，則讓它們附著在粘附材料上例(如，設(shè)置成一個表面)，因此分離貼壁細(xì)胞。本文中使用的短語“貼壁細(xì)胞”是指為了在體外生長而依賴于貼壁(即需要附著于表面)的細(xì)胞。本文中使用的“粘附材料”是指合成的、自然形成的、或者合成加自然形成的、具有可將細(xì)胞保持在表面上的化學(xué)結(jié)構(gòu)(例如，帶電荷的表面暴露基團(tuán))的非細(xì)胞毒性(即生物相容)的材料?？捎糜诒景l(fā)明此方面的粘附材料的例子包括但不限于聚酯、聚丙烯、聚烯烴、聚氟氯乙烯、聚氯乙烯、聚苯乙烯、聚砜、醋酸纖維素、玻璃纖維、陶瓷顆粒、基質(zhì)膠、細(xì)胞外基質(zhì)成分(例如，纖維連接蛋白、玻璃粘連蛋白、軟骨粘連蛋白、層粘連蛋白)、膠原蛋白、聚乳酸、葡聚糖、和惰性金屬纖維。可利用本領(lǐng)域中熟知的方法來實施純化的其他步驟或者貼壁細(xì)胞的富集(例如，通過使用標(biāo)記物表達(dá)的FACS，如本文下文中的進(jìn)一步說明)。根據(jù)本發(fā)明的用于培養(yǎng)的基礎(chǔ)培養(yǎng)基的非限制性例子包括Eagle最低必需培養(yǎng)基、ADC-I、LPM(無牛血清白蛋白)、FlO (HAM)、Fl2 (HAM)、DCCMl、DCCM2、RPMI 1640、BGJ培養(yǎng)基(有和無Fitton-Jackson改良)、Eagle基礎(chǔ)培養(yǎng)基(BME-添加Earle氏鹽基)、Dulbecco 氏改良 Eagle 培養(yǎng)基(DMEM-無血清)、Yamane、I MEM-20 > Glasgow 改良的 Eagle培養(yǎng)基(GMEM)、Leibovitz L-15 培養(yǎng)基、McCoy 5A 培養(yǎng)基、培養(yǎng)基 M199 (M199E-具有 Earle氏鹽基)、培養(yǎng)基M199(M199H-具有Hank氏鹽基)、Eagle最低必需培養(yǎng)基(MEM-E-具有Earle氏鹽基)、Eagle最低必需培養(yǎng)基(MEM-H-具有Hank氏鹽基)和Eagle最低必需培養(yǎng)基(MEM-NAA，具有非必需氨基酸類)等等，包括培養(yǎng)基199、CMRL 1415、CMRL 1969、CMRL1066、NCTC 135、MB 75261、MAB 8713、DM 145、Williams’G、Neuman & Tytell、Higuchi、CDB 30UMCDB 202,MCDB 50UMCDB 40UMCDB 41UMDBC 153 的大量其他培養(yǎng)基。用于本發(fā)明的優(yōu)選培養(yǎng)基是DMEM。這些培養(yǎng)基和其他有用培養(yǎng)基可從美國紐約的GIBCO，GrandIsland和以色列的Biological Industries, Bet HaEmek等公司獲得。在《酶學(xué)中的方法(Methods In Enzymology)》中總結(jié)了這些培養(yǎng)基中的部分,第LV III卷“細(xì)胞培養(yǎng)(CellCulture) ”第 62-72 頁，由 William B. Jakoby 和 Ira H. Pastan ed. ,Academic 出版有限公司出版?？捎美缪?例如?；蛉嘶蛘咂渌N屬的胚胎血清)以及可選擇地或者，用生長因子、維生素(例如抗壞血酸)、細(xì)胞因子、鹽類(例如B-甘油磷酸鹽)、甾體藥物(例如地塞米松)以及激素(例如生長激素)、地塞米松、血小板生成素、白細(xì)胞介素3、白細(xì)胞介素6、白細(xì)胞介素7、巨噬細(xì)胞集落刺激因子、C-試劑盒配體/干細(xì)胞因子、骨保護(hù)素配體、胰島素、胰島素樣生長因子、表皮生長因子、成纖維細(xì)胞生長因子、神經(jīng)生長因子、纖毛親神經(jīng)因子、血小板源性生長因子、和骨形態(tài)發(fā)生蛋白，以皮克/ml到毫克/ml水平的濃度補(bǔ)充到培養(yǎng)基。還公認(rèn)的是可把其他成分加入到培養(yǎng)基中。這種成分可以是抗生素、抗霉菌劑、白蛋白、氨基酸類、以及細(xì)胞培養(yǎng)領(lǐng)域已知的其他成分?？梢栽诩兓に嚨母鞑襟E中實施細(xì)胞群，即母體或者胚胎胎盤細(xì)胞。例如，可以基于胚胎或母體細(xì)胞的核型分析來認(rèn)定雄性胚胎的胎盤(即，XX細(xì)胞是母體而XY細(xì)胞是胚胎，見下面的實施例部分)。一旦獲得，來源于胎盤的貼壁細(xì)胞可以用作在培養(yǎng)中增殖。細(xì)胞可傳代到二維條件或三維條件。應(yīng)理解的是，盡管在分離后可立即將細(xì)胞轉(zhuǎn)移到三維構(gòu)造的基質(zhì)、或者可在二維條件后傳代到三維裝置。本文中使用的短語“二維培養(yǎng)”是指對細(xì)胞進(jìn)行處理以適于細(xì)胞生長條件同時讓細(xì)胞在一個平面中生長的培養(yǎng)。本發(fā)明的二維培養(yǎng)中的條件被設(shè)計成使貼壁細(xì)胞能夠擴(kuò)
士豳
>曰o本文中使用的短語“三維培養(yǎng)”是指對細(xì)胞進(jìn)行處理以適合于細(xì)胞生長的條件(包括支架)從而允許在三維空間實現(xiàn)細(xì)胞與細(xì)胞的接觸的培養(yǎng)?？衫斫獾氖?，在生命有機(jī)體(或者組織)中的細(xì)胞原位環(huán)境是在三維構(gòu)造中。細(xì)胞被其他細(xì)胞包圍。它們被支持在允許建立各種局部微環(huán)境的細(xì)胞外基質(zhì)納米尺度纖維的復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)中。它們的細(xì)胞外配體不僅介導(dǎo)對基底膜的附著，而且進(jìn)入多種血管和淋巴管。將氧、激素和營養(yǎng)素運(yùn)送給細(xì)胞，并帶走廢產(chǎn)物。將本發(fā)明三維培養(yǎng)的條件設(shè)計成模擬這種環(huán)境，正如以下進(jìn)一步的例示。應(yīng)理解的是，二維培養(yǎng)或三維培養(yǎng)的條件是使貼壁細(xì)胞能夠擴(kuò)增。本文中使用的術(shù)語“擴(kuò)大”和“擴(kuò)增”是指細(xì)胞的基本上較少分化的維持以及最終的細(xì)胞生長，即伴隨增加無分化的細(xì)胞群的增加(例如，至少2倍)。本文中使用的術(shù)語“維持”和“維護(hù)”是指基本上較少分化的細(xì)胞更新，即基本上穩(wěn)定的細(xì)胞群并且伴隨這種穩(wěn)定性無細(xì)胞分化。對于二維培養(yǎng)，通常在3±0.2 X IO3個細(xì)胞/cm2的培養(yǎng)密度下實施胎盤細(xì)胞的接種。在接種后，通常將細(xì)胞培養(yǎng)物在組織培養(yǎng)箱中在濕潤條件下在5%C02中于37°C進(jìn)行培、養(yǎng)。根據(jù)本發(fā)明的一 個實施方式，使所述細(xì)胞在無抗生素補(bǔ)充的培養(yǎng)基中生長至少2個傳代、至少3個傳代、或者至少4個傳代。根據(jù)本發(fā)明的一個實施方式，使細(xì)胞進(jìn)行至少4個傳代、至少5個傳代、至少6個傳代、至少7個傳代、或者至少個8傳代。應(yīng)理解的是，通常使細(xì)胞傳代到達(dá)到大約70-90%的匯合，通常在3-5天后(例如，1-3次復(fù)制)。對于三維培養(yǎng)，可在分離后立即將貼壁細(xì)胞轉(zhuǎn)移到三維構(gòu)造的基質(zhì)中，或者作為選擇在二維(2D)條件后可傳代到三維裝置。有時，在二維培養(yǎng)與三維培養(yǎng)之間可能需要進(jìn)行細(xì)胞的低溫保存。因此，根據(jù)一些實施方式的粘附材料是構(gòu)造成三維培養(yǎng)，因此提供基本上增加用于細(xì)胞附著的有效附接表面，從而模擬組織的基本結(jié)構(gòu)即，胎盤的生長基質(zhì)。對于大規(guī)模的生產(chǎn)，可以在三維生物反應(yīng)器中實施培養(yǎng)。這種生物反應(yīng)器的例子包括但不限于推流式生物反應(yīng)器、連續(xù)攪拌釜式生物反應(yīng)器、固定床生物反應(yīng)器(填充床生物反應(yīng)器)、和流化床生物反應(yīng)器。Celligen生物反應(yīng)器(New Brunswick Scientific公司)能夠在受控的條件(例如PH值、溫度和氧水平)且恒定地灌注細(xì)胞生長培養(yǎng)基下實現(xiàn)貼壁細(xì)胞的三維擴(kuò)增。此外，可以監(jiān)測細(xì)胞培養(yǎng)物中的葡萄糖、乳酸鹽、谷氨酰胺、谷氨酸鹽和銨的濃度水平。貼壁細(xì)胞的葡萄糖消耗率和乳酸鹽形成率使得研究人員能夠測量細(xì)胞生長率并確定收獲時間?？梢杂糜诒景l(fā)明的其他三維生物反應(yīng)器包括但不限于連續(xù)攪拌釜式生物反應(yīng)器，其中將培養(yǎng)基連續(xù)地加入生物反應(yīng)器并且將所使用的培養(yǎng)基連續(xù)地抽出，以維持生物反應(yīng)器中的時間恒定穩(wěn)態(tài)。攪拌釜式生物反應(yīng)器可用于流化床(懸浮載體)或者纖維床籃(可從例如紐約Edison的New Brunswick Scientific公司獲得)、固定床生物反應(yīng)器、氣升式生物反應(yīng)器(其中通常將空氣加入到向上流動從而形成氣泡的中央通風(fēng)管的底部并且在柱的頂部除去排氣)、帶Polyactive泡沫的生物反應(yīng)器[正如Wendt, D. et al,Biotechnol Bioeng 84:205-214(2003)的描述]、徑向流灌注生物反應(yīng)器中的多孔支架[如 Kitagawa et al, Biotechnology and Bioengineering 93 (5) :947-954 (2006)中所述]、帶支架或載體的徑向流生物反應(yīng)器、空心纖維生物反應(yīng)器、和微載體?？梢杂糜诒景l(fā)明的其他生物反應(yīng)器描述于美國專利第6，277，151、6，197，575、6，139，578,6, 132,463、5，902，741 和 5，629，186 號。在一個示例性實施方式中，總共接種200±100 X IO6個細(xì)胞，接種3-10 X IO6個細(xì)胞/克載體、或者接種0. 06-0. 2 X IO6個細(xì)胞/ml。根據(jù)一個示例性實施方式，在2000-9000細(xì)胞/cm2的FibraCel盤中實施細(xì)胞接種。當(dāng)至少大約10%的細(xì)胞在增殖時則可以收獲細(xì)胞，同時避免不受控制的分化和衰老。實施培養(yǎng)達(dá)至少約2天、3天、4天、5天、6天、7天、10天、14天、20天、I個月或更
長時間。應(yīng)理解的是，對于在生物反應(yīng)器內(nèi)的培養(yǎng)來說可延長該時間段。可以在培養(yǎng)基的連續(xù)流動下，實施三維培養(yǎng)中的貼壁細(xì)胞培養(yǎng)。也可以通過實施傳代來增加細(xì)胞數(shù)。應(yīng)理解的是，可通過改變培養(yǎng)基而延長并改善培養(yǎng)條件。根據(jù)本發(fā)明的一個實施方式，在培養(yǎng)基灌注下實施細(xì)胞培養(yǎng)。通常，灌注率取決于貼壁細(xì)胞培養(yǎng)基中的葡萄糖濃度。因此，根據(jù)本發(fā)明的教導(dǎo)，當(dāng)葡萄糖濃度約為500mg/L、約為550mg/L、或者約為600mg/L時可以更換培養(yǎng)基。本發(fā)明的一些實施方式的貼壁細(xì)胞包含至少大約10%、28%、30%、50%、80%或者更多的增殖細(xì)胞(正如可以通過利用FACS監(jiān)測S相和G2/M相來檢測)。本發(fā)明的一些實施方式的貼壁細(xì)胞可包括至少一種“基質(zhì)細(xì)胞表現(xiàn)型”。本文中使用的“基質(zhì)細(xì)胞表現(xiàn)型”是指是從骨髓中獲得的基質(zhì)(即，間充質(zhì))細(xì)胞所特有的結(jié)構(gòu)或功能表現(xiàn)型。因此，例如細(xì)胞可具有紡錘形。作為選擇或另外，所述細(xì)胞可表達(dá)基質(zhì)細(xì)胞所特有的標(biāo)記物或一系列標(biāo)記物(例如表面標(biāo)記物)?；|(zhì)細(xì)胞表面標(biāo)記物(陽性和陰性)的例子包括但不限于 CD105+、CD29+、CD44+、CD73+、CD90+、D7-f ib+、CD3\ CD4\ CD34' CD45' CD80'CD5_、CD20—、CDl lb_、CD14—、CD19—、CD79—、HLA-DR—、CD31—、KDR—、和 FMC7—。其他基質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記物包括但不限于酪氨酸羥化酶、巢蛋白和H-NF。根據(jù)本發(fā)明的一個具體實施方式
，貼壁細(xì)胞包括從胎盤母體部分或者胚胎部分獲得的細(xì)胞，不表達(dá)干細(xì)胞標(biāo)記物⑶271。本文中使用的短語“干細(xì)胞”是指不在最后分化的細(xì)胞。根據(jù)本發(fā)明的一個具體實施方式
，從胎盤胚胎部分(例如，由絨毛膜絨毛組成、或者包括絨毛膜絨毛)獲得的貼壁細(xì)胞的特征為陽性CD200表達(dá)(見下面的實施例部分)。根據(jù)本發(fā)明的一個具體實施方式
，不多于3. 5%、不多于3%、不多于2%、或者不多于1%的來自母體部分的貼壁細(xì)胞表達(dá)CD200，正如利用流式細(xì)胞儀并使用確定陰性表達(dá)同種型對照所測量的。基質(zhì)細(xì)胞所特有的功能表現(xiàn)型的例子包括但不限于T細(xì)胞抑制活性(它們不刺激T細(xì)胞卻相反地抑制T細(xì)胞，例如當(dāng)在混合淋巴細(xì)胞培養(yǎng)中進(jìn)行測試時)、和造血干細(xì)胞支持活性。根據(jù)一個示例性實施方式，本發(fā)明的貼壁細(xì)胞與從生長骨髓中獲得的貼細(xì)胞相比較少參與分化成成骨系或脂肪形成系，并且在相同條件下分化。例如，根據(jù)一個示例性實施方式，當(dāng)在W02010026575的實施例4_7 (其全部內(nèi)容以參考的方式并入本文中)中所述的條件下，本發(fā)明的貼壁細(xì)胞不分化成成骨系或脂肪形成系。根據(jù)本發(fā)明的一個實施方式,本發(fā)明的貼壁細(xì)胞能夠抑制受試者中的免疫反應(yīng)。本文中使用的短語“抑制受試者中的免疫反應(yīng)”是指降低或抑制受試者中響應(yīng)于抗原(例如，外源細(xì)胞或其一部分)所發(fā)生的免疫反應(yīng)?？杀毁N壁細(xì)胞抑制的免疫應(yīng)答包括體液免疫應(yīng)答和細(xì)胞免疫反應(yīng)，它們分別涉及到經(jīng)由抗體和T-淋巴細(xì)胞(T細(xì)胞的增殖)特異性地識別病原體抗原。在實施例中給出了判定貼壁細(xì)胞是否抑制免疫反應(yīng)的方法的一些例子。根據(jù)一個具體實施方式
，從母體胎盤獲得的貼壁細(xì)胞能夠抑制免疫反應(yīng)的程度低于來源于胎盤胚胎部分的貼壁細(xì)胞(例如，至少低大約2%、5%、10%、15%、20%、30%、40%或50%)。在一些實施方式中，通過測量細(xì)胞抑制混合淋巴細(xì)胞培養(yǎng)的能力來判定對免疫反應(yīng) 的抑制。在其他實施方式中，通過在體外試驗中測量由植物血凝素(PHA)引起的對T細(xì)胞大量形成的抑制，而確定對免疫反應(yīng)的抑制。根據(jù)一個具體實施方式
，母體胎盤的貼壁細(xì)胞的細(xì)胞直徑小于來源于胎盤胚胎部分的貼壁細(xì)胞(例如，大約2%、5%、10%、15%,20%或30%)。根據(jù)一個具體實施方式
，母體胎盤的貼壁細(xì)胞的細(xì)胞增殖能力高于來源于胎盤胚胎部分的貼壁細(xì)胞(例如，大約2%、5%、10%、15%,20%或30%)。根據(jù)一個具體實施方式
，所述細(xì)胞可以是自體的、同基因的、異基因的或者異種的來源。根據(jù)另一個具體實施方 式，通過用遺傳方法對細(xì)胞進(jìn)行改良而表達(dá)外源蛋白。根據(jù)又一個具體實施方式
，用遺傳學(xué)方法對細(xì)胞進(jìn)行改良。應(yīng)理解的是，可以從包含所述細(xì)胞/有所述細(xì)胞組成的培養(yǎng)物中分離出條件培養(yǎng)基。本文中使用的“條件培養(yǎng)基”是在特定培養(yǎng)期后富含在本文中所述培養(yǎng)物(即，包含/由任何上述細(xì)胞群組成)中所存在的分泌因子的培養(yǎng)基。通過在生長培養(yǎng)基中在適于制造條件培養(yǎng)基的條件下培養(yǎng)上述細(xì)胞，而制作出條
件培養(yǎng)基。生長培養(yǎng)基可以是適于讓本發(fā)明胎盤粘壁細(xì)胞生長的任何生長培養(yǎng)基，如上文中所述?？衫脿I養(yǎng)因子例如氨基酸類(例如，L-谷氨酰胺)、抗氧化劑(例如，￠-巰基乙醇)和生長因子來補(bǔ)充生長培養(yǎng)基。在高達(dá)20%的有效濃度范圍內(nèi)添加血清和/或血清代替物。例如，將細(xì)胞在生長培養(yǎng)基中培養(yǎng)充分長的時間，從而允許分泌因子的充分蓄積以支持免疫抑制和/或血管新生。通常，通過于37°C下培養(yǎng)1-5天來調(diào)整培養(yǎng)基。然而，可以通過評估條件培養(yǎng)基對免疫抑制和/或血管新生的實施來調(diào)整培養(yǎng)期，例如在實施例中所述。在一些實施方式中，為了進(jìn)行免疫抑制而對培養(yǎng)基進(jìn)行3-5天的調(diào)整，為了進(jìn)行血管新生而對培養(yǎng)基進(jìn)行24-72小時的調(diào)整。對用于調(diào)整培養(yǎng)基的培養(yǎng)裝置的選擇，是基于條件培養(yǎng)基的生產(chǎn)規(guī)模和目的。大規(guī)模生產(chǎn)優(yōu)選涉及到生物反應(yīng)器的使用，如上文中所述。在培養(yǎng)基中積累了充分的因子后，從細(xì)胞中分離并收集生長培養(yǎng)基(即，條件培養(yǎng)基)。應(yīng)理解的是，可以在額外的培養(yǎng)期內(nèi)重復(fù)使用細(xì)胞來進(jìn)一步調(diào)整各批次的培養(yǎng)基，假設(shè)這些細(xì)胞保持調(diào)整培養(yǎng)基的能力。本發(fā)明的條件培養(yǎng)基可直接使用(如以下進(jìn)一步的說明)或者進(jìn)行提取例如通過鹽過濾以濃縮有效因子。為了將來的使用，優(yōu)選于_80°C下冷凍條件培養(yǎng)基。胚胎部分的貼壁細(xì)胞可以用于各種研究裝置。例如用于測試與母體部分有關(guān)的貼壁細(xì)胞的生物學(xué)特性(例如，形態(tài)、大小)(見例如實施例部分)。本文中所述的來源于胎盤的經(jīng)純化細(xì)胞群、或者本文中所述的任何條件培養(yǎng)基，可以用于治療可受益于細(xì)胞或器官移植的疾病。本文中使用的術(shù)語“疾病”是指可受益于細(xì)胞(例如基質(zhì)細(xì)胞)或器官移植的任何病狀(疾病、狀態(tài)、綜合癥狀或失調(diào))。其例子包括缺血性疾病、心血管疾病、神經(jīng)系統(tǒng)疾病、胃腸道疾病、整形外科病、造血病、腎病和肝病，例如但不限于外周動脈疾病(PAD)(如肢體缺血和嚴(yán)重肢體缺血(CLI))、下肢缺血、缺血性血管病、中風(fēng)、缺血性心臟病、心肌缺血、急性心肌梗塞(MI)、冠狀動脈疾病(CAD)、動脈粥樣硬化性心血管疾病、左主冠狀動脈疾病、動脈阻塞性疾病、外周缺血、外周血管疾病、動脈硬化、視網(wǎng)膜病變、視網(wǎng)膜修復(fù)、整形疾病、林島綜合征(von Hippel-Lindau syndrome)、遺傳性出血性毛細(xì)血管擴(kuò)張缺血性血管病、伯格氏病、糖尿病、腎血管病、缺血性腎病、肝病、胎盤缺血、與繁殖相關(guān)的疾病、移植物抗宿主病(GVHD)、實體器官移植、造血干細(xì)胞移植(HSCT)、胃腸(GI)道的炎癥疾病、潰瘍性結(jié)腸炎、傷口延遲愈合、潰瘍延遲愈合、癌癥(例如乳腺癌)、癌前期、以結(jié)締組織損傷為特征的疾病(如骨癌、骨肉瘤、骨轉(zhuǎn)移、骨折、視乳頭變性疾病、成骨不全(01)、燒傷、關(guān)節(jié)軟骨缺陷、深部傷、傷口延遲愈合、潰瘍延遲愈合、代謝紊亂、銀屑病、神經(jīng)病理性疼痛、周圍神經(jīng)損傷、腎移植的支持、軟骨下-骨囊腫、骨質(zhì)疏松、骨關(guān)節(jié)炎(OA)、骨退化、軟骨損傷、關(guān)節(jié)軟骨缺陷、腱損傷(例如伸張過度引起的腱損傷)和韌帶損傷。
缺血性疾病是由于因各種因素引起血管構(gòu)造中血流降低而造成組織變成缺血狀態(tài)的醫(yī)學(xué)疾病，所述各種因素例如是血管腔的收縮、血凝塊的形成、血管閉塞、血管炎、血管收縮、或者血粘度增加。缺血性疾病包括外周血管疾病、缺血性心臟病(例如,缺血性心肌病、心肌梗塞、缺血性心力衰竭)、缺血性腦血管疾病(包括中風(fēng))、缺血性腎病、缺血性肺病、以及與感染性疾病有關(guān)的缺血性疾病。在整個本申請中列出了缺血性疾病(本文中也稱為缺血)的其他非限制性例子。外周血管疾病是由于因例如血管腔收縮、血凝塊形成、血管閉塞、血管炎、血管收縮、或血液濃度增加所造成外周動脈血流降低而導(dǎo)致外周組織變成缺血狀態(tài)的醫(yī)學(xué)疾病。與外周血管病相關(guān)的疾病包括慢性動脈阻塞性疾病(如動脈硬化脈管炎和伯格氏病)、和進(jìn)行性全身性硬化、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、雷諾氏病、振動綜合癥、動脈瘤、和血管炎。在整個本申請中列出了外周缺血性疾病的其他非限制性例子。根據(jù)一個具體實施方式
，所述疾病是心力衰竭、心肌梗塞、神經(jīng)病理性疼痛、骨骼肌缺陷和缺血性心臟病。根據(jù)一個具體實施方式
，本文中所述的條件培養(yǎng)基用于治療中風(fēng)。本文中使用的“中風(fēng)”或者“急性腦血管發(fā)作”是指由于大腦血液供應(yīng)失調(diào)所造成的快速形成的大腦功能損失。其原因可以是由血栓形成或栓塞所造成的缺血(缺乏葡萄糖和氧供應(yīng))、或者出血(蛛網(wǎng)膜下腔出血或者腦出血)。應(yīng)理解的是，本發(fā)明的細(xì)胞能夠在受試者中引起免疫抑制和/或免疫耐受并且/或者能夠引起血管新生。因此，貼壁細(xì)胞或者從貼壁細(xì)胞中獲得的條件培養(yǎng)基可用于治療需要血管新生和/或免疫抑制和/或免疫耐受的任何疾病。這種疾病包括但不限于自身免疫性疾病和炎癥性疾病(包括急性和慢性炎性疾病)，包括但不限于心血管疾病、類風(fēng)濕病、腺體疾病、胃腸疾病、皮膚病、肝病、神經(jīng)系統(tǒng)疾病、肌肉疾病、腎病、與繁殖相關(guān)的疾病、結(jié)締組織病、及系統(tǒng)性疾病。自身免疫性心血管疾病的例子包括但不限于動脈粥樣硬化(Matsuura E. et al,Lupus. 1998; 7Suppl 2:S135)、心肌梗塞(Vaarala 0. Lupus. 1998;7Suppl 2:S132)、血栓形成(Tincani A. et al, Lupus 1998; 7Suppl2: S107-9)、韋格納肉芽腫、多發(fā)性大動脈炎、川崎病(Praprotnik S. et al,ffien Klin Wochenschr 2000 年 8 月 25 日；112 (15-16) :660)、抗第八因子自身免疫性疾病(Lacroix-Desmazes S. et al, Semin Thromb Hemost。2000;26(2) :157)、壞死性小血管血管炎、顯微鏡下多血管炎、變應(yīng)性肉芽腫血管炎、微量免疫病灶壞死性和新月體腎炎(Noel LH. Ann Med Interne (巴黎)。2000年5月;151 (3) : 178)、抗磷脂綜合征(Flamholz R. et al, J Clin Apheresis 1999; 14(4) : 171)、抗體引起的心力衰竭(ffallukat G. et al, Am J Cardiol. 1999 年 6 月 17 ；83(12A) :75H)、血小板減少性紫癒(Moccia F. Ann Ital Med Int. 1999年 4 月-6 月;14(2) :114 ；Semple Jff. et al,Blood1996年 5 月 15; 87 (10) :4245)、自身免疫性溶血性貧血(Efremov DG. et al, Leuk Lymphoma1998 年 I 月；28(3-4) :285 ；Sallah S. et al，Ann Hematol 1997Mar; 74 (3) : 139)、恰加斯氏病中的心臟自身免疫(Cunha-Neto E. et al, J Clin Invest 1996年 10 月 15;98 (8) : 1709)、和抗輔助 T 淋巴細(xì)胞自身免疫(Caporossi AP. et al, Viral TmmunoI 1998; 11 (I) :9)。自身免疫性類風(fēng)濕病的例子包括但不限于類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(Krenn V. et al,HistolHistopathol 2000年7 月；15(3):791;Tisch R,McDevitt HO. Proc Natl Acad Sci units
SA 1994 年 I 月 18;91 (2) :437)和強(qiáng)直性脊柱炎(Jan Voswinkel et al, Arthritis Res2001;3 (3):189)。自身免疫性腺體疾病的例子包括但不限于胰腺疾病、I型糖尿病、甲狀腺疾 病、甲狀腺機(jī)能亢進(jìn)、甲狀腺炎、自發(fā)性自身免疫性甲狀腺炎、慢性淋巴性甲狀腺炎、粘液性水腫、卵巢自身免疫、自身免疫性抗精子不孕癥、自身免疫性前列腺炎和I型自身免疫多腺體綜合征包括但不限于胰臟的自身免疫性疾病、I型糖尿病(Castano LandEisenbarth GS. Ann. Rev. Immunol. 8:647;Zimmet P. Diabetes Res Clin Pract 1996年 10月;34Suppl:S125)、自身免疫性甲狀腺疾病、甲狀腺機(jī)能允進(jìn)(Orgiazzi J. Endocrinol etal，Ciin NorthAm 2000 年 6 月;29(2) :339 ；Sakata S. et al，Mol Cell Endocrinol 1993年3月；92 (I) :77)、自發(fā)性自身免疫性甲狀腺炎 raley-Mullen H. and Yu S，J Immunol2000年 12月 15 日；165(12) :7262)、橋本氏甲狀腺炎(ToyodaN. et al,Nippon Rinsho. 1999年 8 月;57 ⑶:1810)、粘液性水腫(Mitsuma T. Nippon Rinsho. 1999 年 8 月;57 ⑶:1759)、卵巢自身免疫(Garza KM. et al, J Reprod TmmunoI 1998 年 2 月；37 (2) : 87)、自身免疫性抗精子不孕癥(Diekman AB. et al, Am J Reprod ImmunoL. 2000 年 3 月；43 (3) : 134)、自身免疫性前列腺炎(Alexander RB. et al, Urology 1997 年 12 月;50 (6) :893)、和 I 型自身免疫多腺體綜合征(Hara T. et al, Blood. 1991 年 5 月 I 日；77 (5) : 1127)。自身免疫性胃腸疾病的例子包括但不限于慢性炎癥腸道疾病(GarciaHerolaA. et al, Gastroenterol Hepatol. 2000 年 I 月；23(1):16)、乳糜灣(Landau YE.andShoenfeld Y. Harefuah 2000年I月16日；138 (2) : 122)、結(jié)腸炎、回腸炎、和克羅恩病。自身免疫性皮膚病的例子包括但不限于自身免疫性大皰性皮膚病，例如但不限于尋常型天皰瘡、大皰性類天皰瘡和落葉性天皰瘡。自身免疫性肝病的例子包括但不限于肝炎、自身免疫性慢性活動性肝炎(Franco A. et al, Clin Immunol Immunopathol 1990 年 4 月；54(3) :382)、原發(fā)性膽汁性肝硬化(Jones DE. Clin Sci (Colch) 1996Nov ；91 (5) :551 ；Strassburg CP. et al, EurJ Gastroenterol HepatoL. 1999 年 6 月；11 (6) : 595)、和自身免疫性肝炎(Manns MP. JHepatol 2000 年 8 月；33 (2):326)。自身免疫性神經(jīng)系統(tǒng)疾病的例子包括但不限于多發(fā)性硬化(Cross AH. et al, JNeuroimmunol, 2001 年 I 月；2 (1-2) : I)、阿爾茨海默氏病(Oron L. et al, J Neural TransmSuppL. 1997; 49; 77)、重癥肌無力(Infante AJ. and Kraig E, Int Rev Immunol 1999 ；18(1-2) :83; Oshima M. et al, Eur J Immunol 1990 年 11 月；20 (12) : 2563)、神經(jīng)病變、自主神經(jīng)病變(Kornberg AJ. J Clin Neurosci. 2000年5月；7 (3) : 191)、格林巴利綜合癥和自身免疫性神經(jīng)病變(Kusunoki S.Am J Med Sci. 2000年4月;319 (4) : 234)、肌無力、Lambert-Eaton 肌無力綜合征(Takamori M. Am J Med Sci. 2000 年 4 月；319 (4) : 204);苜丨」腫瘤性神經(jīng)系統(tǒng)疾病、小腦萎縮、副腫瘤性小腦萎縮、和僵人綜合征(Hiemstra HS. et al,Proc Natl Acad Sci units S A 2001 年 3 月 27 日；98 (7) :3988);非副腫瘤性僵人綜合征、進(jìn)行性小腦萎縮、腦炎、Rasmussen氏腦炎、肌萎縮側(cè)索硬化、小舞蹈病、抽動-移1語綜合征、和自身免疫性多內(nèi)分泌腺病(Antoine JC. and Honnorat J. Rev Neurol (巴黎)2000年I 月;156 (I) : 23);免疫異常性神經(jīng)病變(Nobile-Orazio E. et al, ElectroencephalogrClin Neurophysiol Suppl 1999;50:4-19);獲得性神經(jīng)性肌強(qiáng)直、多關(guān)節(jié)攣縮癥(Vincent
A.et al,Ann N Y Acad Sci. 1998 年 5 月 13 日；841:482)、神經(jīng)炎、視神經(jīng)炎(SoderstromM. et al, J Neurol Neurosurg Psychiatry 1994 年 5 月；57 (5) : 544)、和神經(jīng)退行性疾病。自身免疫性肌肉疾病的例子包括但不限于肌炎、自身免疫性肌炎和原發(fā)性干燥綜合征(Feist E. et al, Int Arch Allergy Immunol 2000Sep ; 123 (I) :92)、及平滑肌自身免疫性疾病(Zauli D. et al, Biomed Pharmacother, 1999 年 6 月;53 (5-6) : 234)。自身免疫性腎病的例子包括但不限于腎炎和自 身免疫性間質(zhì)性腎炎(KellyCJ.，J Am Soc Nephrol, 1990 年 8 月;I (2):140)。與繁殖相關(guān)的自身免疫性疾病的例子包括但不限于反復(fù)胚胎丟失(TincaniA. et al, Lupus 1998;7Suppl 2 S 107-9)。自身免疫性結(jié)締組織病的例子包括但不限于耳病、自身免疫性耳病(YooTJ. etal, Cell Immunol, 1994 年 8 月；157(1) :249)和內(nèi)耳的自身免疫性疾病(Gloddek B. etal, Ann N YAcad Sci 1997 年 12 月 29 日；830:266)。自身免疫系統(tǒng)性疾病的例子包括但不限于系統(tǒng)性紅斑狼瘡(Erikson J. etal, TmmunoI Res 1998; 17 (1-2) :49)和系統(tǒng)性硬化(Renaudineau Y. et al, Clin Diagn LabImmunol. 1999 年 3 月；6 (2):156) ；Chan OT. et al, Immunol Revl999 年 6 月；169:107)。此外，貼壁細(xì)胞或者條件培養(yǎng)基可用于治療與移植物移植相關(guān)的疾病，包括但不限于移植物排斥、慢性移植物排斥、亞急性移植物排斥、超急性移植物排斥、急性移植物排斥、和移植物抗宿主病。本文中使用的術(shù)語“治療”是指抑制或者阻止病狀的發(fā)展并且/或者導(dǎo)致病狀的減輕、緩解、或復(fù)原。本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解可利用各種方法和檢測來評價病狀的發(fā)展，并且類似地也可利用各種方法和檢測來評價病狀的減輕、緩解或復(fù)原。術(shù)語“治療”也可指代減輕或降低與該病狀相關(guān)的癥狀。利用貼壁細(xì)胞或條件培養(yǎng)基治療的受試者可以是任何受試者(例如，哺乳動物)，例如人受試者或者飼養(yǎng)動物，包括但不限于診斷出或者患有可以受益于基質(zhì)細(xì)胞移植的病狀的馬(即馬)、牛、山羊、綿羊、豬、犬、貓、駱騎、羊騎、美洲騎和牦牛。因為所述的細(xì)胞可以是天然的細(xì)胞或者可以是經(jīng)基因技術(shù)改良從而獲得有用的細(xì)胞系(見美國專利申請第20030219423號)。所述細(xì)胞可以是新鮮的或者是冷凍(例如，冷凍保存)制品。根據(jù)醫(yī)學(xué)疾病，可給受試者給予其他化學(xué)藥物(例如，免疫調(diào)節(jié)劑、化療劑等)或者細(xì)胞。所述細(xì)胞，雖然其特征為免疫抑制活性，但仍然會引起寄主或供者所產(chǎn)生的不良免疫應(yīng)答。業(yè)者已開發(fā)出各種方法來降低對非自體細(xì)胞排斥的可能性。這些方法包括抑制受體免疫系統(tǒng)、或者在移植前將非自體細(xì)胞包囊在免疫隔離的半滲透膜中。包囊技術(shù)一般分類為微包囊，涉及小球形賦形劑和大包囊，涉及較大的平片和中空纖維膜(Uludag, H. et al,哺乳動物細(xì)胞包囊。Adv Drug Deliv Rev. 2000; 42:29-64)。制備微膠囊的方法在本領(lǐng)域是熟知的并且包括例如由Lu MZ et al公開的方法，用海藻酸鹽和a-苯氧基肉桂叉-乙?；?烯丙基胺)進(jìn)行細(xì)胞包囊。BiotechnolBioeng.2000，70:479-83，Chang TM 和 Prakash S. enzymes, cells and geneticallyengineered microorganisms. Mol Biotechnol. 2001, 17:249-60,以及 Lu MZ et al,Cell encapsulation with alginate and alpha-phenoxycinnamylidene-acetylatedpoly(allylamine). J Microencapsul. 2000, 17:245-51。例如，通過用甲基丙烯酸2-羥基乙酯(HEMA)、甲基丙烯酸(MAA)和甲基丙烯酸甲酯(MMA)的三元共聚物殼與改良膠原蛋白復(fù)合而制備微膠囊，形成2-5i!m的膠囊厚度?？梢杂妙~外的2-5 三元聚合物殼對這種微膠囊進(jìn)一步包囊，以賦予帶負(fù)電荷的平滑表面并且使血楽■蛋白吸附最小化(Chia, S. M. et al, Multi-layered microcapsules for cellencapsulation Biomaterials. 200223:849-56)。其他微膠囊是基于海藻酸鹽,海產(chǎn)多糖類(Sambanis, A. Encapsulated islets indiabetes treatment. Diabetes TechnoL. Ther. 2003, 5:665-8)或者其衍生物。例如，可以通過在氯化鈣存在下使聚陰離子海藻酸鈉和纖維素硫酸鈉與聚陽離子聚(亞甲基-Co-胍)鹽酸鹽發(fā)生聚電解質(zhì)復(fù)合反應(yīng)而制備微膠囊。應(yīng)理解的是，當(dāng)使用較小的膠囊時可改善細(xì)胞包囊。因此，當(dāng)把膠囊大小從Imm減小至400 ii m時，可改善品質(zhì)控制、機(jī)械穩(wěn)定性、擴(kuò)散性能、和包囊的細(xì)胞的體外活性(Canaple L. et al, Improving cell encapsulation through size control.J Biomater Sci Polym ED. 2002; 13:783-96)。此外，發(fā)現(xiàn)具有良好控制孔徑(小達(dá)7nm)的納米多孔生物膠囊、定做的表面化學(xué)和精細(xì)的微體系結(jié)構(gòu)可成功地使細(xì)胞的微環(huán)境免疫隔離(Williams D. Small is beautiful microparticle and nanoparticletechnology in medical devies. Med Device Technol. 1999, 10 6~9 ；Desai,T. A. Microfabrication technology for pancreatic cell encapsulation. Expert OpinBiol Ther. 2002，2:633-46)。免疫抑制劑的例子包括但不限于甲氨蝶呤、環(huán)磷酰胺、環(huán)孢素、環(huán)孢素A、氯喹、羥基氯喹、柳氮磺批唳(sulphasalazopyrine)、金鹽、D-青霉胺、來氟米特、硫唑嘌呤、阿那白滯素(anakinra)、英夫利昔單抗(REMICADE)、依那西普、TNF-a抑制劑(一種以抗炎細(xì)胞因子為目標(biāo)的生物制劑)、和非甾體抗炎藥(NSAID)。非甾體抗炎藥的例子括但不限于乙酰水楊酸、水楊酸膽堿、二氟尼柳(diflunisal)、水楊酸鎂、雙水楊酯、水楊酸鈉、雙氯芬酸、依托度酸、非諾洛芬、氟比洛芬、吲哚美辛、酮洛芬、酮咯酸、甲氯芬酯、萘普生、萘丁美酮、保泰松、吡羅昔康、舒林酸、托美汀、對乙酰氨基酚、布洛芬、Cox-2抑制劑和曲馬多。此外，應(yīng)理解的是，細(xì)胞或條件培養(yǎng)基可以本身的形式使用，或者優(yōu)選地作為還包括藥學(xué)上可接受載體的藥物組合物的一部分的形式而使用。本文中使用的“藥物組合物”是指細(xì)胞或由該細(xì)胞獲得的條件培養(yǎng)基與其他化學(xué)成分(如藥學(xué)上適合的載體或賦形劑)所組成的制劑。藥物組合物的目的是便于將細(xì)胞給予給受試者。、
在下文中，術(shù)語“藥學(xué)上可接受載體”是指不引起對受試者的顯著刺激并且不取消給予化合物的生物活性和性質(zhì)的載體或稀釋劑。載體的非限制性例子是丙二醇、生理鹽水、DMSO、HAS、有機(jī)溶劑與水的乳液和混合物。本文中的術(shù)語“賦形劑”是指加入到藥物組合物中以進(jìn)一步便于化合物給藥的惰性物質(zhì)。賦形劑的非限制性例子包括碳酸鈣、磷酸鈣、各種糖和各種類型的淀粉、纖維素衍生物、明膠、植物油和聚乙二醇?？蓮摹癛emington,s Pharmaceutical Sciences”Mack Publishing Co, Easton,PA，最新版(其內(nèi)容以參考的方式 并入本文中)中找到藥物的制劑和給藥技術(shù)。因此，可使用一種或多種生理學(xué)可接受的載體(包括賦形劑和輔料)并按常規(guī)方式用于將本發(fā)明的藥物組合物制成制劑，便于將活性成分處理成制劑，可以具有藥學(xué)應(yīng)用。合適的劑型取決于所選的給藥途徑。對于注射，可將該藥物組合物的各活性成分配制在水溶液中，優(yōu)選生理學(xué)相容的緩沖劑中，例如Hank氏液、林格氏液、生理鹽水緩沖液，或者冷凍含冷凍保存劑的培養(yǎng)基。本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠?qū)嵤┲委熡行Я康拇_定，特別是按照本文中的詳細(xì)公開內(nèi)容。可通過標(biāo)準(zhǔn)藥學(xué)步驟在體外、細(xì)胞培養(yǎng)或者實驗動物中測定本文中所描述活性成分的毒性和療效。根據(jù)被治療疾病的嚴(yán)重長度和應(yīng)答性，給藥可以是單次給藥或者多次給藥。然而，給予的組合物量當(dāng)然將取決于被治療的受試者、病痛的嚴(yán)重程度、給藥方式、處方醫(yī)師的判斷等。在移植后，優(yōu)選地使一部分的本發(fā)明細(xì)胞在患病區(qū)存活一時間段(例如大約2-6周)，以便觀察到治療效果。也可以制備包括配制在相容的藥學(xué)載體中的本發(fā)明制劑的組合物，將其置于合適的容器中并且附上所指疾病的治療的標(biāo)簽。若需要，本發(fā)明的組合物可存在于包裝或者分配裝置中，例如FDA批準(zhǔn)的試劑盒，可包含一個或多個包含活性成分的單位劑型。包裝可以是例如包括金屬薄膜或塑料薄膜，如罩板包裝。包裝或者分配裝置可以附帶使用說明書。包裝或者分配裝置也可提供以管理藥品制造、使用或銷售的政府機(jī)構(gòu)頒發(fā)的與容器相關(guān)的通知，通知是由政府機(jī)構(gòu)對組合物或者人或獸醫(yī)使用許可的反應(yīng)。這種通式，例如可以是由美國食品藥物管理局許可的用于處方藥物或許可產(chǎn)品的插件標(biāo)簽。本文中使用的術(shù)語“大約”是指±10%。術(shù)語“包括”、“包含”、“具有”以及它們的同根變形詞表示“包括但不限于”。此術(shù)語包括術(shù)語“由-構(gòu)成”和“基本上由-構(gòu)成”。短語“基本上由…組成”表示組合物或者方法可包括其他成分和/或步驟，但僅僅是在其它成分和/或步驟并不顯著改變申請專利保護(hù)的組合物或方法的基本的和新型的特征的情況下。本文中使用的單數(shù)形式“一”、“一個”和“該”包括復(fù)數(shù)形式，除非上下文中明確指出。例如，術(shù)語“一個化合物”或者“至少一個化合物”可包括多個化合物，包括其混合物。在本申請的全文中，可以用范圍的形式來描述本發(fā)明的各種實施方式。應(yīng)理解的是，采用范圍現(xiàn)實的說明僅僅是為了方便和簡潔并且不應(yīng)理解成對本發(fā)明范圍的不可改變的限制。因此，應(yīng)認(rèn)為對范圍的描述已特異性地公開了所有可能的子范圍以及該范圍內(nèi)的單個數(shù)值。例如，范圍的描述如從I至6應(yīng)該被認(rèn)為具有明確公開的子范圍,例如I至3、1至4、1至5、2至4、2至6、3至6等，以及在此范圍內(nèi)的單獨(dú)數(shù)字，例如1、2、3、4、5、和6。無論范圍的寬度如何均適用。每當(dāng)本文中指出數(shù)值范圍，它表示包括在所指范圍內(nèi)的任何引用的數(shù)字(分?jǐn)?shù)或整數(shù))。短語“在第一指示數(shù)字和第二指示數(shù)字的范圍內(nèi)/在范圍之間”與“在第一指示數(shù)字和第二指示數(shù)字的范圍內(nèi)”在本文中可互換地使用，表示包括第一個和第二個所指的數(shù)字以及兩者之間的所有分?jǐn)?shù)和整數(shù)。 本文中使用的術(shù)語“方法”是指用于完成給定任務(wù)的方式、手段、技術(shù)和步驟，包括但不限于化學(xué)、藥理學(xué)、生物學(xué)、化學(xué)或醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的技術(shù)人員所了解的方式、手段、技術(shù)和步驟，或者可容易地從已知方式、手段、技術(shù)和步驟開發(fā)出的方式、手段、技術(shù)和步驟。本文中使用的術(shù)語“治療”包括消除、基本上抑制、減緩或逆轉(zhuǎn)疾病的進(jìn)展，基本上改善疾病的臨床或者外觀癥狀、或者基本上防止疾病的臨床癥狀或外觀癥狀的出現(xiàn)。本文中使用的詞語“示例性”表示用作例子、舉例或者說明。任何描述成“示例性”的實施方式不必被理解成比其他實施方式優(yōu)選或者有利并且/或者排除其他實施方式的特征的并入。本文中使用的詞語“可選擇地”表示“在一些實施方式中提供并且在其他實施方式中不提供”。本發(fā)明的任何具體實施方式
可包括多個“可選擇的”特征，除非這種特征產(chǎn)生矛盾。應(yīng)理解的是，在單獨(dú)實施方式的上下文中所描述的本發(fā)明某些特征，為了清楚起見，也可以在單個實施方式中以組合的形式提供。相反，為了簡潔，單個實施方式的上下文中描述的本發(fā)明各種特征也可以單獨(dú)地或者以任何適當(dāng)?shù)膩喗M合的形式提供或者以本發(fā)明的任何其他描述的實施方式提供。各種實施方式的上下文中所描述的某些特征不應(yīng)看作是這些實施方式的基本特征，除非沒有這些因素實施方式無法實施。在上文中描述的以及在下面的權(quán)利要求部分中要求的各種實施方式以及本發(fā)明的各方面在下面的實施例中能夠找到實驗支持。實施例現(xiàn)在參照下面的實施例連同以上描述以非限制性方式說明本發(fā)明的一些實施方式。一般來說，本文中使用的命名法和本發(fā)明中采用的實驗室步驟包括分子技術(shù)、生物化學(xué)技術(shù)、微生物技術(shù)和重組DNA技術(shù)。這種技術(shù)完全地在文獻(xiàn)中有說明。參見例如“分子克隆實驗手冊”Sambrook et al (1989)分子生物學(xué)中的實驗室指南"Volumes I-IIIAusubel, M.，ed. (1994) ；Ausubel et al, “分子生物學(xué)中的實驗室指南” John Wiley andSons, Baltimore, Maryland (1989) ；Perbal “分子克隆的實用指南” John Wiley &Sons,紐約(1988) ；ffatson et al, “重組 DNA”，Scientific American Books,紐約；Birrenet al ed. “基因組分析實驗手冊系列” Vol. 1-4, Cold Spring Harbor LaboratoryPress,紐約(1998);如美國專利第 4，666，828,4, 683，202,4, 801，531,5, 192，659 和5，272,057號中所陳述的方法；“細(xì)胞生物學(xué)試驗室手冊”，第I-III卷細(xì)胞Coligan，J. E. , ed. (1994) ； " Basic and Clinical Immunology" Volumes I-III Coligan J. E.,ed. (1994) ；Stites et al ed. , Basic and Clinical Immunology"(第 8 版)，Appleton
&Lange, Norwalk, CT(1994) ；Mishell and Shiigi ed. “細(xì)胞免疫中的選擇方法”W.H-Freeman公司，紐約(1980);有用的免疫檢測方法廣泛地描述于各專利和科學(xué)文獻(xiàn)，見例如美國專利第 3，791，932,3, 839，153,3, 850，752,850, 578 ;3，853，987,3, 867，517、3，879，262,3,901,654,3,935,074,3,984，533,3, 996，345,4, 034, 074,4, 098, 876、4,879, 219,5, 011, 771 和 5, 281, 521 ;“寡核苷酸合成” Gait，M. J.，ed. (1984) ；NucleicAcid Hybridization" Hames, B. D. , and Higgins S. J. , ed. (1985);“轉(zhuǎn)錄和翻譯，，Hames，
B.D.，and Higgins S. J.，ed. (1984)； ”動物細(xì)胞培養(yǎng)"Freshney，R. I. ed. (1986);“固定化細(xì)胞和酶” IRL Press, 1986);“分子克隆的實用指南”Perbal，B.，1984)和“酶學(xué)中的方法” VoL. 1-317, Academic Press ;“PCR 試驗方案方法和應(yīng)用的導(dǎo)論” Academic Press,San Diego, CA(1990) ；Marshak et al, “蛋白純化的策略和特征-ALaboratory CourseManual" CSHL Press (1996);所有以參考的方式并入本文，如全部在本文中列出一樣。本專利文件的全文中提供其他一般性參考。認(rèn)為其中的步驟對于本領(lǐng)域是眾所周知的并且為了方便讀者而提供。其中所包含的所有信息以參考的方式并入本文中。實施例I從胎盤分離的貼壁基質(zhì)細(xì)胞(ASC)中回收和處理貼壁細(xì)胞-人胎盤是簽署知情同意書后在健康供體母親的剖腹產(chǎn)后獲得。將來源于胎盤的切碎的組織于37°C用0. 1%膠原酶(Img膠原酶/ml組織)進(jìn)行2-5小時培養(yǎng)。將包含補(bǔ)充有10%FBS、兩性霉素B 0. 25ii g/ml和慶大霉素50ii g/ml的DMEM的二維(2D)細(xì)胞培養(yǎng)基(2D-培養(yǎng)基)添加到經(jīng)消化的組織中，粗略地過濾經(jīng)過滅菌金屬粗濾器，收集在滅菌燒杯中，并且離心(10分鐘，1200RPM，4°C )。采用輕緩的移液，然后用補(bǔ)充抗生素的二維培養(yǎng)基稀釋懸浮細(xì)胞，接種于175cm2燒瓶中并且于37°C在組織培養(yǎng)培養(yǎng)箱中在補(bǔ)充5%C02的濕潤條件下進(jìn)行培養(yǎng)。2-3天后，讓細(xì)胞附著在燒瓶表面，用PBS清洗細(xì)胞并加入二維培養(yǎng)基。二維(2D)細(xì)胞生長-通常在7-15天后實施第一次傳代。開始于第2代并繼續(xù)直到第6-8代，將細(xì)胞傳代直到培養(yǎng)達(dá)到70-90%的匯合，通常在4-5天后(I. 5-2倍)。利用0. 25%胰蛋白酶-EDTA(4分鐘，于37°C下)從燒瓶中分離出細(xì)胞并且以4±0. 5X103個細(xì)胞/cm2的培養(yǎng)密度進(jìn)行接種。在整個的過程中，在組織培養(yǎng)培養(yǎng)箱中在濕潤的條件下在5%C02中于37°C使培養(yǎng)物生長。在總共進(jìn)行5-9次傳代后，收集細(xì)胞并冷凍保存。二維細(xì)胞的低溫保存步驟-保存產(chǎn)品-為了二維細(xì)胞存量低溫保存，在無菌條件下利用0. 25%胰蛋白酶-EDTA收集二維培養(yǎng)的細(xì)胞。將細(xì)胞離心(1200RPM，10'，4°C )，計數(shù)，再次懸浮于二維培養(yǎng)基中。對于冷凍，用I: I 二維冷凍混合物(最終濃度為10%DMS0，40%FBS和50% 二維培養(yǎng)基)稀釋細(xì)胞懸浮液。以10X 106/ml的最終濃度將細(xì)胞保存在5ml低溫保存聚丙烯玻璃小瓶中。給玻璃小瓶做上標(biāo)記并且轉(zhuǎn)移到控制速率的冷凍器中實施逐漸降溫過程(1°C /分鐘)，然后就將它們轉(zhuǎn)移并保存于液氮冷凍器的氣相中。涉及在二維和三維條件下分離和培養(yǎng)胎盤ASC的進(jìn)一步詳細(xì)內(nèi)容描述于以下參考文獻(xiàn)中。W02007/108003，其全部內(nèi)容以參考的方式并入本文中，描述了三維(3D)培養(yǎng)條件適于來源于胎盤的ASC的擴(kuò)增。W02009/037690，其全部內(nèi)容以參考的方式并入本文中，教導(dǎo)了通過給予受試者治療有效量選自胎盤和脂肪組織的組織的貼壁細(xì)胞而治療缺血和誘導(dǎo)結(jié)締組織再生的方法。W02010/026574，其全部內(nèi)容以參考的方式并入本文中，描述了適于來源于胎盤的ASC的擴(kuò)增的二維(2D)培養(yǎng)條件。W02010/026575，其全部內(nèi)容以參考的方式并入本文中，描述了涉及適于來源于胎盤的ASC的擴(kuò)增的灌注的三維(3D)培養(yǎng)條件。實施例2胎盤部分的分離和特征。I.從不同的胎盤部分分離貼壁細(xì)胞。 材料和方法胎盤-在簽署知情同意書后從健康供體母親的剖腹產(chǎn)后從雄性胚胎中獲得人胎盤。細(xì)胞分離(見圖I的結(jié)構(gòu)說明)從羊膜中分離細(xì)胞-將胎盤放置成胚胎側(cè)朝上。通過鈍的機(jī)械剝離從絨毛膜中分離出羊膜(無血管)。將羊膜轉(zhuǎn)移到含有Hank氏平衡鹽溶液(HBSS)的50ml管中。將該膜切成 0. 5-lcm2的小片并且置于一個新的50ml管中。從蛻膜部分分離細(xì)胞-在除去羊膜后實施此步驟，如以上的詳細(xì)說明。將胎盤放置成母體側(cè)朝上。僅從面向母體的表面的中心區(qū)切開蛻膜(見圖I)。切出約Icm3的正方形，深度不大于0. 5cm。將各小片置于含HBSS的500ml瓶中并用HBSS清洗。從絨毛部分離細(xì)胞-在除去蛻膜部分后實施此步驟，如上面的詳細(xì)說明。把胎盤再放置成胚胎側(cè)面朝上。在大血管之間切出約4-5cm的正方形，深度約為0. 5-lcm。將各小塊置于滅菌玻璃板上再用解剖刀進(jìn)行擦洗。分離絨毛(小血管)并且僅收集周圍組織而不收集女性(chorine)羊膜層。將切碎的組織置于含HBSS的500ml瓶中并用HBSS清洗。貼壁細(xì)胞的分離-以上述方式獲得各種胎盤區(qū)的切碎組織，以上述PLX細(xì)胞的制備中所述的方式進(jìn)行處理。細(xì)胞來源的判定-為了判定從各種胎盤源中獲得的細(xì)胞在分離和擴(kuò)增條件后是否為母體或胚胎來源，按照此方案對從男性新生兒中獲得的5個胎盤中獲得的細(xì)胞實施FISH分析。母體源性的細(xì)胞必定是XX(雌性核型)而胚胎源性的細(xì)胞必定是XY(雄性核型)。將結(jié)果總結(jié)于以下的表I。表I-核型
權(quán)利要求
1.一種來源于胎盤的貼壁細(xì)胞群，其中所述細(xì)胞群包含至少70%的來自所述胎盤母體部分的貼壁細(xì)胞。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的貼壁細(xì)胞群，其中所述胎盤的所述母體部分包括基蛻膜、壁蛻膜，或者同時包括基蛻膜和壁蛻膜。
3.一種來源于胎盤的貼壁細(xì)胞群，其中所述細(xì)胞群包含至少70%的來源于胎盤的胚胎部分的貼壁細(xì)胞。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的細(xì)胞群，其中所述胎盤的胚胎部分包括羊膜。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的細(xì)胞群，其中所述胎盤的胚胎部分是由羊膜構(gòu)成。
6.根據(jù)權(quán)利要求3所述的細(xì)胞群，其中所述胎盤的胚胎部分包括絨毛膜絨毛。
7.根據(jù)權(quán)利要求3所述的細(xì)胞群，其中所述胎盤的胚胎部分是由絨毛膜絨毛構(gòu)成。
8.根據(jù)權(quán)利要求I或2所述的細(xì)胞群，其中不多于3.5%、不多于3%、不多于2%、或者不多于1%的來自母體部分的貼壁細(xì)胞群表達(dá)CD200，如通過流式細(xì)胞術(shù)利用確定陰性表達(dá)的同種型對照所測量的。
9.一種條件培養(yǎng)基，是從包含權(quán)利要求1-8所述的任意細(xì)胞群的培養(yǎng)物中分離的。
10.一種藥物組合物，包括作為活性成分的權(quán)利要求1、2或8所述的細(xì)胞群或權(quán)利要求9所述的條件培養(yǎng)基以及藥學(xué)上可接受載體。
11.一種治療可受益于細(xì)胞或器官移植的醫(yī)學(xué)疾病的方法，包括向需要其的受試者給予治療有效量的權(quán)利要求10所述的藥物組合物，從而治療所述受試者。
12.權(quán)利要求I所述的細(xì)胞群或者權(quán)利要求9所述的條件培養(yǎng)基在制備用于治療可受益于細(xì)胞或器官移植的疾病的藥物中的應(yīng)用。
13.根據(jù)權(quán)利要求11所述的方法或者根據(jù)權(quán)利要求12所述的應(yīng)用，其中所述疾病選自由缺血、外周動脈疾病(PAD)、嚴(yán)重肢體缺血(CLI)、下肢缺血、中風(fēng)、缺血性血管病、腎的血管病、缺血性心臟病、心肌缺血、冠狀動脈疾病(CAD)、動脈粥樣硬化性心血管疾病、左主冠狀動脈疾病、動脈阻塞性疾病、外周缺血、外周血管疾病、動脈硬化、視網(wǎng)膜病變、視網(wǎng)膜修復(fù)、重構(gòu)紊亂、林島綜合征、遺傳性出血性毛細(xì)血管擴(kuò)張缺血性血管病、伯格氏病、缺血性腎病、胎盤缺血、與生育相關(guān)的紊亂、移植物抗宿主病、實體器官移植、造血干細(xì)胞移植、糖尿病、結(jié)締組織損傷、癌癥、癌前期、骨癌、骨肉瘤、骨轉(zhuǎn)移、骨折、燒傷、關(guān)節(jié)軟骨缺陷、深部傷、傷口延遲愈合、潰瘍延遲愈合、軟骨下骨囊腫、骨質(zhì)疏松、骨關(guān)節(jié)炎、骨退化、軟骨損傷、關(guān)節(jié)軟骨缺陷、腱損傷、自身免疫性疾病、代謝紊亂、銀屑病、神經(jīng)病理性疼痛、周圍神經(jīng)損傷、神經(jīng)退行性疾病、對腎移植的支持和炎癥性疾病所構(gòu)成的組。
14.根據(jù)權(quán)利要求11所述的方法或者根據(jù)權(quán)利要求12所述的應(yīng)用，其中所述疾病是心力衰竭、心肌梗塞、神經(jīng)病理性疼痛、骨骼肌缺陷、中風(fēng)、或缺血性心臟病。
15.根據(jù)權(quán)利要求1、2或8所述的細(xì)胞群、根據(jù)權(quán)利要求10所述的藥物組合物、根據(jù)權(quán)利要求11所述的方法、或者根據(jù)權(quán)利要求12所述的應(yīng)用，其中所述貼壁細(xì)胞表達(dá)CD73、CD90、CD29、CD105或者D7_fib中的一種或多種。
16.根據(jù)權(quán)利要求1、2或8所述的細(xì)胞群、根據(jù)權(quán)利要求10所述的藥物組合物、根據(jù)權(quán)利要求11所述的方法、或者根據(jù)權(quán)利要求12所述的應(yīng)用，其中所述貼壁細(xì)胞不表達(dá)CD3、CD4、CD45、CD80、HLA-DR、CDllb, CD14、CD19、CD34、CD31、CD200、KDR、或 CD79。
17.根據(jù)權(quán)利要求1、2或8所述的細(xì)胞群、根據(jù)權(quán)利要求10所述的藥物組合物、根據(jù)權(quán)利要求11所述的方法、或者根據(jù)權(quán)利要求12所述的應(yīng)用，其中當(dāng)在混合的淋巴細(xì)胞培養(yǎng)中進(jìn)行測試時，所述貼壁細(xì)胞抑制免疫反應(yīng)的程度小于來源于胎盤胚胎部分的貼壁細(xì)胞。
18.根據(jù)權(quán)利要求1、2或8所述的細(xì)胞群、根據(jù)權(quán)利要求10所述的藥物組合物、根據(jù)權(quán)利要求11所述的方法、或者根據(jù)權(quán)利要求12所述的應(yīng)用，其中在三維(3D)培養(yǎng)中培養(yǎng)所述貼壁細(xì)胞。
19.根據(jù)權(quán)利要求18所述的細(xì)胞群、藥物組合物、方法、或應(yīng)用，其中所述三維(3D)培養(yǎng)包括3D生物反應(yīng)器。
20.根據(jù)權(quán)利要求18所述的細(xì)胞群、藥物組合物、方法、或應(yīng)用，其中在灌注下實施所述貼壁細(xì)胞在所述3D培養(yǎng)中的培養(yǎng)。
21.根據(jù)權(quán)利要求18所述的細(xì)胞群、藥物組合物、方法、或應(yīng)用，其中實施所述貼壁細(xì)胞的培養(yǎng)至少3天。
22.根據(jù)權(quán)利要求18所述的細(xì)胞群、藥物組合物、方法、或應(yīng)用，其中實施所述貼壁細(xì)胞的培養(yǎng)直到至少10%的所述貼壁細(xì)胞在增殖。
23.根據(jù)權(quán)利要求1、2或8所述的細(xì)胞群、根據(jù)權(quán)利要求10所述的藥物組合物、根據(jù)權(quán)利要求11所述的方法、或者根據(jù)權(quán)利要求12所述的應(yīng)用，其中在二維(2D)培養(yǎng)中培養(yǎng)所述貼壁細(xì)胞。
24.根據(jù)權(quán)利要求23所述的細(xì)胞群、藥物組合物、方法、或者應(yīng)用，其中至少10%的所述貼壁細(xì)胞在增殖。
25.根據(jù)權(quán)利要求1、2或8所述的細(xì)胞群、根據(jù)權(quán)利要求10所述的藥物組合物、根據(jù)權(quán)利要求11所述的方法、或者根據(jù)權(quán)利要求12所述的應(yīng)用，其中與從生長骨髓中獲得的貼壁細(xì)胞相比，所述貼壁細(xì)胞較少定向為成骨細(xì)胞系，并且允許在相同條件下分化。
26.根據(jù)權(quán)利要求1、2或8所述的細(xì)胞群、根據(jù)權(quán)利要求10所述的藥物組合物、根據(jù)權(quán)利要求11所述的方法、或者根據(jù)權(quán)利要求12所述的應(yīng)用，其中與從生長骨髓中獲得的貼壁細(xì)胞相比，所述貼壁細(xì)胞較少定向為脂肪形成細(xì)胞系，并且可以在相同條件下分化。
27.根據(jù)權(quán)利要求1、2或8所述的細(xì)胞群、根據(jù)權(quán)利要求10所述的藥物組合物、根據(jù)權(quán)利要求11所述的方法、或者根據(jù)權(quán)利要求12所述的應(yīng)用，其中所述貼壁細(xì)胞包括小于來源于胎盤胚胎部分的貼壁細(xì)胞的細(xì)胞直徑。
28.根據(jù)權(quán)利要求1、2或8所述的細(xì)胞群、根據(jù)權(quán)利要求10所述的藥物組合物、根據(jù)據(jù)權(quán)利要求11所述的方法、或者根據(jù)權(quán)利要求12所述的應(yīng)用，其中所述貼壁細(xì)胞包括高于來源于胎盤胚胎部分的貼壁細(xì)胞的細(xì)胞增殖能力。
29.一種治療骨骼肌缺陷的方法，包括給予需要其的受試者治療有效量的包含來源于胎盤的貼壁基質(zhì)細(xì)胞的組合物，從而治療骨骼肌缺陷。
30.一種治療神經(jīng)病理性疼痛的方法，包括給予需要其的受試者治療有效量的包含來源于胎盤的貼壁基質(zhì)細(xì)胞的組合物，從而治療神經(jīng)病理性疼痛。
31.根據(jù)權(quán)利要求30所述的方法，其中所述神經(jīng)病理性疼痛與炎性疼痛、糖尿病多發(fā)性神經(jīng)病變、人類免疫缺陷病毒(HIV)感覺神經(jīng)病變、中風(fēng)后綜合征、缺血、或多發(fā)性硬化有關(guān)。
32.—種治療心肌梗塞的方法，包括向需要其的受試者給予治療有效量的包含來源于胎盤的貼壁基質(zhì)細(xì)胞的組合物，從而治療心肌梗塞。
33.包含來源于胎盤的貼壁基質(zhì)細(xì)胞的組合物在制備用于治療骨骼肌缺陷、神經(jīng)病理性疼痛、心肌梗塞的藥物中的應(yīng)用。
34.包含作為活性成分的來源于胎盤的貼壁基質(zhì)細(xì)胞的藥物組合物，用于治療骨骼肌缺陷、神經(jīng)病理性疼痛、或心肌梗塞。
35.根據(jù)權(quán)利要求34所述的藥物組合物，其中所述神經(jīng)病理性疼痛與炎性疼痛、糖尿病多發(fā)性神經(jīng)病變、人類免疫缺陷病毒(HIV)感覺神經(jīng)病變、中風(fēng)后綜合征、缺血、或多發(fā)性硬化有關(guān)。
36.根據(jù)權(quán)利要求29-32中任一項所述的方法，根據(jù)權(quán)利要求33所述的應(yīng)用、或者根據(jù)權(quán)利要求34或35所述的藥物組合物，其中所述貼壁細(xì)胞表達(dá)⑶73、⑶90、⑶29、⑶105或D7-fib中的一種或多種。
37.根據(jù)權(quán)利要求29-32中任一項所述的方法、根據(jù)權(quán)利要求33所述的應(yīng)用、或者根據(jù)權(quán)利要求34或35所述的藥物組合物，其中所述貼壁細(xì)胞不表達(dá)⑶3、⑶4、⑶45、⑶80、HLA-DR、CDllb, CD14、CD19、CD34、CD31、CD200、CD271、KDR、或 CD79。
38.根據(jù)權(quán)利要求29-32中任一項所述的方法、根據(jù)權(quán)利要求33所述的應(yīng)用、根據(jù)權(quán)利要求34或35所述的藥物組合物，其中所述貼壁細(xì)胞表達(dá)β -內(nèi)啡肽、強(qiáng)啡肽A、亮氨酸-腦啡肽、或甲硫氨酸-腦啡肽中的一種或多種。
39.根據(jù)權(quán)利要求29-32中任一項所述的方法、根據(jù)權(quán)利要求33所述的應(yīng)用、或者根據(jù)權(quán)利要求34或35所述的藥物組合物，其中所述貼壁細(xì)胞抑制T細(xì)胞活性。
40.根據(jù)權(quán)利要求29-32中任一項所述的方法、根據(jù)權(quán)利要求33所述的應(yīng)用、或者根據(jù)權(quán)利要求34或35所述的藥物組合物，其中所述貼壁細(xì)胞包括至少70%的來自胎盤母體部分的貼壁細(xì)胞。
41.根據(jù)權(quán)利要求40所述的方法、應(yīng)用、或藥物組合物，其中不多于3.5%、不多于3%、不多于2%、或者不多于1%的來自母體部分的所述貼壁細(xì)胞表達(dá)CD200，如通過流式細(xì)胞術(shù)利用確定陰性表達(dá)的同種型對照所測量的。
42.根據(jù)權(quán)利要求40所述的方法、應(yīng)用、或藥物組合物，其中胎盤的所述母體部分包括基蛻膜、壁蛻膜、或者同時包括基蛻膜和壁蛻膜。
43.根據(jù)權(quán)利要求29-32中任一項所述的方法，根據(jù)權(quán)利要求33所述的應(yīng)用、或者根據(jù)權(quán)利要求34或35所述的藥物組合物，其中通過采用3D培養(yǎng)條件的培養(yǎng)產(chǎn)生所述貼壁細(xì)胞。
44.根據(jù)權(quán)利要求43所述的方法、應(yīng)用、或藥物組合物，其中所述三維(3D)培養(yǎng)包括3D生物反應(yīng)器。
45.根據(jù)權(quán)利要求43所述的方法、應(yīng)用、或藥物組合物，其中，在灌注下實施所述貼壁細(xì)胞在所述3D培養(yǎng)中的培養(yǎng)。
46.根據(jù)權(quán)利要求43所述的方法、應(yīng)用、或藥物組合物，其中實施所述貼壁細(xì)胞的培養(yǎng)至少3天。
47.根據(jù)權(quán)利要求43所述的方法、應(yīng)用、或藥物組合物，其中實施所述貼壁細(xì)胞的培養(yǎng)直到至少10%的所述貼壁細(xì)胞在增殖。
全文摘要
提供了通過給予需要其的受試者來源于胎盤的貼壁基質(zhì)細(xì)胞來治療疾病的方法。這些疾病包括骨骼肌缺陷、神經(jīng)病理性疼痛、和心肌梗塞。還提供了其中將所給予的貼壁基質(zhì)細(xì)胞在2維或3維生長條件下培養(yǎng)的方法。也提供了其中所給予的細(xì)胞中的至少70%貼壁細(xì)胞來自于胎盤的母體或胎兒部分的方法。
文檔編號A61K35/50GK102639692SQ201080054298
公開日2012年8月15日 申請日期2010年11月29日 優(yōu)先權(quán)日2009年11月30日
發(fā)明者扎米·阿貝爾曼 申請人:普拉里斯坦有限公司