專利名稱：治療系統(tǒng)性紅斑狼瘡(sle)的人源化抗il-10抗體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及白細(xì)胞介素-10 (IL-10)和IL-10特異性試劑。特別地，本發(fā)明涉及人源化IL-10抗體及其應(yīng)用。本發(fā)明還涉及治療系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)的方法。
背景技術(shù)：
系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)據(jù)認(rèn)為是自體免疫疾病，其中B淋巴細(xì)胞的異常機(jī)能亢進(jìn)和免疫球蛋白Y(IgG)自體抗體的大量異常產(chǎn)生起著關(guān)鍵作用。該病理學(xué)過程導(dǎo)致Ig包覆的細(xì)胞的隱沒和破壞、補(bǔ)體蛋白的固定和切割以及化學(xué)吸引素(chemotaxin)、血管活性妝和破壞性酶在組織中的釋放(Hahn BH. Systemic Lupus Erythematosus. In:KasperDL, Braunwald E, Fauci AS, Hauser SL,Longo DL, Jameson, JL Ih ^ In:Harrison’ sPrinciples of Internal Medicine(第 16 版)，New York (US) : McGraw-Hi 11; 2005,第 1960-1967 頁)。SLE的特征在于多樣性表現(xiàn)形式。在疾病進(jìn)程中，總共95%的患者訴有肌肉骨骼疾病，80%表現(xiàn)出皮膚損傷，85%有血液疾病，60%有神經(jīng)紊亂，60%有心肺疾病，30% 50%有腎臟疾病，40%有胃腸道疾病，15%有血栓且15%有眼部疾病。大多數(shù)的患者(95%)還經(jīng)受在大多數(shù)時(shí)候均存在的系統(tǒng)性癥狀，如疲倦、不適、發(fā)燒、厭食和體重減輕。多數(shù)患者經(jīng)歷突發(fā)與緩解交替的疾病期。永久性緩解(不治療時(shí)沒有癥狀)極為罕見。超過50年之前，多數(shù)診斷為SLE的患者存活少于5年。現(xiàn)在，10年存活超過90%，這主要是基于早診斷、對(duì)癥抗炎和免疫抑制治療。常見死因?yàn)槊庖咭种圃斐傻母腥?Hahn 2005)。在SLE治療中常規(guī)使用抗瘧疾藥、抗炎藥和免疫抑制藥物。當(dāng)癥狀難以控制時(shí)，對(duì)非甾體抗炎劑補(bǔ)充以皮質(zhì)激素。此外，主要器官受累的活躍的SLE需要采用環(huán)磷酰胺的激進(jìn)性療法。迄今為止，還沒有可用于治愈SLE和/或在長(zhǎng)期基礎(chǔ)上改善患者的生活品質(zhì)的病因性治療。然而，近來在抗體技術(shù)中的發(fā)展和對(duì)引起該自體免疫疾病的因素的進(jìn)ー步鑒定已經(jīng)開啟了使用單克隆抗體作為治療選擇的可能性。特別地，治療SLE的有利方法將是與導(dǎo)致多克隆自體抗體的大量過度產(chǎn)生的病理性免疫響應(yīng)相互作用或?qū)⑵浼m正的特異性治療。由于SLE的發(fā)病機(jī)理主要涉及失調(diào)的B細(xì)胞，特別受關(guān)注的是能夠靶向B細(xì)胞的單克隆抗體。Robak 和 Robak (Current Drug Targets, 2009,第 10 期，第 26-37 頁)注意到，潛在的 B 細(xì)胞表面抗原靶標(biāo)是 CD19、CD20、CD21 和 CD22。此外，IL-10、IL-lra、IL-12 (Capper等，Clin. Exp. Immunol. 2004Nov; 138(2) :348-56)和 IL-6 (Chun 等，J. Clin. Immunol. 2007Sep ;27(5) :461-6)是調(diào)節(jié)免疫響應(yīng)的重要細(xì)胞因子，且尤其在SLE患者的突發(fā)期間升高。IL-10和抗雙鏈DNA (dsDNA)的自體抗體的血漿水平往往反映患SLE的患者的疾病活躍性。升高的IL-10水平與SLE患者的疾病活躍性相關(guān)(Park等，Clin. Exp. Rheumatol. 1998年5月-6月；16 (3) :283-8)。然而，IL-10是對(duì)免疫系統(tǒng)具有多效性的細(xì)胞因子，且已知其還參與降低促炎性響應(yīng)。已對(duì)SLE患者進(jìn)行了采用單克隆抗體的臨床試驗(yàn)。特別地，幾種試驗(yàn)涉及抗體利妥昔單抗(Rituximab)，一種用于治療非霍奇金氏淋巴瘤的嵌合小鼠抗CD20單克隆抗體。Robak和Robak (2009)注意到，這些試驗(yàn)的結(jié)果顯示出該抗體在SLE患者中較高的活性，且已開發(fā)了數(shù)種新的靶向⑶20的抗體(Ofatumumab、IMMU-106和GA-101)。其它報(bào)道了單克隆抗體在SLE中的活性的臨床試驗(yàn)采用抗CD22抗體、依帕珠單抗(Epratuzumab)、抗TNF a 抗體、英夫利昔單抗(Infliximab)、抗 IL-10 抗體、B-N10 (Llorente 等,ArthritisRheum. 2000 年 8 月；43 (8) : 1790-800)、抗 CD40L 抗體、IDEC 131 和 BG 9588、BLYS 抑制劑、貝利單抗(Belimumab)、抗IL6受體抗體、妥克利母單抗(Toclimumab)和抗C5抗體依庫珠單抗(Eculizumab)完成。本發(fā)明的目的在于提供在該領(lǐng)域具有功用的其他試劑、特別是抗體。因此，本發(fā)明提供了能夠結(jié)合白細(xì)胞介素-IO(IL-IO)的人源化的或嵌合的抗體或其片段，其中能夠?qū)⑺隹贵w或其片段施用于受試對(duì)象，而沒有促炎性細(xì)胞因子水平的無法耐受的增加的情況。由于IL-IO代表抗炎性細(xì)胞因子，因此預(yù)期的是阻斷時(shí)細(xì)胞因子會(huì)顯著增加。對(duì)·于鼠IL-IO抗體B-NlO而言，施用時(shí)可以在未經(jīng)刺激的細(xì)胞培養(yǎng)物(其反映了健康個(gè)體的體內(nèi)狀況)中觀察到如1し-6或1即-0等促炎性細(xì)胞因子的増加。然而，本發(fā)明人驚訝地發(fā)現(xiàn)當(dāng)將本發(fā)明的抗體在體外被應(yīng)用于細(xì)胞時(shí)和體內(nèi)施用時(shí)，細(xì)胞因子的釋放低得多。這種細(xì)胞因子釋放的降低是有利的，因此本發(fā)明的抗體對(duì)于接受施用的個(gè)體而言更具可耐受性。將參考以下附圖僅通過示例的方式對(duì)本發(fā)明進(jìn)行說明，其中圖IA顯示了鼠B-NlO抗體的輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列(SEQ ID No:2)。高變互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)以下劃線標(biāo)出(其中LCDRl為SEQ ID No: 4 ;LCDR2為SEQ ID No:5;且LCDR3為 SEQ ID No:6)。圖IB顯示了鼠B-NlO抗體的重鏈可變區(qū)的氨基酸序列(SEQ ID No:3)。高變互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)以下劃線標(biāo)出(其中HCDRl為SEQ ID No:7 ;HCDR2為SEQ ID No:8;且HCDR3為 SEQ ID No:9)。圖2A顯示了編碼鼠B-NlO抗體的輕鏈可變區(qū)的核苷酸序列(SEQ ID No: 10)。圖2B顯示了編碼鼠B-NlO抗體的重鏈可變區(qū)的核苷酸序列(SEQ IDNo: 11)。圖3顯示了鼠B-NlO輕鏈和重鏈可變區(qū)(分別為SEQ ID No: 12和13)以及取自A17(SEQ ID No: 14)、JKl (SEQ ID No: 15)、3-66+04(SEQ ID No:16)和 JH4(SEQ ID No: 17)的序列和在鼠B-NlO抗體的人源化過程中產(chǎn)生的可變區(qū)hVLl hVL12 (SEQ IDNo :18 29)和可變區(qū)hVHl hVH29 (SEQ ID No:30 58)的氨基酸序列。圖4提供了使用hIL-10抗原ELISA的人源化抗體變體與嵌合cB_N10抗體的抗原結(jié)合性質(zhì)的比較。圖5提供了使用純化抗體制備物，與嵌合CB-NlO抗體相比，確定三種人源化變體hVH20/hVL7、hVH20/hVL8 和 hVH26/hVL7 的結(jié)合性質(zhì)的結(jié)果。圖6A顯示與BT-063相比，以B-NlO (50 y g/ml)溫育后的健康志愿者的全血培養(yǎng)物釋放的TNF-a的水平。圖6B顯示與BT-063相比，以B-N10 (50 y g/ml)溫育后的SLE患者的全血培養(yǎng)物釋放的TNF-a的水平。
圖7A顯示與BT-063相比，以B-N10 (50 u g/ml)溫育后的健康志愿者的全血培養(yǎng)物釋放的IL-6的水平。圖7B顯示與BT-063相比，以B-N10 (50 y g/ml)溫育后的SLE患者的全血培養(yǎng)物釋放的IL-6的水平。圖8A顯示與BT-063相比，以B-N10 (50 ii g/ml)溫育后的健康志愿者的全血培養(yǎng)物釋放的IL-I P的水平。圖8B顯示與BT-063相比，以B-N10 (50 u g/ml)溫育后的SLE患者的全血培養(yǎng)物釋放的IL-I P的水平。圖9A顯示與BT-063相比，以B-NlO (50 ii g/ml)溫育后的健康志愿者的全血培養(yǎng)物釋放的IFNy的水平。
圖9B顯示與BT-063相比，以B-N10 (50 u g/ml)溫育后的SLE患者的全血培養(yǎng)物釋放的IFNy的水平。

圖10顯示了與IL-10結(jié)合的BT-063的Fab片段的總體結(jié)構(gòu)。IL-10和Fab片段以帶狀圖顯示。圖11顯示了 BT-063的Fab片段處于IL-10上的與IL-10受體相同的結(jié)合位點(diǎn)。IL-10、IL-10R1和Fab片段以帶狀圖顯示。圖12顯示了在健康志愿者中進(jìn)行BT-063體內(nèi)施用后血漿中細(xì)胞因子濃度的平均cmax與劑量的關(guān)系圖。圖13顯示了在健康志愿者中進(jìn)行BT-063體內(nèi)施用后血漿中平均IL-10濃度隨時(shí)間變化的圖。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明涉及能夠結(jié)合白細(xì)胞介素IO(IL-IO)的人源化或嵌合抗體或其片段，以及該抗體或其片段在由IL-10水平或活性升高所介導(dǎo)的醫(yī)學(xué)狀況的治療中的應(yīng)用。人IL-10是具有37kDa分子量的同源ニ聚體。每個(gè)單體均由160個(gè)氨基酸構(gòu)成并且分子量為18. 5kDa。IL-10 ニ聚體與IL-10受體a (IL-Ra或IL-10R1)相互作用并隨后將IL-10受體P (IL-IOR^或IL-10R2)募集至復(fù)合物中。受體在多種細(xì)胞特別是免疫細(xì)胞上表達(dá)(AsadulIah等,Pharmacol. Rev. 2003 Jun; 55 (2) :241-69)，包括大多數(shù)血源細(xì)胞，如單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞以及T淋巴細(xì)胞和B淋巴細(xì)胞，但也在非血源細(xì)胞上表達(dá)，例如表皮細(xì)胞或角質(zhì)細(xì)胞。IL-10對(duì)IL-10受體a的結(jié)合和IL-10受體P的募集導(dǎo)致經(jīng)由Jakl和Tyk2酪氨酸激酶的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)以及隨后的對(duì)STAT家族的轉(zhuǎn)錄因子的活化。IL-10的各種細(xì)胞來源是已知的，如T輔助細(xì)胞、調(diào)節(jié)T細(xì)胞、單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、B細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、月巴大細(xì)胞、角質(zhì)細(xì)胞、樹突細(xì)胞，甚至癌細(xì)胞。B細(xì)胞上的IL-10功能包括避免凋亡、提高増殖、類別轉(zhuǎn)換事件和分化為血漿細(xì)胞(Asadu 11 ah 等，Pharmaco I. Rev. 2003 Jun; 55 (2) :241-69)以及抑制炎癥。本發(fā)明提供了能夠結(jié)合白細(xì)胞介素-10 (IL-10)的人源化或嵌合的抗體或其片段，其中能夠?qū)⑺隹贵w或其片段施用于受試對(duì)象，而沒有促炎性細(xì)胞因子水平的無法耐受的增加的情況。具體而言，已知治療性抗體的施用能導(dǎo)致促炎性細(xì)胞因子水平的無法耐受的增カロ，從而在受試對(duì)象中引起副作用。具體而言，所述無法耐受的増加能導(dǎo)致皮膚變紅并引起發(fā)燒或流感樣癥狀，包括體溫升高。于是，在本發(fā)明的優(yōu)選方面，所述抗體或抗體片段是能夠施用于受試對(duì)象而沒有大于2°C的體溫増加的情況的抗體或抗體片段。此外，所述抗體或其片段不會(huì)導(dǎo)致施用后受試對(duì)象的血漿中促炎性細(xì)胞因子的量顯著增加。所述細(xì)胞因子的無法耐受的水平通常比細(xì)胞因子正常上限高(ULN)出數(shù)倍，其中ULN被定義為在受試對(duì)象群體中測(cè)定的細(xì)胞因子平均水平加上2X標(biāo)準(zhǔn)偏差。因此，在本發(fā)明的優(yōu)選方面，所述抗體或其片段能能夠施用于受試對(duì)象，而沒有促炎性細(xì)胞因子的增加大于正常上限(ULN)的500%、更優(yōu)選大于其300%的情況。換言之，所述抗體或其片段導(dǎo)致小于促炎性細(xì)胞因子ULN的500%、更優(yōu)選小于300%的該細(xì)胞因子水平的増加。優(yōu)選的是，所述促炎性細(xì)胞因子是TNF-a、IFN-Y、IL-I P中的至少ー種，優(yōu) 選為全部。作為另ー種選擇，所述促炎性細(xì)胞因子不是IL-6或IL-8。另外，特別優(yōu)選的是，本發(fā)明的抗體或其片段能在受試對(duì)象中誘導(dǎo)IL-I受體拮抗劑(IL-lra)，后者導(dǎo)致抗炎性響應(yīng)。在本發(fā)明的優(yōu)選方面，所述人源化抗體或其片段在與PBMC、更特別是免疫細(xì)胞在體外接觸時(shí)不會(huì)引起釋放自該細(xì)胞的促炎性細(xì)胞因子(尤其是TNF-a、IL_10、IL_6)水平的大于500%的增加。本發(fā)明人令人驚訝地發(fā)現(xiàn)，與鼠B-NlO抗體相比，本發(fā)明的人源化抗體或其片段在體外測(cè)試中引起促炎性細(xì)胞因子的水平的更小的増加。利用人全血培養(yǎng)物(例如下述實(shí)施例5中的那些研究)或分離的免疫細(xì)胞通過體外研究，可以確定促炎性細(xì)胞因子的釋放水平。具體而言，所述方法包括以下步驟(a)將細(xì)胞培養(yǎng)物與抗體或其片段溫育；和(b)確定至少ー種促炎性細(xì)胞因子的水平。人全血培養(yǎng)物可以取自健康人或患者，如罹患SLE的那些患者。外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)可以為免疫細(xì)胞，特別選自巨噬細(xì)胞、單核細(xì)胞、樹突細(xì)胞、T輔助細(xì)胞和B細(xì)胞。所述至少一種促炎性細(xì)胞因子可以分別選自白細(xì)胞介素13 (IL-1 @ )、IL-I a、IL-6或腫瘤壞死因子a (TNF-a)或T輔助細(xì)胞因子(干擾素Y、IFN-Y、IL-4)、巨噬細(xì)胞因子(IL-12)、趨化因子(IL-8、MCP-1)。所釋放的此類細(xì)胞因子的水平可以使用本領(lǐng)域公知的方法在細(xì)胞培養(yǎng)物上清液中測(cè)定。更具體而言，這種體外方法可以包括以下步驟a)使50 U g/ml所述抗體或片段與人全血培養(yǎng)物接觸；b)將所述抗體或片段與所述全血培養(yǎng)物在37°C溫育48小時(shí)；c)確定所述培養(yǎng)物中一種或多種促炎性細(xì)胞因子的量。特別地，同時(shí)用未與所述抗體接觸過的人全血培養(yǎng)物執(zhí)行該方法。優(yōu)選地，當(dāng)與該對(duì)照比較時(shí)，本發(fā)明的抗體或抗體片段導(dǎo)致小于500%的細(xì)胞因子水平増加、更優(yōu)選導(dǎo)致小于300%的細(xì)胞因子水平増加。優(yōu)選的是，該方法中的細(xì)胞因子不是IL-6或IL-8。可以采用Multiplex Bead免疫測(cè)試(在96孔過濾板中進(jìn)行的固相蛋白測(cè)試)來在培養(yǎng)物中檢測(cè)細(xì)胞因子。該方法依賴于珠的應(yīng)用，所述珠首先與針對(duì)特定細(xì)胞因子的特定抗體連接，其次展示出明確的光譜特性。這使得所述珠能被特異性鑒別，并因此將它們導(dǎo)向已知的連接抗體。借助于檢測(cè)抗體與所述細(xì)胞因子進(jìn)ー步結(jié)合，可以將與珠結(jié)合的細(xì)胞因子定量。這使得可以同時(shí)檢測(cè)多達(dá)10種人細(xì)胞因子，包括GM-CSF、IL-I P、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-8、IL-10、IFN- y和TNF- a。過濾板用于該目的，在過濾板的濕潤(rùn)孔中移注樣品、標(biāo)準(zhǔn)物和珠溶液。溫育后，用真空泵抽吸液體，將留下的珠洗滌，并添加生物素化檢測(cè)抗體的混合物。通過抽吸液體除去未結(jié)合的檢測(cè)抗體，并洗滌遺留在孔中的珠，然后添加鏈霉親和素綴合的R-藻紅蛋白(鏈霉親和素-RPE)。鏈霉親和素-RPE在溫育期間識(shí)別生物素化的檢測(cè)抗體，在再次洗滌后，可以通過Bio-Plex 200系統(tǒng)分析所形成的免疫復(fù)合物。免疫測(cè)試?yán)肂io-Plex 200裝置進(jìn)行分析。該裝置使用兩種激光體系，其首先基于珠的光譜特性來識(shí)別珠，然后通過使用ニ抗的檢測(cè)來確定結(jié)合的細(xì)胞因子的量。對(duì)結(jié)合量的定量借助采用已知量的細(xì)胞因子平行進(jìn)行的標(biāo)準(zhǔn)物運(yùn)行來實(shí)現(xiàn)。本發(fā)明還提供了能與白細(xì)胞介素IO(IL-IO)結(jié)合的人源化的或嵌合的抗體或其片段，其中所述抗體或其片段能夠在施用于受試對(duì)象時(shí)提高IL-IO的血漿水平。如下文實(shí)施例8所展示，可以施用本發(fā)明的抗體而沒有促炎性細(xì)胞因子水平的無法耐受的增加的情況，同時(shí)施用以劑量依賴性方式増加了血漿樣品中可檢測(cè)的IL-10的量。對(duì)于IL-10水平會(huì)在應(yīng)用中和抗體時(shí)增加的這ー發(fā)現(xiàn)是出人意料的。通常預(yù)期的是，施用細(xì)胞因子中和劑會(huì)降低游離細(xì)胞因子的水平(Strand等，Nature Reviews Drug Discovery, 2007,第6卷，第75_92頁)。雖然不希望受到理論束縛，但據(jù)信所述抗體對(duì)IL-10的結(jié)合阻止了 IL-10與IL-10受體結(jié)合并觸發(fā)了導(dǎo)致B細(xì)胞產(chǎn)生更多IL-10的負(fù)反饋環(huán)。盡管如此，這種上調(diào)不會(huì)阻止本發(fā)明的抗體的治療性功用，因?yàn)橐踩鐚?shí)施例8所展示，所述抗體在以足以中和所有IL-10的高水平施用時(shí)仍是安全的。在本申請(qǐng)中，術(shù)語“嵌合抗體”是指這樣的抗體其中重鏈和/或輕鏈的一部分與源自特定物種或?qū)儆谔囟贵w類別或子類別的抗體中的序列相同，同時(shí)該抗體的其余部分與源自另一物種、抗體類別或子類別的抗體中的序列相同。特別優(yōu)選的是，嵌合抗體的CDR具有ー個(gè)來源，而該抗體的其余部分具有不同的來源。特別地，在本發(fā)明中，嵌合抗體可以為其中已將非人類抗體的抗原結(jié)合序列/可變域移植到人類抗體框架區(qū)的人源化抗體。在本申請(qǐng)中，術(shù)語“片段”是指仍然保留所需生物活性的抗體的片段或衍生物。所述片段通常包含抗體的抗原結(jié)合區(qū)，且特別地包含F(xiàn)ab、Fab'、F(ab) ' 2、Fv和scFv片段，以及多價(jià)抗體衍生物、特別是雙價(jià)抗體(diabody)或串聯(lián)雙價(jià)抗體。所述片段優(yōu)選為至少25個(gè)、更優(yōu)選50個(gè)且進(jìn)而更優(yōu)選200 500個(gè)氨基酸。作為另ー種選擇，所述片段可以被限定為具有30KDa 150kDa的尺寸的那些片段。此外，抗體片段可以涉及兩個(gè)或多個(gè)肽/多肽鏈。例如，包含長(zhǎng)度各自為200 300個(gè)氨基酸的兩條鏈的Fab片段，或包含長(zhǎng)度各自為400 500個(gè)氨基酸的兩條鏈的TandAbs (四價(jià)雙特異性抗體形式)。本發(fā)明的ー個(gè)優(yōu)選特征在于，所述抗體或其片段源自鼠B-NlO抗體或本文所述的人源化BT-063 (變體hVH26/hVL7)抗體。特別地，此類抗體或其片段包含與B-N10/BT-063可變輕鏈的CDR1、CDR2和CDR3的同一性為至少80%的CDR，和/或包含與B-N10/BT-063可變重鏈的⑶RU⑶R2和⑶R3的同一性為至少80%的氨基酸序列。鼠⑶R的氨基酸序列如圖I所示。BT-063 CDR的氨基酸序列如實(shí)施例6所示。更優(yōu)選的是，所述序列與B-NlO/BT-063抗體的⑶R的同一性為至少90%或至少95%。本文實(shí)施例6中所述的X射線晶體學(xué)研究表明了⑶R內(nèi)的哪些殘基對(duì)于與IL-10的結(jié)合是重要的。作為另ー種選擇，本發(fā)明的抗體或片段仍然源自B-N10/BT-063抗體，并且可以包含B-N10/BT-063可變輕鏈的CDRl、CDR2和CDR3的氨基酸序列和/或B-N10/BT-063可變重鏈的⑶R1XDR2和⑶R3的氨基酸序列，且在這些序列中可選地具有不會(huì)顯著改變所述抗體或其片段的親和カ和/或特異性的變異。特別地，與包含鼠B-NlO抗體或BT-063 (變體hVH26/hVL7)抗體的CDR的抗體或片段的親和カ或特異性相比，序列中的所述變異不會(huì)降低所述抗體或片段對(duì)IL-10的親和カ或特異性。在具體實(shí)施方式
中，本發(fā)明提供了包含B-N10/BT-063可變輕鏈和/或重鏈的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列的人源化或嵌合的抗體或其片段。更優(yōu)選地，本發(fā)明提供了人源化或嵌合的抗體或其片段，所述抗體或其片段包含鼠抗體B-NlO的可變域的氨基酸序列，如圖I所示。最優(yōu)選地，所述抗體或片段包含BT-063的可變域的氨基酸序列(SEQ IDNo:69和SEQ ID No:70)中的ー個(gè)或兩個(gè)。通常，本發(fā)明的抗體還包含人恒定區(qū)(Fe)。這可以選自來自任何類型的免疫球蛋白(包括IgM、IgG、IgD、IgA和IgE以及包括IgGl、IgG2、IgG3和IgG4在內(nèi)的任何同種型)的恒定區(qū)。優(yōu)選的恒定區(qū)選自IgG、特別是IgGl的恒定區(qū)。
其它產(chǎn)物本發(fā)明還提供了編碼上述抗體或抗體片段的核酸序列。所述核酸序列可以為DNA或RNA，但優(yōu)選DNA。所述序列可以用在表達(dá)盒或載體中，且特別可用于制備本文所公開的抗體及其片段。本發(fā)明還提供了用這些多核苷酸、表達(dá)盒或載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞。合適的宿主細(xì)胞可以為原核細(xì)胞和真核細(xì)胞。作為另ー種選擇，所述宿主細(xì)胞可以為通過將產(chǎn)生本發(fā)明的抗體的細(xì)胞與骨髄瘤細(xì)胞融合而獲得的雜交瘤。上述宿主細(xì)胞可以用于制備抗體或其片段的方法中。特別地，此類方法可以包括在允許抗體或其片段表達(dá)的條件下在合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng)宿主細(xì)胞并從所述培養(yǎng)基中分離所述抗體或片段的步驟。這類型的方法在本領(lǐng)域中公知且有所描述。醫(yī)學(xué)用途本文所述的抗體及其片段可應(yīng)用于治療由IL-10水平或活性升高所介導(dǎo)的疾病或醫(yī)學(xué)狀況。結(jié)果，本發(fā)明提供了一種治療或預(yù)防受試對(duì)象中的醫(yī)學(xué)狀況的方法，其中所述醫(yī)學(xué)狀況由IL-10水平或活性升高所介導(dǎo)，所述方法包括施用治療有效量的本文所述的抗體或其片段。特別地，由IL-10水平或活性升高所介導(dǎo)的所述醫(yī)學(xué)狀況是SLE。因此，本發(fā)明還提供了用于SLE的治療的本文所述的抗體或其片段。其它實(shí)例為血小板減少性紫癜、狼瘡腎炎、HIV、hCMV和丙型肝炎。另ー個(gè)實(shí)例是通過直接支持增殖或抑制免疫響應(yīng)而對(duì)依賴于IL-10的腫瘤細(xì)胞的治療。本發(fā)明的另ー個(gè)實(shí)施方式是包含上文所述的抗體或其片段以及藥物可接受載劑或稀釋劑的藥物組合物。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述組合物包含偶聯(lián)有抗體或其片段的脂質(zhì)體。此類組合物可以通過胃腸外、靜脈內(nèi)或皮下對(duì)患者施用。優(yōu)選地，在SLE治療中，抗體或其片段通過靜脈內(nèi)或皮下施用。所述抗體或其片段特別可用于治療疾病，其原因在于，由于其不會(huì)導(dǎo)致促炎性細(xì)胞因子水平的顯著增加，它們無需共施用皮質(zhì)激素以避免對(duì)于患者將無法耐受的“細(xì)胞因子風(fēng)暴(cytokine storm) ”。因此，在ー個(gè)特定方面，本發(fā)明提供了用于治療或預(yù)防受試對(duì)象中的醫(yī)學(xué)狀況的方法，其中所述醫(yī)學(xué)狀況由IL-10的水平或活性升高所介導(dǎo)，所述方法包括對(duì)所述受試對(duì)象施用治療有效量的本文所述的抗體或其片段，其中所述受試對(duì)象未同時(shí)或另行接受皮質(zhì)激素治療，即所述患者是沒有在同時(shí)接受皮質(zhì)激素治療的患者。在該優(yōu)選方面的實(shí)施方式中，由IL-10水平或活性升高所介導(dǎo)的醫(yī)學(xué)狀況是SLE。皮質(zhì)激素目前在許多患者中被用來治療SLE。然而，本發(fā)明的該方面在其中施用皮質(zhì)激素不再理想的患者的治療中具有特殊功用。非醫(yī)學(xué)用途本發(fā)明還提供了經(jīng)標(biāo)記的人源化的或嵌合的抗體或其片段，其包含本文所述的抗體或其片段和標(biāo)簽。所述標(biāo)簽可以為本領(lǐng)域內(nèi)已知的用于檢測(cè)樣品中抗體的存在的任何合適類型的標(biāo)簽。特別地，所述標(biāo)簽為熒光標(biāo)簽。 標(biāo)記的或未經(jīng)標(biāo)記的抗體、特別是經(jīng)標(biāo)記的抗體在檢測(cè)樣品中是否存在抗體的體外方法中具有特定功用。所述方法可以包括以下步驟使未經(jīng)標(biāo)記的或經(jīng)標(biāo)記的抗體或其片段與樣品接觸，洗滌樣品以除去未與樣品結(jié)合的抗體及其片段(即未結(jié)合的抗體或抗體片段)，和檢測(cè)樣品中是否存在所述抗體(或片段)(例如經(jīng)由所述標(biāo)簽進(jìn)行檢測(cè))。作為另ー種選擇，未經(jīng)標(biāo)記的抗體或片段可以在中和樣品中IL-10的體外方法中使用。此類方法包括使樣品與抗體或其片段接觸以使所述抗體或其片段與IL-10結(jié)合的步驟?，F(xiàn)在將結(jié)合以下具體實(shí)施方式
對(duì)本發(fā)明進(jìn)行描述。實(shí)施例實(shí)施例I.鼠抗IL-10抗體B-NlO的表征I. I編碼B-NlO可變抗體域的DNA的分離為鑒定鼠BN-10的可變序列，使用了細(xì)胞沉淀。將樣品(3XB-N10，傳代3，IX IO7個(gè)細(xì)胞)儲(chǔ)存在_80°C，直至將mRNA從細(xì)胞中分離，并且在cDNA合成后，通過PCR擴(kuò)增B-NlO的可變序列，然后進(jìn)行克隆。對(duì)于可變輕鏈和可變重鏈，對(duì)總共14個(gè)克隆體進(jìn)行測(cè)序(SEQLaboratories, Gottingen )和分析。明確確定了 B-N10的可變序列。偏差僅出現(xiàn)在N端引物區(qū)中(見表I)。在可變重鏈的情形中，序列變體QVQLKQ (SEQ ID No: 59)在引物區(qū)出現(xiàn)9次，但其它變異僅出現(xiàn)一次或兩次。選擇該變體用于進(jìn)行亞克隆。在可變輕鏈的情形中，兩種變體以相等比例存在。在所述序列與鼠種系序列進(jìn)行比較后，僅具有3個(gè)突變的crl序列展示出與所鑒定的VL序列很大的同源性。這意味著DVLMTQ(SEQ ID No:60)序列最有可能是正確的序列。序列DIVMTQ(SEQ ID No:61)是典型的另ー類種系序列并因此被排除。表I.經(jīng)測(cè)序的B-N10可變輕鏈和重鏈的N端序列變體的出現(xiàn)(所選序列以粗體表示)
權(quán)利要求
1.一種人源化的或嵌合的抗體或其片段，所述抗體或其片段能夠結(jié)合白細(xì)胞介素-10 (IL-IO)，其中能夠?qū)⑺隹贵w或其片段施用于受試對(duì)象，而沒有促炎性細(xì)胞因子水平的無法耐受的增加的情況。
2.如權(quán)利要求I所述的人源化的或嵌合的抗體或其片段，其中，所述抗體或其片段能夠施用于受試對(duì)象，而沒有大于2°C的體溫増加的情況。
3.如權(quán)利要求I或權(quán)利要求2所述的人源化的或嵌合的抗體或其片段，其中，所述抗體或其片段能夠施用于受試對(duì)象，而沒有促炎性細(xì)胞因子増加大于正常上限(ULN)的500%的情況，其中所述促炎性細(xì)胞因子選自TNF- a、IFN- y、IL-I ^。
4.如權(quán)利要求3所述的人源化的或嵌合的抗體或其片段，其中，所述抗體或其片段能夠施用于受試對(duì)象，而沒有促炎性細(xì)胞因子増加大于正常上限(ULN)的300%的情況。
5.如前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的人源化的或嵌合的抗體或其片段，所述抗體或其片段能夠在所述受試對(duì)象中誘導(dǎo)IL-I受體拮抗劑(IL-Ira)。
6.如權(quán)利要求I所述的人源化的或嵌合的抗體或其片段，其中，所述抗體在與外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)在體外接觸時(shí)不會(huì)引起釋放自所述細(xì)胞的促炎性細(xì)胞因子水平的大于500%的增加。
7.如前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的人源化的或嵌合的抗體或其片段，其中，所述促炎性細(xì)胞因子是TNF-a、IFN-Y、IL-I ^中的至少ー種。
8.如權(quán)利要求I 7中任一項(xiàng)所述的人源化的或嵌合的抗體或其片段，其中，所述抗體或其片段源自鼠B-NlO抗體。
9.如前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的人源化的或嵌合的抗體或其片段，其中，所述抗體或其片段包含與鼠抗體B-NlO可變輕鏈的⑶R1、⑶R2和⑶R3的氨基酸序列具有至少80%同一性的氨基酸序列，和/或包含與鼠抗體B-NlO可變重鏈的⑶R1XDR2和⑶R3的氨基酸序列具有至少80%同一性的氨基酸序列。
10.如權(quán)利要求9所述的人源化的或嵌合的抗體或其片段，其中，所述抗體或其片段包含鼠抗體B-NlO可變輕鏈和可變重鏈的⑶R1、⑶R2和⑶R3的氨基酸序列。
11.如權(quán)利要求I 7中任一項(xiàng)所述的人源化的或嵌合的抗體或其片段，其中，所述抗體或其片段包含鼠抗體B-NlO可變輕鏈的CDRl、CDR2和CDR3的氨基酸序列和/或鼠抗體B-NlO可變重鏈的⑶R1XDR2和⑶R3的氨基酸序列，并且在這些序列中可選地具有基本上不會(huì)改變所述人源化抗體或其片段的親和カ和/或特異性的變異。
12.如前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的人源化的或嵌合的抗體或其片段，其中，所述抗體或其片段包含鼠抗體B-NlO可變輕鏈的氨基酸序列和/或鼠抗體B-NlO可變重鏈的氨基酸序列。
13.ー種核酸，所述核酸編碼權(quán)利要求I 12中任一項(xiàng)所述的抗體或其片段。
14.ー種載體，所述載體包含權(quán)利要求13所述的核酸。
15.—種宿主細(xì)胞，所述宿主細(xì)胞包含權(quán)利要求13所述的核酸或權(quán)利要求14所述的載體。
16.ー種制備權(quán)利要求I 12中任一項(xiàng)所述的抗體或其片段的方法，所述方法包括以下步驟在允許所述抗體或其片段表達(dá)的條件下在培養(yǎng)基中培養(yǎng)權(quán)利要求15所述的宿主細(xì)胞，和從所述培養(yǎng)基中分離所述抗體或其片段。
17.ー種藥物組合物，所述藥物組合物包含權(quán)利要求I 12中任一項(xiàng)所述的抗體或其片段，并且還包含藥物可接受載劑。
18.一種治療或預(yù)防受試對(duì)象中的醫(yī)學(xué)狀況的方法，其中，所述醫(yī)學(xué)狀況由IL-IO的水平或活性升高而介導(dǎo)，所述方法包括對(duì)所述受試對(duì)象施用治療有效量的權(quán)利要求I 12中任一項(xiàng)所述的抗體或其片段。
19.一種治療或預(yù)防受試對(duì)象中的醫(yī)學(xué)狀況的方法，其中，所述醫(yī)學(xué)狀況由IL-10的水平或活性升高而介導(dǎo)，所述方法包括對(duì)所述受試對(duì)象施用治療有效量的權(quán)利要求I 12中任一項(xiàng)所述的抗體或其片段，其中所述受試對(duì)象未同時(shí)或另行接受皮質(zhì)激素治療。
20.如權(quán)利要求18或權(quán)利要求19所述的治療或預(yù)防受試對(duì)象中的醫(yī)學(xué)狀況的方法，其中，所述醫(yī)學(xué)狀況是系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)。
21.用于醫(yī)學(xué)應(yīng)用的權(quán)利要求I 12中任一項(xiàng)所述的抗體或其片段。
22.用于治療患者的SLE應(yīng)用的權(quán)利要求I 12中任一項(xiàng)所述的抗體或其片段。
23.如權(quán)利要求22所述的應(yīng)用的抗體或其片段，其中，所述患者未同時(shí)或另行接受皮質(zhì)激素治療。
24.權(quán)利要求I 12中任一項(xiàng)所述的抗體或其片段在制備用于治療患者的SLE的藥物中的應(yīng)用。
25.如權(quán)利要求24所述的應(yīng)用，其中，所述患者未同時(shí)或另行接受皮質(zhì)激素治療。
26.—種經(jīng)標(biāo)記的抗體或其片段，其包含權(quán)利要求I 12中任一項(xiàng)所述的抗體或其片段以及標(biāo)簽。
27.—種中和樣品中的IL-10的體外方法，所述方法包括下述步驟使所述樣品與權(quán)利要求I 12中任一項(xiàng)所述的抗體或其片段接觸，以便將所述抗體或其片段與IL-10結(jié)合。
28.一種用于檢測(cè)樣品中是否存在IL-10的體外方法，所述方法包括以下步驟使權(quán)利要求I 12中任一項(xiàng)或權(quán)利要求26所述的未經(jīng)標(biāo)記的或經(jīng)標(biāo)記的抗體或其片段與所述樣品接觸，洗滌以除去未與所述樣品結(jié)合的抗體或抗體片段，和檢測(cè)所述樣品中是否存在所述抗體或其片段或者所述標(biāo)簽。
全文摘要
本發(fā)明提供了能夠結(jié)合白細(xì)胞介素-10(IL-10)的人源化或嵌合的抗體或其片段，其中能夠?qū)⑺隹贵w或其片段施用于受試對(duì)象，而沒有促炎性細(xì)胞因子水平的無法耐受的增加的情況。此外，本發(fā)明提供了涉及應(yīng)用所述抗體或其片段的治療方法。
文檔編號(hào)A61K39/395GK102811736SQ201080062098
公開日2012年12月5日 申請(qǐng)日期2010年11月30日 優(yōu)先權(quán)日2009年11月30日
發(fā)明者弗蘭克·奧斯特羅斯, 克里斯托夫·尤爾克, 克里斯托夫·布魯切爾, P·羅特根, 本杰明·德爾肯, A·英格利恩, 尚塔爾·祖伯, 尼古拉斯·蔡洛特, 安德里亞·瓦滕貝格-德曼特, M·古特斯切爾, J·維賽斯-卡安茨 申請(qǐng)人:生物測(cè)試股份公司