專利名稱：含6-羥基犬尿喹啉酸的銀杏葉提取物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及天然植物提取物，具體涉及銀杏葉(Ginkgo bilobaL.)的有效成分的 提取物，尤其涉及一種含6-羥基犬尿喹啉酸6-hydroxykynurenic acid(6-HKA)的新一代 銀杏葉提取物。
背景技術(shù)：
從銀杏葉提取物研發(fā)改善血液循環(huán)的藥物，至今已有40多年，從上世紀(jì)90年代 起，中國對銀杏葉提取物進(jìn)行了研究，發(fā)展了它的應(yīng)用范圍，并為心血管疾病患者提供了能 夠明顯改善心臟冠狀動脈血液流量的藥物，極大地緩解了冠心病心絞痛病人的痛苦，同時 改善了生活質(zhì)量。銀杏葉提取物已廣泛應(yīng)用于藥品和保健品。隨著對銀杏葉研究的深入，在銀杏葉中發(fā)現(xiàn)了新的有效成分，如6-羥基犬尿喹啉 酸(6-HKA)，有文獻(xiàn)報道它是一種N-甲基門冬氨酸(NMDA)拮抗劑(陳仲良，殷夢龍等，世界 藥品信息，2-2001)屬于神經(jīng)免疫方面的有效成分，有緩解腦內(nèi)缺氧的功能，其與銀杏葉中 另一有效成分白果內(nèi)酯的協(xié)同作用，可望成為預(yù)防腦內(nèi)營養(yǎng)不良，防止腦神經(jīng)凋亡等神經(jīng) 免疫性疾患，并有用于治療和改善早老性癡呆等神經(jīng)損傷患者的認(rèn)知缺陷的可能。經(jīng)過調(diào)研后發(fā)現(xiàn)，至今，國內(nèi)外的銀杏葉提取物的有效成分質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)僅針銀杏黃 酮苷和銀杏內(nèi)酯設(shè)定含量指標(biāo)，6-HKA還未被應(yīng)用于銀杏葉提取物的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中?，F(xiàn)有的銀杏葉提取方法是經(jīng)水、乙醇或者丙酮作提取劑，繼而采用水或乙醇沉淀、 PH調(diào)節(jié)結(jié)合大孔樹脂層析或者乙酸乙酯、2-丁酮、3-戊酮萃取并精制獲得的。一般需要經(jīng) 過8-10步以上的技術(shù)工序才能得以完成。這樣的制備過程，所獲得的銀杏葉提取物中基本 流失了 6-HKA成分。由于6-HKA是同時含酸性和堿性鹽基性團(tuán)的有機(jī)化合物，分子中的陰 陽離子成鹽性質(zhì)決定了它的水溶性質(zhì)，根據(jù)其類似氨基酸的性質(zhì)推測，其只有在被充分游 離后才有可能以最高效率被獲??；又因6-HKA是一種有機(jī)成分，所以它在某些有機(jī)溶劑中 應(yīng)該具有很好的溶解度；再者就是6-HKA分子結(jié)構(gòu)中的4位羥基在某些條件會轉(zhuǎn)變成為4 位羰基從而影響到對6-HKA的富集。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題在于克服上述不足之處，提供新的含有6-羥基犬尿 喹啉酸(6-HKA)的銀杏葉提取物。同時公開一種有利于節(jié)能環(huán)保、安全高效和簡單經(jīng)濟(jì)的 含6-羥基犬尿喹啉酸(6-HKA)的銀杏葉提取物制備方法。本發(fā)明提供了一種含6-羥基犬尿喹啉酸的銀杏葉提取物。6-羥基犬尿喹啉酸 (6-HKA)是一種既含酸性官能團(tuán)又含堿性官能團(tuán)的鹽基性有機(jī)化合物(陳仲良，殷夢龍.銀 杏葉中抗老年癡呆的活性成分.世界藥品信，2001,2(1))，經(jīng)HPLC分析本發(fā)明提供的銀杏 葉提取物中6-HKA的含量在3% 4. 5%。6-羥基犬尿喹啉酸(6-HKA)的結(jié)構(gòu)式如下
本發(fā)明為獲取6-HKA，并使制備銀杏提取物的過程達(dá)到環(huán)保節(jié)能、安全高效、簡單 經(jīng)濟(jì)的目的。采用了反常規(guī)的制備路線設(shè)計，創(chuàng)造性地將用于萃取的溶劑直接用作提取。本發(fā)明的另一目的是提供了上述含6-羥基犬尿喹啉酸(6-HKA)的銀杏葉提取物 的制備方法，該方法包括下列步驟(1)銀杏葉粉碎，用混合溶劑提取；(2)提取液濃縮成浸膏(濃縮的浸膏含水分10 15% )；(3)將浸膏用水加熱捏溶，冷卻捏溶物料；(4)冷卻的捏溶物料澄清處理得到澄清液；(5)澄清液濃縮；(6)濃縮液干燥得到含6-羥基犬尿喹啉酸的銀杏葉提取物。所述步驟(1)提取所用的銀杏葉原料可以市售得到，優(yōu)選GAP基地種植并烘干的 銀杏葉，其中銀杏黃酮含量在0. 8 1. 2%;提取用的混合溶劑用量為銀杏葉重量的8 12 倍 kg/kg，優(yōu)選 10 倍 kg/kg。所述混合溶劑由溶劑a)、溶劑b)和溶劑C)組成，其中溶劑a)可以是乙酸乙酯、 2-丁酮或3-戊酮，優(yōu)選乙酸乙酯；溶劑b)可以是甲醇、乙醇、丙醇或異丙醇，優(yōu)選乙醇；溶 劑c)可以是pH 6. O的磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉緩沖液、磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液或檸 檬酸-檸檬酸鈉緩沖液，優(yōu)選磷酸鹽緩沖液。所述混合溶劑a)、b)和c)各溶劑的用量為銀 杏葉重量的倍數(shù)依次為a) 7 11倍kg/kg，優(yōu)選9倍kg/kg、b) 0. 5 1. 5倍kg/kg，優(yōu)選 0. 5倍kg/kg ；c)0. 5 1. 5倍kg/kg，優(yōu)選0. 5倍kg/kg ；提取方法可以是靜態(tài)回流、攪拌動 態(tài)回流或者超聲波熱提取，優(yōu)選超聲波熱提?。惶崛? 3次，優(yōu)選提取2次；提取時間每 次1 2小時，優(yōu)選提取2小時；使用超聲波熱提取的溫度35 50°C，優(yōu)選35°C，提取時間 20 40分鐘，優(yōu)選35分鐘。所述步驟( 濃縮方式可以是常壓濃縮、真空濃縮、優(yōu)選真空濃縮；真空濃縮溫度 控制在35 60°C，優(yōu)選50°C ；真空度為0. 09 0. 095MPa，優(yōu)選0. 095MPa。蒸餾到無溶劑 味止，得到浸膏的水分含量在10 15%。所述步驟C3)加熱捏溶的用水量是浸膏重量8 20倍量kg/kg，優(yōu)選20倍量kg/ kg;所述水選自去離子水、反滲透純水或蒸餾水，優(yōu)選用反滲透純水；捏溶是在60 100°C 加熱下攪拌捏溶，加熱溫度優(yōu)選85°C;捏溶操作0. 5 1小時，優(yōu)選40分鐘；將捏溶所得的 料液用冰箱冷卻或者冷卻槽冷卻，優(yōu)選冷卻槽冷卻；將料液冷卻降溫到4 10°C，優(yōu)選降溫 到4°C ；保持2-8小時，優(yōu)選4小時。所述步驟(4)冷卻液過濾澄清選擇采用離心沉降結(jié)合布氏漏斗吸濾或者微孔膜 過濾，優(yōu)選離心機(jī)結(jié)合微孔濾膜；所述微孔濾膜的孔徑為10 2微米，優(yōu)選2微米。
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所述步驟( 澄清液濃縮選用真空濃縮或反滲透濃縮結(jié)合真空濃縮，優(yōu)選反滲透 結(jié)合真空濃縮；所述反滲透濃縮溫度為32 38°C，壓力為9 llMPa，優(yōu)選為35°C，壓力 9MPa，真空濃縮溫度為35 60°C，優(yōu)選50°C ；真空度為0. 09 0. 095MPa，優(yōu)選0. 095MPa ； 濃縮至無液體蒸出為止。所述步驟(6)濃縮液干燥方法為將濃縮液取出進(jìn)行冷凍干燥或濃縮液在原位繼 續(xù)進(jìn)一步加熱真空干燥，優(yōu)選加熱真空干燥；所述加熱真空干燥溫度為85 90°C干燥采用 真空干燥或冷凍干燥，優(yōu)選真空干燥；所述加熱真空干燥溫度為85 90°C，優(yōu)選85°C，保持 真空度為0. 09 0. 095MPa，優(yōu)選0. 095MPa ；干燥時間控制在3 4小時，優(yōu)選4小時。本發(fā)明方法得到的銀杏葉提取物經(jīng)HPLC檢測，含有6-羥基犬尿喹啉酸(6-HKA) 的含量為3% 4. 5%。本發(fā)明為進(jìn)一步開發(fā)銀杏葉的新用途提供基礎(chǔ)，有較大的應(yīng)用價值。


圖1實(shí)施例1銀杏葉提取物的HPLC分析圖2實(shí)施例2銀杏葉提取物的HPLC分析圖3實(shí)施例3銀杏葉提取物的HPLC分析
具體實(shí)施例方式以下實(shí)施例使用的銀杏葉從中藥材市場購得。實(shí)施例1取銀杏黃酮含量0. 8%的粉碎銀杏葉0. ^g，置入不銹鋼桶中，加入4. 5kg新重蒸 的乙酸乙酯，0. 25kg藥用無水乙醇和pH = 6. 0的磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉緩沖液(0. 2mol/ L)0.25kg。加熱到35°C，置于超聲波清洗器中，開啟超聲電源恒溫提取35分鐘。用布氏漏 斗吸濾獲得第一次提取液，重復(fù)第一次操作后獲得第二次提取液。合并提取液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā) 儀真空濃縮，條件分別為50°C和0. 095MPa,得到浸膏90g。趁熱在浸膏瓶中加入ISOOg反滲 透純水，加熱并攪拌，待物料溫度達(dá)85°C起計時，保持溫度并攪拌30分鐘后，停止加熱改為 料液原位置于冰浴中降溫冷卻并伴隨攪拌。待物料降溫到4°C時停止攪拌和降溫，物料在 4°C水浴中靜置6小時。傾出冷卻靜置物料，用臺式離心機(jī)離心以8000轉(zhuǎn)/分鐘離心12分 鐘。收集料液，沉淀做三廢處理。所得料液用布氏漏斗加濾紙真空過濾。濾液用小型反滲 透設(shè)備R0(NF)-4050/4100/4010型濃縮(35°C，9MPa)至白利度(Brix)IO時將料液轉(zhuǎn)移 至旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮(50°C，0.095MPa)濃縮至無液體蒸出，然后在原位將物料加熱到80°C， 并將真空度保持在0. 95MPa持續(xù)4小時得含6-HKA的銀杏葉提取物固體Sg。提取物經(jīng)HPLC分析6-HKA含量為4. 30 %。緩沖液配比0.2mol/L 的 Na2HPO412. 3ml 與 0. 2mol/L 的 NaH2P0487. 7ml。 Na2HPO4 · 2H20 分子量=178. 05 ；0. 2mol/L 溶液為 35. 61g/L。Na2HPO4 · 12H20 分子量= 358. 22 ；0. 2mol/L 溶液為 71. 64g/L。NaH2P04 · H2O 分子量=138. 01 ；0. 2mol/L 溶液為 27. 6g/L。NaH2PO4 · 2H20 分子量=156. 03 ；0. 2mol/L 溶液為 31. 21g/L。實(shí)施例2取銀杏黃酮含量0. 8%的粉碎銀杏葉0. 5kg,置入不銹鋼桶中，加入4. 5kg新重蒸的2- 丁酮，0. 25kg藥用異丙醇和pH = 6. 0的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液(0. 2mol/ L)0.25kg。加熱到35°C，置于超聲波清洗器中，開啟超聲電源恒溫提取35分鐘。用布氏漏 斗吸濾獲得第一次提取液，重復(fù)第一次操作后獲得第二次提取液。合并提取液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā) 儀真空濃縮(50°C和0. 095Mpa)，得到浸膏78g。趁熱在浸膏瓶中加入ISOOg反滲透純水，加 熱并攪拌，待物料溫度達(dá)85°C起計時，保持溫度并攪拌30分鐘后，停止加熱改為料液原位 置于冰浴中降溫冷卻并伴隨攪拌。待物料降溫到4°C時停止攪拌和降溫，物料靜置6小時。 傾出冷卻靜置物料，用臺式離心機(jī)離心以8000轉(zhuǎn)/分鐘離心12分鐘。處理所得料液用布氏 漏斗加濾紙吸濾。濾液用小型反滲透設(shè)備R0(NF)-4050/4100/4010型濃縮(35°C，9MPa) 至白利度(Brix)9時將料液轉(zhuǎn)移至旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮(50°C，0.095MPa)濃縮至無液體蒸出， 然后在原位真空度干燥(80°C，0. 95MPa，4小時)得到含6-HKA的銀杏葉提取物固體7. 6g。提取物經(jīng)HPLC分析6-HKA含量為4. 50 %。緩沖液配比0.2mol/L 的 Na2HPO412. 63ml 與 0. lmol/L 的檸檬酸 7. 37ml。Na2HPO4 分子量=141. 98 ；0. 2mol/L 溶液為 28. 40g/L。Na2HPO4 · 2H20 分子量=178. 05 ；0. 2mol/L 溶液為 35. 61g/L。Na2HPO4 · Iffl2O 分子量=358. 22 ；0. 2mol/L 溶液為 71. 64g/L。檸檬酸 C6H8O7 · H2O 分子量=210. 14 ；0. lmol/L 溶液為 21. 01g/L。實(shí)施例3取銀杏黃酮含量0. 8%的粉碎銀杏葉0. ^g，置入不銹鋼桶中，加入4. 5kg新重蒸 的3-戊酮，0. 25kg藥用丙醇和pH = 6. 0的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液(0. 2mol/L)0. 25kg。 加熱到50°C，置于超聲波清洗器中，開啟超聲電源恒溫提取35分鐘。用布氏漏斗吸濾獲得 第一次提取液，重復(fù)第一次操作后獲得第二次提取液。合并提取液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀真空濃縮， 濃縮(60°C和0. 095Mpa)，得到浸膏71g。趁熱在浸膏瓶中加入ISOOg反滲透純水，加熱并攪 拌，待物料溫度達(dá)85°C起計時，保持溫度并攪拌30分鐘后，停止加熱改為料液原位置于冰 浴中降溫冷卻并伴隨攪拌。待物料降溫到4°C時停止攪拌和降溫，物料靜置6小時。傾出冷 卻靜置物料，用臺式離心機(jī)離心以8000轉(zhuǎn)/分鐘離心12分鐘。處理所得料液用布氏漏斗 加濾紙吸濾。濾液全部用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮(60°C，0.095MPa)并原位干燥(80°C，0. 95MPa，4 小時)得到含6-HKA的銀杏葉提取物固體7. 3g。 提取物經(jīng)HPLC分析6-HKA含量為4. 20 %。緩沖液配比0. lmol/L檸檬酸3.8ml與0. lmol/L檸檬酸鈉16. 2ml。檸檬酸 C6H8O7 · H2O 分子量=210. 14 ；0. lmol/L 溶液為 21. 01g/L。檸檬酸鈉=Na3C6H5O7 · 2H20 分子 量=294. 12 ；0. lmol/L 溶液為 29. 41g/L。
權(quán)利要求
1.一種含6-羥基犬尿喹啉酸的銀杏葉提取物，其特征在于，所述銀杏葉提取物中6-羥 基犬尿喹啉酸的含量為3^-4.5 ^
2.一種如權(quán)利要求1所述含6-羥基犬尿喹啉酸的銀杏葉提取物制備方法，其特征在于 該方法包括下列步驟(1)銀杏葉粉碎，用混合溶劑提??；(2)提取液濃縮成浸膏；(3)浸膏用水加熱捏溶，冷卻捏溶物料；(4)冷卻的捏溶物料澄清處理得到澄清液；(5)澄清液濃縮；(6)濃縮液干燥得到含6-羥基犬尿喹啉酸的銀杏葉提取物。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述方法，其特征在于，步驟(1)提取所用的銀杏葉為銀杏黃酮含量 在0. 8 1. 2%的銀杏葉；提取用的混合溶劑用量為銀杏葉重量的8 12倍kg/kg，優(yōu)選10 倍kg/kg ；所述混合溶劑由溶劑a)、溶劑b)和溶劑c)組成，其中溶劑a)為乙酸乙酯、2- 丁 酮或3-戊酮，優(yōu)選乙酸乙酯；溶劑b)為甲醇、乙醇、丙醇或異丙醇，優(yōu)選乙醇；溶劑c) SpH 6. 0的磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉緩沖液、磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液或檸檬酸-檸檬酸鈉緩 沖液，優(yōu)選磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉緩沖液；提取方法為靜態(tài)回流、攪拌動態(tài)回流或超聲波 熱提取，優(yōu)選超聲波熱提?。惶崛? 3次，優(yōu)選提取2次；提取時間每次1 2小時，優(yōu)選 提取2小時；使用超聲波熱提取的溫度35 50°C，優(yōu)選35°C，提取時間20 40分鐘，優(yōu)選 35分鐘。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述方法，其特征在于，步驟(1)所述混合溶劑a)、b)和c)中各溶 劑的用量為銀杏葉重量的倍數(shù)依次為a) 7 11倍kg/kg，優(yōu)選9倍kg/kg、b) 0. 5 1. 5倍 kg/kg,優(yōu)選 0. 5 倍 kg/kg、c) 0. 5 1. 5 倍 kg/kg，優(yōu)選 0. 5 倍 kg/kg。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述方法，其特征在于，步驟( 濃縮方式為常壓濃縮或真空濃縮， 優(yōu)選真空濃縮，真空濃縮溫度控制在35°C 60°C，優(yōu)選50°C，真空度為0. 09 0. 095MPa, 優(yōu)選0. 095MPa，濃縮得到浸膏，其中水分含量在10 15%。
6.根據(jù)權(quán)利要求2所述方法，其特征在于，步驟C3)用水加熱捏溶的加水量是浸膏重量 8 20倍量kg/kg，優(yōu)選20倍量kg/kg ；所述水選自去離子水、反滲透純水或蒸餾水，優(yōu)選用 反滲透純水；捏溶是在60 100°C加熱下攪拌捏溶，加熱溫度優(yōu)選85°C;捏溶操作0. 5 1 小時，優(yōu)選40分鐘；將捏溶所得的料液用冰箱冷卻或者冷卻槽冷卻，優(yōu)選冷卻槽冷卻；將料 液冷卻降溫到4 10°C，優(yōu)選降溫到4°C ；保持2-8小時，優(yōu)選4小時。
7.根據(jù)權(quán)利要求2所述方法，其特征在于，步驟(4)冷卻液過濾澄清采用離心沉降結(jié) 合布氏漏斗吸濾或者微孔膜過濾，優(yōu)選離心機(jī)結(jié)合微孔濾膜；所述微孔濾膜的孔徑為10 2微米，優(yōu)選2微米。
8.根據(jù)權(quán)利要求2所述方法，其特征在于，步驟(5)澄清液濃縮選用真空濃縮或反滲透 濃縮結(jié)合真空濃縮，優(yōu)選反滲透結(jié)合真空濃縮方式；所述反滲透濃縮溫度為32 38°C，壓 力為9 llMPa，優(yōu)選為35°C，壓力9MPa，真空濃縮溫度為35°C 60°C，優(yōu)選50°C ；真空度 為0. 09 0. 095MPa，優(yōu)選0. 095Mpa，濃縮至無液體蒸出為止。
9.根據(jù)權(quán)利要求2所述方法，其特征在于，步驟(6)濃縮液干燥方法為將濃縮液取出進(jìn) 行冷凍干燥或濃縮液在原位繼續(xù)進(jìn)一步加熱真空干燥，優(yōu)選加熱真空干燥；所述加熱真空干燥溫度為85 90°C干燥采用真空干燥或冷凍干燥，優(yōu)選真空干燥；所述加熱真空干燥溫 度為85 90°C，優(yōu)選85°C，保持真空度為0. 09 0. 095MPa,優(yōu)選0. 095MPa ；干燥時間控制 在3 4小時，優(yōu)選4小時。
全文摘要
本發(fā)明公開一種含6-羥基犬尿喹啉酸6-hydroxykynurenic acid(6-HKA)的銀杏葉提取物，其與銀杏葉中的白果內(nèi)酯有協(xié)同作用，所述提取物中6-HKA含量在3～4.5％。本發(fā)明提供了含6-HKA的銀杏葉提取物的制備方法，采用混合溶劑提取，經(jīng)過濃縮、水沉、過濾、干燥等步驟得到提取物。本發(fā)明為進(jìn)一步開發(fā)銀杏葉的新用途提供基礎(chǔ)，有較大的應(yīng)用價值。
文檔編號A61P25/28GK102133243SQ201110056540
公開日2011年7月27日 申請日期2011年3月9日 優(yōu)先權(quán)日2011年3月9日
發(fā)明者張有發(fā), 殷夢龍, 董惠燕, 龍偉岸 申請人:上海諾德生物實(shí)業(yè)有限公司