專利名稱：一種篩選α-葡萄糖苷酶抑制劑的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及分析化學(xué)領(lǐng)域，特別涉及一種篩選a -葡萄糖苷酶抑制劑的方法。
背景技術(shù)：
糖尿病是一種多病因引起、以高血糖為特征的內(nèi)分泌代謝紊亂性疾病。高血糖是由胰島素分泌不足、胰島素抵抗或二者共同存在引起的。世界上，糖尿病患者已超過I. 7億，已成為繼心血管疾病和腫瘤之后第三大嚴(yán)重威脅人類健康的非傳染性疾病。臨床上，根據(jù)糖尿病發(fā)病機(jī)制不同，主要分為I型糖尿病(胰島素依賴型)和II型糖尿病(非胰島素依賴型)，我國以II型居多。治療II型糖尿病的藥物主要分為胰島素及類似物如賴脯胰島素等；促胰島素分泌劑如磺酰脲類；胰島素增敏劑如噻唑烷類衍生物；a -葡萄糖苷酶抑制劑等。
a -葡萄糖苷酶是一種在機(jī)體代謝過程中起關(guān)鍵作用的酶，與許多因代謝紊亂失調(diào)引起的疾病密切相關(guān)。a-葡萄糖苷酶主要由唾液和胰液中a-淀粉酶及小腸刷狀緣上皮細(xì)胞上的麥芽糖酶、異麥芽糖酶、a -臨界糊精酶、蔗糖酶和乳糖酶等組成。食物中的碳水化合物，如淀粉先經(jīng)a-淀粉酶水解成麥芽糖、麥芽三糖、異麥芽糖和a-臨界糊精等，食物在口腔中停留時(shí)間短，所以該過程主要在小腸內(nèi)進(jìn)行。而后寡糖經(jīng)小腸刷狀緣上皮細(xì)胞上各種酶的作用生成葡萄糖及其他單糖，再經(jīng)小腸黏膜細(xì)胞吸收而被機(jī)體利用。II型糖尿病患者因胰島素分泌不足、胰島素抵抗或二者的共同作用，血液中的葡萄糖進(jìn)入肝、肌肉和脂肪等組織細(xì)胞及在細(xì)胞內(nèi)的氧化利用發(fā)生障礙，同時(shí)，肝糖輸出增多導(dǎo)致高血糖。由于血糖水平超過腎小管吸收葡萄糖的能力，部分血糖隨尿排出而形成糖尿病。因此，可以通過降低a -葡萄糖苷酶活性，限制或延緩碳水化合物在消化道內(nèi)分解為糖類的速度，達(dá)到預(yù)防和治療這類疾病的目的。a-葡萄糖苷酶抑制劑的結(jié)構(gòu)類似寡糖，能夠與寡糖競爭a-葡萄糖苷酶的結(jié)合位點(diǎn)，與a-葡萄糖苷酶結(jié)合，抑制酶的活性，減少寡糖分解，從而延緩腸道對單糖特別是葡萄糖吸收，避免了餐后可能發(fā)生的血糖過高。與胰島素及其他口服降糖藥相t匕，a -葡萄糖苷酶抑制劑的顯著特點(diǎn)是能有效地阻止糖尿病患者餐后血糖升高，使血糖維持在一定水平。目前，國內(nèi)外在a-葡萄糖苷酶抑制劑的研究方面，主要是以對硝基苯基- a -D-吡喃葡萄糖苷(PNPG)為底物，考察樣品對a -葡萄糖苷酶的抑制情況。該方法只能得出樣品是否有活性及抑制性的強(qiáng)弱，無法得到活性成分的結(jié)構(gòu)信息。如果要得到具有抑制活性成分的結(jié)構(gòu)信息，還需要進(jìn)行反復(fù)的分離純化，工藝復(fù)雜，且該方法不能高通量地檢測活性成分。

發(fā)明內(nèi)容
有鑒于此，本發(fā)明提供一種篩選a-葡萄糖苷酶抑制劑的方法。該方法根據(jù)受體-配體親和反應(yīng)原理，從備檢樣品中篩選到能夠與受體a -葡萄糖苷酶結(jié)合的配體，經(jīng)超濾、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)檢測，得到a-葡萄糖苷酶抑制劑。該方法靈敏度高、檢測迅速、目標(biāo)受體a-葡萄糖苷酶可以重復(fù)利用，適于高通量篩選a-葡萄糖苷酶抑制劑。為了實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明提供以下技術(shù)方案本發(fā)明提供了一種篩選a-葡萄糖苷酶抑制劑的方法，將備檢樣品與a-葡萄糖苷酶孵育，a-葡萄糖苷酶與備檢樣品中的活性成分發(fā)生親和反應(yīng)，通過截留分子量為IOOOODa的超濾薄膜，收集濾渣，經(jīng)體積比為I : I的甲醇-水的混合溶液洗脫，超速離心后收集濾液，通過液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)進(jìn)行分離鑒定。超濾和高效液相色譜-質(zhì)譜技術(shù)聯(lián)用主要是利用親和原理，使備選樣品中活性成分的混合物與a-葡萄糖苷酶混合，得到a-葡萄糖苷酶-活性成分復(fù)合物和未結(jié)合的小分子，通過超濾薄膜將未結(jié)合的小分子濾除后，上述復(fù)合物用有機(jī)溶劑處理，將活性成分釋放出來，通過高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)，對這些活性成分進(jìn)行分離和鑒別。
為了驗(yàn)證篩選得到的a -葡萄糖苷酶抑制劑對a _葡萄糖苷酶的抑制活性，本發(fā)明提供的方法還包括對a-葡萄糖苷酶抑制活性的檢測。將備檢樣品與a -葡萄糖苷酶孵育發(fā)生親和反應(yīng)時(shí)，可以將a -葡萄糖苷酶用pH值為6. 8的lOmmol/L的醋酸銨緩沖液配制成lOmmol/L的a -葡萄糖苷酶標(biāo)準(zhǔn)溶液。作為優(yōu)選，備檢樣品可以包含天然產(chǎn)物提取物或中藥復(fù)方提取物。優(yōu)選地，備檢樣品可以選自黃連地黃提取物、刺五加葉提取物、銀杏葉提取物、黃芩提取物。備檢樣品的制備可以取原料用乙醇溶液回流提取，合并提取液，濃縮得浸膏；稱取上述浸膏用雙蒸水懸浮，有機(jī)溶劑萃取，分離有機(jī)溶劑相和水相；合并水相備用；合并有機(jī)溶劑萃取物，蒸除其中的有機(jī)溶劑，得到干膏狀有機(jī)溶劑相樣品，備用；蒸除萃取后的水相部分中溶解的少量有機(jī)溶劑，用打孔樹脂柱層析分離，依次用水和乙醇溶液為流動(dòng)相洗脫，棄去水洗部分，蒸除乙醇溶液洗脫部分的溶劑，得干膏狀樣品備用；合并上述干膏狀有機(jī)溶劑相樣品盒干膏狀樣品，制得上述備檢樣品，發(fā)生親和反應(yīng)時(shí)，可以用PH值為6.8的10mmol/L的醋酸銨緩沖液稀釋成10mmol/L或20mmol/L。作為優(yōu)選，將過量備檢樣品與a -葡萄糖苷酶混合發(fā)生親和反應(yīng)。優(yōu)選地，備檢樣品與a-葡萄糖苷酶的摩爾比為2 I。作為優(yōu)選，孵育條件為在37°C下孵育15 30min。優(yōu)選地，孵育條件為在37°C下孵育30min。作為優(yōu)選，本發(fā)明中超速離心的條件為IOOOOg離心10 15min。作為優(yōu)選，超濾、高速離心后，超濾薄膜用pH值為6. 8U0mmol/L的醋酸溶液離心清洗。優(yōu)選地，超濾、高速離心后，超濾薄膜用pH值為6. 8、10mmol/L的醋酸溶液離心清洗三次，每次用70 IOOii L的lOmmol/L的醋酸溶液洗去未結(jié)合的小分子物質(zhì)。作為優(yōu)選，甲醇-水的混合溶液pH值為3. 3。優(yōu)選地，用10mmol/L的醋酸溶液洗去未結(jié)合的小分子物質(zhì)后，再向?yàn)V膜中加入70 IOOiiL甲醇-水的混合溶液，離心力為IOOOOg下離心10 15min，重復(fù)3次，收集濾液，冷凍干燥后用40 60 y L甲醇-水的混合溶液溶解，進(jìn)行高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用測定。作為優(yōu)選，在從備選樣品黃連地黃提取物中篩選a -葡萄糖苷酶抑制劑時(shí)，高效液相色譜的檢測條件可以為色譜柱DikmaDiamonsil C18 色譜柱(250mmX 4. 6mm, 5 u m);流動(dòng)相乙臆(A)和水(B);梯度洗脫程序0 5min，15% A 20% A ;5 20min，20% A 25% A ;20 25min，25 ~ 90% A ;流速:0. 5mL/min ;進(jìn)樣量10u L0質(zhì)譜的檢測條件可以為采用正離子電離模式，掃描范圍m/z 100-800，實(shí)驗(yàn)前質(zhì)量數(shù)均經(jīng)過校正。噴霧電壓為5. OkV,金屬加熱毛細(xì)管溫度250°C，金屬毛細(xì)管電壓5V，殼氣流速50arbitrary，輔助氣流速lOarbitrary。最大注入時(shí)間為200ms。作為優(yōu)選，在從備選樣品刺五加葉提取物中篩選a-葡萄糖苷酶抑制劑時(shí)，高效液相色譜的檢測條件可以為
色譜柱DikmaDiamonsil C18色譜柱(250mmX4. 6mm, 5 u m);流動(dòng)相乙臆(A)和
0.5%醋酸(B);梯度洗脫程序t = Omin, 16% A(84% B) ;t = 0 14min, 16% A(84% B)；t = 14 30min，16 40% A(84 60% B);柱溫 28°C，流速0. 5mL/min ;進(jìn)樣量10y L。質(zhì)譜的檢測條件可以為電噴霧負(fù)離子模式，噴霧電壓5. OkV,金屬毛細(xì)管電壓5V，金屬毛細(xì)管加熱溫度230°C,殼氣流速50arbitrary,輔助氣流速lOarbitrary,掃描范圍m/z 100 1000。作為優(yōu)選，在從備選樣品黃芩提取物中篩選a-葡萄糖苷酶抑制劑時(shí)，高效液相色譜的檢測條件可以為色譜柱DikmaDiamonsil C18 色譜柱(250mmX4. 6mm, 5 u m);流動(dòng)相(A) 0. 5%乙酸水溶液；(B)乙腈；梯度洗脫程序0 20min，15% A 15% B ；20 30min，15% 35% B ；30 40min,35% 60% B ；40 50min,60%~ 100% B ;流速:0. 5mL/min ;檢測波長254nm ;進(jìn)樣量20u L0質(zhì)譜的檢測條件可以為Agilent RRLC-Q-TOF 6520質(zhì)譜儀，采用負(fù)離子電離模式，掃描范圍m/z 50 1500，實(shí)驗(yàn)前質(zhì)量數(shù)均經(jīng)過校正。干燥氣溫度350°C，氣體流速8L/min，噴霧電壓3500V。碰撞氣電壓20_55V。作為優(yōu)選，在從備選樣品銀杏葉提取物中篩選a -葡萄糖苷酶抑制劑時(shí)，高效液相色譜的檢測條件可以為色譜柱DikmaDiamonsil C18 色譜柱(250mmX4. 6mm, 5 u m);流動(dòng)相(A) 0. 5%乙酸水溶液；⑶乙腈；梯度洗脫程序0 40min，17% 33% B ;40 90min，33% 50%B ；90 120min,50%~ 70% B ;流速:0. 5mL/min ;檢測波長254nm ;進(jìn)樣量20u L0質(zhì)譜的檢測條件可以為采用負(fù)離子電離模式，掃描范圍m/z 50 2000，實(shí)驗(yàn)前質(zhì)量數(shù)均經(jīng)過校正。噴霧電壓為5. OkV,毛細(xì)管溫度230°C，毛細(xì)管電壓5V，殼氣為N2，流速50arbitrary。本發(fā)明提供的篩選a-葡萄糖苷酶抑制劑的方法還包括設(shè)空白對照組，空白樣品可以為不加a-葡萄糖苷酶，終濃度lOmmol/L的醋酸銨緩沖液。本發(fā)明還提供了藥根堿、黃連堿、巴馬汀、小檗堿、蘆丁、金絲桃苷、異槲皮苷、槲皮苷、1，4-二咖啡?？鼘幩?、1，5-二咖啡?？鼘幩?、4，5-二咖啡?？鼘幩帷ⅫS芩苷、Oroxylin-A-7-0 Glu acid、漢黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素、木蝴蝶素A、槲皮素、芹黃素或山奈酚在制備a-葡萄糖苷酶抑制劑中的應(yīng)用。本發(fā)明提供了一種篩選a -葡萄糖苷酶抑制劑的方法，利用親和反應(yīng)中配體-受體特異性結(jié)合的原理，采用超濾質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)，從天然產(chǎn)物提取物或中藥復(fù)方提取物中篩選得到a-葡萄糖苷酶抑制劑，靈敏度高，每次分析僅需5 iimol的a-葡萄糖苷酶和備檢樣品中的活性成分；檢測迅速，只需要很短時(shí)間就可以從備檢樣品中快速檢測出a-葡萄糖苷酶抑制劑；目標(biāo)受體a-葡萄糖苷酶可以重復(fù)利用；能夠在一次試驗(yàn)中檢測到多個(gè)a -葡萄糖苷酶抑制劑，適于高通量篩選a -葡萄糖苷酶抑制劑。


圖I示實(shí)施例I中空白樣品與黃連地黃提取物孵育、超濾后的高效液相色譜圖。其中，峰3示藥根堿,峰4示黃連堿,峰5示巴馬汀,峰6示小檗堿。

圖2示實(shí)施例I中a-葡萄糖苷酶樣品與黃連地黃提取物孵育、超濾后的高效液相色譜圖。其中，峰3示藥根堿,峰4示黃連堿,峰5示巴馬汀,峰6示小檗堿。圖3示實(shí)施例I中篩選得到的a-葡萄糖苷酶抑制劑藥根堿的質(zhì)譜圖。圖4示實(shí)施例I中篩選得到的a-葡萄糖苷酶抑制劑黃連堿的質(zhì)譜圖。圖5示實(shí)施例I中篩選得到的a -葡萄糖苷酶抑制劑巴馬汀的質(zhì)譜圖。圖6示實(shí)施例I中篩選得到的a-葡萄糖苷酶抑制劑小檗堿的質(zhì)譜圖。圖7示實(shí)施例2中a -葡萄糖苷酶樣品和空白樣品分別與刺五加葉提取物孵育、超濾后的高效液相色譜圖。其中，虛線示空白樣品與刺五加葉提取物孵育、超濾后的高效液相色譜圖，實(shí)線示a-葡萄糖苷酶樣品與刺五加葉提取物孵育、超濾后的高效液相色譜圖。峰3示蘆丁，峰5示金絲桃苷,峰6示異槲皮苷,峰7示1,4- 二咖啡酰奎寧酸,峰8示I,5- 二咖啡?？鼘幩?，峰10示斛皮苷，峰11示4，5- 二咖啡酰奎寧酸。圖8示實(shí)施例2中篩選得到的a _葡萄糖苷酶抑制劑蘆丁的質(zhì)譜圖。圖9示實(shí)施例2中篩選得到的a _葡萄糖苷酶抑制劑金絲桃苷的質(zhì)譜圖。圖10示實(shí)施例2中篩選得到的a-葡萄糖苷酶抑制劑異槲皮苷的質(zhì)譜圖。圖11示實(shí)施例2中篩選得到的a -葡萄糖苷酶抑制劑1，4_ 二咖啡酰奎寧酸的質(zhì)譜圖。圖12示實(shí)施例2中篩選得到的a -葡萄糖苷酶抑制劑1，5_ 二咖啡?？鼘幩岬馁|(zhì)譜圖。圖13示實(shí)施例2中篩選得到的a-葡萄糖苷酶抑制劑斛皮苷的質(zhì)譜圖。圖14示實(shí)施例2中篩選得到的a -葡萄糖苷酶抑制劑4，5_ 二咖啡酰奎寧酸的質(zhì)譜圖。圖15示實(shí)施例3中a -葡萄糖苷酶樣品和空白樣品分別與黃芩提取物孵育、超濾后的高效液相色譜圖。其中，虛線示空白樣品與黃芩提取物孵育、超濾后的高效液相色譜圖，實(shí)線示a-葡萄糖苷酶樣品與黃芩提取物孵育、超濾后的高效液相色譜圖。峰I示黃芩苷，峰2示Oroxylin-A-7-0 Glu acid,峰3示漢黃芩苷，峰4示黃芩素，峰5示漢黃芩素，峰6示木蝴蝶素A。圖16示實(shí)施例3中篩選得到的a _葡萄糖苷酶抑制劑黃芩苷的質(zhì)譜圖。圖17示實(shí)施例3中篩選得到的a -葡萄糖苷酶抑制劑Oroxylin-A-7-0 Gluacid、漢黃芩苷的質(zhì)譜圖。圖18示實(shí)施例3中篩選得到的a_葡萄糖苷酶抑制劑黃芩素的質(zhì)譜圖。圖19示實(shí)施例3中篩選得到的a_葡萄糖苷酶抑制劑漢黃芩素、木蝴蝶素A的質(zhì)譜圖。圖20示實(shí)施例4中a -葡萄糖苷酶樣品和空白樣品分別與銀杏葉提取物孵育、超濾后的高效液相色譜圖。其中，虛線示空白樣品與銀杏葉提取物孵育、超濾后的高效液相色譜圖，實(shí)線示a-葡萄糖苷酶樣品與銀杏葉提取物孵育、超濾后的高效液相色譜圖。峰I示槲皮素，峰2示芹黃素，峰3示山奈酚。圖21示實(shí)施例4中篩選得到的a-葡萄糖苷酶抑制劑槲皮素的質(zhì)譜圖。 圖22示實(shí)施例4中篩選得到的a_葡萄糖苷酶抑制劑芹黃素的質(zhì)譜圖。圖23示實(shí)施例4中篩選得到的a -葡萄糖苷酶抑制劑山奈酚的質(zhì)譜圖。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明公開了一種篩選a -葡萄糖苷酶抑制劑的方法，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以借鑒本文內(nèi)容，適當(dāng)改進(jìn)工藝參數(shù)實(shí)現(xiàn)。特別需要指出的是，所有類似的替換和改動(dòng)對本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是顯而易見的，它們都被視為包括在本發(fā)明。本發(fā)明的方法及應(yīng)用已經(jīng)通過較佳實(shí)施例進(jìn)行了描述，相關(guān)人員明顯能在不脫離本發(fā)明內(nèi)容、精神和范圍內(nèi)對本文所述的方法和應(yīng)用進(jìn)行改動(dòng)或適當(dāng)變更與組合，來實(shí)現(xiàn)和應(yīng)用本發(fā)明技術(shù)。實(shí)施例中所使用的材料除有特別說明外，均可通過商業(yè)途徑從市場上購買獲得。Waters2695液相色譜(美國Waters公司)；Finnigan LCQ 離子講質(zhì)譜儀(美國ThermoFinnigan 公司)；Agilent RRLC-Q-TOF 6520 質(zhì)譜儀(美國 Agilent 公司)。質(zhì)譜是一種靈敏度很高的檢測手段，其檢測限遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于紅外紫外等檢測手段。下面結(jié)合實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明實(shí)施例I a -葡萄糖苷酶抑制劑的篩選超濾篩選反應(yīng)緩沖液的配制10mmol/L醋酸銨，pH值為6. 8 ;a -葡萄糖苷酶樣品的配制用lOmmol/L醋酸銨緩沖液將a -葡萄糖苷酶標(biāo)準(zhǔn)品分別配成濃度為10mmol/L的標(biāo)準(zhǔn)溶液；空白樣品和樣品的超濾篩選反應(yīng)總體積200 U L，不加a -葡萄糖苷酶，終濃度IOmmoI/L醋酸銨緩沖液與終濃度為lOmmol/L的黃連地黃提取物于37°C孵育30min。吸取IOOii L轉(zhuǎn)移至截留分子量為10000的YM-10型超濾管中，在離心力IOOOOg下超速離心IOmin,濾膜加10mmol/L醋酸溶液(pH6. 8)離心清洗3次,每次加100 u L洗去未結(jié)合小分子。再向?yàn)V膜中加IOOiiL甲醇-水的混合溶液(體積比為I : 1，口11值為3.30)，在離心力IOOOOg下離心15min釋放結(jié)合配體，重復(fù)3次，收集洗脫液，冷凍干燥后加40 y L甲醇-水的混合溶液(體積比為I : 1，PH值為3.30)溶解，高效液相色譜和質(zhì)譜聯(lián)用測定。樣品的超濾篩選反應(yīng)總體積200 U L，終濃度lOmmol/L的a -葡萄糖苷酶與終濃度為20mmol/L的黃連地黃提取物于37°C孵育30min。吸取100 u L轉(zhuǎn)移至截留分子量為10000的YM-10型超濾管中，離心力IOOOOg下超速離心IOmin,濾膜加10mmol/L醋酸溶液(pH6. 8)離心清洗3次，每次加IOOii L洗去未結(jié)合小分子。再向?yàn)V膜中加IOOiiL甲醇-水的混合溶液(體積比為I : I，pH值為3. 30),離心力IOOOOg下離心15min釋放結(jié)合配體，重復(fù)3次，收集洗脫液，冷凍干燥后加40yL甲醇-水的混合溶液(體積比為I : l，pH值為3. 30)溶解，高效液相色譜和質(zhì)譜聯(lián)用測定。常規(guī)方法檢測黃連地黃提取物及所得配體對a -葡萄糖苷酶的抑制活性，結(jié)果顯示，黃連地黃提取物及所得配體對a-葡萄糖苷酶均具有抑制活性。高效液相色譜的檢測條件如下色譜柱DikmaDiamonsil C18 色譜柱(250mmX 4. 6mm, 5 u m);流動(dòng)相乙臆(A)和水(B);梯度洗脫程序0 5min，15% A 20% A ;5 20min，20% A 25% A ;20 25min，25 ~ 90% A ;流速:0. 5mL/min ;進(jìn)樣量10u L0質(zhì)譜條件如下 采用正離子電離模式，掃描范圍m/z 100 800，實(shí)驗(yàn)前質(zhì)量數(shù)均經(jīng)過校正。噴霧電壓為5. OkV,金屬加熱毛細(xì)管溫度250°C，金屬毛細(xì)管電壓5V，殼氣流速50arbitrary，輔助氣流速lOarbitrary。最大注入時(shí)間為200ms。經(jīng)質(zhì)譜鑒定，所得一級(jí)全譜圖中只有單個(gè)化合物的離子峰，通過文獻(xiàn)比對，即可確定結(jié)構(gòu)；通過二級(jí)三級(jí)質(zhì)譜顯示，黃連地黃提取物中a-葡萄糖苷酶抑制劑為藥根堿、黃連堿、巴馬汀、小檗堿。分析僅需Iumol的a-葡萄糖苷酶和備檢樣品中的活性成分；檢測迅速，只需要25min就可以從備檢樣品中快速檢測出a-葡萄糖苷酶抑制劑；能夠在一次試驗(yàn)中檢測到4個(gè)a-葡萄糖苷酶抑制劑。實(shí)施例2 a -葡萄糖苷酶抑制劑的篩選超濾篩選反應(yīng)緩沖液的配制10mmol/L醋酸銨，pH值為6. 8 ;a -葡萄糖苷酶樣品的配制用lOmmol/L醋酸銨緩沖液將a -葡萄糖苷酶標(biāo)準(zhǔn)品分別配成濃度為10mmol/L的標(biāo)準(zhǔn)溶液；空白樣品和樣品的超濾篩選反應(yīng)總體積150 U L，不加a -葡萄糖苷酶，終濃度IOmmoI/L醋酸銨緩沖液與終濃度為lOmmol/L的刺五加葉提取物于37°C孵育15min。吸取80ii L轉(zhuǎn)移至截留分子量為10000的YM-10型超濾管中，在離心力IOOOOg下超速離心12min，濾膜加lOmmol/L醋酸溶液(pH6. 8)離心清洗3次，每次加70 y L洗去未結(jié)合小分子。再向?yàn)V膜中加70 甲醇-水的混合溶液(體積比為I : 1，？11值為3.30)，在離心力IOOOOg下離心IOmin釋放結(jié)合配體，重復(fù)3次，收集洗脫液，冷凍干燥后加40 y L甲醇-水的混合溶液(體積比為I : 1，PH值為3. 30)溶解，高效液相色譜和質(zhì)譜聯(lián)用測定。樣品的超濾篩選反應(yīng)總體積150 U L，終濃度lOmmol/L的a -葡萄糖苷酶與終濃度為20mmol/L的刺五加葉提取物于37°C孵育15min。吸取80 y L轉(zhuǎn)移至截留分子量為10000的YM-10型超濾管中，離心力IOOOOg下超速離心12min,濾膜加10mmol/L醋酸溶液(pH6. 8)離心清洗3次，每次加80 ii L洗去未結(jié)合小分子。再向?yàn)V膜中加70 ii L甲醇-水的混合溶液(體積比為I : l，pH值為3. 30)，離心力IOOOOg下離心IOmin釋放結(jié)合配體，重復(fù)3次，收集洗脫液，冷凍干燥后加40yL甲醇-水的混合溶液(體積比為I : l，pH值為3. 30)溶解，高效液相色譜和質(zhì)譜聯(lián)用測定。常規(guī)方法檢測刺五加葉提取物及所得配體對a -葡萄糖苷酶的抑制活性，結(jié)果顯示，刺五加葉提取物及所得配體對a-葡萄糖苷酶均具有抑制活性。Waters2695液相色譜與Finnigan LCQTM離子講質(zhì)譜聯(lián)用對所得配體進(jìn)行鑒定。
高效液相色譜的檢測條件如下色譜柱DikmaDiamonsil C18色譜柱(250mmX 4. 6mm, 5 u m);流動(dòng)相乙臆(A)和
0.5%醋酸(B);梯度洗脫程序t = Omin, 16% A(84% B) ;t = 0 14min, 16% A(84% B)；t = 14 30min，16 40% A(84 60% B);柱溫 28°C，流速0. 5mL/min ;進(jìn)樣量10y L。質(zhì)譜條件如下電噴霧負(fù)離子模式，噴霧電壓5. OkV,金屬毛細(xì)管電壓5V，金屬毛細(xì)管加熱溫度230°C,殼氣流速50arbitrary,輔助氣流速lOarbitrary,掃描范圍m/z 100 1000。刺五加葉提取物中a -葡萄糖苷酶抑制劑質(zhì)譜鑒定信息見表I。表I刺五加葉提取物中a-葡萄糖苷酶抑制劑質(zhì)譜鑒定
保留
峰UVXmax^
時(shí)間MSn(m/z)及相對豐度(％)化合物
號(hào)(nm)
(min)____
MS: 609(100)
MS2[609]: 301(100), 300(35)
312.53 254,353蘆丁
MS3[609—301]: 179(100), 151(62),
____273(18)，257(13)，229(8)，193(5)__MS: 463(100)
MS2[463]: 301(100), 300(40)
515.17 254,353金絲桃苷
MS3[463—301]: 179(100), 151(73),
____273(15)，257(13)，229(8)，193(5)__
MS: 463(100)
MS2[463]: 301(100), 300(45)
616.32 254,353異槲皮苷
MS3[463—301]: 179(100), 151(75),
____273(15)，257(13)，229(6)，193(6)__
權(quán)利要求
1.一種篩選a-葡萄糖苷酶抑制劑的方法，其特征在于，將a-葡萄糖苷酶與備檢樣品孵育，通過截留分子量為IOOOODa的超濾薄膜后，收集濾渣，加入體積比為I : I的甲醇-水混合溶液，超速離心后收集濾液高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)檢測，得到a -葡萄糖苷酶抑制劑。
2.如權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于，還包括a-葡萄糖苷酶抑制活性的檢測。
3.如權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于，所述孵育條件為在37°C下反應(yīng)15 30min。
4.如權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于，所述超速離心為在離心力IOOOOg下離心10 15min0
5.如權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于，所述備檢樣品為天然產(chǎn)物提取物或中藥復(fù)方提取物。
6.如權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，所述中藥復(fù)方提取物為黃連地黃提取物、刺五加葉提取物、銀杏葉提取物或黃芩提取物。
7.藥根堿、黃連堿、巴馬汀、小檗堿、蘆丁、金絲桃苷、異槲皮苷、槲皮苷、I，4-二咖啡?？鼘幩?、1，5-二咖啡?？鼘幩帷?，5-二咖啡?？鼘幩?、黃芩苷、Oroxylin-A-7-0 Glu acid、漢黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素、木蝴蝶素A、槲皮素、芹黃素或山奈酚在制備a -葡萄糖苷酶抑制劑中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及分析化學(xué)領(lǐng)域，提供了一種篩選α-葡萄糖苷酶抑制劑的方法。該方法將α-葡萄糖苷酶與備檢樣品孵育，通過超濾薄膜，收集濾渣，加入甲醇-水的混合溶液，超速離心后收集濾液，液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)分離鑒定得到α-葡萄糖苷酶抑制劑?；诔瑸V質(zhì)譜技術(shù)，本發(fā)明提供的方法靈敏度高、檢測迅速、目標(biāo)受體α-葡萄糖苷酶可以重復(fù)利用，適于高通量篩選α-葡萄糖苷酶抑制劑。
文檔編號(hào)A61K36/16GK102735782SQ20111009119
公開日2012年10月17日 申請日期2011年4月12日 優(yōu)先權(quán)日2011年4月12日
發(fā)明者劉志強(qiáng), 劉淑瑩, 周慧, 宋鳳瑞, 楊冬, 蔡宗葦, 邢俊鵬, 鄭重 申請人:中國科學(xué)院長春應(yīng)用化學(xué)研究所