專利名稱：土茯苓提取物的制備方法及其在腫瘤治療中的應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種土茯苓提取物、其制備方法及其應用，特別是涉及土茯苓水部分及水上清部分提取物及其制備方法，以及土茯苓提取物在抗腫瘤藥物的制備中的應用。
背景技術：
惡性腫瘤是嚴重威脅人類生命的常見病和多發(fā)病，其死亡率僅次于心血管疾病而列居第二，且發(fā)生率有逐年上升的趨勢，因此，抗腫瘤藥物的研究一直是醫(yī)學研究的熱點。作為腫瘤治療主要手段的化療雖然有較好的療效，但是常引起骨髓抑制、免疫功能低下等副反應，使患者難以堅持治療，并且化療藥物在治療過程中出現(xiàn)的耐藥性已成為目前臨床治療中的難題之一。因此，有必要尋求療效好、毒副作用小的治療方法和藥物。隨著分子生物學和分子藥理學對腫瘤本質和作用機制方面的闡述，中藥天然藥物 抗腫瘤藥物的研究水平也有了顯著提高并展示出了廣闊的前景。其在抑制、殺傷腫瘤細胞，改善癥狀與體征、以及減輕放化療不良反應等方面，都發(fā)揮著重要作用。目前廣泛用于臨床的抗腫瘤藥物，如紫杉醇、喜樹堿、長春花堿等，都是天然植物的提取物，它們在腫瘤治療中療效確切、不良反應小，成為腫瘤治療的重要藥物。例如，紫杉醇(paclitaxel)是1971年由Wani等首先從短葉紅豆杉中提取分離出來的，具有良好抗腫瘤活性，目前被廣泛用于治療卵巢癌、乳腺癌、肺癌及與艾滋病(acquiredimmune deficiency syndrome,AIDS)相關的Kaposi’s肉瘤，由于其作用機制獨特、抗癌療效顯著，已成為目前全球銷售量排名第一的抗腫瘤藥物。近年來，對白藜蘆醇、鬼白毒素、人參、青蒿素、風車子抑堿、小檗堿、苦參類生物堿以及天然黃酮類化合物的抗腫瘤作用的研究也日漸升溫?？梢?，中藥天然藥物正成為抗腫瘤藥物研究的熱點。由于腫瘤的發(fā)生發(fā)展是一個涉及到多基因改變的復雜過程，上述的單一化合物雖然取得了一定的抗腫瘤療效，但其與其它化療藥物一樣，存在耐藥與毒副作用的問題。而某些具有抗腫瘤作用的天然中藥，其抗腫瘤作用可能是由同類物質的不同化合物共同發(fā)揮作用取得的，因此，如果能從中抗腫瘤作用的天然中藥中獲得具有抗腫瘤作用的有效組分，將有可能作為抗腫瘤藥物直接用于臨床，其組分中的不同化合物可通過對腫瘤細胞的多靶點作用，達到有可能優(yōu)于單一靶點的臨床治療效果。土獲茶為百合科植物光葉菝葜Smilax glabra Roxb.的干燥根莖，它分布長江流域以南等地，是一種常用中藥材，其味甘淡，性平，入肝、胃經(jīng)，為清熱祛濕，泄?jié)峤舛镜某Ｓ弥兴帯！侗静菥V目》中稱它“健脾胃，強筋骨，去風濕，利關節(jié)，止泄灣，治拘攣骨痛，惡瘡癰腫，解汞粉銀朱毒?！睂τ谕淋蜍叩目鼓[瘤作用，非專利文獻I報道了土茯苓對黃曲霉毒素BI (AFBl)致大鼠肝癌的作用，進食土茯苓的大鼠肝r-谷氨酰轉肽酶(r-GT)灶小于對照組每個灶的平均面積，差別非常顯著，表明土茯苓對AFBl致肝癌有一定抑制作用。另外，已知土茯苓在體外試驗對子宮頸癌培養(yǎng)株系JTC226有抑制作用，抑制率在90%以上。但土茯苓對N- 丁基-N-(4-羥丁基)亞硝胺誘發(fā)大鼠的膀胱腫瘤無明顯影響(參見非專利文獻2)。另外，對于土茯苓具有的活性化學成分，普遍認為土茯苓化學成分中具有明顯藥理作用的為皂甙類、黃酮類(參見非專利文獻3)。作為抗腫瘤活性成分，非專利文獻4中記載了土茯苓總皂苷對體外培養(yǎng)的艾氏腹水癌(EAC)、肉瘤S180和肝癌(H22)細胞均具有一定的細胞毒性，對荷瘤小鼠S180具有一定的抑制作用，但其認為土茯苓總皂甙在體內(nèi)對EAC和H22小鼠無明顯抑瘤作用，臨床上土茯苓主要與其他中草藥配伍治療腫瘤。但是，如上所述，土茯苓總皂甙的抗腫瘤方面的效果并不理想，對于體內(nèi)抗腫瘤效果，僅在非專利文獻I中報道了土茯苓提取物對肝癌有一定抑制作用。關于土茯苓總提取物、尤其是非皂甙、黃酮部分的體內(nèi)抗腫瘤活性沒有任何報道，對于土茯苓提取物單獨作為活性成分在抗腫瘤藥物中的應用也沒有任何記載。 現(xiàn)有技術非專利文獻I :嚴瑞琪，陳志英，覃國忠，等.當歸等三種中藥及聯(lián)苯雙酯對黃曲霉素BI致大鼠肝癌作用的影響.癌癥，1986 ;5 (2) :141非專利文獻2 :楊德安，石炳毅，李炎唐，等.豬芩、土茯苓和硒對膀胱化學致癌抑制作用的實驗研究〔J〕.中華醫(yī)學雜志，1987,67(11) 622.非專利文獻3 :土茯苓品質與藥理研究進展，沙飛等，中藥材第29卷第5期，2006年5月非專利文獻4 :土茯苓總皂甙的抗腫瘤作用研究，邱光清等，中藥藥理與臨床2001 ；17(5) 1
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明是鑒于上述問題完成的，其提供一種土茯苓提取物、其制備方法及其應用，尤其是土茯苓水部分或水上清部分提取物及其制備方法，以及土茯苓提取物在抗腫瘤藥物的制備中的應用；所述土茯苓提取物具有優(yōu)異的抗腫瘤效果，能夠確實地用于抗腫瘤藥物的制備。本發(fā)明人在對土茯苓總提取物進行研究時意外地發(fā)現(xiàn)，其不僅在體外顯出了抗腫瘤作用，在體內(nèi)也顯出了明顯的抗腫瘤作用。進一步對活性成分進行研究時發(fā)現(xiàn)，利用系統(tǒng)溶劑法得到的乙酸乙酯部分、水部分和水上清部分也顯示出了具有抑制腫瘤細胞體內(nèi)/外增殖的活性，進一步研究發(fā)現(xiàn)，水部分抑瘤活性呈現(xiàn)明顯的量效關系，并且主要的活性成分集中在土茯苓的水上清部分。由此完成了本發(fā)明。具體地說，本發(fā)明涉及下述的技術方案。I、一種土茯苓提取物的制備方法，所述制備方法包括下述步驟用選自水、甲醇、乙醇的至少一種溶劑對土茯苓原料進行提取，回收溶劑獲得土茯苓總提取物的步驟；用水將所述土茯苓總提取物溶解，用石油醚進行提取，獲得土茯苓石油醚部分提取物的步驟；進一步用乙酸乙酯進行提取，獲得土茯苓乙酸乙酯部分提取物的步驟；進一步用水飽和正丁醇進行提取，獲得土茯苓水飽和正丁醇部分提取物和土茯苓水部分提取物，所述土茯苓提取物至少含有所述土茯苓水部分提取物。2、如上述I所述的土茯苓提取物的制備方法，其中，進一步包括對土茯苓水部分提取物進行醇沉，獲得水上清部分提取物和粗多糖的步驟，所述土茯苓提取物至少含有所述土茯苓水上清部分提取物。3、一種土茯苓提取物，其是通過上述I或2所述的土茯苓提取物的制備方法得到的土茯苓水部分提取物或土茯苓水上清部分提取物。
4、一種抗腫瘤藥物，其中，所述抗腫瘤藥物含有上述3所述的土茯苓提取物作為活性成分。5、如上述4所述的抗腫瘤藥物，其中，所述抗腫瘤藥物是治療肝癌、結腸癌、乳腺癌、胃癌、食管癌、鼻咽癌或肺癌等腫瘤的藥物。6、土茯苓提取物在制備抗腫瘤藥物中的應用，其中，所述土茯苓提取物是選自上述3所述的土茯苓提取物。7、如上述6所述的土茯苓提取物在制備抗腫瘤藥物中的應用，其中，所述抗腫瘤藥物是治療肝癌、結腸癌、乳腺癌、胃癌、食管癌、鼻咽癌或肺癌等腫瘤的藥物。8、一種抗腫瘤藥物，其中，所述抗腫瘤藥物含有土茯苓提取物作為唯一的活性成分，所述土茯苓提取物是用選自水、甲醇、乙醇的至少一種溶劑對土茯苓原料進行提取，獲得的土茯苓總提取物。 9、土茯苓提取物在制備抗腫瘤藥物中的應用，其中，所述土茯苓提取物是用選自水、甲醇、乙醇的至少一種溶劑對土茯苓原料進行提取，獲得的土茯苓總提取物，并且在所述抗腫瘤藥物中，所述土茯苓提取物是唯一的活性成分。10、如上述9所述的土茯苓提取物在制備抗腫瘤藥物中的應用，其中，所述抗腫瘤藥物是治療肝癌、結腸癌、乳腺癌、胃癌、食管癌、鼻咽癌或肺癌等腫瘤的藥物。根據(jù)本發(fā)明，明確了土茯苓中的抗腫瘤活性成分的存在部位，通過簡單的制備方法就能有效獲得具有體內(nèi)/外抗腫瘤作用的土茯苓提取物，從而能夠有效地用于抗腫瘤藥物的制備。


圖I :土茯苓各部分的分離提取流程2-1 圖2-3 :土茯苓各部分的抑瘤(H22)活性分析3 :土茯苓水部分的抑瘤(H22)活性量效分析4 :土茯苓水上清部分和粗多糖的抑瘤(H22)活性分析5-1 :土茯苓水上清部分對人源性腫瘤HT-29的抑瘤活性分析5-2 :土茯苓水上清部分對人源性腫瘤PG的抑瘤活性分析6-1 :溶劑(DMSO)對MCF-7的體外增殖抑制活性分析6-2 :土茯苓總提取物對MCF-7的體外增殖抑制活性分析6-3 :土茯苓石油醚部分提取物對MCF-7的體外增殖抑制活性分析6-4 :土茯苓乙酸乙酯部分提取物對MCF-7的體外增殖抑制活性分析6-5 :土茯苓正丁醇部分提取物對MCF-7的體外增殖抑制活性分析6-6 :土茯苓水部分提取物對MCF-7的體外增殖抑制活性分析6-7 :土茯苓水上清部分提取物對MCF-7的體外增殖抑制活性分析6-8 :土茯苓粗多糖部分對MCF-7的體外增殖抑制活性分析6-9 :溶劑(DMSO)對BGC-823的體外增殖抑制活性分析6-10 :土茯苓總提取物對BGC-823的體外增殖抑制活性分析6-11 :土茯苓石油醚部分提取物對BGC-823的體外增殖抑制活性分析6-12 :土茯苓乙酸乙酯部分提取物對BGC-823的體外增殖抑制活性分析圖
圖6-13 :土茯苓正丁醇部分提取物對BGC-823的體外增殖抑制活性分析6-14 :土茯苓水部分提取物對BGC-823的體外增殖抑制活性分析6-15 :土茯苓水上清部分提取物對BGC-823的體外增殖抑制活性分析6-16 :土茯苓粗多糖部分對BGC-823的體外增殖抑制活性分析7-1 :土茯苓水部分提取物對人乳腺癌細胞系BICR體外增殖抑制活性分析7-2 :土茯苓水部分提取物對人結腸癌細胞系HT-29體外增殖抑制活性分析7-3 :土茯苓水部分提取物對人胃腺癌細胞系AGS體外增殖抑制活性分析7-4 :土茯苓水部分提取物對人食管癌細胞系EC-9706體外增殖抑制活性分析 7-5 :土茯苓水部分提取物對人肺腺癌細胞系A549體外增殖抑制活性分析7-6 :土茯苓水部分提取物對人高轉移性巨細胞肺癌細胞系PG體外增殖抑制活性分析7-7 :土茯苓水部分提取物對人鼻咽癌細胞系CNE體外增殖抑制活性分析7-8 :土茯苓水部分提取物對人宮頸癌細胞系HeLa體外增殖抑制活性分析7-9 :土茯苓水部分提取物對人前列腺癌細胞系PC3體外增殖抑制活性分析8-1 :土茯苓總提取物抑制體外對腫瘤細胞的克隆形成能力8-2 :土茯苓水部分提取物抑制體外對腫瘤細胞的克隆形成能力9-1 :土茯苓總提取物抑制體外可誘導腫瘤細胞凋亡的細胞核形態(tài)觀察9-2 :土茯苓水部分提取物抑制體外可誘導腫瘤細胞凋亡的細胞核形態(tài)觀察10-1 :土茯苓總提取物體外可誘導腫瘤細胞凋亡的DNALadder檢測10-2 :土茯苓水部分抑制體外可誘導腫瘤細胞凋亡的DNALadder檢測11-1 : 土茯苓總提取物誘導細胞凋亡的結果的11-2 :土茯苓水部分提取物誘導細胞凋亡的結果的圖
具體實施例方式本發(fā)明的土茯苓抗腫瘤活性物質的制備方法包括下述步驟用選自水、甲醇、乙醇的至少一種溶劑對土茯苓原料進行提取，回收溶劑獲得土茯苓總提取物的步驟；用水將所述土茯苓總提取物溶解，用石油醚進行提取，獲得土茯苓石油醚部分提取物的步驟；進一步用乙酸乙酯進行提取，獲得土茯苓乙酸乙酯部分提取物的步驟；進一步用水飽和正丁醇進行提取，獲得土茯苓水飽和正丁醇部分提取物和土茯苓水部分提取物。用所述至少一種溶劑對土茯苓原料進行提取時，可以采用現(xiàn)有公知的方法。例如滲漉法、回流提取法等。為了盡可能地提取土茯苓的有效成分，優(yōu)選通過回流的方法來獲得土茯苓總提取物。所用溶劑優(yōu)選為乙醇。通過乙醇回流的方式得到土茯苓總提取物時，更優(yōu)選用較高濃度的乙醇回流提取后，用濃度較低的乙醇對藥渣進一步回流提取，并將其合并。所述較高濃度的乙醇優(yōu)選為95%的乙醇，濃度較低的乙醇的濃度優(yōu)選為50%。本發(fā)明的制備方法更優(yōu)選還包括對水部分提取物進一步進行醇沉的步驟。這樣能夠得到有效成分富集的土茯苓提取物。
進行醇沉時，優(yōu)選使醇濃度達到80%以上?？紤]到活性成分純度，本發(fā)明的土茯苓提取物優(yōu)選至少包含水部分提取物或水上清部分提取物。更優(yōu)選包含水上清部分提取物，進一步優(yōu)選是水分部分提取物，最優(yōu)選是水上清部分提取物。本發(fā)明中土茯苓提取物中的具體抗腫瘤活性成分尚不清楚，但從該活性成分富集在水上清部分可知，其不是現(xiàn)有技術中普遍認為的活性成分-皂甙或黃酮類化合物。另外，本發(fā)明的土茯苓提取物的抗腫瘤的作用機制尚不清楚，根據(jù)申請人的實驗結果，推測其是通過誘導腫瘤細胞凋亡實現(xiàn)的，具體地說，其可能是通過增加腫瘤細胞中的活性氧、增加細胞內(nèi)鈣離子濃度和改變線粒體膜電位來誘導細胞發(fā)生凋亡的。下面舉出實施例對本發(fā)明的制備方法進行說明，但本發(fā)明的制備方法并不限于此。例如，實施例中采用的是乙醇回流提取的方法，但本領域技術人員顯然清楚，采用其他方法(例如滲漉法、浸提法等)也能取得相同的效果。 實施例:參考例I :土茯苓飲片(市售)20kg，粉碎，95%乙醇回流提取3次(6倍量(以體積計，下同)、5倍量、5倍量)，每次2hr，過濾；藥渣再以50%乙醇回流提取3次(5倍量、5倍量、5倍量)，每次2hr，與95 %乙醇提取液合并，減壓回收溶劑，得流浸膏2552g (該部分為乙醇總提取物)。參考例2 土茯苓飲片(市售)200g，粉碎，取IL蒸餾水浸泡2hr，大火煮沸，同時行文火煎煮2hr，通過充分的擠壓藥渣，獲得全部土茯苓煎劑，進而通過減壓回收溶劑，將土茯苓煎劑濃縮為Ig 土茯苓生藥/mL的濃度。參考例3 土茯苓乙酸乙酯部分提取物的制備將參考例I得到的乙醇總提取物以10升水混懸后，依次用等體積石油醚、乙酸乙酯各萃取4次，回收溶劑，分別獲得土茯苓石油醚部分提取物、土茯苓乙酸乙酯部分提取物。實施例I 土茯苓水部分提取物的制備與參考例3同樣進行，其中，用乙酸乙酯提取后用水飽和正丁醇萃取4次，回收溶齊IJ，獲得土茯苓水飽和正丁醇部分提取物，剩余水相為土茯苓水部分提取物水溶液。減壓回收溶劑，得到土茯苓水部分提取物。實施例2 土茯苓水部分上清提取物的制備與實施例I同樣進行得到土茯苓水部分提取物水溶液，將該土茯苓水部分提取物水溶液取一半量在攪拌下加入95 %乙醇，使其含醇量達80 %，攪拌，靜置，抽濾，所得沉淀依次用無水乙醇、丙酮、無水乙醚洗滌，獲得土茯苓粗多糖，干燥，稱重。剩余上清液減壓回收溶劑，加水溶解，凍干，即為土茯苓水部分上清提取物。下面通過試驗例證明本發(fā)明的土茯苓提取物的抗腫瘤活性下述試驗例中，所得土茯苓各活性部分在進行體內(nèi)荷瘤小鼠腫瘤生長抑制模型試驗時采用PBS (磷酸鹽緩沖液)為溶解介質，通過超聲將各活性部分溶解為懸濁液或真溶液待用，同時使用PBS為該類試驗的陰性對照品；在進行體外土茯苓各活性部分對細胞生長狀態(tài)影響相關試驗中土茯苓各活性部分用含二甲基亞砜(DMSO)的PBS溶液溶解(使用時DMSO終濃度不超過0.2% )，儲液濃度為1000mg/mL，于-70°C凍存，兩周內(nèi)使用保存于_20°C，同時使用含0. 2% DMS0/PBS為該類試驗的陰性對照品。試驗例I :對荷瘤(H22)小鼠體內(nèi)腫瘤生長抑制試驗從北京維通利華實驗動物技術有限公司購買的5周齡ICR鼠80只，在前肢皮下接種鼠肝癌H22細胞(衛(wèi)生部藥品生物制品檢定所)(2. 5X 106/100 ia/只)。接種后次日，隨機分成8組，每組10只。各組分別灌胃給予參考例I得到的土茯苓乙醇總提取物、參考例2得到的土茯苓煎劑、參考例3得到的土茯苓石油醚部分提取物、土茯苓乙酸乙酯部分提取物、實施例I得到的土茯苓水飽和正丁醇部分提取物和土茯苓水部分提取物(相當于生藥量lg/lmL/天/只)，并以環(huán)磷酰胺(CTX)為陽性對照(80mg/kg，皮下給藥一次)，PBS為陰性對照(ImL/天/只)，連續(xù)給藥7天，每日注意觀察小鼠的飲食、自主活動、毛色等，用藥結束后處死老鼠，取瘤塊稱重進行統(tǒng)計分析。結果見圖2-1 圖2-3。
由圖2-2可知，土茯苓總提取物、水部分提取物及乙酸乙酯部分提取物給藥組的瘤塊重量明顯小于溶劑對照組(P值均小于0. 01)，并且由圖2-3可知，給藥組小鼠的飲食和自主活動無明顯異常，體重與對照組相比沒有明顯的降低。該結果表明總提取物、水部分提取物以及乙酸乙酯部分提取物能夠抑制ICR小鼠體內(nèi)小鼠肝癌H22細胞的生長，三種部分提取物對H22細胞的體內(nèi)抑瘤率分別為47. 9%、46. 7%和43. I %，并且對小鼠無明顯的毒副作用。另一方面，煎劑對體內(nèi)腫瘤的生長也具有一定的抑制作用，其抑瘤率為37. 5%。由此可見，本申請的土茯苓的部分提取物的抗腫瘤效果優(yōu)于傳統(tǒng)水煎土茯苓提取物的抗腫瘤效果。試驗例2 :土茯苓水部分提取物對荷瘤(H22)小鼠體內(nèi)腫瘤生長抑制的量效分析試驗從北京維通利華實驗動物技術有限公司購買的5周齡ICR鼠40只，在前肢皮下接種鼠肝癌H22細胞(衛(wèi)生部藥品生物制品檢定所)(2. 5X 106/100 ia/只)。接種后次日，隨機分成5組，每組8只。將荷瘤(H22細胞)ICR小鼠分別灌胃給予相當于生藥量0.5、1、2g/lmL/天/只的實施例I中得到的土茯苓水部分提取物，并以環(huán)磷酰胺(CTX)為陽性對照(80mg/kg，皮下給藥一次)，PBS為陰性對照(ImL/天/只)，連續(xù)給藥7天后，次日處死小鼠，取瘤塊稱重進行統(tǒng)計分析。結果見圖3。由圖3可知，水部分提取物對ICR小鼠體內(nèi)小鼠肝癌H22細胞的生長抑制作用呈現(xiàn)明顯的量效關系，2g/mL/天/只劑量組的抑瘤率可達61. 97% (P < 0. 01)，從而進一步確證了水部分提取物的體內(nèi)抗腫瘤作用。試驗例3 :土茯苓水上清部分提取物/粗多糖對荷瘤(H22)小鼠體內(nèi)腫瘤生長抑制試驗從北京維通利華實驗動物技術有限公司購買的5周齡ICR鼠28只，在前肢皮下接種鼠肝癌H22細胞(衛(wèi)生部藥品生物制品檢定所)(2. 5X 106/100 ia/只)。接種后次日，隨機分成4組，每組7只。將荷瘤(H22細胞)ICR小鼠分別灌胃給予相當于生藥量lg/lmL/天/只的實施例2中得到的土茯苓水上清部分提取物和粗多糖，并以環(huán)磷酰胺(CTX)為陽性對照(80mg/kg，皮下給藥一次)，PBS為陰性對照(ImL/天/只)，連續(xù)給藥7天后，次日處死小鼠，取瘤塊稱重進行統(tǒng)計分析。結果見圖4。由圖4可知，水上清部分提取物對ICR小鼠體內(nèi)小鼠肝癌H22細胞的生長呈現(xiàn)明顯的抑制作用，抑制率為47. 40%，而粗多糖的抑制率為33. 21 %。由此證明了，與粗多糖相t匕，土茯苓的抗腫瘤活性成分集中在水上清部分提取物中。試驗例4 :土茯苓水上清部分抑制裸鼠體內(nèi)人結腸癌HT-29細胞和人肺癌PG細胞的生長抑制試驗從北京維通利華實驗動物技術有限公司購買的8周齡裸鼠30只，分別在前肢皮下接種人結腸癌細胞系HT-29(衛(wèi)生部藥品生物制品檢定所)或人高轉移性巨細胞肺癌細胞系PG (衛(wèi)生部藥品生物制品檢定所)(2. 5X107100 u I/只)。接種后次日，每種接種細胞隨機分成3組，每組5只。將荷瘤裸鼠分別灌胃給予實施例3中得到的水上清液(相當于生藥量lg/ImL/天/只)或溶劑對照PBS (ImL/天/只)，并以CTX (環(huán)磷酰胺；80mg/kg,皮 下給藥一次)為陽性對照。連續(xù)給藥15天，并注意每日觀察小鼠的飲食、自主活動等，給藥結束后次日，斷頸處死裸鼠，取瘤塊稱重進行統(tǒng)計學分析。試驗結果如圖5-1、圖5-2所示。由圖5-1、圖5-2可知，與溶劑對照組相比，土茯苓水上清部分提取物可以顯著抑制裸鼠體內(nèi)人結腸癌細胞系HT-29和人高轉移性巨細胞肺癌細胞系PG的生長，抑瘤率分別可達69. 3%和67. 95% (P < 0. 01)。另外，給藥組小鼠的飲食和自主活動無明顯異常，兩組間小鼠體重亦無明顯差異。試驗例5 :土茯苓各活性部分體外對腫瘤細胞的生長抑制試驗試驗例5-1采用MTT法對參考例以及實施例中得到的土茯苓各部分提取物對MCF-7和BGC-823細胞株生長能力的影響進行檢測，其中，所述MTT法中，將培養(yǎng)的MCF-7 (人乳腺癌細胞系(衛(wèi)生部藥品生物制品檢定所))和BGC-823細胞(人胃癌細胞系(衛(wèi)生部藥品生物制品檢定所))用0. 04%胰蛋白酶-EDTA消化，按2X IO3細胞/孔接種96孔板，培養(yǎng)24小時后，細胞貼壁后，分別給予參考例I得到的土茯苓乙醇總提取物、參考例3得到的土茯苓石油醚部分提取物、土茯苓乙酸乙酯部分提取物、實施例I得到的土茯苓水飽和正丁醇部分提取物和土茯苓水部分提取物、實施例2得到的土茯苓水上清部分提取物和粗多糖以及溶劑對照(DMSO)進行處理，每個藥物設5個濃度(相當于生藥量的5、10、15、20、50mg/mL)，每組設3個平行孔。分別于藥物作用后的0111'、24111'、48111'、72111'、96111'和120hr，取待測的96孔板進行MTT分析，繪制生長曲線。結果見圖6-1 圖6-16。如圖6-1 圖6-16所示，土茯苓總提取物、土茯苓水部分提取物和土茯苓乙酸乙酯部分提取物對MCF-7和BGC-823細胞有明顯的生長抑制作用，呈現(xiàn)明顯的時效和量效關系，水部分提取物的作用要略強于乙酸乙酯部分提取物，而溶劑對照(DMSO)、正丁醇部分和石油醚部分對兩株細胞的生長能力均未見明顯影響。在水部分中，以水上清部分提取物的作用較為顯著，于10-15mg/mL時就表現(xiàn)出抑制作用，明顯優(yōu)于粗多糖部分。以上體外試驗結果表明，水部分提取物和水上清部分提取物是土茯苓的主要抑瘤活性部位。試驗例5-2與試驗例5-1同樣地采用MTT法對實施例I中得到的土茯苓水部分提取物對多種人腫瘤細胞株生長能力的影響進行了檢測，其結果見圖7-1 圖7-9。如圖7-1 圖7-9所示，除了以上經(jīng)過檢測的MCF-7和BGC-823細胞外，水部分提取物還對人乳腺癌細胞系BICR(衛(wèi)生部藥品生物制品檢定所)、人結腸癌細胞系HT-29 (衛(wèi)生部藥品生物制品檢定所)、人胃腺癌細胞系AGS (衛(wèi)生部藥品生物制品檢定所)、人食管癌細胞系EC-9706 (衛(wèi)生部藥品生物制品檢定所)、人肺腺癌細胞系A549 (衛(wèi)生部藥品生物制品檢定所)、人高轉移性巨細胞肺癌細胞系PG(衛(wèi)生部藥品生物制品檢定所)及人鼻咽癌細胞系CNE(衛(wèi)生部藥品生物制品檢定所)都具有較為明顯的生長抑制作用。水部分提取物在濃度達到lOmg/mL(相當于生藥量)時，對BICR和HT-29細胞有明顯的生長抑制作用；濃度為20mg/mL (相當于生藥量)時，對PG和CNE細胞有明顯的生長抑制作用；濃度為50mg/mL(相當于生藥量)時，對AGS、EC-9706和A549細胞有明顯的生長抑制作用。這表明土茯苓水部分提取物具有較廣泛的抑瘤瘤譜。而人宮頸癌細胞系HeLa (衛(wèi)生部藥品生物制品檢定所)和人前列腺癌細胞系PC3(衛(wèi)生部藥品生物制品檢定所)對土茯苓水部分的敏感性較弱。試驗例6 :土茯苓總提取物、水部分提取物體外對腫瘤細胞的克隆形成能力抑制試驗將生長狀態(tài)良好的細胞消化后吹散成單個，每孔500-600個接種于12孔板中，設3 個平行孔，細胞貼壁12-24小時后，加入圖8中所示生藥量濃度的參考例I得到的土茯苓總提取物、實施例I得到的土茯苓水部分提取物或相應量的溶劑對照(DMS0/PBS)，繼續(xù)培養(yǎng)7天后，固定細胞并染色，對形成的細胞克隆計數(shù)分析。結果如圖8-1 圖8-2所示。由圖8-1 圖8-2可知，土茯苓總提取物和水部分提取物均能抑制MCF-7、HT-29和BGC-823細胞的平板克隆形成能力。試驗例7 :土茯苓水部分誘導腫瘤細胞凋亡試驗試驗例7-1用圖9-1所示濃度的參考例I得到的土茯苓總提取物、圖9-2所示濃度實施例I得到的水部分提取物或溶劑對照(DMS0/PBS)處理MCF-7、HT-29和BGC-823細胞24和48hr后，用DNA特異性的染料Hoechst 33342染細胞核，然后在激光共聚焦顯微鏡下觀察細胞核的形態(tài)。結果如圖9-1、圖9-2所示。由圖9-1、圖9-2可知，當細胞給予20mg/mL的土獲茶總提取物及50mg/mL的水部分提取物(相當于生藥量的濃度)處理后24hr，即可觀察到細胞核凋亡形態(tài)的改變，如新月形核、核濃縮、凋亡小體等，表明土茯苓總提取物和水部分提取物可以誘導腫瘤細胞凋亡的發(fā)生。試驗例7-2將培養(yǎng)狀態(tài)良好的細胞消化后鋪于6孔板中，每孔約5X IO5個細胞，細胞貼壁12-24小時后，分別加入20mg/mL和50mg/mL生藥量濃度的參考例I得到的土茯苓總提取物、實施例I得到的水部分提取物或溶劑對照(DMSO/PBS)作用24、48和72hr，然后分別收集細胞，提取基因組DNA，用2%的瓊脂糖凝膠電泳進行鑒定。試驗結果見圖10-1 圖10-2。由該圖10-1 圖10-2可知，該濃度范圍下的土茯苓總提取物和水部分提取物作用于MCF-7、HT-29和BGC-823細胞后，其DNA瓊脂糖凝膠電泳圖譜出現(xiàn)典型的凋亡特點-DNALadder，并呈現(xiàn)劑量和時間依賴關系。試驗例7-3采用FITC-AnnexinV/PI雙染法，用流式細胞儀定量檢測了土茯苓誘導細胞凋亡的情況。將參考例I得到的土茯苓總提取物、參考例3得到的乙酸乙酯部分提取物、實施例I得到的水部分提取物或溶劑對照加入處于對數(shù)生長期的MCF-7、HT-29和BGC-823細胞中，藥物作用24小時后，消化細胞，轉移至離心管中，加入PI和FITC-Annexin V，室溫避光溫育15min，立即用流式細胞儀進行分析。結果見圖11-1和圖11-2。表明，土茯苓總提取物作用后可以顯著增加凋亡細胞的比例(FITC-Annexin V單染及FITC-AnnexinV和PI雙染的細胞)，呈現(xiàn)一定的劑量依賴關系。50mg/mL生藥量濃度的水部分提取物作用于上述三株細胞后，與對照組相比，凋亡細胞的比例也有所增加。該結果進一步證實了土茯苓能夠誘導細胞發(fā)生凋亡。上述試驗結果表明，土茯苓的抗腫瘤活性成分存在與水部分提取物中，與以往認為的活性成分不同。上述試驗例中主要針對土茯苓的水部分提取物的抗腫瘤作用進行了試驗，驗證了其顯著的抗腫瘤效果，證明了土茯苓提取物由于包括確切的抗腫瘤活性物質，能夠確實地用于抗腫瘤藥物的制備，其不僅可以與其他藥物合用，即使單獨作為有效成分也能實現(xiàn)抗腫瘤的作用。 產(chǎn)業(yè)上的可利用性根據(jù)本發(fā)明，確定了土茯苓中抗腫瘤活性成分的存在部位，能夠確實地從土茯苓中提取有效的抗腫瘤活性成分，從而能夠用于抗腫瘤藥物的制備，實現(xiàn)確實有效的抗腫瘤效果。
權利要求
1.一種土茯苓提取物的制備方法，該制備方法包括下述步驟 用選自水、甲醇、乙醇的至少一種溶劑對土茯苓原料進行提取，回收溶劑獲得土茯苓總提取物的步驟；用水將所述土茯苓總提取物溶解，用石油醚進行提取，獲得土茯苓石油醚部分提取物的步驟；進一步用乙酸乙酯進行提取，獲得土茯苓乙酸乙酯部分提取物的步驟；進一步用水飽和正丁醇進行提取，獲得土茯苓水飽和正丁醇部分提取物和土茯苓水部分提取物，所述土茯苓提取物至少含有所述土茯苓水部分提取物。
2.如權利要求I所述的土茯苓提取物的制備方法，其中，進一步包括對土茯苓水部分提取物進行醇沉，獲得水上清部分提取物和粗多糖的步驟，所述土茯苓提取物至少含有所述土茯苓水上清部分提取物。
3.一種土茯苓提取物，其是通過權利要求I或2所述的土茯苓提取物的制備方法得到的土茯苓水部分提取物或土茯苓水上清部分提取物。
4.一種抗腫瘤藥物，其中，所述抗腫瘤藥物含有權利要求3所述的土茯苓提取物作為活性成分。
5.如權利要求4所述的抗腫瘤藥物，其中，所述抗腫瘤藥物是治療肝癌、結腸癌、乳腺癌、胃癌、食管癌、鼻咽癌或肺癌的藥物。
6.土茯苓提取物在制備抗腫瘤藥物中的應用，其中，所述土茯苓提取物是選自權利要求3所述的土茯苓提取物。
7.如權利要求6所述的土茯苓提取物在制備抗腫瘤藥物中的應用，其中，所述抗腫瘤藥物是治療肝癌、結腸癌、乳腺癌、胃癌、食管癌、鼻咽癌或肺癌的藥物。
8.一種抗腫瘤藥物，其中，所述抗腫瘤藥物含有土茯苓提取物作為唯一的活性成分，所述土茯苓提取物是用選自水、甲醇、乙醇的至少一種溶劑對土茯苓原料進行提取，獲得的土茯苓總提取物。
9.土茯苓提取物在制備抗腫瘤藥物中的應用，其中，所述土茯苓提取物是用選自水、甲醇、乙醇的至少一種溶劑對土茯苓原料進行提取，獲得的土茯苓總提取物，并且在所述抗腫瘤藥物中，所述土茯苓提取物是唯一的活性成分。
10.如權利要求9所述的土茯苓提取物在制備抗腫瘤藥物中的應用，其中，所述抗腫瘤藥物是治療肝癌、結腸癌、乳腺癌、胃癌、食管癌、鼻咽癌或肺癌的藥物。
全文摘要
本發(fā)明提供一種土茯苓提取物的制備方法及其在腫瘤治療中的應用。所述土茯苓提取物的制備方法包括下述步驟用選自水、甲醇、乙醇的至少一種溶劑對土茯苓原料進行提取，獲得土茯苓總提取物的步驟；用石油醚對土茯苓總提取物進行提取，獲得土茯苓石油醚部分提取物的步驟；進一步用乙酸乙酯進行提取，獲得土茯苓乙酸乙酯部分提取物的步驟；進一步用水飽和正丁醇進行提取，獲得土茯苓水飽和正丁醇部分提取物和土茯苓水部分提取物，進一步通過對土茯苓水部分提取物進行醇沉，可以得到水上清部分提取物。
文檔編號A61P35/00GK102805829SQ20111014921
公開日2012年12月5日 申請日期2011年6月3日 優(yōu)先權日2011年6月3日
發(fā)明者壽成超, 蘇亞輝, 高玉婧 申請人:北京市腫瘤防治研究所