專利名稱：鈣通道阻斷劑在制備拮抗水母毒素心臟毒性藥物中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，具體是指鈣通道阻斷劑能夠拮抗水母毒素心臟毒性， 進(jìn)一步地，不同類型的鈣通道阻斷劑在制備預(yù)防或治療水母蜇傷藥物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
水母蜇傷是全球范圍內(nèi)最常見的海洋生物致傷，水母蜇傷后可以產(chǎn)生局部劇痛、 炎癥與壞死等癥狀，嚴(yán)重者出現(xiàn)全身肌肉痙攣、呼吸和循環(huán)抑制甚至休克、死亡。水母毒素是一類結(jié)構(gòu)新穎、毒性極強(qiáng)的肽類毒素，具有心血管、溶血、神經(jīng)、呼吸等多種生物活性，其中心血管毒性成分引起的急性循環(huán)衰竭被認(rèn)為是水母蜇傷致死的主要原因。盡管存在溶血、肌肉、神經(jīng)等其他多種毒性成分，但心血管毒性成分是水母毒素中引起死亡的主要致病因素(Xiao L, Liu GS, Wang QQ, et al.，The lethality of tentacle-only extract from jellyfish Cyanea capillata is primarily attributed to cardiotoxicity in anaesthetized SD rats[J]. Toxicon. 2010,55(4) :838-845)。因此，要深入研究水母蜇傷致死的防治方法，必須首先研究水母毒素中心血管毒性成分的作用機(jī)理及其拮抗藥物的干預(yù)效果，以利于開發(fā)水母蜇傷的預(yù)防或治療藥物。研究表明，心血管毒性成分的作用可能與其引起心肌細(xì)胞鈣超載有關(guān)，心肌細(xì)胞膜上的鈣通道過度激活是心血管毒性成分引起鈣超載的重要原因。因而阻斷鈣離子通道可能起到拮抗水母毒素心臟毒性的作用。鈣通道阻滯劑有多種類型，根據(jù)其對(duì)鈣通道的選擇性可分為非選擇性鈣通道阻斷劑(如氟桂利嗪等)和選擇性鈣通道阻斷劑；選擇性鈣通道阻斷劑又可分為多種亞型，以作用于L型鈣通道和T型鈣通道(如苯妥英等)的阻斷劑最為常用。L型鈣通道是成熟心肌細(xì)胞膜上最重要的鈣通道，其阻斷劑在臨床上廣泛應(yīng)用于心絞痛、高血壓、心律失常以及周圍血管痙攣性疾病等，其作用機(jī)理與心肌或血管平滑肌細(xì)胞膜除極時(shí)抑制鈣離子內(nèi)流有關(guān)，可以使心臟產(chǎn)生負(fù)性肌力、負(fù)性頻率以及負(fù)性傳導(dǎo)作用，使血管平滑肌松弛，周圍血管阻力下降，血壓降低等。根據(jù)L型鈣通道阻斷劑的化學(xué)結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，又可分為二氫吡啶類(如硝苯地平、尼莫地平、氨氯地平等)、地爾硫卓類(地爾硫卓)、苯烷胺類(維拉帕米)以及粉防己堿等類型。至今未見鈣通道阻斷劑應(yīng)用于制備預(yù)防或治療水母蜇傷藥物中的報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供鈣通道阻斷劑的新的適應(yīng)癥，具體是指不同類型鈣通道阻斷劑在制備預(yù)防或治療水母蜇傷藥物的應(yīng)用。本發(fā)明人前期研究從整體動(dòng)物心功能、離體心臟以及心肌細(xì)胞三個(gè)層面闡述了水母毒素的心臟及心肌細(xì)胞毒性，證明水母毒素具有直接的心臟毒性，心肌收縮力下降引起的急性全心衰竭是毒素導(dǎo)致大鼠死亡的主要原因(Xiao L，Liu GS, Wang QQ, et al.，The lethality of tentacle-only extract from jellyfish Cyanea capillata is primarilyattributed to cardiotoxicity in anaesthetized SD rats[J]. Toxicon. 2010,55 (4) 838-84 。進(jìn)一步從整體動(dòng)物水平發(fā)現(xiàn)TOE可以導(dǎo)致心臟組織鈣含量增高，而激光掃描共聚焦顯微技術(shù)發(fā)現(xiàn)水母毒素可以導(dǎo)致細(xì)胞外液含鈣與無鈣的心肌細(xì)胞鈣超載，且細(xì)胞外含鈣的心肌細(xì)胞鈣超載發(fā)生的速度快，幅度大，毒性強(qiáng)，提示鈣超載可能在水母毒素心肌細(xì)胞毒性中發(fā)揮重要的作用，且細(xì)胞外鈣離子影響非常大。本發(fā)明人設(shè)想，鑒于細(xì)胞外鈣離子內(nèi)流需要通過心肌細(xì)胞膜上的鈣通道(主要為 L型鈣通道)，因此采用不同類型的鈣通道阻斷劑，通過抑制心肌細(xì)胞膜上L型鈣通道的開放頻率，降低心肌細(xì)胞膜外的鈣離子內(nèi)流，可以有效地拮抗水母毒素心血管毒性成分引起的心肌細(xì)胞鈣超載，從而拮抗水母毒素引起的心臟毒性作用。本發(fā)明提供了不同類型鈣通道阻斷劑在制備預(yù)防或治療水母蜇傷藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明還提供了不同類型鈣通道阻斷劑在制備水母毒素心臟毒性拮抗藥物中的應(yīng)用。不同類型鈣通道阻斷劑，是指L型鈣通道阻斷劑，具體是指地爾硫卓類鈣通道阻斷劑地爾硫卓、粉防己堿類鈣通道阻斷劑粉防己堿、二氫吡啶類鈣通道阻斷劑硝苯地平、尼莫地平；不同類型鈣通道阻斷劑，是指T型鈣通道阻斷劑苯妥英；不同類型鈣通道阻斷劑，是指非特異性鈣通道阻斷劑氟桂利嗪；不同類型鈣通道阻斷劑，還包括非特異性陽(yáng)離子通道阻斷劑氯化鑭。本發(fā)明的具體技術(shù)方案如下1.制備水母粗毒提取液1)采樣采集鮮活水母，迅速剪下其觸手，立即將觸手干冰冷凍，運(yùn)回后置于_70°C超低溫冰箱凍存?zhèn)溆谩?)制備水母粗毒提取液將凍存觸手用自配海水于4°C自溶4天，磁力攪拌器攪拌，收集觸手自溶液體，10000 X g離心15min，上清液即水母粗毒提取液。2.不同種類鈣通道阻斷劑拮抗水母毒素心臟毒性實(shí)驗(yàn)(以地爾硫卓為代表)1)在心肌細(xì)胞水平，鈣通道阻斷劑地爾硫卓拮抗水母毒素心臟毒性體外培養(yǎng)的乳鼠心肌細(xì)胞預(yù)先給予不同濃度的地爾硫卓(0、2、5、10、20μπιΟ1/υ作用30min后，給予 40μ g/ml上述制備的水母粗毒提取液作用12h，采用CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞活力。發(fā)現(xiàn)給予地爾硫卓(5、10、20ymOl/L)的心肌細(xì)胞存活率顯著高于未給予地爾硫卓或僅給予低濃度地爾硫卓Qymol/L)的心肌細(xì)胞，表明在乳鼠心肌細(xì)胞水平，地爾硫卓可以拮抗水母毒素心臟毒性。2)在離體心臟水平，鈣通道阻斷劑地爾硫卓拮抗水母毒素心臟毒性采用含有 1 μ mol/L地爾硫卓KH液灌注Langendorff離體心臟模型，穩(wěn)定30min后側(cè)管給予0. 18mg 上述提取的水母粗毒提取液，觀察30min，發(fā)現(xiàn)給予1 μ mol/L地爾硫卓灌注的離體心臟心功能各項(xiàng)指標(biāo)(心率、冠脈流量、左心室發(fā)展壓、左心室內(nèi)壓最大上升/下降速率以及左心室舒張末壓)都要顯著優(yōu)于未給地爾硫卓的對(duì)照組，表明在離體心臟水平，地爾硫卓可以拮抗水母毒素心臟毒性。3)在整體動(dòng)物水平，鈣通道阻斷劑地爾硫卓拮抗水母毒素心臟毒性采用麻醉 Sprague-Dawley (SD)大鼠，預(yù)先通過頸外靜脈注射0. 5mg/kg地爾硫卓(30min注射完)，然后靜脈給予lmg/kg上述提取的水母粗毒提取液，監(jiān)測(cè)大鼠動(dòng)脈血壓變化。發(fā)現(xiàn)給予0. 5mg/ kg地爾硫卓的大鼠動(dòng)脈血壓要明顯高于未給予地爾硫卓的對(duì)照組，表明在整體動(dòng)物水平， 地爾硫卓可以拮抗水母毒素心臟毒性。本發(fā)明在培養(yǎng)的乳鼠心肌細(xì)胞、離體心臟以及整體動(dòng)物三個(gè)層面，分別預(yù)先給予一定量的不同種類的鈣通道阻斷劑，然后再給予水母毒素，觀察鈣通道阻斷劑拮抗水母毒素心臟毒性的效果。其中乳鼠心肌細(xì)胞水平包括地爾硫卓類鈣通道阻斷劑地爾硫卓(2、 5、10、20μΜ)、苯烷胺類鈣通道阻斷劑維拉帕米Ο、5、10、20μΜ)、粉防己堿類鈣通道阻斷劑粉防己堿(0.5、1、2、5μΜ)、二氫吡啶類鈣通道阻斷劑硝苯地平(5、10、20、50μΜ)、尼莫地平(10、20、50、100μΜ)、氨氯地平(10、20、50、100μΜ)、尼群地平(10、20、50、100 μ Μ)、 T型鈣通道阻斷劑苯妥英(5、10、20、50μΜ)、非特異性鈣通道阻斷劑氟桂利嗪(5、10、20、 50 μ Μ)、非特異性鈉通道阻斷劑利多卡因(20、50、100、20(^11)、非特異性鉀通道阻斷劑四乙基溴化銨(0.5、1、2、5μΜ)以及非特異性陽(yáng)離子通道阻斷劑氯化鑭(20、50、100、 200 μ Μ)；離體心臟水平包括地爾硫卓類鈣通道阻斷劑地爾硫卓(1 μ Μ)、苯烷胺類鈣通道阻斷劑維拉帕米(0. ΙμΜ)以及二氫吡啶類鈣通道阻斷劑硝苯地平(0.25μΜ)；整體動(dòng)物水平包括地爾硫卓類鈣通道阻斷劑地爾硫卓(0. 5mg/kg)與非特異性鈣通道阻斷劑氟桂利嗪(lmg/kg)。結(jié)果表明，不同種類鈣通道阻斷劑在乳鼠心肌細(xì)胞、離體心臟以及整體動(dòng)物三個(gè)層面上具有拮抗水母毒素毒素心臟毒性的效應(yīng)，但其拮抗效應(yīng)間有差異其中在乳鼠心肌細(xì)胞水平，地爾硫卓(5、10、20μΜ)、粉防己堿(5 μ Μ)、硝苯地平(10、20、50μΜ)、尼莫地平(10、20、50、100μΜ)、苯妥英(20、50μΜ)、氟桂利嗪(20,50 μ Μ)以及氯化鑭(50、100、 200 μ Μ)等具有明顯的拮抗水母毒素心臟毒性的作用；在離體心臟水平，地爾硫卓(ΙμΜ)、 維拉帕米(0. 1 μ Μ)以及硝苯地平(0. 25 μ Μ)具有拮抗水母毒素心臟毒性的作用；而在整體動(dòng)物水平，地爾硫卓(lmg/kg，i. ν)則可以有效維持中毒大鼠的動(dòng)脈血壓。說明不同種類鈣通道阻斷劑可以有效地拮抗水母毒素心臟毒性，適用于開發(fā)水母蜇傷的預(yù)防或治療藥物。本發(fā)明為開發(fā)水母蜇傷的預(yù)防或治療藥物提供了一種有效的候選藥物。


圖1在乳鼠心肌細(xì)胞水平，不同鈣通道阻斷劑拮抗水母毒素心臟毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果。其中圖1-1在乳鼠心肌細(xì)胞水平，地爾硫卓能夠明顯拮抗水母毒素心臟毒性圖1-2在乳鼠心肌細(xì)胞水平，維拉帕米未見明顯的拮抗水母毒素心臟毒性的效應(yīng)圖1-3在乳鼠心肌細(xì)胞水平，粉防己堿可以拮抗水母毒素心臟毒性圖1-4在乳鼠心肌細(xì)胞水平，硝苯地平可以明顯拮抗水母毒素心臟毒性圖1-5在乳鼠心肌細(xì)胞水平，尼莫地平可以明顯拮抗水母毒素心臟毒性圖1-6在乳鼠心肌細(xì)胞水平，氨氯地平未見明顯的拮抗水母毒素心臟毒性的效應(yīng)圖1-7在乳鼠心肌細(xì)胞水平，尼群地平未見明顯的拮抗水母毒素心臟毒性的效應(yīng)圖1-8在乳鼠心肌細(xì)胞水平，苯妥英可以拮抗水母毒素心臟毒性圖1-9在乳鼠心肌細(xì)胞水平，氟桂利嗪可以明顯拮抗水母毒素心臟毒性圖1-10在乳鼠心肌細(xì)胞水平，利多卡因未見明顯的拮抗水母毒素心臟毒性的效應(yīng)
圖1-11在乳鼠心肌細(xì)胞水平，四乙基溴化銨未見明顯拮抗水母毒素心臟毒性的效應(yīng)圖1-12在乳鼠心肌細(xì)胞水平，氯化鑭可以明顯拮抗水母毒素心臟毒性圖2在離體心臟水平，不同鈣通道阻斷劑拮抗水母毒素心臟毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果。其中圖2-1A在離體心臟水平，地爾硫卓能夠拮抗水母毒素心臟毒性(心率)圖2-1B在離體心臟水平，地爾硫卓能夠拮抗水母毒素心臟毒性(左心室發(fā)展壓)圖2-1C在離體心臟水平，地爾硫卓能夠拮抗水母毒素心臟毒性(左心室內(nèi)壓最大上升速率)圖2-1D在離體心臟水平，地爾硫卓能夠拮抗水母毒素心臟毒性(左心室內(nèi)壓最大下降速率)圖2-1E在離體心臟水平，地爾硫卓能夠拮抗水母毒素心臟毒性(冠脈流量)圖2-1F在離體心臟水平，地爾硫卓能夠拮抗水母毒素心臟毒性(左心室舒張末壓)圖2-2A在離體心臟水平，維拉帕米可以拮抗水母毒素的心臟毒性(心率)圖2-2B在離體心臟水平，維拉帕米可以拮抗水母毒素的心臟毒性(左心室發(fā)展壓)圖2-2C在離體心臟水平，維拉帕米可以拮抗水母毒素的心臟毒性(左心室內(nèi)壓最大上升速率)圖2-2D在離體心臟水平，維拉帕米可以拮抗水母毒素的心臟毒性(左心室內(nèi)壓最大下降速率)圖2-2E在離體心臟水平，維拉帕米可以拮抗水母毒素的心臟毒性(冠脈流量)圖2-2F在離體心臟水平，維拉帕米可以拮抗水母毒素的心臟毒性(左心室舒張末壓)圖2-3A在離體心臟水平，硝苯地平可以明顯拮抗水母毒素的心臟毒性(心率)圖2- 在離體心臟水平，硝苯地平可以明顯拮抗水母毒素的心臟毒性(左心室發(fā)展壓)圖2-3C在離體心臟水平，硝苯地平可以明顯拮抗水母毒素的心臟毒性(左心室內(nèi)壓最大上升速率)圖2-3D在離體心臟水平，硝苯地平可以明顯拮抗水母毒素的心臟毒性(左心室內(nèi)壓最大下降速率)圖2-3E在離體心臟水平，硝苯地平可以明顯拮抗水母毒素的心臟毒性(冠脈流量)圖2-3F在離體心臟水平，硝苯地平可以明顯拮抗水母毒素的心臟毒性(左心室舒張末壓)圖3在整體動(dòng)物水平，不同鈣通道阻斷劑拮抗水母毒素心臟毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果。其中圖3-1在整體動(dòng)物水平，地爾硫卓能夠拮抗水母毒素心臟毒性圖3-2在整體動(dòng)物水平，氟桂利嗪未見明顯的拮抗水母毒素心臟毒性的效應(yīng)
具體實(shí)施例方式
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下面結(jié)合本發(fā)明的實(shí)施例和附圖對(duì)本發(fā)明的實(shí)施作詳細(xì)說明，以下實(shí)施例是在以本發(fā)明技術(shù)方案為前提下進(jìn)行實(shí)施，給出了詳細(xì)的實(shí)施方式和具體的操作過程，但本發(fā)明的保護(hù)范圍不限于下述的實(shí)施例。實(shí)施例1.制備水母粗毒提取液發(fā)形霞水母(Cyanea capillata)于2010年8月采自浙江省三門灣海域，取觸手 10g，加入等體積3. 34%自配海水10ml，自溶4天，磁力攪拌器每日攪拌2次，每次lOmin。 100目細(xì)胞篩網(wǎng)過濾3次，濾液IOOOOXg離心3次，每次15min，收集上清即水母粗毒提取液(TOE，tentacle-only extract)。采用 Bradford 法測(cè)定蛋白濃度為 1.2mg/ml。自配海水配方:NaCl 28g, MgCl2 · 6H20 5g, KC10. 8g, CaCl2 1. 033g，加水至 1000ml。所有操作都在冰水或4°C條件下進(jìn)行。使用前采用0. 01mol/L,pH 7. 4PBS透析他。實(shí)施例2.在乳鼠心肌細(xì)胞、離體心臟以及整體動(dòng)物三個(gè)層面，地爾硫卓類鈣通道阻斷劑地爾硫卓拮抗水母毒素心臟毒性實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)用地爾硫卓購(gòu)自日本田邊制藥株式會(huì)社，由天津田邊制藥有限公司生產(chǎn)，通用名稱注射用鹽酸地爾硫卓，商品名稱合貝爽；為白色塊狀物或多孔固體，使用時(shí)溶解于生理鹽水中。2. 1在乳鼠心肌細(xì)胞水平，地爾硫卓能夠明顯拮抗水母毒素心臟毒性取新生SD乳鼠15只，無菌條件下開胸取心，立即用冰冷的D-hanks液(NaCl 8. Og ；KCl 0. 4g ；KH2PO4 0. 06g ；NaHCO3 0. 35g ；Na2HPO2 · 12H20 :0. 12348g,加三蒸水至1000ml，0. 22 μ m濾器過濾)洗去殘血，剪成Imm3大小碎片，采用II型膠原酶消化及 Percoll密度梯度離心法獲取乳鼠心肌細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度至1 X IO6個(gè)/ml，每孔200 μ 1接種到96孔培養(yǎng)板上，置入37°C、5% CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，于接種4 后更換正常培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)備用。心肌細(xì)胞活力采用CCK-8 法(Hou G, Xue L, Lu Z, et al. An activated mTOR/ p70S6K signaling pathway in esophageal squamous cell carcinoma cell lines and inhibition of the pathway by rapamycin and siRNA against mTOR[J]. Cancer Lett. 2007,253(2) :236-248)測(cè)定，實(shí)驗(yàn)分空白對(duì)照組、TOE染毒組、地爾硫卓藥物干預(yù)組O、5、10及20ymol/L)及相應(yīng)地爾硫卓藥物內(nèi)參組Ο、5、10及20ymol/L)共10 組，每組η = 8，其中空白對(duì)照組既不加地爾硫卓，也不加水母毒素，TOE染毒組為僅加 TOE (40 μ g/ml)，地爾硫卓藥物干預(yù)各組分別給予不同濃度的地爾硫卓作用30min后再給予TOE (40 μ g/ml)，而地爾硫卓藥物內(nèi)參組則給予相應(yīng)濃度的地爾硫卓但不給TOE。TOE作用1 后加入CCK-8試劑顯色，450nm波長(zhǎng)測(cè)各孔吸光值(其中Al孔加入200 μ 1 PBS所測(cè)吸光值為本底)。細(xì)胞活力(％)=[(實(shí)驗(yàn)A45Q)_(本底A45Q)]/[(陰性對(duì)照A45Q)_(本底 A450)] X 100%比較地爾硫卓干預(yù)組細(xì)胞活力與相應(yīng)的空白對(duì)照組細(xì)胞活力(Τ0Ε%/ Control % )，從而判斷地爾硫卓是否在乳鼠心肌細(xì)胞水平具有拮抗水母毒素心臟毒性的效應(yīng)。結(jié)果表明地爾硫卓在5、10、20ymol/L濃度時(shí)，能夠顯著提高經(jīng)水母毒素處理的乳鼠心肌細(xì)胞的存活率，說明在心肌細(xì)胞水平，地爾硫卓具有明顯的拮抗心臟毒性的效應(yīng)(見表 1，圖 1-1)。
2. 2在離體心臟水平，地爾硫卓能夠拮抗水母毒素心臟毒性雄性SD大鼠對(duì)只(第二軍醫(yī)大學(xué)動(dòng)物中心提供，下同)，體重280 320g，用25% 烏拉坦(1.2g/kg)和肝素生理鹽水GOOIU/kg)混合液腹腔麻醉后，迅速開胸取心，按經(jīng)典的Langendorff方法(H. G.沃格爾(德)，W. H.沃格爾(美).編著；杜冠華，李學(xué)軍，張永祥，等譯.藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)指南.科學(xué)出版社.2001. 2，A. 3. 1:108-112)，經(jīng)升主動(dòng)脈逆行插入灌注管，使其置于主動(dòng)脈瓣上方，以利于冠狀動(dòng)脈灌注。采用KH液進(jìn)行平衡灌注，于灌注前 30min及灌注時(shí)充以混合氣體(95% 02+5% CO2)，使平衡灌注的KH液充分達(dá)到氧飽和，pH值維持在7. 35 7. 45，保持灌注溫度為37. 0 37. 5°C，灌注壓力60mmHg。實(shí)驗(yàn)過程中全程記錄心率(HR)、左心室發(fā)展壓(LVDP)、左心室舒張末壓(LVEDP)、左心室內(nèi)壓最大上升速率 (+dp/dtmax)、左心室內(nèi)壓最大下降速率(_dp/dtmax)以及冠脈流量(CF)等各項(xiàng)心功能指標(biāo)。24只SD大鼠隨機(jī)分為地爾硫卓藥物內(nèi)參組(地爾硫卓+生理鹽水， Diltiazem+NS)、TOE染毒組(生理鹽水+TOE，NS+T0E)和地爾硫卓藥物干預(yù)組(地爾硫卓 +TOE, Diltiazem+TOE)共3組，每組各8只。其中地爾硫卓通過KH液灌注給藥(1 μ mol/ L)，TOE通過側(cè)管給藥(0. 18mg)，給藥后觀察離體心臟各心功能指標(biāo)的變化。結(jié)果表明地爾硫卓藥物干預(yù)組HR、LVDP、dp/dt以及CF等心功能指標(biāo)均顯著優(yōu)于TOE染毒組，說明在離體心臟水平，地爾硫卓具有明顯的拮抗水母毒素心臟毒性的效應(yīng)(圖2-1A至F)。2. 3在整體動(dòng)物水平，地爾硫卓能夠拮抗水母毒素心臟毒性雄性SD大鼠M只，體重200士20g，隨機(jī)分為地爾硫卓藥物內(nèi)參組(地爾硫卓+ 生理鹽水，Diltiazem+NS)、TOE染毒組(生理鹽水+Τ0Ε，NS+T0E)和地爾硫卓藥物干預(yù)組 (地爾硫卓+TOE，Diltiazem+TOE)共3組，每組各8只。25%烏拉坦腹腔注射麻醉，麻醉劑量1.2g/kg。左側(cè)股動(dòng)脈插管連接壓力感受器，生物信號(hào)分析系統(tǒng)(MPA-2000，奧爾科特，上海)監(jiān)測(cè)并記錄大鼠股動(dòng)脈血壓的變化。左側(cè)頸外靜脈置管按體重給予地爾硫卓(0.5mg/ kg,30min內(nèi)注射完)，右側(cè)頸外靜脈置管按體重給予TOE (lmg/kg)，觀察大鼠血壓變化。結(jié)果表明，給予地爾硫卓藥物干預(yù)組血壓幾乎維持不變，與地爾硫卓藥物內(nèi)參組基本一致，而 TOE染毒組血壓下降顯著，說明在整體動(dòng)物水平，地爾硫卓可以明顯拮抗水母毒素的心臟毒性(圖3-1)。實(shí)施例3.在乳鼠心肌細(xì)胞、離體心臟層面，苯烷胺類鈣通道阻斷劑維拉帕米拮抗水母毒素心臟毒性實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)用維拉帕米購(gòu)自上海禾豐制藥有限公司，通用名稱鹽酸維拉帕米注射液，為無色澄明液體。3. 1在乳鼠心肌細(xì)胞水平，維拉帕米未見明顯的拮抗水母毒素心臟毒性的效應(yīng)維拉帕米采用濃度2、5、10、20μΜ，實(shí)驗(yàn)方法如實(shí)施例2. 1。結(jié)果表明，維拉帕米在乳鼠心肌細(xì)胞層面，拮抗水母毒素心臟毒性不明顯(見表1，圖1-2)。3. 2在離體心臟水平，維拉帕米可以拮抗水母毒素的心臟毒性維拉帕米濃度采用0. 1 μ Μ，實(shí)驗(yàn)方法如實(shí)施例2. 2。結(jié)果表明，維拉帕米藥物干預(yù)組LVDP、dp/dt以及CF等心功能指標(biāo)均顯著優(yōu)于中毒對(duì)照組，而其他指標(biāo)HR、LVEDP也有一定的拮抗作用，說明在離體心臟水平，維拉帕米可以拮抗水母毒素心臟毒性的效應(yīng)(圖 2-2A-F)。實(shí)施例4.在心肌細(xì)胞層面，粉防己堿類鈣通道阻斷劑粉防己堿拮抗水母毒素心臟毒性實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)用粉防己堿原料藥購(gòu)自上海華藍(lán)化學(xué)科技有限公司，為白色粉末狀固體。4. 1在乳鼠心肌細(xì)胞水平，粉防己堿可以拮抗水母毒素心臟毒性粉防己堿濃度采用0.5、1、2、5 4 11，實(shí)驗(yàn)方法如實(shí)施例2.1。結(jié)果表明，粉防己堿在 5μΜ濃度時(shí)，可以明顯拮抗水母毒素心肌細(xì)胞毒性(見表1，圖1-3)。實(shí)施例5.在乳鼠心肌細(xì)胞、離體心臟層面，二氫吡啶類鈣通道阻斷劑硝苯地平拮抗水母毒素心臟毒性實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)用硝苯地平原料藥購(gòu)自上海華藍(lán)化學(xué)科技有限公司，為黃色粉末狀固體。5. 1在乳鼠心肌細(xì)胞水平，硝苯地平可以明顯拮抗水母毒素心臟毒性硝苯地平采用濃度5、10、20、50μΜ，實(shí)驗(yàn)方法如實(shí)施例2. 1。結(jié)果表明，硝苯地平在10、20、50μΜ濃度時(shí)，可以明顯拮抗水母毒素心臟毒性(見表1，圖1-4)。5. 2在離體心臟水平，硝苯地平可以明顯拮抗水母毒素的心臟毒性硝苯地平濃度采用0. 25 μ Μ,實(shí)驗(yàn)方法如實(shí)施例2. 2。結(jié)果表明，硝苯地平藥物干預(yù)組LVDP、dp/dt以及CF等心功能指標(biāo)均顯著優(yōu)于中毒對(duì)照組，而其他指標(biāo)HR、LVEDP也有一定的拮抗作用，說明在離體心臟水平，硝苯地平可以明顯拮抗水母毒素心臟毒性的效應(yīng) (圖 2-3A-F)。實(shí)施例6.在乳鼠心肌細(xì)胞層面，二氫吡啶類鈣通道阻斷劑尼莫地平拮抗水母毒素心臟毒性實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)用尼莫地平原料藥購(gòu)自上海華藍(lán)化學(xué)科技有限公司，為黃色粉末狀固體。6. 1在乳鼠心肌細(xì)胞水平，尼莫地平可以明顯拮抗水母毒素心臟毒性尼莫地平采用濃度10、20、50、10(^11，實(shí)驗(yàn)方法如實(shí)施例2.1。結(jié)果表明，尼莫地平在10、20、50、100μΜ濃度時(shí)，可以明顯拮抗水母毒素心臟毒性(見表1，圖1_5)。實(shí)施例7.在心肌細(xì)胞層面，二氫吡啶類鈣通道阻斷劑氨氯地平拮抗水母毒素心臟毒性實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)用氨氯地平原料藥購(gòu)自上海華藍(lán)化學(xué)科技有限公司，為白色粉末狀固體。7. 1在乳鼠心肌細(xì)胞水平，氨氯地平未見明顯的拮抗水母毒素心臟毒性的效應(yīng)氨氯地平采用濃度10、20、50、10(^11，實(shí)驗(yàn)方法如實(shí)施例2.1。結(jié)果表明，氨氯地平在10、20、50、100 μ M濃度時(shí)，未見明顯拮抗水母毒素心臟毒性的效應(yīng)(見表1，圖1_6)。實(shí)施例8.在乳鼠心肌細(xì)胞層面，二氫吡啶類鈣通道阻斷劑尼群地平拮抗水母毒素心臟毒性實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)用尼群地平原料藥購(gòu)自上海華藍(lán)化學(xué)科技有限公司，為淡黃色粉末狀固體。8. 1在乳鼠心肌細(xì)胞水平，尼群地平未見明顯的拮抗水母毒素心臟毒性的效應(yīng)尼群地平采用濃度10、20、50、10(^11，實(shí)驗(yàn)方法如實(shí)施例2.1。結(jié)果表明，尼群地平在10、20、50、100 μ M濃度時(shí)，未見明顯拮抗水母毒素心臟毒性的效應(yīng)(見表1，圖1-7)。實(shí)施例9.在心肌細(xì)胞層面，T型鈣通道阻斷劑苯妥英拮抗水母毒素心臟毒性實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)用苯妥英原料藥購(gòu)自上海華藍(lán)化學(xué)科技有限公司，為白色粉末狀固體。9. 1在乳鼠心肌細(xì)胞水平，苯妥英可以拮抗水母毒素心臟毒性苯妥英采用濃度5、10、20、50μΜ，實(shí)驗(yàn)方法如實(shí)施例2. 1。結(jié)果表明，苯妥英在20、 50 μ M濃度時(shí)，可見明顯拮抗水母毒素心臟毒性的效應(yīng)(見表1，圖1-8)。
實(shí)施例10.在心肌細(xì)胞與整體動(dòng)物層面，非特異性鈣通道阻斷劑氟桂利嗪拮抗水母毒素心臟毒性實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)用氟桂利嗪原料藥購(gòu)自上海華藍(lán)化學(xué)科技有限公司，為白色粉末狀固體。10. 1在乳鼠心肌細(xì)胞水平，氟桂利嗪可以明顯拮抗水母毒素心臟毒性氟桂利嗪采用濃度5、10、20、50μΜ，實(shí)驗(yàn)方法如實(shí)施例2. 1。結(jié)果表明，氟桂利嗪在20、50 μ M濃度時(shí)，可見明顯拮抗水母毒素心臟毒性(見表1，圖1-9)。10. 2在整體動(dòng)物水平，氟桂利嗪未見明顯的拮抗水母毒素心臟毒性的效應(yīng)氟桂利嗪濃度采用lmg/kg，30min內(nèi)注射完，實(shí)驗(yàn)方法如實(shí)施例2. 3。結(jié)果表明，給予氟桂利嗪藥物干預(yù)組血壓與TOE染毒組基本一致，說明在整體動(dòng)物水平，氟桂利嗪未見明顯拮抗水母毒素的心臟毒性的效應(yīng)(見圖3-2)。實(shí)施例11.在乳鼠心肌細(xì)胞與整體動(dòng)物層面，非特異性鈉通道阻斷劑利多卡因拮抗水母毒素心臟毒性實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)用利多卡因購(gòu)自上海旭東海普藥業(yè)有限公司，通用名鹽酸利多卡因注射液， 為無色澄明液體。11. 1在乳鼠心肌細(xì)胞水平，利多卡因未見明顯的拮抗水母毒素心臟毒性的效應(yīng)利多卡因采用濃度20、50、100、20(^11，實(shí)驗(yàn)方法如實(shí)施例2.1。結(jié)果表明，利多卡因未見明顯拮抗水母毒素心臟毒性的效應(yīng)(見表1，圖1-10)。實(shí)施例12.在心肌細(xì)胞與整體動(dòng)物層面，非特異性鉀通道阻斷劑四乙基溴化銨拮抗水母毒素心臟毒性實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)用四乙基溴化銨原料藥購(gòu)自上海華藍(lán)化學(xué)科技有限公司，為白色粉末狀固體。12. 1在乳鼠心肌細(xì)胞水平，四乙基溴化銨未見明顯拮抗水母毒素心臟毒性的效應(yīng)四乙基溴化銨采用濃度0. 5、l、2、5mM，實(shí)驗(yàn)方法如實(shí)施例2. 1。結(jié)果表明，四乙基溴化銨未見明顯拮抗水母毒素心臟毒性的效應(yīng)(見表1，圖1-11)。實(shí)施例13.在心肌細(xì)胞與整體動(dòng)物層面，非特異性陽(yáng)離子通道阻斷劑氯化鑭拮抗水母毒素心臟毒性實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)用氯化鑭購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，為白色粉末狀固體。13. 1在乳鼠心肌細(xì)胞水平，氯化鑭可以明顯拮抗水母毒素心臟毒性氯化鑭采用濃度20、50、100、20(^11，實(shí)驗(yàn)方法如實(shí)施例2.1。結(jié)果表明，氯化鑭在 50、100、200 μ M濃度時(shí)，可見明顯拮抗水母毒素心臟毒性(見表1，圖1-12)。表1不同類型離子通道阻斷劑對(duì)TOE心肌細(xì)胞毒性的干預(yù)效果(TOE :40 μ g/ml)
權(quán)利要求
1.鈣通道阻斷劑在制備預(yù)防或治療水母蜇傷藥物中的應(yīng)用。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的鈣通道阻斷劑在制備預(yù)防或治療水母蜇傷藥物中的應(yīng)用，該應(yīng)用是指在制備水母毒素心臟毒性拮抗藥物中的應(yīng)用。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的鈣通道阻斷劑在制備預(yù)防或治療水母蜇傷藥物中的應(yīng)用，該鈣通道阻斷劑是指L型鈣通道阻斷劑。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的鈣通道阻斷劑在制備預(yù)防或治療水母蜇傷藥物中的應(yīng)用，該鈣通道阻斷劑是指地爾硫卓、粉防己堿、硝苯地平或尼莫地平。
5.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的鈣通道阻斷劑在制備預(yù)防或治療水母蜇傷藥物中的應(yīng)用，該鈣通道阻斷劑是指T型鈣通道阻斷劑。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的鈣通道阻斷劑在制備預(yù)防或治療水母蜇傷藥物中的應(yīng)用，該鈣通道阻斷劑是指苯妥英。
7.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的鈣通道阻斷劑在制備預(yù)防或治療水母蜇傷藥物中的應(yīng)用，該鈣通道阻斷劑是指氟桂利嗪。
全文摘要
本發(fā)明涉及醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域。水母蜇傷是全球范圍內(nèi)最常見的海洋生物致傷，水母毒素中的心血管毒性成分引起的急性循環(huán)衰竭被認(rèn)為是水母蜇傷致死的主要原因。本發(fā)明的目的在于提供不同類型鈣通道阻斷劑在制備預(yù)防或治療水母蜇傷藥物中的應(yīng)用。不同類型鈣通道阻斷劑，包括L型鈣通道阻斷劑、T型鈣通道阻斷劑、非特異性鈣通道阻斷等。本發(fā)明在培養(yǎng)的乳鼠心肌細(xì)胞、離體心臟以及整體動(dòng)物三個(gè)層面，發(fā)現(xiàn)不同類型鈣通道阻斷劑能夠有效地拮抗水母毒素心臟毒性，可以開發(fā)為水母蜇傷的預(yù)防或治療藥物。
文檔編號(hào)A61K45/00GK102228692SQ20111018087
公開日2011年11月2日 申請(qǐng)日期2011年6月30日 優(yōu)先權(quán)日2011年6月30日
發(fā)明者厲瑛, 張琳, 張黎明, 溫小娟, 王倩倩, 王濤, 王蓓蕾, 聶菲, 肖良, 陸佳 申請(qǐng)人:中國(guó)人民解放軍第二軍醫(yī)大學(xué)