專利名稱：一種血紅蛋白微膠囊血液代用品及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種血紅蛋白微膠囊血液代用品及其制備方法。
背景技術(shù)：
目前，輸血已成為醫(yī)療的一個重要組成部分。臨床輸血技術(shù)是安全的，但是由于臨床血液庫存嚴重短缺、供-受血者之間需要配型以及血液交叉感染等原因，限制了配體輸血技術(shù)在緊急狀況中的廣泛應(yīng)用，因此，尋求安全有效的血液代用品對于輸血醫(yī)學具有十分重要的意義。血液代用品的研究主要沿著氟碳化合物和血紅蛋白(Hb)制品兩個方向進行。氟碳化合物通過對氧的高溶解度而發(fā)揮作用，能有效地攜氧釋氧，維持血容量和電解質(zhì)平衡。但是氟碳化合物的保存條件特殊，在使用之前必須乳化，在空氣中溶氧量不足和要求吸入 高濃度的氧等，限制了其在實際中的應(yīng)用。由于血紅蛋白獨特的氧結(jié)合性能、來源廣泛、正常的生理代謝途徑等原因，使得血紅蛋白類血液代用品比氟碳化合物更符合人體生理需要。天然的無基質(zhì)的血紅蛋白容易分解為二聯(lián)體和單聯(lián)體結(jié)構(gòu)而引起腎毒性，并且存在氧親和性高、循環(huán)半壽期短、膠體滲透壓高等缺點，因此將天然游離的血紅蛋白作為血液代用品用于臨床之前，必須對其進行修飾和改造。目前，基于血紅蛋白的血液代用品主要可以分為三代。第一代血紅蛋白的血液代用品為修飾血紅蛋白型血液代用品，主要包括表面修飾型血紅蛋白、分子內(nèi)交聯(lián)血紅蛋白、聚合型血紅蛋白、基因重組血紅蛋白等。表面修飾型血紅蛋白常用磷酸吡多醛、葡萄聚糖和聚乙二醇等對血紅蛋白進行表面修飾；分子內(nèi)交聯(lián)的血紅蛋白是利用特殊化學交聯(lián)劑與血紅蛋白交聯(lián)從而將四聚體之間容易產(chǎn)生解離的多鍵連接起來以防止多肽斷裂成二聚體或單聚體，血紅蛋白的分子量沒有明顯的改變；聚合型血紅蛋白主要是采用戍二醒、genipin和Reuterin等天然交聯(lián)劑使血紅蛋白聚合。但是受限于聚合度的關(guān)系，聚合后的血紅蛋白仍然有機會經(jīng)過微血管間隙滲漏出去，使得其半衰期有一定的瓶頸存在；基因重組血紅蛋白是利用基因重組技術(shù)將人血紅蛋白在大腸桿菌中表達制成一種雙α-血紅蛋白，但是由于基因表達不高、不適當?shù)牡鞍踪|(zhì)折疊和價格昂貴等原因，使得該方法沒有進入臨床III期的實驗。第二代血紅蛋白的血液代用品主要是利用納米技術(shù)將血紅蛋白與超氧化物歧化酶和過氧化氫酶交聯(lián)起來，制備成納米級別的、具有攜氧能力的新型偶聯(lián)物。在第一代和第二代血液代用品中，血紅蛋白都是直接與血液接觸，因此兩種方法對血紅蛋白的純度要求非常高，而且血紅蛋白直接暴露在外面非常容易氧化而失去攜氧能力，并且會產(chǎn)生毒副作用。因此，人們致力于研究一種包裹血紅蛋白的新型血液代用品，使其結(jié)構(gòu)更接近紅細胞的實際結(jié)構(gòu)，并且避免攜氧單元與免疫系統(tǒng)直接接觸，即第三代血液代用品-Hemoglobin Vehicle。關(guān)于利用微膠囊包裹血紅蛋白來模擬紅細胞結(jié)構(gòu)最早研究是TMSChang開展的，分別用乳液聚合法、聚合物沉聚法、乳化擴散法，以苯甲酸丁酯、聚乳酸、聚異丁基丙烯氰酯或聚乳酸聚乙醇酸共聚物為膜材包裹血紅蛋白制備粒徑為O. 05 μ m-1 μ m的血紅蛋白納米膠囊。但是TMS Chang的這幾種方法存在血紅蛋白易變性和大量使用有機試劑的缺點。Toyoda及Kambara-Kimoto等分別于1965年和1968年利用白明膠、阿拉伯樹膠、娃樹脂等制備了包裹血紅蛋白的物質(zhì)。1977年Djordjevich和Miller利用磷脂、膽固醇和脂肪酸等制備了一種脂質(zhì)體包裹的血紅蛋白，但是磷脂材料機械性能差，生成的微囊難以收集和儲存，在價格和工藝上也不具備優(yōu)勢。1994年和1997年N. Cedrati采用復乳法分別以聚乳酸、聚乳酸和乙基纖維素為膜材包裹血紅蛋白，制備了粒徑在10 μ m-500 μ m的血紅蛋白微膠囊。盡管該工藝簡單，但是制備的微膠囊粒徑偏大，并且氧親和性太強，不易于氧氣的釋放。上述研究結(jié)果表明，很難獲得可調(diào)控微粒尺寸、結(jié)構(gòu)和功能，并且具有良好的生物相容性和血液相容性的血紅蛋白血液代用品
發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于克服上述血紅蛋白代用品的諸多不足，提供一種可調(diào)控血紅蛋白微膠囊尺寸、結(jié)構(gòu)和功能，并具有良好的生物相容性和血液相容性的血紅蛋白血液代用品即血紅蛋白微膠囊。本發(fā)明所提供的血紅蛋白微膠囊是將層層組裝技術(shù)和模板法相結(jié)合，基于西佛堿鍵組裝得到，具體包括以下步驟(a)將模板粒子分散到含有組分I的溶液中吸附，得到了吸附組分I的模板粒子；其中，所述組分I為血紅蛋白；(b)將步驟(a)得到的粒子再分散到含有組分2的溶液中吸附，得到所述血紅蛋白微膠囊；所述組分2為含醛基的多糖或多糖的衍生物，所述多糖的衍生物是多糖的部分或全部羥基被氧化成醛基而得到的。以所述步驟(a)和(b)作為一次組裝處理，所述方法還包括將步驟(b)得到的血紅蛋白微膠囊作為模板粒子重復所述組裝處理至少一次，得到西佛堿鍵層層組裝生物相容、血液相容的血紅蛋白微膠囊。在上述重復處理中，各組裝處理步驟(a)中的組分I可以相同，也可以不同；步驟(b)中的組分2可以相同，也可以不同。本發(fā)明中所述血紅蛋白具體選自下述至少一種人血紅蛋白、牛血紅蛋白、羊血紅蛋白、馬血紅蛋白、狗血紅蛋白和豬血紅蛋白。所述多糖的衍生物可選自下述至少一種多糖的衍生物肝素、殼聚糖、透明質(zhì)酸、海藻酸鈉、淀粉、纖維素和葡聚糖。在制備所述多糖的衍生物中，所采用的氧化試劑是高碘酸或其水溶性鹽。上述，步驟(a)中所述含有組分I的溶液為含有氯化鈉的血紅蛋白的醋酸鹽緩沖溶液，其PH值為5-9 ;所述醋酸鹽緩沖溶液中氯化鈉的濃度為O. 1-0. 5mol/L，血紅蛋白的濃度為 4-10mg/mL。根據(jù)組分2(多糖或其衍生物)所帶電荷情況進行調(diào)節(jié)，若是組分2帶負電荷，可調(diào)節(jié)血紅蛋白的溶液的pH值在5-7左右，此時血紅蛋白表面帶正電荷，有利于兩個組分之間的接觸以便反應(yīng)；反之亦然，若是組分2帶正電荷，可調(diào)節(jié)血紅蛋白的溶液的pH值在7-9左右，此時血紅蛋白表面帶負電荷。步驟(b)中所述含有組分2的溶液為含有氯化鈉的多糖或多糖的衍生物的醋酸鹽緩沖溶液，其PH值為5-9 ;所述醋酸鹽緩沖溶液中氯化鈉的濃度為O. 1-0. 5mol/L，多糖或多糖的衍生物的濃度為4-10mg/mL。步驟(a)中所述吸附的時間為O. 5-4小時，優(yōu)選I小時；步驟(b)中所述吸附的時間為4-24小時，優(yōu)選12小時。本發(fā)明中所采用的模板粒子可為生物相容和生物可降解的粒子，或生物不相容和/或生物不可降解的粒子。若本發(fā)明的血紅蛋白微膠囊作為血液代用品，其所采用的模板粒子的粒徑為200納米-I微米。其中，所述生物相容和生物可降解的粒子可為二氧化硅粒子、蛋白質(zhì)球、多糖球 等;所述生物不相容和/或生物不可降解的粒子可為碳酸錳粒子、碳酸鎘粒子、碳酸鈣粒子、聚苯乙烯膠體粒子或三聚氰胺甲醛膠體粒子。所述的模板粒子可以是橢圓形、正方形、長方形、多邊形以及各種不規(guī)則形狀。當所述模板粒子為生物不相容和/或生物不可降解的粒子；本發(fā)明制備血紅蛋白微膠囊的方法還包括除去所述模板粒子，得到中空微膠囊的步驟。此外，在本發(fā)明微膠囊的囊壁組分中還可添加別構(gòu)效應(yīng)調(diào)節(jié)劑和輔助酶(如超氧歧化酶、高鐵還原酶)等其它結(jié)構(gòu)和功能調(diào)節(jié)劑；具體制備是將在所述含有組分I的溶液中或在含有組分2的溶液中加入別構(gòu)效應(yīng)調(diào)節(jié)劑和/或輔助酶。當然，也可在所述血紅蛋白微膠囊的外表面用生物靶向分子或功能性分子進行修飾。本發(fā)明所提供的血紅蛋白微膠囊包括交替層層組裝的高分子層，組分I (血紅蛋白)含有多個氨基、組分2 (多糖或其衍生物)含有多個醛基，在層層組裝過程中組分I或2可以是一種或者多種的組合，交替組裝的層可以相同，也可以不同；所述微膠囊任選含有核，所述的核為聚合物或無機物模板粒子、蛋白質(zhì)球、藥物、磁性粒子；在微膠囊表面任選被生物靶向分子或功能性分子修飾。 本發(fā)明的再一個目的是提供上述血紅蛋白微膠囊的應(yīng)用。本發(fā)明所提供的血紅蛋白微膠囊可用于制備下述產(chǎn)品1)血液代用品；2)用于腫瘤氧化處理的產(chǎn)品；3)局部缺血部位的氧氣供給液；4)器官保存的灌注液；5)體外循環(huán)補充液；6)治療慢性貧血的制劑；7)氧載體(如水下動力系統(tǒng)供氧和呼吸用氧等各種形式的氧載體)。本發(fā)明所提供的血紅蛋白微膠囊具有如下優(yōu)點(I)生物相容，生物可降解囊壁成分為血紅蛋白以及多糖或者是多糖的衍生物，均為生物相容和生物可降解的材料；(2)可自發(fā)熒光由于囊壁成分之間形成了西佛堿鍵，因而可自發(fā)熒光；(3)未使用額外的有毒的交聯(lián)劑未使用戊二醛，碳化二亞胺等有毒的交聯(lián)劑；(4)尺寸、結(jié)構(gòu)和功能可調(diào)控可根據(jù)實際需要，通過選擇不同粒徑的模板任意改變微膠囊的尺寸、結(jié)構(gòu)并包裹額外的功能性囊壁成分，如別構(gòu)效應(yīng)調(diào)節(jié)劑和輔助酶(超氧歧化酶、高鐵還原酶等)。


圖I為實施例I制備的(Hb/DHP) 6血紅蛋白微膠囊的透射電鏡照片。圖2為實施例I制備的(HVDHP)6血紅蛋白微膠囊的激光共聚焦顯微圖。圖3為實施例I制備的(HVDHP)6血紅蛋白微膠囊對人胚胎皮膚成纖維細胞的細胞毒性測試，(A)為對照樣，(B) (C) (D)分別為加入20，40，60 μ L濃度為O. 6mg/mL的(Hb/DHP) 6血紅蛋白微膠囊后細胞的存活率。圖4為實施例I制備的(HVDHP)6血紅蛋白微膠囊對血漿凝血時間的影響，包括前凝血酶時間(PT)，凝血酶時間(TT)和活化部分凝血激酶時間(APTT)。
具體實施方式

下面通過具體實施例對本發(fā)明的方法進行說明，但本發(fā)明并不局限性于此。下述實施例中所述實驗方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法；所述試劑和材料，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑獲得。實施例I(I)制備具有二醒結(jié)構(gòu)的氧化肝素(Dialdehyde Heparin, DHP)用蒸餾水將O. 6g肝素配制成質(zhì)量濃度為I %的水溶液，向其中加入O. 65g高碘酸鈉，避光反應(yīng)24h后加入適量乙二醇終止反應(yīng)。溶液與O. 5g氯化鈉混合后用150mL無水乙醇使產(chǎn)物沉淀析出，抽濾并用去離子水溶解沉淀，再次用乙醇析出，抽濾，重復此步驟3次，將產(chǎn)物裝入表面皿，50°C真空干燥24h，即可制得DHP。(2)基于西佛堿鍵組裝的生物相容的血紅蛋白微膠囊首先，將粒徑為4 μ m的碳酸錳粒子分散到含有O. IM氯化鈉的4mg/mL牛血紅蛋白(hemoglobin,Hb)的醋酸鹽緩沖溶液(pH = 5)中，振蕩吸附Ih后，離心分離，充分洗滌后，再分散到含有O. IM氯化鈉的4mg/mL DHP的醋酸鹽緩沖溶液(pH = 5)中吸附12h，DHP上的醛基與粒子表面上Hb的氨基反應(yīng)，由此，DHP借助與Hb間的反應(yīng)接到了粒子表面，洗滌3次。至此完成一個組裝周期。然后再將上述粒子分散到含有O. IM氯化鈉的4mg/mL Hb的醋酸鹽緩沖溶液(pH = 5)中吸附12h，同樣Hb的氨基會與粒子表面DHP中過量的醛基反應(yīng)，從而將Hb固定在粒子表面，洗滌3次；接著再吸附DHP。依次重復吸附Hb、DHP的操作，直到所需的層數(shù)。然后，將包覆著多層Hb/DHP的碳酸錳粒子分散到O. IM的乙二胺四乙酸二鈉鹽溶液中，可分批溶解直到得到中空微膠囊，接著離心，用pH = 7. 4的PBS溶液洗滌，重復離心和洗滌3次后，將制備得到的中空微膠囊分散在6mLpH = 7. 4的PBS溶液中，4°C存放以備用。對上述方法制備的(HVDHP)6血紅蛋白微膠囊進行細胞毒性測試。以人胚胎皮膚成纖維細胞(ESF)為例進行細胞毒性測試。ESF細胞密度大約為5X104cells/mL，細胞在聚苯乙烯(Corning)培養(yǎng)皿中培養(yǎng)。培養(yǎng)基中含10% (v/v% )的胎牛血清，I %的鏈霉素和青霉素，培養(yǎng)基每兩天更換一次。培養(yǎng)箱(STERI 371, ThermoElectron Corporation)溫度設(shè)定為37°C,含有5% (v/v% ) CO2的濕空氣。當細胞達到90%的生長期時，用標準的消化技術(shù)將他們分在24孔板中進行培養(yǎng)，根據(jù)細胞的培養(yǎng)情況，約兩天后，吸取培養(yǎng)液，換新液，其中一列中不加入任何樣品，作參比樣，另外幾列中分別加入不同體積(20，40，60 μ L) (Hb/DHP)6血紅蛋白微膠囊樣品溶液(以Hb濃度計為O. 6mg/mL)，繼續(xù)培養(yǎng)12小時。為了測定細胞的活性，在每孔中各加入40 μ L MTT溶液(濃度為IOmg/mL)，用鋁箔包裹培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱中溫育4h。去除孔中的培養(yǎng)基和MTT，然后在孔中各加入400 μ L DMSO，震蕩lOmin，充分溶解沉淀在培養(yǎng)板底部的MTT-甲臜晶體。立即使用紫外-可見光光譜儀檢測其在570nm處的吸光值，以防止產(chǎn)物變質(zhì)。結(jié)果見圖3，由圖3可知，加入微膠囊后沒有對細胞的生長造成影響，說明微膠囊無細胞毒性，是生物相容的?？疾?Hb/DHP)6血紅蛋白微膠囊對血漿凝血時間的影響，包括前凝血酶時間(PT)，凝血酶時間(TT)和活化部分凝血激酶時間(APTT)。方法如下將新鮮的人全血在4°C，3000r/min下離心15min后取上層清液得到貧血小板血衆(zhòng)，取100 μ L貧血小板血衆(zhòng)與20 μ L(Hb/DHP)6血紅蛋白微膠囊樣品溶液(以Hb濃度計為O. 6mg/mL)混合，在37°C下培養(yǎng)30min，然后通過CA-1500自動凝血分析儀進行測量，結(jié)果見圖4。由圖4可知，加入微膠囊后前凝血酶時間(PT)，凝血酶時間(TT)和活化部分凝血激酶時間(APTT)略微升高，但仍保持在正常值范圍內(nèi)，說明血液中加入微膠囊后不會造成凝血現(xiàn)象，因此該微膠囊具有血液相容性。 對(HVDHP)6血紅蛋白微膠囊的溶血率進行測定，具體方法如下將新鮮的人全血用12%的雙草酸(草酸鉀和草酸鈉)或肝素做抗凝劑。取此血8mL，加入IOmL生理鹽水得到稀釋的人血，將100 μ L(HVDHP)6血紅蛋白微膠囊溶液(以Hb濃度計為O. 6mg/mL)置于IOmL生理鹽水中，37°C下恒溫30min后加入O. 2mL稀釋血，輕輕搖勻，在水浴中繼續(xù)保持60min。陰性對照樣中是IOmL生理鹽水中加入O. 2mL稀釋血，陽性對照樣中是IOmL去離子水中加入O. 2mL稀釋血。相同條件下培養(yǎng)60min后，以1000r/min的速度離心分離,取上層溶液，用紫外分光光度計測定該溶液在545nm處的吸光度。溶血率(％ )=(試樣吸光度-陰性吸光度)/(陽性吸光度-陰性吸光度)X 100%，結(jié)果見表1，由表I可知，微膠囊的溶血率為O. 68%，遠遠小于公認所允許的5%，說明血液中加入微膠囊后不會產(chǎn)生溶血現(xiàn)象，從而再次說明該微膠囊是血液相容的。表I樣品的溶血率
權(quán)利要求
1.一種制備血紅蛋白微膠囊的方法，包括下述步驟 (a)將模板粒子分散到含有組分I的溶液中吸附，得到了吸附組分I的模板粒子；其中，所述組分I為血紅蛋白； (b)將步驟(a)得到的粒子再分散到含有組分2的溶液中吸附，得到所述血紅蛋白微膠囊；所述組分2為多糖或多糖的衍生物，所述多糖的衍生物是多糖的部分或全部羥基被氧化成醛基而得到的。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于以所述步驟(a)和(b)作為一次組裝處理，所述方法還包括將步驟(b)得到的血紅蛋白微膠囊作為模板粒子重復所述組裝處理至少一次的步驟。
3.根據(jù)權(quán)利要求I或2所述的方法，其特征在于所述血紅蛋白選自下述至少一種人血紅蛋白、牛血紅蛋白、羊血紅蛋白、馬血紅蛋白、狗血紅蛋白和豬血紅蛋白； 所述多糖的衍生物是下述至少一種多糖的衍生物肝素、殼聚糖、透明質(zhì)酸、海藻酸鈉、淀粉、纖維素和葡聚糖； 在制備所述多糖的衍生物中，所采用的氧化試劑是高碘酸或其水溶性鹽。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3中任一項所述的方法，其特征在于步驟(a)中所述含有組分I的溶液為含有氯化鈉的血紅蛋白的醋酸鹽緩沖溶液，其pH值為5-9 ;其中，氯化鈉的濃度為O.1-0. 5mol/L,血紅蛋白的濃度為4-lOmg/mL ； 步驟(b)中所述含有組分2的溶液為含有氯化鈉的多糖或多糖的衍生物的醋酸鹽緩沖溶液，其PH值為5-9 ;其中，氯化鈉的濃度為O. 1-0. 5mol/L，多糖或多糖的衍生物的濃度為4~10mg/mT,n
5.根據(jù)權(quán)利要求1-4中任一項所述的方法，其特征在于步驟(a)中所述吸附的時間為O. 5-4小時，優(yōu)選I小時；步驟(b)中所述吸附的時間為4-24小時，優(yōu)選12小時。
6.根據(jù)權(quán)利要求1-5中任一項所述的方法，其特征在于所述模板粒子為生物相容和生物可降解的粒子，或生物不相容和/或生物不可降解的粒子； 所述生物相容和生物可降解的粒子優(yōu)選為二氧化硅粒子、蛋白質(zhì)球或多糖球； 所述生物不相容和/或生物不可降解的粒子優(yōu)選為碳酸錳粒子、碳酸鎘粒子、碳酸鈣粒子或聚苯乙烯膠體粒子。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于所述模板粒子為生物不相容和/或生物不可降解的粒子；所述方法還包括除去所述模板粒子的步驟。
8.根據(jù)權(quán)利要求1-7中任一項所述的方法，其特征在于所述方法還包括在所述含有組分I的溶液中或在含有組分2的溶液中加入別構(gòu)效應(yīng)調(diào)節(jié)劑和/或輔助酶；或在所述血紅蛋白微膠囊的外表面用生物靶向分子或功能性分子修飾。
9.權(quán)利要求1-8中任一項所述方法制備得到的血紅蛋白微膠囊。
10.權(quán)利要求9所述的血紅蛋白微膠囊在制備下述產(chǎn)品中的應(yīng)用1)血液代用品；2)用于腫瘤氧化處理的產(chǎn)品；3)局部缺血部位的氧氣供給液；4)器官保存的灌注液；5)體外循環(huán)補充液；6)治療慢性貧血的制劑；7)氧載體。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種血紅蛋白微膠囊及其制備方法。該血紅蛋白微膠囊是基于西佛堿鍵層層組裝制成的生物相容、血液相容的血紅蛋白微膠囊血液代用品；其所用囊壁成分為生物相容和生物可降解的多糖衍生物和血紅蛋白，囊壁成分之間形成了西佛堿鍵，未使用額外的有毒的交聯(lián)劑。本發(fā)明得到的血紅蛋白微膠囊血液代用品兼?zhèn)浞€(wěn)定性好，生物相容，血液相容，生物可降解，無毒，無需使用交聯(lián)劑，并且尺寸、結(jié)構(gòu)和功能可調(diào)控。
文檔編號A61P7/06GK102871985SQ20111019544
公開日2013年1月16日 申請日期2011年7月13日 優(yōu)先權(quán)日2011年7月13日
發(fā)明者李峻柏, 賈怡, 崔岳, 費進波, 楊洋 申請人:中國科學院化學研究所