專利名稱：一種醫(yī)用骨骼復(fù)合支架及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種支架及其制備方法，特別是一種醫(yī)用骨骼復(fù)合支架及其制備方法。屬于醫(yī)療器械的技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
由于外傷、感染、腫瘤等因素而使骨喪失了一些骨質(zhì)，形成較大的間隙，稱為骨缺損。絕大多數(shù)骨缺損都難以愈合，最后形成骨不連。由于缺損間隙大，成骨細(xì)胞難以爬過間隙而不能發(fā)生正常的愈合過程，僅由纖維組織充填。而對(duì)于骨缺損的治療是骨科領(lǐng)域的一個(gè)疑難且具有挑戰(zhàn)性的課題，臨床上主要通過自體、異體組織移植和生物替代材料來達(dá)到一定的治療目的。目前最常用的自體組織移植，由于來源不足、創(chuàng)傷大、供區(qū)合并癥等不利因素，限制了臨床上應(yīng)用；而異體組織移植存在異體排斥反應(yīng)、來源有限、具有傳播疾病的危險(xiǎn)等因素；所以，尋找不損害自身，又可達(dá)到預(yù)期骨缺損修復(fù)的功能效果的替代物成為臨床工作者追求的目標(biāo)。組織工程學(xué)技術(shù)為解決這一難題提供了新的思路和方法。組織工程的基本方法是將體外培養(yǎng)的高濃度組織細(xì)胞擴(kuò)增后吸附于生物相容性好、可被人體降解吸收的組織工程支架材料上，該材料的功能是為細(xì)胞提供生存空間，使細(xì)胞獲得足夠的營養(yǎng)物質(zhì)，進(jìn)行氣體交換，并使細(xì)胞按預(yù)制形態(tài)的三維支架生長，然后將細(xì)胞和生物材料的復(fù)合體植入機(jī)體病損部位，在生物支架降解吸收過程中，種植的細(xì)胞繼續(xù)增殖繁殖，形成新的具有原來特殊功能和形態(tài)的相應(yīng)組織和器官，以達(dá)到修復(fù)創(chuàng)傷和重建功能的目的。骨組織工程學(xué)是組織工程的一個(gè)重要的分支，有望首先在臨床得到應(yīng)用。目前已經(jīng)逐漸形成了較為完善的關(guān)于種子細(xì)胞、細(xì)胞載體支架及組織構(gòu)建的理論和技術(shù)路線。但不可否認(rèn)的是這些成果距離骨組織工程最終在臨床的應(yīng)用尚有一定距離。因此現(xiàn)階段研究的熱點(diǎn)仍集中于尋找合適的種子細(xì)胞、材料和體內(nèi)構(gòu)建方式，尋找三者的最佳組合，模擬人體骨修復(fù)的自然過程，最大限度的重現(xiàn)骨結(jié)構(gòu)和功能。目前，骨組織工程研究的熱點(diǎn)集中在種子細(xì)胞、支架材料、生物活性因子三方面。其中支架材料在組織工程中的作用是提供一種多孔材料作為組織再生的構(gòu)架，將體外培養(yǎng)細(xì)胞種植其上，并回植入體內(nèi)，引導(dǎo)所需組織的不斷生長，同時(shí)構(gòu)架材料逐漸消失，最終在原構(gòu)架區(qū)內(nèi)形成和再生出完全有生命的組織，實(shí)現(xiàn)永久的修復(fù)。理想的支架材料需符合以下條件(1)材料表面結(jié)構(gòu)及性質(zhì)有利于細(xì)胞吸附、增殖和分化；( 按可控制的速度進(jìn)行降解；C3)良好的生物相容性；(4)易制成三維多孔狀， 以及易加工成不規(guī)則的幾何形態(tài)；( 具有一定的機(jī)械強(qiáng)度能支持生理壓力；(6)能保持對(duì)細(xì)胞的分化，不會(huì)使細(xì)胞產(chǎn)生變異。目前骨組織工程多孔支架材料的制備方法及過程在國內(nèi)以基本成熟，采用的支架材料主要有人工合成材料和天然生物衍生材料及復(fù)合材料，其中以聚乙酸(polyglycolic Acid, PGA)、聚乳酸(polylactic Acid, PLA)、磷酸三鈣 (tricalcium phosphate，TCP)、羥基磷灰石(hydroxy lapatite, HA)等較為常用。通過研究的深入人們發(fā)現(xiàn)，上述幾種材料在進(jìn)一步的研究過程中其生物降解性和成骨作用都有不足之處；PGA、PLA雖具有較好的生物相容性、可降解性和可吸收性，但存在費(fèi)用昂貴、可塑性差等缺點(diǎn)，而且降解后的酸性代謝產(chǎn)物會(huì)降低聚合物周圍的PH值，影響細(xì)胞和組織的生長，還可引起纖維化及發(fā)生周圍組織的免疫反應(yīng)。HA存在植入后難以吸收替代、長期滯留于體內(nèi)妨礙骨組織的改建和完全修復(fù)等缺點(diǎn).那么我們不妨將思路拓寬來尋找一些新的材料-醫(yī)用級(jí)硫酸鈣(Medical-grade Calcium Sulfate)，它具有良好的生物相容性、降解性和成骨作用，使其作為制備支架的原材料必將會(huì)得到良好的效果和應(yīng)用價(jià)值。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的發(fā)明一種醫(yī)用骨骼復(fù)合支架及其制備方法。經(jīng)過多種研究發(fā)現(xiàn)，硫酸鈣是一種骨引導(dǎo)性材料，主要作為空隙的填充物，它能恢復(fù)骨的形態(tài)輪廓，阻止軟組織長入。它為血管和成骨細(xì)胞的長入提供了骨引導(dǎo)性的基質(zhì)。本發(fā)明的一種醫(yī)用骨骼復(fù)合支架的制備方法，其制備步驟如下將2重量份的醫(yī)用硫酸鈣(上海睿研生物科技有限公司)放入23. 5重量份的去離子水中，形成渾懸液；再將1重量份的I型膠原充分溶解于23. 5重量份的0. 5Mol/L的醋酸溶液中；I型膠原膠原是一種天然的纖維蛋白，白色，不透明，無支鏈，主要存在于動(dòng)物的皮骨肌腱等組織中，是結(jié)締組織中重要的結(jié)構(gòu)蛋白，起著支撐器官，保護(hù)機(jī)體的功能V膠原蛋白是哺乳動(dòng)物體內(nèi)含量最多的蛋白質(zhì)占人體或其它動(dòng)物體蛋白質(zhì)總含量的25%到35%，2004年確認(rèn)的膠原蛋白已有27種，最常見的膠原蛋白有I、II、III型其中I型膠原蛋白含量最多，應(yīng)用最為廣泛，對(duì)其進(jìn)行的研究也最多。本發(fā)明采用的I型膠原商購自上海睿研生物科技有限公司。膠原醋酸溶液中緩慢滴入醫(yī)用硫酸鈣渾懸液形成“中間液”，將50重量份的 0. 05mol/L的NaOH(天津市化學(xué)試劑三廠)溶液緩慢滴入“中間液”中并攪拌，保持30min， 容器底部出現(xiàn)膠凍樣沉淀物，去除上層清液，保留膠凍樣沉淀物，將其分管，倒入離心管， 一并放入預(yù)先制備好的異種脫蛋白松質(zhì)骨；將異種松質(zhì)骨骨塊采用1 1的氯仿-甲醇液脫脂Mh，50°C蒸餾水震蕩沖洗，20 % H202浸漬Mh，反復(fù)3次。將處理后的骨塊置于蒸餾水中，于室溫下浸泡透析Mh，烘干后，60Co γ射線2. 5X105Gry,照射30min后，取出置于4°C冰箱備用，離心去上清液。其中，所述的異種脫蛋白松質(zhì)骨的制備方法如下取成年豬股骨遠(yuǎn)端松質(zhì)部分，所截取骨塊內(nèi)不含軟骨及皮質(zhì)骨成分，-70°C冷凍干燥后，制成 3. OcmXO. 5cmX0. 5cm大小，其長軸與所取松質(zhì)骨骨小梁排列方向一致，取材各骨塊的表觀孔隙密度基本相同。所得樣品冷凍干燥，得到I型膠原/醫(yī)用硫酸鈣/異種脫蛋白松質(zhì)骨復(fù)合支架；7令凍干燥的條件溫度:-800C ；壓力0. 13Pa 時(shí)間24小時(shí)。將所得材料塊放人0. 25%戊二醛溶液(天津市化學(xué)試劑三廠)內(nèi)進(jìn)行化學(xué)交聯(lián) 24h ；交聯(lián)完成后將材料塊置于4°C去離子水中漂洗1周，每天換水2次，去除殘余的未結(jié)合戊二醛溶液，干燥后即得到本發(fā)明的產(chǎn)品。有益效果支架表層及孔壁涂有均勻一致的醫(yī)用硫酸鈣，孔內(nèi)無醫(yī)用硫酸鈣堆積，具有相互連通的孔隙結(jié)構(gòu)，孔隙率高，孔徑約為110士 12um，孔隙率約為(72. 1 士3. 5) %，仿生三維空間結(jié)構(gòu)利于提供良好的成骨細(xì)胞生長環(huán)境，抗壓強(qiáng)度為43士3. 植入機(jī)體骨缺損部位能夠滿足生物力學(xué)強(qiáng)度。通過體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)證實(shí)支架材料不規(guī)則的高密度孔隙網(wǎng)架結(jié)構(gòu)，類似于松質(zhì)骨結(jié)構(gòu)，具有良好的骨傳導(dǎo)、骨誘導(dǎo)能力，有利于骨組織的長入和材料自身的生物降解；植入體內(nèi)無排斥反應(yīng)，無過敏反應(yīng)，亦具有良好的生物相容性，符合醫(yī)用生物材料應(yīng)用于生物體的要求。支架可作為理想的骨替代物在臨床應(yīng)用中會(huì)有廣闊的前景。當(dāng)醫(yī)用硫酸鈣被吸收，新骨塑形并恢復(fù)解剖學(xué)特點(diǎn)和結(jié)構(gòu)特性。其最重要的優(yōu)點(diǎn)是其自然吸收速度與新骨形成速度相當(dāng)。隨著醫(yī)用硫酸鈣植入物的吸收，新骨逐漸恢復(fù)解剖性質(zhì)及結(jié)構(gòu)特點(diǎn)。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1本發(fā)明的一種醫(yī)用骨骼復(fù)合支架的制備方法，其制備步驟如下將2重量份的醫(yī)用硫酸鈣放入23. 5重量份的去離子水中，形成渾懸液；再將1重量份的I型膠(上海睿研生物科技有限公司)原充分溶解于23. 5重量份的0. 5Mol/L的醋酸溶液中；采用的I型膠原商購自上海佳和生物科技有限公司。膠原醋酸溶液中緩慢滴入醫(yī)用硫酸鈣渾懸液形成“中間液”，將50重量份的 0. 05mol/L的NaOH溶液(天津市化學(xué)試劑三廠)緩慢滴入“中間液”中并攪拌，保持30min， 容器底部出現(xiàn)膠凍樣沉淀物，去除上層清液，保留膠凍樣沉淀物，將其分管，倒入離心管， 一并放入預(yù)先制備好的異種脫蛋白松質(zhì)骨；將異種松質(zhì)骨骨塊采用1 :1的氯仿-甲醇液脫脂Mh，50°C蒸餾水震蕩沖洗，20% H2O2浸漬Mh，反復(fù)3次。將處理后的骨塊置于蒸餾水中，于室溫下浸泡透析Mh，烘干后，60Co γ射線2. 5X105Gry,照射30min后，取出置于4°C冰箱備用，離心去上清液。其中，所述的異種脫蛋白松質(zhì)骨的制備方法如下取成年豬股骨遠(yuǎn)端松質(zhì)部分，所截取骨塊內(nèi)不含軟骨及皮質(zhì)骨成分，-70°C冷凍干燥后，制成 3. OcmXO. 5cmX0. 5cm大小，其長軸與所取松質(zhì)骨骨小梁排列方向一致，取材各骨塊的表觀孔隙密度基本相同。所得樣品冷凍干燥，得到I型膠原/醫(yī)用硫酸鈣/異種脫蛋白松質(zhì)骨復(fù)合支架；冷凍干燥的條件溫度:-800C ；壓力0. 13Pa 時(shí)間24小時(shí)。將所得材料塊放人0. 25%戊二醛溶液(北京清海洋科技有限公司)內(nèi)進(jìn)行化學(xué)交聯(lián) 24h ；交聯(lián)完成后將材料塊置于4°C去離子水中漂洗1周，每天換水2次，去除殘余的未結(jié)合戊二醛溶液，干燥后即得到本發(fā)明的產(chǎn)品。實(shí)施例2本發(fā)明的一種醫(yī)用骨骼復(fù)合支架的制備方法，其制備步驟如下將2重量份的醫(yī)用硫酸鈣放入23. 5重量份的去離子水中，形成渾懸液；再將1重量份的I型膠原充分溶解于23. 5重量份的0. 5Mol/L的醋酸溶液中；I型膠原膠原是一種天然的纖維蛋白，白色，不透明，無支鏈，主要存在于動(dòng)物的皮骨肌腱等組織中，是結(jié)締組織中重要的結(jié)構(gòu)蛋白，起著支撐器官，保護(hù)機(jī)體的功能V膠原蛋白是哺乳動(dòng)物體內(nèi)含量最多的蛋白質(zhì)占人體或其它動(dòng)物體蛋白質(zhì)總含量的25%到35%，2004年確認(rèn)的膠原蛋白已有27種，最常見的膠原蛋白有I、II、III型其中I型膠原蛋白含量最多，應(yīng)用最為廣泛，對(duì)其進(jìn)行的研究也最多。本發(fā)明采用的I型膠原商購自上海睿研生物科技有限公司。膠原醋酸溶液中緩慢滴入醫(yī)用硫酸鈣渾懸液形成“中間液”，將50重量份的 0. 05mol/L的NaOH溶液緩慢滴入“中間液”中并攪拌，保持30min，容器底部出現(xiàn)膠凍樣沉淀物，去除上層清液，保留膠凍樣沉淀物，將其分管，倒入離心管，一并放入預(yù)先制備好的異種脫蛋白松質(zhì)骨；將異種松質(zhì)骨骨塊采用1 1的氯仿-甲醇液脫脂Mh，50°c蒸餾水震蕩沖洗，20% H202浸漬Mh，反復(fù)3次。將處理后的骨塊置于蒸餾水中，于室溫下浸泡透析Mh， 烘干后，60Co γ射線2. 5X105Gry,照射30min后，取出置于4°C冰箱備用，離心去上清液。 其中，所述的異種脫蛋白松質(zhì)骨的制備方法如下取成年豬股骨遠(yuǎn)端松質(zhì)部分，所截取骨塊內(nèi)不含軟骨及皮質(zhì)骨成分，-70°C冷凍干燥后，制成3. OcmXO. 5cmX0. 5cm大小，其長軸與所取松質(zhì)骨骨小梁排列方向一致，取材各骨塊的表觀孔隙密度基本相同。所得樣品冷凍干燥，得到I型膠原/醫(yī)用硫酸鈣/異種脫蛋白松質(zhì)骨復(fù)合支架；冷凍干燥的條件溫度:-800C ；壓力0. 13Pa 時(shí)間24小時(shí)。將所得材料塊放人0. 25%戊二醛溶液(天津市化學(xué)試劑三廠)內(nèi)進(jìn)行化學(xué)交聯(lián) 24h ；交聯(lián)完成后將材料塊置于4°C去離子水中漂洗1周，每天換水2次，去除殘余的未結(jié)合戊二醛溶液，干燥后即得到本發(fā)明的產(chǎn)品。經(jīng)掃描后，電鏡SEM形貌圖可以測(cè)出，所得本發(fā)明支架孔徑分布在120 280 μ m 之間，孔洞之間互相連通，而且材料內(nèi)部微孔豐富、分布均勻，呈現(xiàn)疏松珊瑚狀結(jié)構(gòu)。這種結(jié)構(gòu)類似于生物活體的松質(zhì)骨構(gòu)架，它有利于骨組織的長入和材料自身的生物降解。當(dāng)醫(yī)用硫酸鈣被吸收，新骨塑形并恢復(fù)解剖學(xué)特點(diǎn)和結(jié)構(gòu)特性。其最重要的優(yōu)點(diǎn)是其自然吸收速度與新骨形成速度相當(dāng)。隨著醫(yī)用硫酸鈣植入物的吸收，新骨逐漸恢復(fù)解剖性質(zhì)及結(jié)構(gòu)特點(diǎn)ο
權(quán)利要求
1.一種醫(yī)用骨骼復(fù)合支架的制備方法，其特征在于制備步驟如下1)將2重量份的醫(yī)用硫酸鈣放入23.5重量份的去離子水中，形成渾懸液；2)再將1重量份的I型膠原充分溶解于23.5重量份的0. 5Mol/L的醋酸溶液中；3)膠原醋酸溶液中緩慢滴入醫(yī)用硫酸鈣渾懸液形成“中間液”，將50重量份的 0. 05mol/L的NaOH溶液緩慢滴入“中間液”中并攪拌，保持30min，容器底部出現(xiàn)膠凍樣沉淀物，去除上層清液，保留膠凍樣沉淀物，將其分管，倒入離心管，一并放入預(yù)先制備好的異種脫蛋白松質(zhì)骨；將異種松質(zhì)骨骨塊采用1 1的氯仿-甲醇液脫脂Mh，50°C蒸餾水震蕩沖洗，20% H202浸漬Mh，反復(fù)3次。將處理后的骨塊置于蒸餾水中，于室溫下浸泡透析Mh， 烘干后，60Co γ射線2. 5X 105Gry，照射30min后，取出置于4°C冰箱備用，離心去上清液。4)所得樣品冷凍干燥，得到I型膠原/醫(yī)用硫酸鈣/異種脫蛋白松質(zhì)骨復(fù)合支架；5)將所得材料塊放人0.25%戊二醛溶液內(nèi)進(jìn)行化學(xué)交聯(lián)Mh ；6)交聯(lián)完成后將材料塊置于4°C去離子水中漂洗1周，每天換水2次，去除殘余的未結(jié)合戊二醛溶液，干燥后即得到本發(fā)明的產(chǎn)品。
2.如權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于所述步驟2)中I型膠原膠原是一種天然的纖維蛋白，白色，不透明，無支鏈，主要存在于動(dòng)物的皮骨肌腱等組織中，是結(jié)締組織中重要的結(jié)構(gòu)蛋白，起著支撐器官，保護(hù)機(jī)體的功能V膠原蛋白是哺乳動(dòng)物體內(nèi)含量最多的蛋白質(zhì)占人體或其它動(dòng)物體蛋白質(zhì)總含量的25%到35%，2004年確認(rèn)的膠原蛋白已有 27種，最常見的膠原蛋白有I、II、III型其中I型膠原蛋白含量最多，應(yīng)用最為廣泛，對(duì)其進(jìn)行的研究也最多。本發(fā)明采用的I型膠原商購自上海睿研生物科技有限公司。
3.如權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于所述步驟幻中異種脫蛋白松質(zhì)骨的制備方法如下取成年豬股骨遠(yuǎn)端松質(zhì)部分，所截取骨塊內(nèi)不含軟骨及皮質(zhì)骨成分，-70°C冷凍干燥后，制成3. OcmXO. 5cmX0. 5cm大小，其長軸與所取松質(zhì)骨骨小梁排列方向一致，取材各骨塊的表觀孔隙密度基本相同。
4.如權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于所述步驟4)中冷凍干燥的條件溫度:-800C ；壓力0. 13Pa 時(shí)間24小時(shí)。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種支架及其制備方法，特別是一種醫(yī)用骨骼復(fù)合支架及其制備方法。屬于醫(yī)療器械的技術(shù)領(lǐng)域。將2重量份的醫(yī)用硫酸鈣放入23.5重量份的去離子水中，形成渾懸液；再將1重量份的I型膠原充分溶解于23.5重量份的0.5mol/L的醋酸溶液中。在膠原醋酸溶液中同時(shí)緩慢滴入醫(yī)用硫酸鈣渾懸液和50重量份的0.05mol/L的NaOH溶液并攪拌，混合液中出現(xiàn)絮狀沉淀物，保持30min，在經(jīng)過浸泡等工藝，最終干燥后支架制備完成。本發(fā)明產(chǎn)品植入體內(nèi)無排斥反應(yīng)，無過敏反應(yīng)，亦具有良好的生物相容性，符合醫(yī)用生物材料應(yīng)用于生物體的要求。支架可作為理想的骨替代物在臨床應(yīng)用中會(huì)有廣闊的前景。
文檔編號(hào)A61L27/24GK102302802SQ20111027370
公開日2012年1月4日 申請(qǐng)日期2011年9月16日 優(yōu)先權(quán)日2011年9月16日
發(fā)明者劉亮, 孫海鈺, 栗樹偉, 王東, 范偉 申請(qǐng)人:孫海鈺, 栗樹偉, 王東