專利名稱：一種低分子量卡拉膠寡糖及其制備方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于海洋藥物領(lǐng)域，尤其涉及一種低分子量卡拉膠寡糖及其制備方法和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
甲型、流感病毒(Influenza A Virus, IAV)屬于正粘病毒科(Orthomyxoviridae), 是具有包膜的負(fù)鏈RNA病毒；根據(jù)其表面的血凝素蛋白(HA)和神經(jīng)氨酸酶蛋白(NA)的結(jié)構(gòu)及基因特性的不同可分為若干亞型，如H1N1，H5W等。甲型流感病毒(IAV)在上個(gè)世紀(jì)至少引起三次大規(guī)模的流感爆發(fā)，其中最嚴(yán)重的是1918-1919年間爆發(fā)的西班牙流感造成了超過 4000 萬(wàn)人死亡(Lamb et al.，Nat. Med.，2001，7 :1沘6_1沘8)。自 09 年 4 月份以來，發(fā)源于墨西哥的Hmi亞型的甲型流感病毒造成了世界范圍的流感爆發(fā)，給人類的健康帶來了巨大威脅。據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計(jì)，全球每年約有6億人感染流感，約30萬(wàn)人死于流感，直接經(jīng)濟(jì)損失超過100億美元。目前治療甲型流感病毒的藥物主要是兩大類，分別是以離子通道蛋白(IC)為靶點(diǎn)的金剛烷胺和金剛乙胺以及以神經(jīng)氨酸酶(NA)蛋白為靶點(diǎn)的扎那米韋(zanamivir) 和奧司他韋(oseltamivir) (Krug et al.，Trends Pharmacol. Sci.，2009，30 :269-277 ； Kim et al.，J. Am. Chem. Soc.，1997，119 :681-690)。但是由于流感病毒是分節(jié)段的 RNA 病毒，容易發(fā)生變異，所以很容易對(duì)現(xiàn)有藥物產(chǎn)生耐藥性；目前已經(jīng)有研究指出在全球范圍內(nèi)特別是歐洲出現(xiàn)了對(duì)金剛烷胺甚至奧司他韋產(chǎn)生耐藥性的IAV毒株(Moscona，N. Engl. J. Med.，2009，360 :953-956)。另外，現(xiàn)有的抗流感病毒藥物大多具有不同程度的毒副作用，尤其是離子通道阻斷劑具有神經(jīng)毒性等副作用(Hayden et al. ,J. Infect. Dis. ,2006, 194(Suppl.2) :S119-S126)0因此，研發(fā)針對(duì)新作用靶點(diǎn)的低毒有效的抗IAV藥物十分迫切。卡拉膠(Carrageenan)是從海洋紅藻中提取的一種硫酸半乳聚糖，是由1，3_ β -D 半乳糖和1，4_α-D半乳糖交替連接形成的骨架結(jié)構(gòu)。卡拉膠及其降解產(chǎn)物具有免疫調(diào)節(jié)，抗病毒，抗腫瘤等多種生物活性；特別是其抗病毒活性已引起藥物學(xué)家的高度重視。 目前國(guó)內(nèi)外學(xué)者已經(jīng)報(bào)道了一些關(guān)于卡拉膠多糖及其衍生物在抗流感病毒方面的應(yīng)用 (CN100435805C, W02009027057)。但是還沒有關(guān)于卡拉膠寡糖應(yīng)用在抗甲型Hmi亞型流感病毒方面的報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中甲型流感病毒容易對(duì)現(xiàn)有藥物產(chǎn)生耐藥性和現(xiàn)有的抗流感病毒藥物大多具有不同程度的毒副作用的缺陷，本發(fā)明的目的是提供一種低分子量卡拉膠寡糖及其制備方法和在抗甲型Hmi亞型流感病毒感染和增殖中的應(yīng)用。所述卡拉膠寡糖是來源于海洋紅藻的新型低分子量寡糖，它在體外可以顯著抑制甲型Hmi亞型流感病毒的增殖，具有很好的抗流感病毒作用；而且它在一定濃度下，沒有任何細(xì)胞毒性；還具有來源廣泛，成本低廉，安全性高等諸多優(yōu)點(diǎn)，并且在體內(nèi)外水平上都具有較好的抗甲型Hmi流感病毒感染和增殖的活性，為該類藥物的開發(fā)提供了新的途徑。為實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明采用下述技術(shù)方案予以實(shí)現(xiàn)一種低分子量卡拉膠寡糖，它的糖鏈骨架結(jié)構(gòu)為l，3-i3_D半乳糖和l，4-a-D半乳糖交替連接而成，其糖鏈結(jié)構(gòu)為G4S-[A-G4S]n-，n = 1_7，重均分子量為l_3kD。對(duì)技術(shù)方案的進(jìn)一步改進(jìn)所述卡拉膠寡糖的硫酸根含量為8-12%。本發(fā)明還提供了所述的低分子量卡拉膠寡糖的制備方法，在反應(yīng)容器中將精制 κ -卡拉膠加入水中置于80°C水浴下溶解得均勻溶液，再將反應(yīng)容器轉(zhuǎn)移至60°C恒溫水浴中，在攪拌的情況下加入0. 4mol/L硫酸溶液，使κ -卡拉膠終濃度為5 10mg/ml，硫酸終濃度為0. lmol/L，在60°C下水浴攪拌反應(yīng)3 4h ；反應(yīng)結(jié)束后用BaCO3中和反應(yīng)液，精密測(cè)定pH6 7，再逐滴加入NaOH溶液，調(diào)節(jié)pH7 8，將溶液濃縮、冷凍干燥得到κ -卡拉膠寡糖。本發(fā)明還提供了所述的低分子量卡拉膠寡糖在制備用于抗甲型Hmi亞型的流感病毒藥物中的應(yīng)用。對(duì)技術(shù)方案的進(jìn)一步改進(jìn)所述卡拉膠寡糖在濃度為50uM以上可顯著抑制甲型 HlNl流感病毒在MDCK細(xì)胞中的感染和增殖。對(duì)技術(shù)方案的進(jìn)一步改進(jìn)所述卡拉膠寡糖在40mg/kg/day的劑量下作用可顯著減輕IAV感染引起的小鼠肺部炎癥。對(duì)技術(shù)方案的進(jìn)一步改進(jìn)肺指數(shù)抑制率達(dá)到47. 0%，對(duì)于小鼠的死亡保護(hù)率達(dá)到 60%。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和積極效果是本發(fā)明提供的卡拉膠寡糖KCO由于其分子量小，溶解性和穩(wěn)定性都比卡拉膠多糖有了很大提高；并且此寡糖在體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)中可以顯著抑制甲型Hmi亞型流感病毒的增殖， 都呈現(xiàn)出很好的抗甲型Hmi流感病毒的活性。本發(fā)明證實(shí)新型卡拉膠寡糖KCO可以很好地抑制Hmi亞型的甲型流感病毒對(duì)于 MDCK細(xì)胞的感染和增殖過程；不僅可以顯著緩解甲型流感病毒感染引起的小鼠肺部炎癥， 減輕流感引起的小鼠體重下降癥狀；而且還能顯著減少IAV感染引起的小鼠死亡，降低死亡率，延長(zhǎng)生存時(shí)間。本發(fā)明產(chǎn)品來源于海洋天然產(chǎn)物，具有資源豐富易于產(chǎn)業(yè)化，低毒高效等諸多優(yōu)點(diǎn)，能很好地抑制甲型Hmi流感病毒的感染和增殖，在甲型流感病毒的防治方面具有廣闊的市場(chǎng)應(yīng)用前景。結(jié)合附圖閱讀本發(fā)明的具體實(shí)施方式
后，本發(fā)明的其他特點(diǎn)和優(yōu)點(diǎn)將變得更加清林疋。


圖1表明本發(fā)明中卡拉膠寡糖KCO對(duì)于感染甲型流感病毒小鼠的死亡保護(hù)作用， 圖1中，模型組為不加藥的病毒對(duì)照組，利巴韋林為陽(yáng)性對(duì)照組，寡糖KCO為卡拉膠寡糖組， 給藥劑量為40mg/kg/day，模型組給予同樣體積的生理鹽水。
具體實(shí)施方式
下面結(jié)合附圖和具體實(shí)施方式
對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案作進(jìn)一步詳細(xì)的說明。本發(fā)明采用酸降解法從紅藻多糖卡拉膠中分離獲得低分子量的新型κ -卡拉膠寡糖KC0，并試驗(yàn)其在制備抗甲型Hmi亞型流感病毒藥物中的應(yīng)用。實(shí)施例1 新型卡拉膠寡糖的制備將0. 5 Ig精制κ -卡拉膠加入75ml水中，置于80°C水浴下溶解得均勻溶液。 再將反應(yīng)容器轉(zhuǎn)移至60°C恒溫水浴中，待體系溫度穩(wěn)定后，在攪拌的情況下加入25ml的 0. 4mol/L硫酸溶液，使κ -卡拉膠終濃度為5 10mg/ml，硫酸終濃度為0. lmol/L，在此溫度下水浴攪拌反應(yīng)3 4h ；反應(yīng)結(jié)束后用BaCO3中和反應(yīng)液，精密測(cè)定pH 6 7，再逐滴加入0. 4mol/LNaOH溶液，調(diào)節(jié)pH7 8，將溶液濃縮至5ml，冷凍干燥得到κ -卡拉膠寡糖 (KCO)。制得的所述κ -卡拉膠寡糖(KCO)為一種低分子量卡拉膠寡糖，它的糖鏈骨架結(jié)構(gòu)是由1，3-β-D半乳糖(4-硫酸半乳糖，G4S)和1，4-α-D半乳糖(3，6-內(nèi)醚半乳糖，Α)交替連接而成，重均分子量約為l_3kD，其糖鏈結(jié)構(gòu)可表述為G4S-[A-G4S]n-，其中，η = 1-7, 硫酸根含量為8-12%。實(shí)施例2 卡拉膠寡糖抗甲型Hmi亞型流感病毒的活性評(píng)價(jià)將得到的所述卡拉膠寡糖按照本領(lǐng)域通用的測(cè)試對(duì)流感病毒作用的方法，評(píng)價(jià)它對(duì)甲型Hmi亞型的流感病毒的體內(nèi)外感染和增殖的影響，具體實(shí)驗(yàn)和結(jié)果如下。1、卡拉膠寡糖KCO體外抗甲型Hmi流感病毒復(fù)制作用利用甲型流感病毒小鼠適應(yīng)株Hmi (A/PR/8/34，中科院武漢病毒所提供)感染狗腎上皮細(xì)胞(MDCK)建立細(xì)胞模型，并利用此細(xì)胞模型結(jié)合CPE抑制試驗(yàn)、病毒滴度測(cè)定實(shí)驗(yàn)(TCID5tl法)和MTT法分別檢測(cè)卡拉膠寡糖KCO對(duì)于IAV的抑制活性以及細(xì)胞毒性的大小，并且計(jì)算半數(shù)抑制濃度IC5tl和半數(shù)細(xì)胞毒性濃度CC5tl，陽(yáng)性對(duì)照藥物選擇利巴韋林。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表1所示，卡拉膠寡糖KCO對(duì)于IAV的抑制活性非常顯著(IC5tl = 12. 8 μ Μ)，且細(xì)胞毒性較小(CC50 = 342. 8 μ Μ),治療指數(shù)SI (CC50/IC50)達(dá)到26. 8。與廣譜的抗病毒藥物利巴韋林相比，卡拉膠寡糖KCO起效的藥物濃度更低，IC50值遠(yuǎn)小于利巴韋林 (IC50 = 112. 3 μ M)，且兩者的治療指數(shù)相近(Si > 25.0)。說明卡拉膠寡糖具有較好的體外抑制甲型流感病毒感染和增殖的作用。表1卡拉膠寡糖KCO體外抗甲型Him流感病毒結(jié)果
權(quán)利要求
1.一種低分子量卡拉膠寡糖，其特征在于它的糖鏈骨架結(jié)構(gòu)為l，3-i3-D半乳糖和 1，4-α-D半乳糖交替連接而成，其糖鏈結(jié)構(gòu)為G4S-[A-G4S]n-，n=l_7，重均分子量為1_3 kD。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種低分子量卡拉膠寡糖，其特征在于所述卡拉膠寡糖的硫酸根含量為8-12%。
3.一種根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的低分子量卡拉膠寡糖的制備方法，其特征在于在反應(yīng)容器中將精制κ -卡拉膠加入水中置于80°C水浴下溶解得均勻溶液，再將反應(yīng)容器轉(zhuǎn)移至60°C恒溫水浴中，在攪拌的情況下加入0.4 mol/L硫酸溶液，使κ-卡拉膠終濃度為5 10 mg/ml，硫酸終濃度為0. lmol/L，在60°C下水浴攪拌反應(yīng)3 4 h ；反應(yīng)結(jié)束后用BaCO3 中和反應(yīng)液，精密測(cè)定pH 6 7，再逐滴加入NaOH溶液，調(diào)節(jié)pH7 8，將溶液濃縮、冷凍干燥得到κ-卡拉膠寡糖。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的低分子量卡拉膠寡糖在制備用于抗甲型Hmi亞型的流感病毒藥物中的應(yīng)用。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的低分子量卡拉膠寡糖在制備用于抗甲型Hmi亞型的流感病毒藥物中的應(yīng)用，其特征在于所述卡拉膠寡糖在濃度為50 uM以上可顯著抑制甲型Hmi 流感病毒在MDCK細(xì)胞中的感染和增殖。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的低分子量卡拉膠寡糖在制備用于抗甲型Hmi亞型的流感病毒藥物中的應(yīng)用，其特征在于所述卡拉膠寡糖在40 mg/kg/day的劑量下作用可顯著減輕 IAV感染引起的小鼠肺部炎癥。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的低分子量卡拉膠寡糖在制備用于抗甲型Hmi亞型的流感病毒藥物中的應(yīng)用，其特征在于肺指數(shù)抑制率達(dá)到47. 0%,對(duì)于小鼠的死亡保護(hù)率達(dá)到60%。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種低分子量卡拉膠寡糖，其糖骨架由1,3-β-D半乳糖和1,4-α-D半乳糖交替連接而成，重均分子量為1-3kD，結(jié)構(gòu)式表述為G4S-[A-G4S]n-，其中，n=1-7，硫酸根含量為8-12%。本發(fā)明的卡拉膠寡糖不僅可在體外抵抗甲型H1N1亞型流感病毒的感染；還能顯著減輕病毒感染引起的小鼠肺部炎癥，降低死亡率，延長(zhǎng)生存時(shí)間；本發(fā)明的卡拉膠寡糖來源于海洋紅藻，具有來源廣泛，低毒高效等諸多優(yōu)點(diǎn)，能很好地抑制甲型流感病毒的體內(nèi)外感染，在甲型流感病毒的防治方面具有廣闊的市場(chǎng)應(yīng)用前景。
文檔編號(hào)A61P11/00GK102516323SQ201110327780
公開日2012年6月27日 申請(qǐng)日期2011年10月25日 優(yōu)先權(quán)日2011年10月25日
發(fā)明者張攀, 李春霞, 王偉, 管華詩(shī) 申請(qǐng)人:中國(guó)海洋大學(xué)