專(zhuān)利名稱(chēng)：一種用于光動(dòng)力治療的納米光敏劑給藥系統(tǒng)及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及腫瘤光動(dòng)力療法領(lǐng)域的一種藥物，更具體地講，涉及一種新型納米光敏劑給藥系統(tǒng)及其制備方法。
背景技術(shù)：
光動(dòng)力療法利用光敏劑(photosensitizer，PS)經(jīng)激光(或其它光源)激發(fā)后產(chǎn)生光化學(xué)反應(yīng)，反應(yīng)產(chǎn)物如單線態(tài)氧、自由基等具有細(xì)胞殺傷作用。光動(dòng)力療法不同于傳統(tǒng)的手術(shù)、放療和化療三大治療腫瘤手段，它的主要優(yōu)點(diǎn)選擇性、不可逆的毀壞疾病組織的同時(shí)，并不損害周?chē)恼＜?xì)胞。應(yīng)用光動(dòng)力療法(Wiotodynamic therapy,PDT)治療惡性腫瘤，特別是淺表腫瘤(如食道癌，膀胱癌，口腔鱗癌，惡性黑色素瘤)，近年來(lái)愈來(lái)愈成為臨床研究的熱點(diǎn)。而現(xiàn)有的PDT療法中使用的光敏劑存在許多缺點(diǎn)，如在皮膚中滯留時(shí)間長(zhǎng)、排泄慢、易產(chǎn)生副反應(yīng)、避光時(shí)間長(zhǎng)、選擇性差等。葉綠素類(lèi)光敏劑二氫卟吩e6是葉綠素a穩(wěn)定的降解產(chǎn)物，是目前新一代光敏劑研究的熱點(diǎn)。二氫卟吩e6 (Chlorin e6)是以天然葉綠素為原料，通過(guò)現(xiàn)代科技手段精制、提煉和修飾而得的葉綠素降解產(chǎn)物，是一種性能優(yōu)良的光敏劑。與目前報(bào)導(dǎo)和使用的血卟啉醚類(lèi)(HPD)、光敏素IKphotofrin II)等卟啉類(lèi)光敏劑相比，具有分子結(jié)構(gòu)明確、紅外區(qū)吸收系數(shù)大、光動(dòng)力反應(yīng)能力強(qiáng)以及毒副作用小等優(yōu)諸多點(diǎn)，因此正在發(fā)展成為新一代理想的光動(dòng)力治癌藥物。但是，二氫卟吩e6不溶于水，穩(wěn)定性差，無(wú)法制成水溶液體系，即使先用有機(jī)溶劑溶解，然后分散在水溶液中，也是以懸濁液形式存在，很難被細(xì)胞有效地?cái)z?。?而且，有機(jī)溶劑本身對(duì)細(xì)胞也存在一定的毒性。因此，如何提高Ce6的親水性和穩(wěn)定性，使 Ce6快速、有效地進(jìn)入細(xì)胞以提高PDT的療效是目前研究的熱點(diǎn)。碳納米管(carbon nanotubes，CNTs)自1991年被發(fā)現(xiàn)以來(lái)，以其獨(dú)特的結(jié)構(gòu)和性能引起廣泛人們關(guān)注，成為納米材料領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。由于碳納米管具有獨(dú)特的一維結(jié)構(gòu)，其外表面除了可以非共價(jià)力吸附各種分子，還可以鍵合多種化學(xué)基團(tuán)以實(shí)現(xiàn)增溶及靶向，其內(nèi)部空間則可以包埋離子以及小分子，并且能以最小的毒性穿越細(xì)胞膜，因此在生物醫(yī)學(xué)，包括藥物傳遞、分子影像、基因治療等方面具有較好的應(yīng)用前景。同時(shí)，碳管能吸收特殊的激光以及射線進(jìn)而轉(zhuǎn)化成熱量來(lái)破壞腫瘤細(xì)胞。碳納米管具有高純度和尺寸一致等優(yōu)點(diǎn)，在結(jié)構(gòu)上表面積大，能裝載大量藥物，體外活細(xì)胞以及動(dòng)物活體實(shí)驗(yàn)的結(jié)果表明，碳管對(duì)癌細(xì)胞以及正常細(xì)胞的生長(zhǎng)沒(méi)有明顯的影響，對(duì)人體毒性較小，碳納米管材料具備優(yōu)良的細(xì)胞穿透性能。近年來(lái)，碳納米管應(yīng)用在生物醫(yī)學(xué)特別是在藥物載體上的研究逐漸成為新熱點(diǎn)。當(dāng)前，大部分研究集中在將碳納米管作為一種有效的腫瘤細(xì)胞載體來(lái)傳送造影劑、 藥物以及具生物活性的分子，碳納米管為納米材料，其空腔管體還可容納生物特異性分子及藥物。碳納米管和二氫卟吩e6不溶于水，從而限制了它在藥物載體領(lǐng)域的應(yīng)用。殼聚糖是甲殼質(zhì)的一級(jí)衍生物。其化學(xué)結(jié)構(gòu)為帶陽(yáng)離子的高分子堿性多糖聚合物，是自然界唯一的帶正電荷、陽(yáng)離子的食用纖維；具有物理性能穩(wěn)定、良好的溶解性、親水吸濕性、生物降解性、生物相容性等理化性能。而具有生物相容性的殼聚糖對(duì)載藥后碳納米管的修飾則可改善其溶解性，并可提高其生物相容性，使碳納米管在藥物載體領(lǐng)域得以應(yīng)用。碳納米管用作藥物載體，藥物的包埋主要有3種方法吸附、共價(jià)接枝和非共價(jià)包覆。非共價(jià)包覆是指將溶解于溶劑的藥物分子或生物活性分子與原始碳納米管混合后超聲/攪拌分散可在碳納米管表面吸附藥物分子，使所包覆的碳納米管在溶劑中可溶解，同時(shí)實(shí)現(xiàn)藥物包埋。目前，關(guān)于采用碳納米管、二氫卟吩e6和殼聚糖制備納米光敏劑藥物方面的研究還未見(jiàn)報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的就是為了克服上述現(xiàn)有技術(shù)存在的缺陷而提供一種具有暗毒性低、 進(jìn)入細(xì)胞迅速、輸送藥量大的用于光動(dòng)力治療的納米光敏劑給藥系統(tǒng)及其制備方法。本發(fā)明的目的可以通過(guò)以下技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn)一種用于光動(dòng)力治療的納米光敏劑給藥系統(tǒng)，其特征在于，該給藥系統(tǒng)由殼聚糖(Chitosan)、二氫卟吩e6和單壁碳納米管 (SffCNTs)構(gòu)成，所述的單壁碳納米管通過(guò)非共價(jià)鍵結(jié)合的方式裝載二氫卟吩e6，所得二氫卟吩e6_單壁碳納米管復(fù)合物(Ce6-SWCNTs)外層用殼聚糖包裹，所述的單壁碳納米管和二氫卟吩e6的質(zhì)量比為1 (1.2-10)。所述的殼聚糖的量為2L/g 二氫卟吩e6_單壁碳納米管復(fù)合物。所述的殼聚糖在0. 05M的醋酸溶液中的濃度為lmg/ml。一種用于光動(dòng)力治療的納米光敏劑給藥系統(tǒng)的制備方法，其特征在于，該方法包括以下步驟(1)將單壁碳納米管和二氫卟吩e6加入溶劑中，超聲處理30min后，攪拌混合 12-24h，抽濾、洗滌、用濾膜收集后真空干燥得到二氫卟吩e6-單壁碳納米管復(fù)合物；(2)將步驟⑴制得的二氫卟吩e6-單壁碳納米管復(fù)合物，加入殼聚糖的水溶液中，攪拌12-Mh，抽濾、洗滌，用濾膜收集后在50°C真空干燥，即得產(chǎn)品 Chitosan-Ce6_SWCNTs0步驟(1)所述的單壁碳納米管純化是將市售單壁碳納米管采用濃硫酸和濃硝酸進(jìn)行清洗，除去無(wú)定型碳和重金屬離子，所述的濃硫酸的質(zhì)量百分比濃度為70 95%，所述的濃硝酸的質(zhì)量百分比濃度為65 90%。步驟(1)所述的溶劑為二甲基甲酰胺，溶劑的加入量為2L/g單壁碳納米管。步驟(1)、(2)中所述的抽濾是采用直徑為0.22 μ m的微孔濾膜抽濾，所述的洗滌是采用電阻率為18. 2MU的超純水洗滌。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明用殼聚糖包裹來(lái)改善載藥碳納米管的親水性和生物相容性。將碳納米管用作藥物載體，主要是利用其細(xì)胞穿透能力，攜帶目標(biāo)藥物分子——光敏劑二氫卟吩e6進(jìn)入細(xì)胞，通過(guò)低分子殼聚糖對(duì)其功能化修飾載藥碳納米管則可改善其水溶解性和生物相容性。將碳納米管有效的細(xì)胞穿透性、優(yōu)良導(dǎo)熱效應(yīng)、在腫瘤組織優(yōu)先聚集的特點(diǎn)穩(wěn)定性好、靈敏度高的光敏特性和有機(jī)地結(jié)合起來(lái)，光敏劑在激光照射下，放出熱量對(duì)碳管進(jìn)行加熱從而對(duì)腫瘤細(xì)胞進(jìn)行破壞，成功地殺滅腫瘤細(xì)胞，而對(duì)附近的正常細(xì)胞只造成了很少量的傷害，從而形成一種納米光敏劑藥物輸送系統(tǒng)，為疾病的光動(dòng)力療法治療提供了新方法。具有暗毒性低、進(jìn)入細(xì)胞迅速、輸送藥量大等特點(diǎn)，對(duì)腫瘤細(xì)胞殺傷作用顯著，為其實(shí)現(xiàn)低毒高效的腫瘤光動(dòng)力治療提供可能。


圖1. 二氫卟吩e6(a)和殼聚糖(b)的分子結(jié)構(gòu)式以及Chitosan-Ce6_SWCNTs的制備原理(c)；圖2.純化前的SWCNTs (a)禾Π (b)和純化后的SWCNTs (C)禾Π (d)，的TEM圖像；圖 3.純化后的 SWCNTs (a)，Ce6-SWCNTs (b)和 Chitosan-Ce6_SWCNTs (c)的 TEM 圖像；圖 4.純化后的 SWCNTs (a)，Ce6-SWCNTs (b)和 Chitosan-Ce6_SWCNTs (c)的 SEM 圖像；圖5.常溫放置30天以后，濃度均為lmg/mL的未純化的SWCNTs (a)， Ce6-SWCNTs (b)和Chitosan-Ce6_SWCNTs (c)在水溶液中的分散性觀察；圖6. 二氫卟吩e6，Ce6_SWNTs，Chitosan-Ce6_SWNTs和殼聚糖的紫外可見(jiàn)吸收光譜(a)和紅外吸收光譜(b)；圖7. Chitosan-Ce6-SWCNTs對(duì)3T3細(xì)胞的暗毒性檢測(cè)，傳代后的3T3細(xì)胞，用不同濃度(二氫卟吩 e6 的終濃度為 5，10，20，50，100 μ g/mL)的 Chitosan-Ce6_SWCNTs 溶液孵育Ih后，再用無(wú)菌的PBS溶液沖洗，然后換上新鮮的培養(yǎng)基(含繼續(xù)孵育24h和 48h ；圖8.在溫度為 37°C 時(shí)，經(jīng)過(guò)(a) 5min, (b) 15min, (c)30min, (d) lh，用流式細(xì)胞儀觀察Hela細(xì)胞對(duì)Chitosan-Ce6-SWCNTs ( 二氫卟吩e6的終濃度為15 μ g/mL)的內(nèi)攝作用；圖 9. Hela 細(xì)胞經(jīng) Chitosan-Ce6_SWCNTs ( 二氫卟吩 e6 的終濃度為 50 μ g/mL)孵育Ih后的熒光顯微鏡圖像；圖 10. Chitosan-Ce6-SWCNTs 對(duì) Hela 細(xì)胞的 IC50 測(cè)定；圖 11.純化后的 SWCNTs，二氫卟吩 e6，Ce6_SWCNTs 以及 Chitosan-Ce6_SWCNTs 對(duì) Hela細(xì)胞的體外光動(dòng)力作用。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明做詳細(xì)說(shuō)明，但是實(shí)例的作用僅是解釋而非限定本發(fā)明。下述實(shí)施例中采用的原材料和設(shè)備如下1、原材料單壁碳納米管的管徑是l-2nm，長(zhǎng)度> 5(^111，純度> 90% (中國(guó)成都有機(jī)所)。二氫卟吩e6純度> 95% ((北京百靈威公司)。殼聚糖的乙酰化程度是75-85%， 平均分子量是16. OkDa(Sigma公司)。二甲基甲酰胺(DMF，分析純AR)。WST-I試劑盒(中國(guó)江蘇海門(mén)市碧云天生物科技有限公公司)。PVDC微孔濾膜(上海摩速有限公司)。DMEM 干粉培養(yǎng)基(高糖)、胎牛血清、非必需氨基酸、青-鏈霉素、0. 25%胰蛋白酶-0. 02% EDTA 消化液、四甲基偶氮哇藍(lán)(MTT)，96孔板等生物試劑及材料購(gòu)自Corning Costar公司。2、主要設(shè)備透射電鏡形貌分析在上海交大分析測(cè)試中心電鏡室進(jìn)行，電鏡型號(hào)為 JEOL JEM-2010(日本 JEOL 公司)，CCD 型號(hào)為 Gatan 832 型。FEI Siron 200(20kV, 1. Onm)場(chǎng)發(fā)射掃描電子顯微鏡(美國(guó)FEI公司)。紫外可見(jiàn)(UV/Vis)光譜由Thermo公司生產(chǎn)的Evolution 300II型紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)測(cè)得，波長(zhǎng)范圍在200-800nm。使用德國(guó)Bruker公司的EQUINOX 55型傅立葉變換紅外光譜儀測(cè)定FIlR光譜，樣品掃描范圍4000到 400CHT1，分辨率km S掃描模式為透射譜。流式細(xì)胞儀(BD FACSCalibur flow cytometer) 和熒光顯微鏡(Zeiss，Axiovert 200)。二氧化碳培養(yǎng)箱(SANYO MC0-17A，日本SL Shel LAB)，超凈工作臺(tái)(蘇州凈化設(shè)備廠)。半導(dǎo)體激光器(PDT 630型激光腫瘤治療儀，桂林市興達(dá)光電醫(yī)療器械有限公司)。實(shí)施例11.納米光敏劑的制備將市售單壁碳納米管采用質(zhì)量百分比濃度為70 95%的濃硫酸和質(zhì)量百分比濃度為65 90%的濃硝酸進(jìn)行清洗，除去無(wú)定型碳和重金屬離子等雜質(zhì)，得到純化后的單壁碳納米管。在裝有磁力攪拌子的50ml單頸圓底燒瓶中，加入20mlDMF，IOmg純化后的單壁碳納米管，IOOmgcee,超聲處理30min，攪拌過(guò)夜(12_Mh)，用直徑0. 22 μ m的微孔濾膜抽慮。 先用超純水(18. 2MU)洗滌，再用濾膜收集，真空干燥。稱(chēng)取IOmg 二氫卟吩-碳管復(fù)合物，加入20ml殼聚糖(0. 05M醋酸)的水溶液，攪拌過(guò)夜(12-24h)，用直徑0.22μπι的微孔濾膜抽濾。先用超純水(18. 2MU)洗滌，再用濾膜收集，50°C真空干燥。載藥量和載藥率的公式定義為載藥量(wt% )=(吸附藥物的重量/載體的重量)X 100%載藥率(％ )=(吸附藥物的重量/藥物的總量)X 100%2.細(xì)胞培養(yǎng)3T3細(xì)胞系、Hela細(xì)胞系均培養(yǎng)在有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液(含200u/mL青霉素、鏈霉素)中。復(fù)蘇的細(xì)胞按常規(guī)培養(yǎng)操作置于37°C、5% CO2(相對(duì)濕度90%)培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，約2至3天更換一次培養(yǎng)液。分別取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞接種于6孔培養(yǎng)板或96 孔培養(yǎng)板，培養(yǎng)M小時(shí)，待細(xì)胞貼壁后，通過(guò)流式細(xì)胞儀測(cè)細(xì)胞熒光強(qiáng)度實(shí)驗(yàn)。3. 二氫卟酚納米光敏劑的細(xì)胞內(nèi)攝作用3. 1流式細(xì)胞儀觀察細(xì)胞內(nèi)攝作用a.傳代48小時(shí)的Hela細(xì)胞生長(zhǎng)鋪滿(mǎn)培養(yǎng)瓶底后，分別用0. 25%胰蛋白酶消化， 制成細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞密度為5 X IO5個(gè)/mL。b. Hela細(xì)胞以每孔5X IO5個(gè)細(xì)胞接種于6孔培養(yǎng)板中。37°C、5% CO2孵育箱中培養(yǎng)M小時(shí)，觀察細(xì)胞貼壁后使用。c.吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)基，每孔加入ImL含二氫卟酚e6濃度為15 μ g/mL的游離ce6或納米光敏劑(以無(wú)血清DMEM培養(yǎng)基配藥)。d. 37°C>5% 0)2孵育箱中分別培養(yǎng)511^11，151^11，3011和Ih后，吸出孔內(nèi)液體，每孔加入PBS液2mL，洗滌3次，5分鐘/次。e.每孔加入胰酶0. ImL消化細(xì)胞，倒置顯微鏡下觀察消化細(xì)胞，待胞質(zhì)回縮，細(xì)胞之間不再連接成片，加入0.9mL PBS溶液中和；用滴管將已經(jīng)消化細(xì)胞吹打成細(xì)胞懸液將細(xì)胞懸液吸入5mL離心管中。f.平衡后將離心管放入臺(tái)式離心機(jī)中，以1000轉(zhuǎn)/min離心5min。加入2mL培養(yǎng)液，用滴管輕輕吹打細(xì)胞制成細(xì)胞懸液。
g.棄去上清液，加入0. 5mL冰PBS溶液，用滴管輕輕吹打細(xì)胞制成細(xì)胞懸液，放入冰中待用。h.移至流式管中，控制細(xì)胞數(shù)為IX IO4個(gè)，用BD FACSCalibur型流式細(xì)胞儀和 CELLQuest軟件檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)熒光強(qiáng)度。3. 2熒光顯微鏡觀察細(xì)胞內(nèi)攝作用a.傳代48小時(shí)的Hela細(xì)胞以每孔3X105個(gè)細(xì)胞接種于6孔培養(yǎng)板中。37°C、5% CO2孵育箱中培養(yǎng)M小時(shí)，觀察細(xì)胞貼壁后使用。c.吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)基，每孔加入ImL含二氫卟酚e6濃度為50 μ g/mL的游離ce6或納米光敏劑(以無(wú)血清DMEM培養(yǎng)基配藥)。d. 37°C>5% 0)2孵育箱中分別培養(yǎng)511^11，151^11，3011和Ih后，吸出孔內(nèi)液體，每孔加入PBS液2mL，洗滌3次，5分鐘/次。e.用熒光顯微鏡觀察細(xì)胞內(nèi)熒光強(qiáng)度。4. 二氫卟酚納米光敏劑的體外暗毒性作用a.實(shí)驗(yàn)分組分為實(shí)驗(yàn)組及空白對(duì)照組。實(shí)驗(yàn)組為光敏劑處理組，空白組設(shè)立不加光敏劑的單純對(duì)照組。根據(jù)光敏劑的不同，實(shí)驗(yàn)組又分為二氫卟酚e6和HPEE-ce6納米光敏劑兩個(gè)組。根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)，含ce6濃度分別選為游離 ce6 5,10,20,50,100 μ g/mL納米光敏劑:5，10，20，50，100μ g/mLb.傳代48小時(shí)的小鼠成纖維細(xì)胞株3T3細(xì)胞生長(zhǎng)鋪滿(mǎn)培養(yǎng)瓶底后，用0. 25%胰蛋白酶消化，制成細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞密度為4X IO4個(gè)/mL。c.以每孔8000個(gè)細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板中。37°C、5% CO2孵育箱中培養(yǎng)M小時(shí)，觀察細(xì)胞貼壁后使用。d.在嚴(yán)格避光的條件下，將配制好的光敏劑溶液包括空白對(duì)照PBS (50 μ L)加入 96孔板內(nèi)，使孔內(nèi)含ce6濃度梯度為(5，10，20，50，100 μ g/mL)，并分別設(shè)5個(gè)重復(fù)孔。e. 37°C,5% CO2孵育箱中分別培養(yǎng)M小時(shí)后，每孔加人5mg/mL的MTT液20 μ L(用 PBS配制)，繼續(xù)孵育4小時(shí)。f.用WST-I方法檢測(cè)。選擇450nm波長(zhǎng)，在酶標(biāo)儀上檢測(cè)各孔的光密度值(Optical density. 0D)，以不加細(xì)胞只加培養(yǎng)液的空白孔調(diào)零，記錄OD值。OD值越高，說(shuō)明3T3細(xì)胞的增殖越強(qiáng)。根據(jù)以下公式計(jì)算細(xì)胞存活率。每次實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。細(xì)胞存活率=實(shí)驗(yàn)組OD值/空白組OD值X 100%繪制殺傷曲線，計(jì)算各組的細(xì)胞存活率，最后作出不同光敏劑對(duì)不同細(xì)胞生長(zhǎng)曲線，以此為依據(jù)進(jìn)行比較。5. 二氫卟酚-碳管納米光敏劑介導(dǎo)的光動(dòng)力作用(PDT)5. 1 Chitosan-Ce6-SWCNTs 光敏劑對(duì) Hela 細(xì)胞的 IC50 測(cè)定a.傳代48小時(shí)的Hela細(xì)胞生長(zhǎng)鋪滿(mǎn)培養(yǎng)瓶底后，用0. 25%胰蛋白酶消化，制成細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞密度為4X IO4個(gè)/mL。b.以每孔8000個(gè)細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板中。37°C、5% CO2孵育箱中培養(yǎng)M小時(shí)，觀察細(xì)胞貼壁后使用。c在嚴(yán)格避光的條件下，將配制好的chit0San-Ce6-SWCNTS光敏劑溶液包括空白對(duì)照PBS (50 μ L)加入96孔板內(nèi)，使孔內(nèi)含Ce6濃度梯度為(5，10，20，50，100 μ g/mL)，并分別設(shè)5個(gè)復(fù)孔。d. 37°C,5% CO2孵育箱中分別培養(yǎng)4小時(shí)后，吸棄孔內(nèi)液體，用PBS小心清洗后， 每孔重新置入200 μ L培養(yǎng)液。e.細(xì)胞的照光處理采用波長(zhǎng)630nm的半導(dǎo)體激光進(jìn)行照射，調(diào)整功率密度為150mW/cm2，能量密度為 20J/cm2,使光束均勻地垂直照射到96孔培養(yǎng)板上，照射時(shí)間為600s，同時(shí)每塊96孔培養(yǎng)板均設(shè)既不加光敏劑又不照光的完全空白對(duì)照組。用WST-I方法檢測(cè)。選擇450nm波長(zhǎng)，在酶標(biāo)儀上檢測(cè)各孔的光密度值(Optical density. 0D)。5. 2對(duì)Hela細(xì)胞的體外光動(dòng)力實(shí)驗(yàn)比較a.傳代48小時(shí)的Hela細(xì)胞生長(zhǎng)鋪滿(mǎn)培養(yǎng)瓶底后，用0. 25%胰蛋白酶消化，制成細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞密度為4X IO4個(gè)/mL。b.以每孔8000個(gè)細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板中。37°C、5% CO2孵育箱中培養(yǎng)M小時(shí)，觀察細(xì)胞貼壁后使用。c在嚴(yán)格避光的條件下，將配制好的溶液包括空白對(duì)照PBSJiKW 50yg/mL SWCNTs、50 μ g/mL Ce6、50 μ g/mL Ce6-SWCNTs (含 Ce6 的終濃度為 50 μ g/mL)、50 μ g/mL chitosan-Ce6-SWCNTs (含Ce6的終濃度為50 μ g/mL)加入96孔板內(nèi)，，并分別設(shè)5個(gè)復(fù)孔。d. 37°C,5% CO2孵育箱中分別培養(yǎng)4小時(shí)后，吸棄孔內(nèi)液體，用PBS小心清洗后， 每孔重新置入200 μ L培養(yǎng)液。e.細(xì)胞的照光處理采用波長(zhǎng)630nm的半導(dǎo)體激光進(jìn)行照射，調(diào)整功率密度為150mW/cm2，能量密度為 20J/cm2照射。用WST-I方法檢測(cè)。5.統(tǒng)計(jì)學(xué)處理數(shù)據(jù)采用SAS 6. 12軟件包對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行ANOVA方差分析；WST-I法檢測(cè)的細(xì)胞毒性之間的比較采用t檢驗(yàn)。當(dāng)數(shù)據(jù)P < 0. 05時(shí)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。三、實(shí)驗(yàn)結(jié)果和討論商業(yè)購(gòu)買(mǎi)的SWCNTs里混有的金屬催化劑顆?？赡軐?dǎo)致細(xì)胞內(nèi)活性氧的水平升高，致使的凋亡，為了消除金屬催化劑對(duì)細(xì)胞的影響，在載藥之前必須首先對(duì)SWCNTs進(jìn)行純化處理。圖2為SWCNTs純化前后的TEM照片，從圖2_a和2_b可見(jiàn)純化之前樣品表面布滿(mǎn)了金屬催化劑和無(wú)定形碳顆粒，從圖2-c可見(jiàn)純化之后樣品光滑，表面殘留的金屬催化劑和無(wú)定形碳已基本去除，從圖2-d中可以看到相對(duì)光滑并且結(jié)構(gòu)比較致密的SWCNTs管壁。Ce6通過(guò)π - ji共軛作用或其他非共價(jià)相互作用吸附到SWCNTs表面，從圖3_a中可見(jiàn)SWCNTs光滑的管壁，而在圖3-b中，SWCNTs的管壁已不再光滑而是布滿(mǎn)了相對(duì)比較松散Ce6，所以管壁相對(duì)圖3-a比較粗糙。殼聚糖可以通過(guò)疏水相互作用或者范德華力纏繞包覆到SWCNTs表面，在圖3-c中由于殼聚糖的包覆和遮蓋，已經(jīng)很難辨認(rèn)出SWCNTs的管壁。 這些TEM照片給出了藥物和殼聚糖糖能夠包覆SWCNTs的直接證據(jù)。圖4為純化后及藥物和多糖修飾后的SWCNTs的SEM照片，進(jìn)一步證明了藥物和殼聚糖對(duì)SWCNTs的成功修飾。經(jīng)過(guò)藥物修飾后的SWCNTs表面變得粗糙，而經(jīng)過(guò)殼聚糖修飾后的SWCNTs表面更加的粗糙，水溶性也有所改善，這點(diǎn)從圖5可以看到，在殼聚糖修飾之后， SffCNTs的分散性和穩(wěn)定性都大大提升。Chitosan-Ce6-SWCNT和ce6在DMF中的吸收光譜見(jiàn)圖6 (a)，雖然不同二氫卟酚e6 衍生物的吸收強(qiáng)度有所不同，但它們的吸收峰形基本相同，在300 700nm之間都有三個(gè)吸收峰，最大吸收峰均位于404nm左右處，在500nm左右處均有一個(gè)小吸收峰。Ce6在66 ! 左右處有一個(gè)相對(duì)較強(qiáng)的吸收峰，而chitosan-Ce6-SWCNT在669nm左右處有一個(gè)相對(duì)較強(qiáng)的吸收峰。chitosan-Ce6-SWCNT納米光敏劑在紅光區(qū)(669nm)的吸收峰比ce6在紅光區(qū) (663m)吸收峰紅移了 6nm。這是因?yàn)镾WCNTs與Ce6非共價(jià)相互作用的結(jié)果，SffCNTs具有富電子的大η鍵結(jié)構(gòu)，而Ce6分子的卟啉環(huán)也是π鍵結(jié)構(gòu)，所以他們可以產(chǎn)生π-π共軛現(xiàn)象。另外，以Ce6在404nm的峰為對(duì)照，通過(guò)紫外標(biāo)準(zhǔn)曲線的方法測(cè)定平均載藥量為144%， 結(jié)果大于120%。FTIR光譜是鑒別功能基團(tuán)的重要方法，因此，我們用FIlR來(lái)分析 ChitoSan-Ce6-SWCNT納米光敏劑表面基團(tuán)的改變。圖6(b)是通過(guò)紅外光譜測(cè)定納米光敏劑的結(jié)構(gòu)特征，1092cm-1是殼聚糖上的吡喃環(huán)的典型吸收峰，2877CHT1是苯環(huán)上的c_c骨架振動(dòng)，3430CHT1是-OH的峰，S^ecnr1是卟吩的N-H峰。M以上結(jié)果說(shuō)明藥物成功接枝，殼聚糖成功修飾。評(píng)選優(yōu)良光敏劑的條件之一是光敏劑的暗毒性小而光毒性大。光敏劑的暗毒性越小，說(shuō)明光敏劑用于臨床越安全；光毒性越大，則光敏劑的殺傷效應(yīng)越強(qiáng)。暗毒性即在嚴(yán)格避光條件下，光敏劑本身對(duì)細(xì)胞的殺傷作用，這種殺傷效應(yīng)是沒(méi)有選擇性的，在殺死腫瘤細(xì)胞的同時(shí)也會(huì)造成對(duì)正常細(xì)胞、組織及系統(tǒng)的損害。而理想的光敏劑則應(yīng)避免對(duì)正常細(xì)胞、組織及系統(tǒng)有損害，即光敏劑的暗毒性越小越好。本研究采用WST-I方法從細(xì)胞水平探討了 Chitosan-Cee-SWCNTs納米光敏劑的細(xì)胞暗毒性作用和光動(dòng)力殺傷效應(yīng)，并與游離ce6進(jìn)行比較。圖7是Chitosan-Ce6-SWCNTs對(duì)3T3細(xì)胞的暗毒性檢測(cè)。此實(shí)驗(yàn)提示 Chitosan-Ce6-SWCNTs納米光敏劑本身對(duì)細(xì)胞的內(nèi)在毒性大小，并在實(shí)驗(yàn)條件相同的情況下與游離Ce6進(jìn)行比較。在無(wú)光條件下，3T3細(xì)胞的存活率隨光敏劑濃度增加而逐漸下降， 并且可以看到Chitosan-Ce6-SWCNTs納米光敏劑和ce6即使?jié)舛壬咧?00 μ g/mL，作用 24h后，細(xì)胞存活率仍均高于85 %。為了評(píng)價(jià)chit0San-Ce6-SWCNTS納米光敏劑的細(xì)胞內(nèi)攝作用，我們采用流式細(xì)胞儀對(duì)細(xì)胞內(nèi)平均熒光強(qiáng)度進(jìn)行檢測(cè)。圖8為在溫度為37°C時(shí)，用流式細(xì)胞儀觀察Hela細(xì)胞對(duì)chitosan-Ce6-SWCNTs(Ce6的終濃度為15 μ g/mL)的內(nèi)攝作用。結(jié)果證明經(jīng)光敏劑預(yù)處理的細(xì)胞內(nèi)平均熒光強(qiáng)度比未經(jīng)處理組明顯升高，這些顯著的熒光信號(hào)與細(xì)胞攝入光敏劑有關(guān)。平均熒光強(qiáng)度隨著光敏劑處理細(xì)胞的時(shí)間延長(zhǎng)而增加，表明平均熒光強(qiáng)度越高，光敏劑在細(xì)胞內(nèi)量越多。并且隨時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)胞內(nèi)的熒光強(qiáng)度逐漸增強(qiáng)，從圖中可以看出Ih 的熒光強(qiáng)度大于5min的熒光強(qiáng)度。從圖9的熒光顯微鏡圖片進(jìn)一步驗(yàn)證了這一結(jié)果。為了考察chit0San-Ce6-SWCNTS納米光敏劑對(duì)細(xì)胞的光動(dòng)力殺傷效應(yīng)，我們?cè)谕瑯拥膶?shí)驗(yàn)條件下與游離Ce6進(jìn)行了比較。圖10為chitosan-Ce6-SWCNTs對(duì)Hela細(xì)胞的IC50測(cè)定。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，Hela細(xì)胞的存活率均隨光敏劑濃度增加而逐漸下降， chitosan-Ce6-SWCNTs納米光敏劑和ce6的斜率均較陡直，可以看出納米光敏劑對(duì)腫瘤細(xì)胞的光動(dòng)力殺傷效應(yīng)較強(qiáng)。在相同濃度時(shí)，chitosan-Cee-SWCNTs納米光敏劑的細(xì)胞殺傷效率明顯高于ce6 (P < 0. 05)。通過(guò)實(shí)驗(yàn)結(jié)果計(jì)算得出，單純的Ce6的IC50值是8. 80 μ g/ mL, chitosan-Ce6-SWCNTs 納米光敏劑的 IC50 值是 5. 98 μ g/mL。圖 11.純化后的 SWCNTs，Ce6, Ce6-SWCNTs 以及 chitosan-Ce6_SWCNTs 對(duì) Hela 細(xì)胞的體外光動(dòng)力作用。結(jié)果表明，在相同濃度時(shí)，chitoSan-Ce6-SWCNTS納米光敏劑的細(xì)胞殺傷效率明顯高于Ce6 (P < 0. 05)。光動(dòng)力效應(yīng)的強(qiáng)弱受光源、組織氧濃度、光敏劑種類(lèi)、光敏劑濃度、光源能量密度等諸多因素的影響，本實(shí)驗(yàn)之所以選擇用12J/cm2能量密度，是根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道二氫卟酚類(lèi)光敏劑所用的能量密度比卟啉類(lèi)光敏劑小，一般在10 20J/cm2已足夠25。根據(jù)預(yù)出試驗(yàn)提示，選用12J/cm2這一較小的光劑量較為合適，可以避免由于光劑量不足而引起的光動(dòng)力殺傷效應(yīng)的減小。在光動(dòng)力治療中，當(dāng)光敏劑治療區(qū)吸收峰與激發(fā)波長(zhǎng)相匹配時(shí)，才能獲得最佳光動(dòng)力效應(yīng)，并可以實(shí)施非熱效應(yīng)PDT治療。值得注意的是，本實(shí)驗(yàn)中我們所選擇的激發(fā)光源是630nm半導(dǎo)體激光器，而根據(jù)前期吸收光譜測(cè)定，顯示此納米光敏劑在669nm處有一個(gè)較強(qiáng)吸收峰，盡管我們所用的激發(fā)波長(zhǎng)與光敏劑吸收峰都在紅光范圍內(nèi)，但并不完全匹配。因此，若選用絕對(duì)匹配的激發(fā)波長(zhǎng)，此納米光敏劑的光動(dòng)力效應(yīng)可能更強(qiáng)，在臨床應(yīng)用中可能用極小的光敏劑劑量就可以達(dá)到很好的光動(dòng)力效應(yīng)，其本身的光毒副反應(yīng)也將隨之降低。四、結(jié)論Chitosan-Ce6-SWCNTs納米光敏劑給藥系統(tǒng)可以通過(guò)細(xì)胞的胞吞作用有效進(jìn)入細(xì)胞；暗毒性小，且有明顯的光動(dòng)力殺傷作用；chitoSan-Ce6-SWCNTS對(duì)Hela細(xì)胞的體外光動(dòng)力殺傷效率明顯高于Ce6，由此推測(cè)，chitosan-Ce6-SWCNTs納米光敏劑在以后開(kāi)展PDT治療淺表腫瘤或癌前病變中有著相當(dāng)大的應(yīng)用潛力。本發(fā)明中二氫卟吩e6的裝載量(定義為二氫卟吩e6與單壁碳納米管的質(zhì)量比) 大于120%，可以達(dá)到1000%。與單純的二氫卟吩e6相比，本納米光敏劑給藥系統(tǒng)具有進(jìn)入細(xì)胞迅速、輸送藥量大等特點(diǎn)，對(duì)腫瘤細(xì)胞殺傷作用顯著。
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權(quán)利要求
1.一種用于光動(dòng)力治療的納米光敏劑給藥系統(tǒng)，其特征在于，該給藥系統(tǒng)由殼聚糖、二氫卟吩e6和單壁碳納米管構(gòu)成，所述的單壁碳納米管通過(guò)非共價(jià)鍵結(jié)合的方式裝載二氫卟吩e6，所得二氫卟吩e6_單壁碳納米管復(fù)合物外層用殼聚糖包裹，所述的單壁碳納米管和二氫卟吩e6的質(zhì)量比為1 (1. 2-10)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種用于光動(dòng)力治療的納米光敏劑給藥系統(tǒng)，其特征在于， 所述的殼聚糖的量為2L/g 二氫卟吩e6-單壁碳納米管復(fù)合物。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種用于光動(dòng)力治療的納米光敏劑給藥系統(tǒng)，其特征在于， 所述的殼聚糖在0. 05M的醋酸溶液中的濃度為lmg/ml。
4.一種如權(quán)利要求1所述的用于光動(dòng)力治療的納米光敏劑給藥系統(tǒng)的制備方法，其特征在于，該方法包括以下步驟(1)將單壁碳納米管純化后與二氫卟吩e6加入溶劑中，超聲處理30min后，攪拌混合 12-24h，抽濾、洗滌、用濾膜收集后真空干燥得到二氫卟吩e6-單壁碳納米管復(fù)合物；(2)將步驟(1)制得的二氫卟吩e6-單壁碳納米管復(fù)合物，加入殼聚糖的水溶液中，攪拌12-24h，抽濾、洗滌，用濾膜收集后在50°C真空干燥，即得產(chǎn)品。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的一種用于光動(dòng)力治療的納米光敏劑給藥系統(tǒng)的制備方法，其特征在于，步驟(1)所述的單壁碳納米管純化是將市售單壁碳納米管采用濃硫酸和濃硝酸進(jìn)行清洗，除去無(wú)定型碳和重金屬離子，所述的濃硫酸的質(zhì)量百分比濃度為70 95%，所述的濃硝酸的質(zhì)量百分比濃度為65 90%。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的一種用于光動(dòng)力治療的納米光敏劑給藥系統(tǒng)的制備方法，其特征在于，步驟(1)所述的溶劑為二甲基甲酰胺，溶劑的加入量為2L/g單壁碳納米管。
7.根據(jù)權(quán)利要求4所述的一種用于光動(dòng)力治療的納米光敏劑給藥系統(tǒng)的制備方法，其特征在于，步驟(1)、(幻中所述的抽濾是采用直徑為0. 22 μ m的微孔濾膜抽濾，所述的洗滌是采用電阻率為18. 2MU的超純水洗滌。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種用于光動(dòng)力治療的納米光敏劑給藥系統(tǒng)及其制備方法，該給藥系統(tǒng)由殼聚糖、二氫卟吩e6和單壁碳納米管構(gòu)成，所述的單壁碳納米管通過(guò)非共價(jià)鍵結(jié)合的方式裝載二氫卟吩e6，所得二氫卟吩e6-單壁碳納米管復(fù)合物外層用殼聚糖包裹，所述的單壁碳納米管和二氫卟吩e6的質(zhì)量比為1∶(1.2-10)。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有暗毒性低、進(jìn)入細(xì)胞迅速、輸送藥量大等特點(diǎn)，對(duì)腫瘤細(xì)胞殺傷作用顯著，為其實(shí)現(xiàn)低毒高效的腫瘤光動(dòng)力治療提供可能。
文檔編號(hào)A61K47/04GK102397545SQ20111037200
公開(kāi)日2012年4月4日 申請(qǐng)日期2011年11月21日 優(yōu)先權(quán)日2011年11月21日
發(fā)明者何琳, 朱新遠(yuǎn), 朱邦尚, 王端斌, 肖海榮, 金承鈺 申請(qǐng)人:上海交通大學(xué)