專利名稱：二氧化硅基超聲造影劑/hifu增效劑及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及納米材料技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及醫(yī)用納米生物材料技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種可兼用作超聲造影劑和HIFU增效劑的介孔二氧化硅納米膠囊材料及其制備方法。
背景技術(shù)：
目前無創(chuàng)治療的理念已經(jīng)成為未來醫(yī)學(xué)發(fā)展的新方向。超聲療法是向組織中沉積聲能的最小侵入或非侵入性方法。高強度聚焦超聲(High Intensity Focused Ultrasound, HIFU)作為最具有代表性的非侵入性和非放射性新型治療模式，目前已經(jīng)在臨床上針對某些疾病(諸如子宮肌瘤)取得了巨大的成功。然而，HIFU在腫瘤特別是惡性腫瘤(癌癥)的手術(shù)治療上還沒有得到廣泛的應(yīng)用。要解決這一難題，有兩個關(guān)鍵點必須要得到有效的解決一個就是如何利用目前臨床廣泛使用的成像系統(tǒng)(諸如超聲成像(US)、核磁共振成像(Magnetic Resonance Imaging, MRI)、CT、PET、X光等等)對病變部位進(jìn)行高質(zhì)量的成像，為HIFU的超聲能量聚焦提供高質(zhì)量的圖像依據(jù)；另一個是在對病變部位進(jìn)行精確的定位后，在利用HIFU進(jìn)行無創(chuàng)手術(shù)時， 如何有效地提高HIFU的治療效果，即如何在低超聲功率下能得到高效的治療效果。目前商業(yè)化的針對HIFU無創(chuàng)手術(shù)治療的引導(dǎo)方式主要有兩種超聲成像(US)引導(dǎo)和核磁共振成像(MRI)引導(dǎo)。其中，超聲成像是一個多功能、非侵入性、低風(fēng)險、低價、便攜的實時成像技術(shù)，是目前世界上應(yīng)用最廣泛的成像技術(shù)之一。然而，由于缺乏有效的造影劑，其對組織成像的空間/時間分辨率仍較低，不能滿足一些早期疾病的診斷，其應(yīng)用仍受到較大的限制。開發(fā)生物相容性好、造影性能優(yōu)異的超聲成像造影劑是解決超聲成像低分辨率的有效途徑之一。目前超聲造影劑的研發(fā)仍局限在普通的微泡，即為包裹提高超聲分辨的溫敏型氟碳?xì)怏w的微米級聚合物或有機脂質(zhì)體微泡。由于其穩(wěn)定性差，在血管內(nèi)存留時間較短而影響靶向物質(zhì)與受體的結(jié)合，且其粒徑較大(多為微米級)，因而不能穿透血管內(nèi)皮間隙，屬于血池顯像，限制了它們對血管外疾病的診斷與治療(Ultrasonics，2004, 42，343)。而對于高強度聚焦超聲(HIFU)增效消融治療的研究也僅限于商用的微米級有機微泡。研究表明，腫瘤部位的血管內(nèi)皮間隙至多允許直徑小于700nm的顆粒穿過(Prοc. Natl. Acad. Sci. USA，1998，95，4607)。因此，尋找高效、小型化的影像學(xué)(超聲、CT、MRI)共享型造影劑已成為分子顯像領(lǐng)域的一個重要研究方向，也成為臨床診斷和疾病治療的迫切需要。近年來粒徑在幾十至幾百納米范圍內(nèi)可調(diào)控納米造影劑引起人們極大的關(guān)注(Angew. Chem. -Int. Edit.，2003，42，3218)，它可以穿越血管內(nèi)皮間隙，而微泡類造影劑/增效劑僅能發(fā)生血池內(nèi)超聲顯像的局限，從而大大提高了對血管外病變組織的早期診斷能力。介孔納米材料，例如介孔二氧化硅空心納米材料具有巨大的空腔納米結(jié)構(gòu)、高比表面積、大孔容、可以負(fù)載客體分子而可用于吸附劑、催化劑載體和藥物載體等相關(guān)領(lǐng)域。 例如CN100998335A公開一種核殼結(jié)構(gòu)的稀土納米抗菌劑，其包括球形介孔二氧化硅作為載體以及抗菌劑。近年來介孔二氧化硅空心納米材料在生物醫(yī)藥領(lǐng)域的應(yīng)用研究引起了廣泛關(guān)注，特別是作為抗癌藥物傳輸體系有望實現(xiàn)臨床應(yīng)用?？梢?，目前國內(nèi)外對介孔二氧化硅納米材料的研究主要集中在藥物或DNA的運輸以及藥物的釋放等方面，而在超聲成像領(lǐng)域的應(yīng)用鮮有報道。粒徑大、薄壁的納米介孔二氧化硅材料本身對于超聲就有一定的超聲增強作用。 結(jié)合其本身所具有的大比表面積、高孔容量、良好的可修飾性、優(yōu)異的化學(xué)及熱穩(wěn)定性以及良好的生物相容性和可降解性等優(yōu)點(Nano Lett.，2003，3，609 ；Biomaterials, 2010, 31，1085)。Pei-Lun Lin 等(Adv. Mater. , 2009, 21，3949)首次報道了利用無機空心納米粒子(SiO2)作為超聲成像造影劑。然而由于S^2殼層沒有孔道結(jié)構(gòu)，無法實現(xiàn)在空腔內(nèi)部擔(dān)載溫敏型的氟碳化合物超聲造影劑，造影效果差，同時也無法實現(xiàn)藥物的裝載，難以賦予造影和治療雙重功能的結(jié)合。該研究尚屬于起步階段，有關(guān)無機SiO2納米超聲造影劑的生物學(xué)效應(yīng)以及與超聲之間的相互作用機制還未涉及。此外，介孔二氧化硅納米材料真正使用前必須全面深入了解其包括毒性、降解性等在內(nèi)的一系列生物相容性問題。然而，在這方面國際上的基礎(chǔ)研究工作的報道還十分有限?？上驳氖牵罱?，中科院上海硅酸鹽研究所施劍林等在介孔二氧化硅納米材料的生物相容性基礎(chǔ)研究和生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用研究方面取得了一系列創(chuàng)新性研究成果從體外到體內(nèi)、從細(xì)胞到活體組織和血液，系統(tǒng)考察了介孔二氧化硅納米材料的生物降解性、細(xì)胞毒性、血液相容性、藥代動力學(xué)和組織相容性，證明了介孔二氧化硅納米材料具有良好的生物相容性，為其在生物醫(yī)藥領(lǐng)域的應(yīng)用研究提供了重要的生物安全性參考資(Biomaterials 2010， 31， 1085; Biomaterials 2010， 31， 3335； Biomaterials 2010, 31,
7785; Small 2009， 5， 2722; Small 2010， DOI 10. 1002/ smll. 201001459)。最近，CN102068706A公開一種二氧化硅超聲成像造影材料的制備方法，其通過表面修飾使二氧化化硅微球表面連有聚乙二醇，然而其也未涉及HIFU增效的作用?？梢姡壳皩τ诶眉{米生物材料同時實現(xiàn)超聲造影和對HIFU治療進(jìn)行增效的研究還未見報道，
更無相關(guān)專利可尋，有待進(jìn)一步研究。

發(fā)明內(nèi)容
面對現(xiàn)有技術(shù)存在的上述問題，本發(fā)明人經(jīng)過銳意的研究，意識到近幾年發(fā)展起來的介孔納米材料可以有效地解決這一問題。即、介孔納米材料，尤其是對生物相容性好的介孔二氧化硅空心納米材料進(jìn)行表面修飾并使其裝載用于HIFU增效的分子可兼用作超聲造影劑/HIFU增效劑。本發(fā)明人意識到可對介孔二氧化硅納米材料進(jìn)行表面改性，使其表面帶有氨基、 羧基或巰基等活性官能團，然后進(jìn)行表面修飾與聚二乙醇相連可增加其分散性進(jìn)而可增加其超聲成像效果。此外，本發(fā)明人還意識到介孔納米材料由于具有大的空腔結(jié)構(gòu)(空心球)，可以裝載大量的客體分子有望用于HIFU增效。此外，空腔結(jié)構(gòu)和孔道結(jié)構(gòu)還可以賦予該納米材料藥物包覆和傳輸?shù)男阅?，使得化療和HIFU治療一體化成為可能。在此，本發(fā)明提供一種二氧化硅基超聲造影劑/HIFU增效劑，包括表面修飾有聚乙二醇的介孔二氧化硅納米膠囊以及裝載在所述介孔二氧化硅納米膠囊中的用于HIFU增效的客體分子。采用本發(fā)明，很好地結(jié)合無機介孔二氧化硅納米粒子與有機氟碳化合物的優(yōu)勢， 可提供有機無機復(fù)合的納米超聲造影劑/HIFU增效劑，得到更加穩(wěn)定、生物相容性更好、超聲造影性能更為優(yōu)良、HIFU增效明顯的診療劑。而且選用生物相容性優(yōu)良的介孔二氧化硅納米膠囊作為基體材料可進(jìn)一步提高了本發(fā)明的臨床應(yīng)用性。又，所述介孔二氧化硅空心納米膠囊的粒徑可為100 lOOOnm，孔徑可為2. 5 5nm。這種大比表面積和大孔徑的空心載體結(jié)構(gòu)可以更高效地裝載客體分子用于HIFU增效。例如在本發(fā)明的一個優(yōu)選示例中，所述用于HIFU增效的客體分子為所述介孔納米顆粒質(zhì)量的1. 7 8. 5%ο又，用于HIFU增效的客體分子可為有機氟碳化合物或者有機氟碳?xì)怏w，包括全氟己烷(PFH)和全氟溴辛烷(PFOB )。在本發(fā)明中，所述介孔二氧化硅納米膠囊還可裝載有熒光標(biāo)記物。這樣，可更方便地跟蹤試驗和診療。本發(fā)明的二氧化硅基超聲造影劑/HIFU增效劑還可包括裝載在所述介孔納米顆粒中的抗腫瘤藥物。空腔結(jié)構(gòu)和孔道結(jié)構(gòu)可以賦予該納米材料藥物包覆和傳輸?shù)男阅?，使得化療和HIFU治療一體化成為可能。所述抗腫瘤藥物包括但不限于阿霉素、紫杉醇、多烯紫杉醇、長春新堿、氟尿嘧啶、甲氨喋呤、米托蒽醌、環(huán)磷腺苷、環(huán)磷酰胺、培洛霉素、硝卡介、 亞胺醌、阿柔比星、卡莫司汀、替莫唑胺、洛莫司汀、卡莫氟、替加氟、放線菌素D、絲裂霉素、 安吖啶、安磷汀、順鉬、阿拉瑞林、安魯米特、氮芥中的一種或兩種以上的混合物。另一方面，本發(fā)明提供一種制備上述二氧化硅基超聲造影劑/HIFU增效劑的方法，包括對介孔二氧化硅納米膠囊進(jìn)行表面改性以使所述介孔二氧化硅納米膠囊的表面帶有氨基、羧基或巰基；使所述介孔二氧化硅納米膠囊裝載用于HIFU增效的客體分子；以及利用化學(xué)嫁接法對所述介孔二氧化硅納米膠囊進(jìn)行表面修飾以使所述介孔二氧化硅納米膠囊的表面修飾有聚乙二醇。本發(fā)明的方法通過對介孔二氧化硅納米材料進(jìn)行表面改性和表面修飾使其與聚乙二醇相連，可增加材料的分散性和超聲性能，同時使材料裝載HIFU增效的客體分子形成有機無機復(fù)合多功能材料可同時實現(xiàn)超聲造影和HIFU增效功能。本發(fā)明的方法，合成工藝簡單易行、無污染、成本低。在本發(fā)明中，可通過揮發(fā)浸漬或真空灌注使所述介孔二氧化硅納米膠囊裝載用于 HIFU增效的客體分子。本發(fā)明裝載用于HIFU增效的客體分子的方式簡便、易行。在本發(fā)明中，所述介孔二氧化硅納米膠囊可通過傳統(tǒng)的選擇性蝕刻法合成，包括 采用去離子水和乙醇作為溶劑、氨水作為堿化劑、正硅酸乙酯TEOS作為硅源、以及采用硅烷偶聯(lián)劑作為結(jié)構(gòu)導(dǎo)向劑制得實心二氧化硅納米球；以及采用碳酸鈉水溶液作為蝕刻劑蝕刻所述實心二氧化硅納米球。此外，所述介孔二氧化硅納米膠囊還可通過一步法合成即、以全氟十七烷三甲基氧硅烷作為硅烷偶聯(lián)劑，將乙醇、正硅酸乙酯和全氟十七烷三甲基氧硅烷在室溫下攪拌30 分鐘 6小時后，以去離子水作為溶劑、氨水作為堿化劑在30 50°C下反應(yīng)1 6小時。該方法利用了特殊的全氟十七烷三甲基氧硅烷PDES強的疏水氟碳鏈段與醇水之間的作用， 一步法即可合成介孔二氧化硅納米膠囊。
再一方面，本發(fā)明還提供另一種制備上述二氧化硅基超聲造影劑/HIFU增效劑的方法，包括將乙醇、正硅酸乙酯和硅烷偶聯(lián)劑在室溫下攪拌30分鐘 6小時后，然后加入用于HIFU增效的客體分子，以去離子水作為溶劑、氨水作為堿化劑在30 50°C下反應(yīng)1 6 小時，得到裝載有用于HIFU增效的客體分子的介孔二氧化硅納米膠囊；對所述介孔二氧化硅納米膠囊進(jìn)行表面改性以使所述介孔二氧化硅納米膠囊的表面帶有氨基、羧基或巰基； 以及利用化學(xué)嫁接法對所述介孔二氧化硅納米膠囊進(jìn)行表面修飾以使所述介孔二氧化硅納米膠囊的表面修飾有聚乙二醇。采用該方法，可先一步法合成無機有機復(fù)合二氧化硅納米材料后再進(jìn)行表面改性和表面修飾，制備工藝簡單、易行。本發(fā)明所用的硅烷偶聯(lián)劑可包括十八烷基三甲基硅烷C18TMS、十六烷基三甲基溴化銨CTAB、和全氟十七烷三甲基氧硅烷PDES。優(yōu)選與有機氟碳化合物有著較強作用力的表面活性劑全氟十七烷三甲基氧硅烷PDES。在本發(fā)明中，所述用于HIFU增效的客體分子與所述硅烷偶聯(lián)劑的體積比可為0. 61 3 :1，以得到合適的裝載量。本發(fā)明合成工藝簡單易行、無任何污染(無污染物排放)、產(chǎn)量高、成本低、效率高、 易工業(yè)化生產(chǎn)；制得的二氧化硅基超聲造影劑/HIFU增效劑可以有效地給腫瘤組織顯影， 并且可顯著提高HIFU治療的效果，因此顯示出廣闊的應(yīng)用前景。此外，該造影劑/增效劑比表面積高、孔容大、孔徑分布均一，有利于藥物在其中的高效擔(dān)載，有利于實現(xiàn)化療與HIFU 無創(chuàng)治療的一體化。


圖1示出制備本發(fā)明的二氧化硅基超聲造影劑/HIFU增效劑的示意流程圖2A示出以表面活性劑C18TMS作為結(jié)構(gòu)導(dǎo)向劑制得的介孔SW2納米膠囊的透射電鏡照片；
圖2B示出以表面活性劑CTAB作為結(jié)構(gòu)導(dǎo)向劑制得的介孔SiO2納米雙層壁膠囊的透射電鏡照片；
圖2C示出以表面活性劑CTAB作為結(jié)構(gòu)導(dǎo)向劑制得的介孔SiO2納米空心膠囊的透射電鏡照片；
圖2D示出以新型表面活性劑PDES作為結(jié)構(gòu)導(dǎo)向劑制得的介孔SW2納米空心球的透射電鏡照片；
圖2E示出以新型表面活性劑PDES和C18TMS作為聯(lián)合結(jié)構(gòu)導(dǎo)向劑制得的介孔SW2交聯(lián)球載體的透射電鏡照片；
圖2F示出通過一步法制備的有機無機復(fù)合的介孔S^2納米診療劑的透射電鏡照片； 圖3 A和;3B示出介孔SiO2納米膠囊、表面改性帶有巰基的介孔SiO2納米膠囊、表面修飾有聚乙二醇的介孔SW2納米膠囊、以及裝載有PFH且表面修飾有聚乙二醇的介孔SW2 納米膠囊的平均粒徑和^ta電位；
圖3C示出表面修飾有聚乙二醇的介孔SW2納米膠囊的紅外光譜； 圖4示出本發(fā)明的二氧化硅基超聲造影劑/HIFU增效劑在不同溫度下溫敏現(xiàn)象的共聚焦照片；
圖5示出不含本發(fā)明的二氧化硅基超聲造影劑/HIFU增效劑的磷酸緩沖液對照液在不同溫度下溫敏現(xiàn)象的共聚焦照片；
圖6示出本發(fā)明的帶有熒光標(biāo)記物的二氧化硅基超聲造影劑/HIFU增效劑被細(xì)胞吞噬后的共聚焦顯微照片；
圖7示出本發(fā)明的二氧化硅基超聲造影劑/HIFU增效劑在超聲作用下的體外造影性
能；
圖8示出采用體外脫氣牛肝評價本發(fā)明的二氧化硅基超聲造影劑/HIFU增效劑在HIFU 治療中的增效結(jié)果；
圖9示出采用荷有腫瘤的兔子模型評價本發(fā)明的二氧化硅基超聲造影劑/HIFU增效劑在HIFU治療中的增效結(jié)果。
具體實施例方式參照說明書附圖，并結(jié)合下述實施方式進(jìn)一步說明本發(fā)明，應(yīng)理解，說明書附圖及下述實施方式僅用于說明本發(fā)明，而非限制本發(fā)明。參見圖1，其示出本發(fā)明的二氧化硅基超聲造影劑/HIFU增效劑的兩種方法的示例制備流程。首先，在第一種方法中，在步驟Si，可采用不同的制備工藝制備具有不同孔道結(jié)構(gòu)和表面特性的介孔S^2納米載體。例如采用傳統(tǒng)的選擇性蝕刻法，通過蝕刻實心S^2納米球制得介孔S^2納米載體。也可通過一步法合成介孔S^2納米載體。選擇性刻蝕法合成不同的介孔SiA納米膠囊載體制備過程可以去離子水和乙醇作為溶劑，氨水作為堿催化劑，可采用不同的硅烷偶聯(lián)劑(例如，十八烷基三甲基硅烷 C18TMS、十六烷基三甲基溴化銨CTAB、全氟十七烷三甲基氧硅烷PDES等)作為結(jié)構(gòu)導(dǎo)向劑， 加入正硅酸乙酯(TEOS)作為硅源在一定的溫度下反應(yīng)一定的時間并處理，得到介孔SiO2納米載體材料。大致過程如下一定量的離子水、乙醇和氨水溶液，在水浴中30°C攪拌一定時間，逐滴加入一定量的TE0S，可以觀察到溶液呈乳白色狀(sSi02)。然后分別加入一定量的 TEOS和不同的量的C18TMS、CTAB、PDES，30°C水域中攪拌一段時間后，將產(chǎn)物收集后充分洗滌。配制Na2CO3的水溶液，加入上述離心產(chǎn)物，水域一定溫度下(例如，50 80°C )攪拌一定時間(例如，30min IOh)去除中間的實心SW2內(nèi)核，將產(chǎn)物收集后充分洗滌、真空干燥， 煅燒得到不同孔結(jié)構(gòu)的介孔SW2納米膠囊載體(MSNCs)。一步法合成新型介孔SiO2納米膠囊載體材料制備時，首先將一定比例的乙醇、 TEOS以及特殊的氟碳硅烷PDES室溫攪拌一定時間(例如，30min 6h)后，以去離子水和氨水作為溶劑和堿催化劑，在一定溫度(例如，30 50°C)的水浴中反應(yīng)一定時間(例如，1 他)，得到的產(chǎn)物經(jīng)過通過充分洗滌、真空干燥，煅燒得到新型介孔基S^2納米膠囊載體材料(PMSNCs)。應(yīng)理解，這里盡管采用新型的與有機氟碳化合物有著較強作用力的表面活性劑PDES作為示例結(jié)構(gòu)導(dǎo)向劑，但應(yīng)理解也可采用其它與有機氟碳化合物有著較強作用力的合適表面活性劑。上述制備方法采用正硅酸乙酯(TEOS)作為硅源，但應(yīng)理解，也可采用其它非功能性的硅源。本發(fā)明的方法可通過采用不同表面活性劑制備具有不同表面特性的介孔SiO2 納米材料，例如采用新型的表面活性劑PDES，由于其具有較強的結(jié)合有機氟碳化合物的能力，可增加制得的納米材料負(fù)載有機氟碳化合物的能力，進(jìn)而提高HIFU的增效作用。通過不同的制備工藝(例如，選擇性腐蝕、一步法合成空心膠囊)、采用不同的表面活性劑材料 C18TMS, CTAB和PDES作為結(jié)構(gòu)導(dǎo)向劑，可制備出不同形貌(空心膠囊，雜化介孔材料)、粒徑大小(100 lOOOnm)、介孔結(jié)構(gòu)(有序/無序，孔徑2. 3 5nm,孔容0. 2 1. 4cm3/g)。接著在步驟S2，對制得的介孔S^2納米材料進(jìn)行表面修飾以使其表面帶有氨基、 羧基或巰基等活性官能團。表面改性的操作可采用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的常用方法。然后，在步驟S3，采用不同的裝載工藝(例如，揮發(fā)浸漬法，真空灌注法)裝載用于 HIFU增效的客體分子(有機氟碳化合物或氟碳?xì)怏w)得到無機有機復(fù)合納米材料。裝載的大致過程可如下所示將不同條件制備出的介孔SiO2納米膠囊粉體經(jīng)過一定的預(yù)處理過程(例如，溶解，脫氣)，加入一定量(例如1 10 μ L/mg MSNCs )的有機氟碳化合物(Ρ 、 PF0B)或者灌注入氟碳化合物氣體，經(jīng)過一定時間的攪拌或超聲，得到復(fù)合的納米診療劑 (MSNC-PFH, PMSNC-PFH).選擇生物相容性良好的有機氟碳化合物(Pi7H)作為負(fù)載分子，其具有良好的超聲敏感及溫敏特性，在超聲作用或56°C產(chǎn)生相變，由液態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)槌暩邚椥缘姆細(xì)馀荩妮d體的介孔孔道中緩慢、持續(xù)地釋放，穩(wěn)定、有效地增強超聲成像及HIFU 增效消融的能力。最后，在步驟S4對制得的復(fù)合納米材料進(jìn)行表面修飾。本發(fā)明所選用的表面修飾材料為公認(rèn)具有良好生物相容性的生物大分子聚乙二醇。聚乙二醇的修飾方法可采用領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的常用方法，例如采用由酰胺基活化的聚乙二醇，或者輔助采用合適的縮合劑或連接劑。經(jīng)過一定表面修飾后納米材料可分散到PBS的溶液中，配制成不同濃度的溶液，封存。制備不同的無機載體之后，裝載不同相變溫度、超聲敏感特性的良好生物相容性的有機氟碳化合物(Pra、PFOB)或者有機氟碳?xì)怏w(Pra氣體、pfob氣體)，賦予良好的可修飾性及優(yōu)異的化學(xué)及熱穩(wěn)定性的無機介孔納米載體材料優(yōu)良的超聲敏感特性。對灌注、浸漬有機氟碳化合物的復(fù)合材料，利用表面預(yù)先修飾的官能團(-NH2, -C00H, -SH等)，采用溫和的化學(xué)嫁接方法進(jìn)行表面修飾(PEG等)，既保證了氟碳化合物不損失又賦予復(fù)合材料在 PBS中良好的分散性。又參見圖1，其還示出制備本發(fā)明的二氧化硅基超聲造影劑/HIFU增效劑的另一種方法，與上述方法不同的是，在該方法中，首先采用一步法制備無機有機復(fù)合的納米材料，即、在制備納米材料載體的同時完成裝載有機氟碳化合物的過程，然后再進(jìn)行表面改性和表面修飾。在步驟Si’，通過一步法制備無機有機復(fù)合的納米材料取一定量的乙醇、PDES表面活性劑和TEOS作為前軀體溶液，室溫攪拌一定時間(30min 他)，加入一定量(例如， 0. 61 3倍于PDES量)的有機氟碳化合物(PFH、PF0B)，以去離子水和氨水作為溶劑和堿催化劑，在一定溫度(30 50°C )的水浴中反應(yīng)一定時間(1 他)，觀察到溶液呈乳白色狀， 將產(chǎn)物收集后充分洗滌，得到復(fù)合的診療劑(PMSN-PFH)。采用有機無機交聯(lián)一步法可合成具有優(yōu)良的超聲敏感特性的穩(wěn)定的有機無機復(fù)合的介孔納米診療劑材料。該方法中的表面改性(S2’)和表面修飾的步驟與第一種方法類似，在這里不再累述。本發(fā)明提供了一種簡單、環(huán)境友好的方法制備出具有良好分散性、良好生物相容性、粒徑可控和孔徑可控、超聲造影性能優(yōu)良、HIFU增效明顯的多功能的納米材料。本發(fā)明選用不同的硅烷偶聯(lián)劑(例如，十八烷基三甲基硅烷C18TMS、十六烷基三甲基溴化銨CTAB、全氟十七烷三甲基氧硅烷PDES等)、不同的合成工藝可制備出不同形貌(空心膠囊，雜化介孔材料)、粒徑大小、介孔結(jié)構(gòu)(及表面特性的介孔S^2納米載體材料；其次， 利用介孔S^2納米膠囊載體材料豐富的孔道及空腔體積，選擇不同的超聲敏感的有機氟碳化合物(例如，全氟己烷pra、全氟溴辛烷PF0B)或者氟碳?xì)怏w，采用合適的裝載方式(例如， 揮發(fā)浸漬法，真空灌注法)將疏水性的氟碳化合物進(jìn)行裝載，制備無機有機復(fù)合的介孔SW2 納米基診療劑體系材料；同時還可以利用特殊的PDES表面活性劑與有機氟碳化合物的作用力，在載體制備的過程當(dāng)中加入有機氟碳化合物(pra、PFOB等)，一步法制備粒徑和孔徑可控的有機無機復(fù)合介孔SiO2納米基診療劑材料。本發(fā)明首次結(jié)合無機介孔納米粒子與有機氟碳化合物的優(yōu)勢，設(shè)計制備出有機無機復(fù)合的納米超聲造影劑/HIFU增效劑，得到穩(wěn)定、生物相容性良好、超聲造影性能優(yōu)良、HIFU增效明顯的診療劑體系。此外，本發(fā)明還可以整合其它功能模塊，例如熒光成像、PET成像、CT成像和超聲成像等，得到更加智能化的納米藥物/造影劑輸送體系。重要的是，利用介孔SiO2納米基載體的可控孔結(jié)構(gòu)和表面的可修飾性，在擔(dān)載有機氟碳化合物之前還可以實現(xiàn)親/疏水藥物的擔(dān)載，實現(xiàn)材料診斷、HIFU治療、藥物化療、藥物緩釋和靶向作用的多種功能的復(fù)合，因此可以實現(xiàn)HIFU無創(chuàng)治療和化療的一體化，為腫瘤的治療提供更好、更有效的治療方案。圖2A 2F分別示出以表面活性劑C18TMS、CTAB、PDES作為結(jié)構(gòu)導(dǎo)向劑制得的介孔SiA納米材料以及一步法制得的介孔SiA納米材料的透射電鏡照片(TEM照片)。結(jié)果表明不同方法制備的載體材料均具有良好的分散性、可控的孔徑和空腔體積。圖3 A和;3B示出介孔SiO2納米膠囊、表面改性帶有巰基的介孔SiO2納米膠囊、 表面修飾有聚乙二醇的介孔SW2納米膠囊、以及負(fù)載有PFH且表面修飾有聚乙二醇的介孔 SiO2納米膠囊的平均粒徑和^ta電位；圖3C示出表面修飾有聚乙二醇的介孔SiA納米膠囊的紅外光譜；從圖中可以看出，經(jīng)巰基(-SH)和馬來酰亞胺作用后，材料在溫和的條件下可以在表面修飾上PEG，保證了材料在PBS溶液中良好的分散性。圖4示出本發(fā)明的二氧化硅基超聲造影劑/HIFU增效劑在不同溫度下溫敏現(xiàn)象的共聚焦照片；從圖中可以看出在室溫下，裝載的全氟己烷(Pra)穩(wěn)定存在于MSNCs中，進(jìn)行一次70°c加熱之后，超聲敏感/溫敏的Pra發(fā)生相變產(chǎn)生氣泡，即可以起到超聲增強的作用；70°C二次加熱之后可以觀察到氣泡長大等空化效應(yīng)。圖示出不含本發(fā)明的二氧化硅基超聲造影劑/HIFU增效劑的磷酸緩沖液對照液在不同溫度下溫敏現(xiàn)象的共聚焦照片。從圖中可以發(fā)現(xiàn)無明顯氣泡產(chǎn)生。圖6示出本發(fā)明的帶有熒光標(biāo)記物的二氧化硅基超聲造影劑/HIFU增效劑被 MCF-7、Hela和細(xì)胞吞噬后的共聚焦顯微照片；細(xì)胞核被DAPI染色并呈現(xiàn)出藍(lán)色。 MSNC-PFH被FITC標(biāo)記呈現(xiàn)出綠色。從圖片中可以看出綠色的熒光出現(xiàn)在胞漿中，證明 MSNC-PFH納米粒子可以被癌細(xì)胞吞噬。圖7示出本發(fā)明的二氧化硅基超聲造影劑/HIFU增效劑在超聲作用下的體外造影性能；與PBS對照組比較，MSNC-PFH材料在超聲作用下釋放出氣泡顯著增強了超聲成像的性能。圖8示出采用體外脫氣牛肝評價本發(fā)明的二氧化硅基超聲造影劑/HIFU增效劑在 HIFU治療中的增效結(jié)果；其示出注入0.3mL MSNC-ΡΠΙ材料后牛肝在HIFU作用下的消融結(jié)果的B超圖。由圖可知，在70W-10S作用后，Pi7H沒有達(dá)到相變溫度，只有MSNCs對于HIFU消融的貢獻(xiàn)。在120W4S時，Pra發(fā)生相變，從MSNCs中釋放處理，產(chǎn)生氣泡，顯著增加了 HIFU的消融結(jié)果。圖9示出采用荷有腫瘤的兔子模型評價本發(fā)明的二氧化硅基超聲造影劑/HIFU增效劑在HIFU治療中的增效結(jié)果。其示出將MSNC-Pra材料通過種植VX2腫瘤的瘤兔耳靜脈注射后HIFU消融腫瘤后的超聲成像的B超圖。從圖中可以顯著地看出在腫瘤部位，經(jīng)過 HIFU消融之后，腫瘤部位的灰度值明顯增強，顯示出HIFU消融產(chǎn)生損傷。腫瘤消融前后數(shù)碼圖片說明了 MSNC-Pra可以有效實現(xiàn)HIFU消融腫瘤的能力。體外和體內(nèi)的實驗結(jié)果表明本發(fā)明提供的這種多功能納米材料可以有效地用作超聲造影劑，精確地為HIFU治療定位腫瘤部位，并有效地提高HIFU的治療效果。重要的是，這種新型的多功能材料還可以進(jìn)行抗癌藥物的擔(dān)載和傳輸，因此可以將HIFU治療和化療進(jìn)行相互輔助治療，從而提高腫瘤的治療效果。本發(fā)明進(jìn)一步例如以下實施例以更好地說明本發(fā)明。同樣應(yīng)理解，以下實施例是為了更好地說明本發(fā)明，而非限制本發(fā)明。實施例1
合成介孔SW2納米膠囊35. 7 mL乙醇，5 mL去離子水和1. 57 mL氨水在30°C水域中攪拌30 min。迅速加入3 mL正硅酸乙酯(TEOS)攪拌Ih。之后，再加入2. 5 mL TEOS和1 mL十八烷基三甲基硅烷(C18TMS)繼續(xù)攪拌lh，得到的白色沉淀離心。配制0. 6 M的Na2CO3 水溶液，加入上述白色沉淀80°C攪拌刻蝕0. ^！。得到的沉淀水洗3次，干燥后550 °C煅燒 6 h0實施例2
合成負(fù)載熒光的有序介孔S^2納米膠囊35. 7 mL乙醇，5 mL去離子水和1. 57 mL氨水在30°C水域中攪拌30 min。迅速加入3 mL正硅酸乙酯(TEOS)攪拌lh。之后，再加入2 mL TEOS后反應(yīng)后離心分散在14mL水中；取上述溶液2mL，75 mg CTAB，去離子水15 mL，乙醇 15 mL 和氨水 0.275 mL攪拌 0.5 h。最后加入 0.125 mL TEOS 和 150uL FITC_APTES30°C 攪拌2 h。在IOmL水中加入212 mg Na2CO3,加入離心產(chǎn)物，50°C反應(yīng)10 h，甲醇中回流去除表面活性劑CTAB，得到負(fù)載熒光的有序介孔空心球載體。實施例3
重復(fù)實施例2的方法，但在70°C蝕刻反應(yīng)2 h，得到負(fù)載熒光的有序介孔鈴鐺型載體。實施例4
重復(fù)實施例2的方法，但在80°C蝕刻反應(yīng)0.證，得到負(fù)載熒光的有序介孔雙層壁載體。實施例5
一步法制備粒徑和孔徑可控的介孔SiA納米膠囊載體材料11. 9 mL乙醇，0. 833 mL TE0S,0. 345 mL PDES溶液在30°C水域中攪拌1.證，加入1. 67 mL去離子水和0. 523 mL氨水在30°C水域中反應(yīng)lh。離心分散。實施例6
一步法制備無機有機復(fù)合的粒徑和孔徑可控的介孔SiO2納米基診療劑體系材料11. 9 mL乙醇，0.833 mL TE0S，0. 345 mL PDES溶液室溫攪拌Ih后加入0. 5mL全氟己烷，30°C水域中攪拌30 min，加入1.67 mL去離子水和0. 523 mL氨水在30°C水域中反應(yīng)lh。離心分散。
實施例7
將不同合成工藝先得到介孔S^2納米膠囊干燥后溶解在二氯甲烷中，加入一定量的超聲溫敏聚合物全氟己烷(Pra)IO μ L/mg MSNCs，在40°C加熱套中緩慢攪拌一定時間，揮發(fā)二氯甲烷并裝載Pra在介孔的孔道和空腔中。后續(xù)處理參照實施例1。實施例8
重復(fù)實施例7的方法，但將介孔S^2納米膠囊干燥后溶解在二氯甲烷中，加入一定量的超聲溫敏聚合物全氟溴辛烷(PFOB) 10 μ L/mg MSNCs0實施例9
重復(fù)實施例7的方法，但將介孔S^2納米膠囊干燥后，通入一定量的超聲溫敏聚合物全氟溴辛烷氣體(PFOB氣體)。實施例10
重復(fù)實施例7的方法，但產(chǎn)物干燥后封裝在帶橡膠蓋的小瓶中，用針筒將瓶中抽真空后加入一定量的全氟己烷(PI7H) 10 μ L/mg MSNCs0實施例11
將制備的介孔SiO2納米膠囊100 mg，加入300uL 3-巰基丙基三甲氧基硅烷(MPTMS)在 IOOmL異丙醇中回流接上巰基，干燥后裝載ΡΠΙ，分散在水中。加入1:1的馬來酰亞胺PEG (MAL-PEG),室溫攪拌他后放入配制的PBS溶液中透析Mh，配制成相應(yīng)濃度的溶液。實施例12
將一步法制備的無機有機復(fù)合的粒徑和孔徑可控的介孔S^2納米基診療劑體系材料 100 mg，加入300uL 3-巰基丙基三甲氧基硅烷(MPTMS)在IOOmL異丙醇中回流接上巰基，干燥后分散在水中。加入1:1的馬來酰亞胺PEG (MAL-PEG),室溫攪拌他后放入配制的PBS 溶液中透析Mh，配制成相應(yīng)濃度的溶液。實施例13
重復(fù)實施例12的方法，但加入300uL 3-氨丙基三甲氧基硅氧烷(APTMS)，在IOOmL異丙醇中回流接上氨基。加入1 1的羧基PEG (COOH-PEG)，室溫攪拌他后放入配制的PBS 溶液中透析Mh，配制成相應(yīng)濃度的溶液。實施例14
重復(fù)實施例12的方法，但加入300uL 3-(3-羧基烯丙酰胺基)丙基三乙氧基硅烷，在 IOOmL異丙醇中回流接上氨基。加入1:1的氨基PEG (NH2-PEG),室溫攪拌他后放入配制的PBS溶液中透析Mh，配制成相應(yīng)濃度的溶液。實施例15
通過共聚焦顯微鏡進(jìn)行細(xì)胞吞噬觀察首先將FITC標(biāo)記好的MSNC-Pra分散到細(xì)胞培養(yǎng)基中(200yg/mL)。再將細(xì)胞接種到共聚焦顯微鏡專用培養(yǎng)皿中，待細(xì)胞密度長到 60%-70%時，去掉培養(yǎng)基，加入含有MSNC-Pra納米粒子的細(xì)胞培養(yǎng)基再共培養(yǎng)。去掉培養(yǎng)基，用PBS溶液盡量清洗掉沒有被細(xì)胞吞噬的納米粒子。最后用DAPI試劑染細(xì)胞核，轉(zhuǎn)移到共聚焦顯微鏡下觀察。圖6示出FITC標(biāo)記好的MSNC-Pra被MCF_7、Hela和細(xì)胞吞噬后的共聚焦顯微照片；細(xì)胞核被DAPI染色并呈現(xiàn)出藍(lán)色。MSNC-Pra被FITC標(biāo)記呈現(xiàn)出綠色。從圖片中可以看出綠色的熒光出現(xiàn)在胞漿中，證明MSNC-Pra納米粒子可以被癌細(xì)胞吞噬。
實施例16
將擔(dān)載Pra后的MSNC-Pra的PBS溶液O. 3mL封裝在玻底培養(yǎng)皿中，加熱后產(chǎn)生氣泡并出現(xiàn)氣泡融合長大過程；將材料注入導(dǎo)管中，埋入導(dǎo)電膠中，在超聲作用下(MI=L 1)體外成像，與PBS的超聲成像的結(jié)果相對比，MSNC-PFH的具有較好的超聲成像效果(參見圖7)。實施例17
將體外牛肝脫氣30min后，利用針管注入0. 3mL MSNC-PFH的PBS溶液到牛肝皮下23mm 下。HIFU在不同功率下消融，記錄B超顯示消融前后的不同灰度值并對消融之后的損傷體積進(jìn)行計算。參見圖8，由圖可知，在70W-10S作用后，Pi7H沒有達(dá)到相變溫度，只有MSNCs 對于HIFU消融的貢獻(xiàn)。在120W-k時，PHI發(fā)生相變，從MSNCs中釋放處理，產(chǎn)生氣泡，顯著增加了 HIFU的消融結(jié)果。實施例18
將MSNC-Pra的PBS溶液通過瘤兔的耳靜脈注入到瘤兔體內(nèi)，經(jīng)過IOmin的循環(huán)，采用超聲掃描瘤兔肝部，定位腫瘤后，采用HIFU消融腫瘤，記錄消融前后的不同灰度值并對消融之后的損傷體積進(jìn)行計算。參見圖9，從圖中可以顯著地看出在腫瘤部位，經(jīng)過HIFU消融之后，腫瘤部位的灰度值明顯增強，顯示出HIFU消融產(chǎn)生損傷。腫瘤消融前后數(shù)碼圖片說明了 MSNC-Pra可以有效實現(xiàn)HIFU消融腫瘤的能力。產(chǎn)業(yè)應(yīng)用性本發(fā)明提供一種制備具有良好的生物相容性的二氧化硅基超聲造影劑/HIFU增效劑及其制備方法。本發(fā)明的制備工藝簡單易行、無任何污染、產(chǎn)量高、成本低、 效率高，得到的二氧化硅基超聲造影劑/HIFU增效劑可以有效地給腫瘤組織顯影，并且顯著提高HIFU治療的效果，因此顯示出廣闊的應(yīng)用前景。此外，該多動能材料比表面積高、孔容大、孔徑分布均一可調(diào)，有利于藥物在其中的高效擔(dān)載，有利于實現(xiàn)化療與HIFU無創(chuàng)治療的一體化。
權(quán)利要求
1.一種二氧化硅基超聲造影劑/HIFU增效劑，其特征在于，包括表面修飾有聚乙二醇的介孔二氧化硅納米膠囊以及裝載在所述介孔二氧化硅納米膠囊中的用于HIFU增效的客體分子。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的二氧化硅基超聲造影劑/HIFU增效劑，其特征在于，所述介孔二氧化硅納米膠囊粒徑為100 lOOOnm，孔徑為2. 5 5nm，孔容為0. 2 1. 4cmVgo
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的二氧化硅基超聲造影劑/HIFU增效劑，其特征在于，所述用于 HIFU增效的客體分子為所述介孔納米顆粒質(zhì)量的1. 7 8. 5%。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的二氧化硅基超聲造影劑/HIFU增效劑，其特征在于，用于 HIFU增效的客體分子包括全氟己烷和全氟溴辛烷。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的二氧化硅基超聲造影劑/HIFU增效劑，其特征在于，所述介孔二氧化硅納米膠囊裝載有熒光標(biāo)記物。
6.根據(jù)權(quán)利要求1 5中任一項所述的二氧化硅基超聲造影劑/HIFU增效劑，其特征在于，所述介孔二氧化硅納米膠囊裝載有抗腫瘤藥物。
7.一種制備權(quán)利要求1 6中任一項所述的二氧化硅基超聲造影劑/HIFU增效劑的方法，其特征在于，包括對介孔二氧化硅納米膠囊進(jìn)行表面改性以使所述介孔二氧化硅納米膠囊的表面帶有氨基、羧基或巰基；使所述介孔二氧化硅納米膠囊裝載用于HIFU增效的客體分子；以及利用化學(xué)嫁接法對所述介孔二氧化硅納米膠囊進(jìn)行表面修飾以使所述介孔二氧化硅納米膠囊的表面修飾有聚乙二醇。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，通過揮發(fā)浸漬或真空灌注使所述介孔二氧化硅納米膠囊裝載用于HIFU增效的客體分子。
9.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，所述介孔二氧化硅納米膠囊通過選擇性蝕刻法合成，包括采用去離子水和乙醇作為溶劑、氨水作為堿化劑、正硅酸乙酯作為硅源、以及采用硅烷偶聯(lián)劑作為結(jié)構(gòu)導(dǎo)向劑制得實心二氧化硅納米球；以及采用碳酸鈉水溶液作為蝕刻劑蝕刻所述實心二氧化硅納米球。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于，所述硅烷偶聯(lián)劑包括十八烷基三甲基硅烷、十六烷基三甲基溴化銨、和全氟十七烷三甲基氧硅烷。
11.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，所述介孔二氧化硅納米膠囊通過一步法合成以全氟十七烷三甲基氧硅烷作為硅烷偶聯(lián)劑，將乙醇、正硅酸乙酯和全氟十七烷三甲基氧硅烷在室溫下攪拌30分鐘 6小時后，以去離子水作為溶劑、氨水作為堿化劑在30 50°C下反應(yīng)1 6小時。
12.—種制備權(quán)利要求1 6中任一項所述的二氧化硅基超聲造影劑/HIFU增效劑的方法，其特征在于，包括將乙醇、正硅酸乙酯和硅烷偶聯(lián)劑在室溫下攪拌30分鐘 6小時后，然后加入用于 HIFU增效的客體分子，以去離子水作為溶劑、氨水作為堿化劑在30 50°C下反應(yīng)1 6小時，得到裝載有用于HIFU增效的客體分子的介孔二氧化硅納米膠囊；對所述介孔二氧化硅納米膠囊進(jìn)行表面改性以使所述介孔二氧化硅納米膠囊的表面帶有氨基、羧基或巰基；以及利用化學(xué)嫁接法對所述介孔二氧化硅納米膠囊進(jìn)行表面修飾以使所述介孔二氧化硅納米膠囊的表面修飾有聚乙二醇。
13.根據(jù)權(quán)利要求12所述的方法，其特征在于，所述硅烷偶聯(lián)劑包括十八烷基三甲基硅烷、十六烷基三甲基溴化銨和全氟十七烷三甲基氧硅烷。
14.根據(jù)權(quán)利要求12所述的方法，其特征在于，所述硅烷偶聯(lián)劑為全氟十七烷三甲基氧硅烷，所述用于HIFU增效的客體分子與所述硅烷偶聯(lián)劑的體積比為0. 61 3 :1。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種二氧化硅基超聲造影劑/HIFU增效劑及其制備方法，所述二氧化硅基超聲造影劑/HIFU增效劑包括表面修飾有聚乙二醇的介孔二氧化硅納米膠囊以及裝載在所述介孔二氧化硅納米膠囊中的用于HIFU增效的客體分子。采用本發(fā)明，很好地結(jié)合無機介孔二氧化硅納米粒子與有機氟碳化合物的優(yōu)勢，可提供有機無機復(fù)合的納米超聲造影劑/HIFU增效劑，得到更加穩(wěn)定、生物相容性更好、超聲造影性能更為優(yōu)良、HIFU增效明顯的診療劑。
文檔編號A61K45/00GK102441179SQ20111040239
公開日2012年5月9日 申請日期2011年12月7日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月7日
發(fā)明者施劍林, 王霞, 陳航榕, 陳雨 申請人:中國科學(xué)院上海硅酸鹽研究所