專利名稱：：鉤端螺旋體兩個疫苗候選的外膜蛋白的制作方法
技術領域：
：本發(fā)明屬于生物技術與醫(yī)學領域，具體涉及可作為候選疫苗的兩個鉤端螺旋體外膜蛋白。
背景技術：
：鉤端螺旋體是一種細長彎曲呈螺旋狀、運動活潑的單細胞原核微生物，屬于螺旋體目(Spirochaetals)鉤端螺旋體禾斗(L印tospiraceae)鉤端螺旋體屬。致病性鉤端螺旋體所引起的鉤端螺旋病(Leptospirosis)是我國法定的乙類傳染病，也是在全球廣泛分布的威脅人類健康和畜牧業(yè)生產(chǎn)的常見人獸共患病。已經(jīng)有77個國家和地區(qū)報告有此病的存在，每年發(fā)病數(shù)萬例。鉤端螺旋體病主要臨床表現(xiàn)是高熱、頭痛、寒戰(zhàn)、乏力、^^巴結腫大和明顯的肌肉疼痛。重者可并發(fā)肺出血、黃疸、腦膜腦炎和腎功能衰竭等。我國是世界上鉤端螺旋體病的高發(fā)地區(qū)之一。安全有效的疫苗是防治鉤端螺旋體病的最好方法。鉤端螺旋體疫苗的研究始于1916年日本Ido等首次試制鉤端螺旋體全菌體疫苗，先后經(jīng)歷了傳統(tǒng)的全菌體疫苗、改良的濃縮疫苗和鉤端螺旋體外膜疫苗時期。無論是菌體疫苗還是純化的外膜疫苗，共同的缺點是免疫力不夠強久，需要每年在疫區(qū)進行免疫接種。同時現(xiàn)用的疫苗都具有一定的副作用，并且對不同血清型的鉤端螺旋體不能引起交叉免疫保護，這些缺點限制了鉤端螺旋體疫苗的應用。致病性鉤端螺旋體的免疫原性蛋白尤其是表面暴露蛋白質(zhì)，因為最有可能與宿主的免疫系統(tǒng)接觸而產(chǎn)生抗體，有可能是有效的疫苗候選分子。因此鑒定那些在致病性鉤端螺旋體中表面暴露的保守蛋白質(zhì)，從而能夠產(chǎn)生對不同血清型的鉤端螺旋體產(chǎn)生交叉免疫保護，成為鉤端螺旋體研究的重點。從1990年代以來，已經(jīng)有許多鉤端螺旋體的表面蛋白質(zhì)被鑒定出來，其中某些蛋白質(zhì)在動物模型中顯示能引起保護性免疫反應。迄今為止已經(jīng)鑒定出的鉤端螺旋體的疫苗候選抗原主要有OmpLl、LipL41、LipL32、LipL21、LigA和LigB等，雖有一些結果，但至今尚未完全解決此難題。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供兩個可以作為候選疫苗的鉤端螺旋體的外膜蛋白、及其片段、類似物、衍生物。本發(fā)明的另一目的是提供編碼這些蛋白的多核苷酸。本發(fā)明的另一目的是提供生產(chǎn)這些蛋白的方法以及蛋白和編碼序列的用途。在本發(fā)明的第一方面，提供分離出來的鉤端螺旋體的外膜蛋白，如SEQIDNO:1、3的氨基酸序列的多肽、或其保守性變異多肽、或其活性片段、或其活性衍生物。較佳地不含信號肽序列。在本發(fā)明的第二方面，提供分離出來的編碼上述多肽的多核苷酸，該多核苷酸包含一核苷酸序列，該核苷酸序列與選自下組的一種核苷酸序列有至少70%相同性(a)編碼上述鉤端螺旋體外膜蛋白的多核苷酸；和(b)與多核苷酸(a)互補的多核苷酸。較佳地，該多核苷酸編碼具有SEQIDN0:1、3氨基酸序列的多肽。更佳地，該多核苷酸的序列是選自下組的一種(a)具有SEQIDNO:2、4的序列。在本發(fā)明的第三方面，提供了含有上述多核苷酸的載體，以及被該載體轉化的宿主細胞或者被上述多核苷酸直接轉化的宿主細胞。在本發(fā)明的第四方面，提供了制備鉤端螺旋體外膜蛋白多肽的方法，該方法包含(a)在適合表達鉤端螺旋體外膜蛋白的條件下，培養(yǎng)上述被轉化的宿主細胞；(b)從培養(yǎng)物中分離出鉤端螺旋體外膜蛋白多肽。在本發(fā)明的第五方面，提供了與上述的鉤端螺旋體外膜多肽特異性結合的抗體。還提供了可用于檢測的核酸分子。在本發(fā)明的第六方面，提供了檢測樣品中是否存在外膜蛋白的方法，它包括將樣品與外膜蛋白的特異性抗體反應，觀察是否形成抗體復合物，形成了抗體復合物就表示樣品中存在外膜蛋白。在本發(fā)明的第七方面，提供了本發(fā)明多肽和編碼序列的用途。例如本發(fā)明的鉤端螺旋體外膜蛋白的編碼序列或其片段，可被作為引物用于PCR擴增反應,或者作為探針用于雜交反應，或者用于制造基因芯片或微陣列。在本發(fā)明的第八方面，提供了一種疫苗組合物，它含有安全有效量的本發(fā)明的鉤端螺旋體外膜多肽或其片段以及藥學上可接受的載體。本發(fā)明的其它方面由于本文的技術的公開，對本領域的技術人員而言是顯而易見的。圖1A及圖1B分別是本發(fā)明LA0957LA1495兩個基因PCR擴增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳分析結果圖；圖2A及圖2B分別是是本發(fā)明LA0957LA1495兩個基因PQE31重組表達質(zhì)粒的酶切鑒定結果圖；圖3A及圖3B分別是本發(fā)明LA0957LA1495兩個重組蛋白質(zhì)的SDS-PAGE結果圖(1:uninducedrecombinantprotein;2:inducedrecombinantprotein;3:supernatantofrecombinantprotein;4:precipitationofrecombinantprotein;5:purifiedprotein;M:proteinmarker^圖4A及圖4B分別是本發(fā)明FACS檢測LA0957和LA1495的結果圖；圖5A及圖5B分別是Westemblot檢測疫苗候選抗原在15個血清群代表株中保守性的結果圖。具體實施方式本發(fā)明人經(jīng)過廣泛而深入的研究，從鉤端螺旋體賴株中分離純化和鑒定了一類新的外膜蛋白質(zhì)，該外膜蛋白可作為抗原用于疫苗的設計和制備。在此基礎上完成了本發(fā)明。在本發(fā)明中，術語"外膜蛋白"、"外膜多肽"或"鉤端螺旋體外膜蛋白"可互換使用，都指具有鉤端螺旋體外膜蛋白氨基酸序列(SEQIDN0:1、3)的蛋白或多肽。它們包括含有或不含起始甲硫氨酸的鉤端螺旋體外膜蛋白，以及含有或不含有信號肽的外膜蛋白。如本文所用"分離的"是指物質(zhì)從其原始環(huán)境中分離出來(如果是天然的物質(zhì)，原始環(huán)境即是天然環(huán)境)。如活體細胞內(nèi)的天然狀態(tài)下的多聚核苷酸和多肽是沒有分離純化的，但同樣的多聚核苷酸或多肽如從天然狀態(tài)中同存在的其他物質(zhì)中分開，則為分離純化的。如本文所用"分離的外膜蛋白或多肽"是指外膜多肽基本上不含天然與其相關的其它蛋白、脂類、糖類或其它物質(zhì)。本領域的技術人員能用標準的蛋白質(zhì)純化技術純化外膜蛋白。本發(fā)明的多肽可以是重組多肽、天然多肽、合成多肽，優(yōu)選重組多肽。本發(fā)明的多肽可以是天然純化的產(chǎn)物，或是化學合成的產(chǎn)物，或使用重組技術從原核或真核宿主(例如，細菌、酵母、高等植物、昆蟲和哺乳動物細胞)中產(chǎn)生。根據(jù)重組生產(chǎn)方案所用的宿主，本發(fā)明的多肽可以是糖基化的，但優(yōu)選的是非糖基化的。本發(fā)明還包括鉤端螺旋體外膜蛋白，蛋白的片段、衍生物和類似物。如本文所用，術語"片段"、"衍生物"和"類似物"是指基本上保持本發(fā)明的天然鉤端螺旋體外膜蛋白相同的生物學功能或活性的多肽。本發(fā)明的多肽片段、衍生物或類似物可以是(i)有一個或多個保守或非保守性氨基酸殘基(優(yōu)選保守性氨基酸殘基)被取代的多肽，而這樣的取代的氨基酸殘基可以是也可以不是由遺傳密碼編碼的，或(ii)在一個或多個氨基酸殘基中具有取代基團的多肽，或(iii)成熟多肽與另一個化合物(比如延長多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合所形成的多肽，或(iv)附加的氨基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽(如前導序列或分泌序列或用來純化此多肽的序列或蛋白原序列，或與抗原IgG片段的形成的融合蛋白)。根據(jù)本文的教導，這些片段、衍生物和類似物屬于本領域熟練技術人員公知的范圍。在本發(fā)明中，術語"鉤端螺旋體外膜多肽"指具有鉤端螺旋體外膜蛋白活性或免疫原性的SEQIDNO:1、3序列的多肽。該術語還包括具有與鉤端螺旋體外膜蛋白相同功能的、上述序列的變異形式。這些變異形式包括(但并不限于)若干個(通常為1-50個，較佳地1-30個，更佳地1-20個，最佳地1-10個)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一個或數(shù)個(通常為10個以內(nèi)，更佳地為5個以內(nèi))氨基酸。該術語還包括鉤端螺旋體外膜蛋白的活性片段和活性衍生物。該多肽的變異形式包括同源序列、保守性變異體、等位變異體、天然突變體、誘導突變體、在高或低的嚴緊度條件下能與鉤端螺旋體外膜蛋白DNA雜交的DNA所編碼的蛋白、以及利用抗鉤端螺旋體外膜多肽的抗血清獲得的多肽或蛋白。本發(fā)明還提供了其他多肽，如包含鉤端螺旋體外膜多肽或其片段的融合蛋白。除了幾乎全長的多肽外，本發(fā)明還包括了鉤端螺旋體外膜多肽的可溶性片段。通常，該片段具有鉤端螺旋體外膜多肽序列的至少約IO個連續(xù)氨基酸，通常至少約30個連續(xù)氨基酸，較佳地至少約50個連續(xù)氨基酸，更佳地至少約80個連續(xù)氨基酸，最佳地至少約100個連續(xù)氨基酸。這些片段也可用作免疫原以誘導針對鉤端螺旋體的免疫應答反應。發(fā)明還提供鉤端螺旋體外膜蛋白或多肽的類似物。這些類似物與天然鉤端螺旋體外膜多肽的差別可以是氨基酸序列上的差異，也可以是不影響序列的修飾形式上的差異，或者兼而有之。這些多肽包括天然或誘導的遺傳變異體。誘導變異體可以通過各種技術得到，如通過輻射或暴露于誘變劑而產(chǎn)生隨機誘變，還可通過定點誘變法或其他已知分子生物學的技術。類似物還包括具有不同于天然L-氨基酸的殘基(如D-氨基酸)的類似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如P、Y-氨基酸)的類似物。應理解，本發(fā)明的多肽并不限于上述例舉的代表性的多肽。修飾(通常不改變一級結構)形式包括體內(nèi)或體外的多肽的化學衍生形式如乙酰化或羧基化。修飾還包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或進一步加工步驟中進行糖基化修飾而產(chǎn)生的多肽。修飾形式還包括具有磷酸化氨基酸殘基(如磷酸酪氨酸，磷酸絲氨酸，磷酸蘇氨酸)的序列。還包括被修飾從而提高了其抗蛋白水解性能或優(yōu)化了溶解性能的多肽。在本發(fā)明中，"鉤端螺旋體外膜蛋白保守性變異多肽"指與SEQIDNO:1、3的氨基酸序列相比，有至多10個，較佳地至多8個，更佳地至多5個，最佳地至多3個氨基酸被性質(zhì)相似或相近的氨基酸所替換而形成多肽。這些保守性變異多肽最好根據(jù)表1進行氨基酸替換而產(chǎn)生。<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>本發(fā)明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因組DNA或人工合成的DNA。DNA可以是單鏈的或是雙鏈的。DNA可以是編碼鏈或非編碼鏈。編碼成熟多肽的多核苷酸包括只編碼成熟多肽的編碼序列；成熟多肽的編碼序列和各種附加編碼序列；成熟多肽的編碼序列(和任選的附加編碼序列)以及非編碼序列。術語"編碼多肽的多核苷酸"可以是包括編碼此多肽的多核苷酸，也可以是還包括附加編碼和/或非編碼序列的多核苷酸。本發(fā)明還涉及上述多核苷酸的變異體，其編碼與本發(fā)明有相同的氨基酸序列的多肽或多肽的片段、類似物和衍生物。此多核苷酸的變異體可以是天然發(fā)生的等位變異體或非天然發(fā)生的變異體。這些核苷酸變異體包括取代變異體、缺失變異體和插入變異體。如本領域所知的，等位變異體是一個多核苷酸的替換形式，它可能是一個或多個核苷酸的取代、缺失或插入，但不會從實質(zhì)上改變其編碼的多肽的功能。本發(fā)明還涉及與上述的序列雜交且兩個序列之間具有至少50%，較佳地至少70%，更佳地至少80%相同性的多核苷酸。奉發(fā)明特別涉及在嚴格條件下與本發(fā)明所述多核苷酸可雜交的多核苷酸。在本發(fā)明中，"嚴格條件"是指(1)在較低離子強度和較高溫度下的雜交和洗脫，如O.2XSSC，0.1%SDS，60°C:或(2)雜交時加有變性劑，如50%(v/v)甲酰胺，0.1%小牛血清/0.1%Ficoll，42°。等或(3)僅在兩條序列之間的相同性至少在90%以上，更好是95%以上時才發(fā)生雜交。并且，可雜交的多核苷酸編碼的多肽與成熟的鉤端螺旋體外膜蛋白有相同的生物學功能和活性。本發(fā)明還涉及與上述的序列雜交的核酸片段。如本文所用，"核酸片段"的長度至少含15個核苷酸，較好是至少30個核苷酸，更好是至少50個核苷酸，最好是至少100個核苷酸以上。核酸片段可用于核酸的擴增技術(如PCR)以確定和/或分離編碼外膜蛋白的多聚核苷酸。本發(fā)明的鉤端螺旋體外膜核苷酸全長序列或其片段通?？梢杂肞CR擴增法、重組法或人工合成的方法獲得。對于PCR擴增法，可根據(jù)本發(fā)明所公開的有關核苷酸序列，尤其是開放閱讀框序列來設計引物，并用市售的DNA文庫或按本領域技術人員己知的常規(guī)方法所制各的DNA文庫作為模板，擴增而得有關序列。當序列較長時，常常需要進行兩次或多次PCR擴增，然后再將各次擴增出的片段按正確次序拼接在一起。一旦獲得了有關的序列，就可以用重組法來大批量地獲得有關序列。這通常是將其克隆入載體，再轉入細胞，然后通過常規(guī)方法從增殖后的宿主細胞中分離得到有關序列。此外，還可用人工合成的方法來合成有關序列，尤其是片段長度較短時。通常，通過先合成多個小片段，然后再進行連接可獲得序列很長的片段。目前，已經(jīng)可以完全通過化學合成來得到編碼本發(fā)明蛋白(或其片段，或其衍生物)的DNA序列。然后可將該DNA序列引入本領域中已知的各種現(xiàn)有的DNA分子(或如載體)和細胞中。此外，還可通過化學合成將突變引入本發(fā)明蛋白序列中。本發(fā)明也涉及包含本發(fā)明的多核苷酸的載體，以及用本發(fā)明的載體或外膜蛋白編碼序列經(jīng)基因工程產(chǎn)生的宿主細胞，以及經(jīng)重組技術產(chǎn)生本發(fā)明所述多肽的方法。通過常規(guī)的重組DNA技術，可利用本發(fā)明的多聚核苷酸序列可用來表達或生產(chǎn)重組的外膜多肽。一般來說有以下步驟(1).用本發(fā)明的編碼鉤端螺旋體外膜多肽的多核苷酸(或變異體)，或用含有該多核苷酸的重組表達載體轉化或轉導合適的宿主細胞；(2).在合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng)的宿主細胞；(3).從培養(yǎng)基或細胞中分離、純化蛋白質(zhì)。本發(fā)明中，鉤端螺旋體外膜多核甘酸序列可插入到重組表達載體中。術語"重組表達載體"指本領域熟知的細菌質(zhì)粒、噬菌體、酵母質(zhì)粒、植物細胞病毒、哺乳動物細胞病毒如腺病毒、逆轉錄病毒或其他載體。在本發(fā)明中適用的載體包括但不限于在細菌中表達的基于T7的表達載體；在哺乳動物細胞中表達的pMSXND表達載體和在昆蟲細胞中表達的來源于桿狀病毒的載體?？傊?，只要能在宿主體內(nèi)復制和穩(wěn)定，任何質(zhì)粒和載體都可以用。表達載體的一個重要特征是通常含有復制起點、啟動子、標記基因和翻譯控制元件。本領域的技術人員熟知的方法能用于構建含鉤端螺旋體外膜編碼DNA序列和合適的轉錄/翻譯控制信號的表達載體。這些方法包括體外重組DNA技術、DNA合成技術、體內(nèi)重組技術等。所述的DNA序列可有效連接到表達載體中的適當啟動子上，以指導mRNA合成。表達載體還包括翻譯起始用的核糖體結合位點和轉錄終止子。此外，表達載體優(yōu)選地包含一個或多個選擇性標記基因，以提供用于選擇轉化的宿主細胞的表型性狀，如真核細胞培養(yǎng)用的二氫葉酸還原酶、新霉素抗性以及綠色熒光蛋白(GFP)，或用于大腸桿菌的四環(huán)素或氨節(jié)青霉素抗性。包含上述的適當DNA序列以及適當啟動子或者控制序列的載體，可以用于轉化適當?shù)乃拗骷毎允蛊淠軌虮磉_蛋白質(zhì)。宿主細胞可以是原核細胞，如細菌細胞；或是低等真核細胞，如酵母細胞或是高等真核細胞，如哺乳動物細胞。代表性例子有大腸桿菌，鏈霉菌屬；鼠傷寒沙門菌的細菌細胞；真菌細胞如酵母；植物細胞；果蠅S2或Sf9的昆蟲細胞；CHO的動物細胞等。用重組DNA轉化宿主細胞可用本領域技術人員熟知的常規(guī)技術進行。當宿主為原核生物如大腸桿菌時，能吸收DNA的感受態(tài)細胞可在指數(shù)生長期后收獲，用CaCl2法處理，所用的步驟在本領域眾所周知。另一種方法是使用MgCl2。如果需要，轉化也可用電穿孔的方法進行。當宿主是真核生物，可選用如下的DNA轉染方法磷酸鈣共沉淀法，常規(guī)機械方法如顯微注射、電穿孔、脂質(zhì)體包裝等。獲得的轉化子可以用常規(guī)方法培養(yǎng)，表達本發(fā)明的基因所編碼的多肽。根據(jù)所用的宿主細胞，培養(yǎng)中所用的培養(yǎng)基可選自各種常規(guī)培養(yǎng)基。在適于宿主細胞生長的條件下進行培養(yǎng)。當宿主細胞生長到適當?shù)募毎芏群?，用合適的方法(如溫度轉換或化學誘導)誘導選擇的啟動子，將細胞再培養(yǎng)一段時間。在上面的方法中的重組多肽可在細胞內(nèi)、或在細胞膜上表達、或分泌到細胞外。如果需要，可利用其物理的、化學的和其它特性通過各種分離方法分離和純化重組的蛋白。這些方法是本領域技術人員所熟知的。這些方法的例子包括但并不限于常規(guī)的復性處理、用蛋白沉淀劑處理(鹽析方法)、離心、滲透破菌、超處理、超離心、分子篩層析(凝膠過濾)、吸附層析、離子交換層析、高效液相層析(HPLC)和其它各種液相層析技術及這些方法的結合。重組的鉤端螺旋體外膜蛋白或多肽有多方面的用途，其中包括(但不限于)作為抗原用于制備疫苗。另一方面，本發(fā)明還包括對鉤端螺旋體外膜DNA或是其片段編碼的多肽具有特異性的多克隆抗體和單克隆抗體，尤其是單克隆抗體。這里，"特異性"是指抗體能結合于鉤端螺旋體外膜基因產(chǎn)物或片段。較佳地，指那些能與鉤端螺旋體外膜基因產(chǎn)物或片段結合但不識別和結合于其它非相關抗原分子的抗體。本發(fā)明還包括那些能與修飾或未經(jīng)修飾形式的鉤端螺旋體外膜基因產(chǎn)物結合的抗體。本發(fā)明不僅包括完整的單克隆或多克隆抗體，而且還包括具有免疫活性抗體片段，如Fab'或(Fab)2片段；抗體重鏈；抗體輕鏈或嵌合抗體。本發(fā)明的抗體可以通過本領域內(nèi)技術人員己知的各種技術進行制備。例如，純化的鉤端螺旋體外膜基因產(chǎn)物或者其具有抗原性的片段，可被施用于動物以誘導多克隆抗體的產(chǎn)生。與之相似的，表達鉤端螺旋體外膜蛋白或其具有抗原性的片段的細胞可用來免疫動物來生產(chǎn)抗體。本發(fā)明的抗體也可以是單克隆抗體。此類單克隆抗體可以利用雜交瘤技術來制備。疫苗組合物本發(fā)明的疫苗可以是預防性的(即預防感染)或治療性的(即在感染后治療疾病)。這些疫苗包含免疫性抗原或免疫原、免疫原性多肽、蛋白或蛋白片段、或核酸(如核糖核酸或脫氧核糖核酸)，通常與"藥學上可接受的載體"組合，這些載體包括本身不誘導產(chǎn)生對接受該組合物的個體有害的抗體的任何載體。合適的載體通常是大的、代謝緩慢的大分子，如蛋白質(zhì)、多糖、聚乳酸、聚乙醇酸、氨基酸聚合物、氨基酸共聚物、脂質(zhì)凝集物(如油滴或脂質(zhì)體)以及無活性的病毒顆粒。這些載體是本領域普通技術人員所熟知的。另外，這些載體可起免疫刺激劑(佐劑)作用。另外，抗原或免疫原可以和細菌類毒素(如白喉、破傷風、霍亂、幽門螺桿菌等病原體的類毒素)偶聯(lián)。增強組合物效果的較佳的佐劑包括但不局限于(l)鋁鹽(alum)，如氫氧化鋁、磷酸鋁、硫酸鋁等；(2)水包油型乳劑配方(有或沒有其它特異性的免疫刺激劑，如胞壁酰肽(見下文)或細菌細胞壁成分)，例如，(a)MF59其含有5%鯊烯、0.5%的吐溫80和0.5%Span85(任選地含有不同量的MTP-PE(見下文)，雖然并不需要)，用微量流化器(如110Y型微量流化器(Microfluidics，Newton，MA))制成亞微米級顆粒；(b)SAF，其含有10%鯊烯、0.4%吐溫80、5%普盧蘭尼克(pluronic)嵌段聚合物L121以及thr^MDP(見下文)，微量流化成業(yè)微米級乳劑或渦流振蕩產(chǎn)生粒徑較大的乳劑，和(c)Ribi佐劑系統(tǒng)(RAS)(RibiImmunochem，Hamilton,MT)，其含有2%鯊烯、0.2%吐溫80以及取自單磷酰脂A(MPL)、二霉菌酸海藻糖酯(TDM)、和細胞壁骨架(CWS)的一種或多種細菌細胞壁組分，較佳的是MPL+CWS(Detox);(3)皂素佐劑，例如可采用stimulon(CambridgeBioscience,Worcester,MA)或從其產(chǎn)生的顆粒，如ISCOM(免疫刺激性復合物)；(4)Freund完全佐劑(CFA)和Freund不完全佐劑(IFA);(5)細胞因子，如白介素(如IL-1、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-12等)、干擾素(如Y干擾素)、巨噬細胞集落刺激因子(M"CFS)、腫瘤壞死因子(TNF)等(6)細菌ADP-核糖基化毒素(如霍亂毒素CT，百日咳毒素PT或大腸桿菌熱不穩(wěn)定毒素LT)的脫毒變異體，尤其是LT-K63、LT-R72,CT_S109、PT-K9/G129;參見例如W093/13302和W092/19265;以及(7)作為免疫刺激劑來增強組合物效果的其它物質(zhì)。如上所述，胞壁酰肽包括但不局限于，N-乙酰-胞壁酰-L-蘇氨酰-D-異谷氨酰胺(thr-MDP)、N-乙酰-去胞壁酰-L-丙氨酰-D-異谷氨酰胺(nor-MDP)、N-乙酰胞壁酰-L-丙氨酰-D-異谷氨酰氨?；?L-丙氨酸-2-(r-2，-二棕櫚酰-sn-甘油-3-羥基磷酰氧)-乙胺(MTP-PE)等。包括免疫原性組合物在內(nèi)的疫苗組合物(如可包括抗原，藥學上可接受的載體以及佐劑)，通常含有稀釋劑，如水，鹽水，甘油，乙醇等。另外，輔助性物質(zhì)，如潤濕劑或乳化劑、pH緩沖物質(zhì)等可存在于這類運載體中。此外，包括免疫原性組合物在內(nèi)的疫苗組合物可含有在藥學上可接受載體中的抗原、多肽、蛋白、蛋白片段或核酸。更具體地，包括免疫原性組合物在內(nèi)的疫苗，包含免疫學有效量的免疫原性多肽，以及上述其它所需的組分。"免疫學有效量"指以單劑或連續(xù)劑一部分給予個體的量對治療或預防是有效的。該用量根據(jù)所治療個體的健康狀況和生理狀況、所治療個體的類別(如非人靈長類等)、個體免疫系統(tǒng)合成抗體的能力、所需的保護程度、疫苗的配制、治療醫(yī)師對醫(yī)療狀況的評估、及其它的相關因素而定。預計該用量將在相對較寬的范圍內(nèi)，可通過常規(guī)實驗來確定。通常，可將疫苗組合物或免疫原性組合物制成可注射劑，例如液體溶液或懸液；還可制成在注射前適合配入溶液或懸液、液體賦形劑的固體形式。該制劑還可乳化或包封在脂質(zhì)體中，在上述藥學上可接受的載體下增強佐劑效果。常規(guī)方法是從腸胃外(皮下或肌內(nèi))途徑通過注射給予免疫原性組合物。適合其它給藥方式的其它配方包括口服制劑。治療劑量可以是單劑方案或多劑方案。疫苗可以結合其它免疫調(diào)節(jié)劑一起給予。作為以蛋白質(zhì)為基礎的疫苗的一種替代方案是，還可以采用DNA疫苗接種。下面結合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。應理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件如Sambrook等人在《分子克隆實驗室手冊》(NewYork:ColdSpringHarborLaboratoryPress,1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。一、基于生物信息學和基因芯片的基因組方法篩選鉤端螺旋體疫苗候選基因1、生物信息學分析預測鉤端螺旋體編碼表面暴露蛋白的基因2、比較基因組學雜交篩選出在中國流行的十個流行血清群鉤端螺旋體代表株中保守的基因3、轉錄組學分析鑒定鉤端螺旋體基因組中高表達基因經(jīng)過上述3個方法，最后從鉤端螺旋體賴株基因組中篩選鑒定出226個疫苗候選基因。這226個疫苗候選基因表達的蛋白質(zhì)不但是表面暴露蛋白，而且是在中國流行的大部分血清群的代表株中保守，并且具有較高的轉錄水平。(本部分內(nèi)容已發(fā)表于BMCgenomics2006年第七巻)二、鉤端螺旋體兩個新的疫苗候選基因la0957，lal495的克隆表達和篩選鑒定表一基因基因長度(bp)引物_^_1623F:5'-catgcatgcACTCACGATGATTCAGC-3'outermembraneLA0957R:5'-ccaagcttGATTTATTTTTCGGAAGT-3'effluxprotein931F:5'-cgggatccAGTTTCGCCGGATCAGAT-3'putativeLA1495R:5，-ccaagcttTTMTTTTGTGTTTTTGTAGG-3，outermembraneprotein實施例1兩個新的疫苗候選基因la0957,lal495的克隆表達通過常規(guī)分子生物學方法克隆表達這兩個基因，表達載體為pQE31，表達菌為￡co力'M15。將測序成功的重組質(zhì)粒轉化至感受態(tài)M15，Amp和Kan雙抗篩選陽性克隆后，加入LB液體培養(yǎng)基中，37"C250rpm擴增過夜。按1:100的接種量轉至LB培養(yǎng)液，37'C培養(yǎng)至OD約為0.60.8后，采用IPTG誘導蛋白表達。不同蛋白誘導溫度及IPTG濃度各不相同。超聲粉碎已表達蛋白的￡co力'M15細胞，分別收集沉淀和上清，10%15%SDS-PAGE和Westernblot鑒定。然后大量表達重組蛋白，并對重組蛋白進行純化，用BCA(bicinchoninicacid)法檢測蛋白濃度。la0957，lal495兩個基因PCR擴增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳分析如圖1A及圖IB,PQE31重組表達質(zhì)粒的酶切鑒定結果如圖2A及圖2B，LA0957LA1495兩個重組蛋白質(zhì)的SDS-PAGE結果如圖3A及圖3B。實施例2重組蛋白質(zhì)的免疫原性檢測首先用BALB/c小鼠制備上述2個重組蛋白質(zhì)的多克隆抗體，檢測血清效價為1:32000，顯示有良好的免疫原性。Western-blot檢測重組蛋白的免疫反應性，顯示重組蛋白可與相應多抗血清反應，說明這兩個疫苗候選抗原具有良好的免疫反應性實施例3Westernblot檢測疫苗候選抗原在鉤端螺旋體賴株兔血清中的抗體方法是將2ug重組蛋白經(jīng)SDS-PAGE后轉膜，用封閉液(1%脫脂奶粉-0.1%Tween20-PBS，pH7.4)封閉2小時，PBS-T液沖洗3次，每次10分鐘。用兔抗鉤端螺旋體血清稀釋作為一抗，稀釋倍數(shù)為1:50，1:100，1:200和1:400，反應3小時，PBS-T液洗三次，每次10分鐘。二抗為Goat-anti-RabbitIgGHRP(1:2000)，反應1小時后，PBS-T洗三次?；瘜W發(fā)光底物顯色。檢測結果顯示，LA0957和LA1495的抗體存在于鉤端螺旋體全菌兔抗血清中。這2個鉤端螺旋體疫苗候選分子在感染鉤端螺旋體的動物體內(nèi)有表達并能刺激機體產(chǎn)生相應抗體。實施例4FACS(流式細胞儀)檢測LA0957和LA1495為鉤端螺旋體表面暴露蛋白質(zhì)方法鉤端螺旋體賴株培養(yǎng)至濃度為2X107ml，PBS緩沖液洗2次并調(diào)整濃度到3X107ml。取300tU鉤端螺旋體細胞懸液加入重組蛋白的BALB/c小鼠血清或者PBS免疫BALB/c小鼠所得抗血清(終濃度為1:50)，37。C孵育30分鐘，10000r/min離心10分鐘，PBS緩沖液洗2次，再加入6u1FITCanti-mouseIgG2a/2b，37'C避光孵育30分鐘，PBS洗滌2次，PBS重懸。FACS檢測熒光值，統(tǒng)計學軟件SPSS10.0分析結果。陰性對照為正常BALB/c小鼠血清，陽性對照為重組蛋白質(zhì)LipL32及LipL41的BALB/c小鼠抗血清。每個樣本重復檢測45次。結果見圖4A及圖4B，其中灰色峰圖為正常小鼠血清與鉤端螺旋體細胞反應，以排除小鼠血清與鉤端螺旋體的非特異性結合。白色峰圖為特異性外膜蛋白抗血清或者PBS免疫BALB/c小鼠抗血清與鉤端螺旋體細胞的結合反應。這兩者的差異性表明特異性鉤端螺旋體蛋白質(zhì)與鉤端螺旋體細胞的結合程度。SPSS10.0軟件進行兩個獨立樣本的非參數(shù)統(tǒng)計學統(tǒng)計(Kolmorov-Smirnovtest,K-Stest)，分析疫苗候選抗原免疫小鼠抗血清與正常小鼠血清熒光信號的平均值是否有統(tǒng)計學意義。結果顯示已知的暴露于外膜的蛋白LipL32和LipL41及疫苗候選抗原LA0957和LA1495的K-S檢驗代O.05，有統(tǒng)計學意義。說明疫苗候選抗原LA0957和LA1495是鉤端螺旋體的表面暴露蛋白質(zhì)。實施例5WesternBlot檢測疫苗候選抗原在不同菌株中的保守性鉤端螺旋體菌體處理我國流行的鉤端螺旋體15個血清群代表株用EMJH培養(yǎng)基28"C振蕩培養(yǎng)，培養(yǎng)3天后10000rpm離心10分鐘，PBS洗滌2次，去除多余的PBS后稱量濕重，按照100mg/ml加無菌雙蒸水，充分混勻，備用。WesternBlot檢測12XSDS-PAGE后轉膜，用封閉液(1%脫脂奶粉_0.1%Tween20-PBS，pH7.4)封閉2小時，PBS-T液沖洗3次，每次10分鐘。用重組蛋白的BALB/c小鼠血清l:1000稀釋作為一抗，反應3小時，PBS-T液洗三次，每次IO分鐘。二抗為Goat-anti-MouseIgGHRP(1:2000)，反應1小時，PBS-T次?；瘜W發(fā)光底物顯色。結果如圖5A及圖5B,在疫苗候選抗原LA0957和LA1495在15株不同血清群代表株中均有表達，是保守的疫苗候選抗原。本發(fā)明應用逆向疫苗學的理論，通過生物信息學方法，并整合了比較基因組學雜交以及轉錄組學的結果，篩選出226個鉤端螺旋體疫苗候選基因。通過對LA0957和LA1495這2個疫苗候選基因進行進一步篩選和鑒定，顯示他們不但具有較好的免疫原性，在鉤端螺旋體賴株兔血清中存在抗體，F(xiàn)ACS檢測證實均為鉤端螺旋體細胞的表面暴露蛋白質(zhì)，而且在15個血清群的代表株中具有強保守性，是兩個新的鉤端螺旋體疫苗候選基因。序列表<110>上海交通大學醫(yī)學院<120>鉤端螺旋體兩個疫苗候選的外膜蛋白〈130〉<160>4〈170〉Patentlnversion3.3<210>1<211>557<212〉PRT<213〉Leptospirainterrogans(鉤端螺旋體)〈400〉1MetTyrTyrLysLysLysArgThrLeuGluLysPheLeuValPheGly151015ThrlieLeuLeuThrMetlieGinProThrTrpSerGluAsplieLeu202530ProGluGluThrValLeuGluGluAsnLysLysSerProValGluAsn354045LeuGlyAspSerLysLyslieLeuArgLeuThrLeuLysAspAlaVal505560AsnTyrValLeuGluLysAsnlieThrlieGinAsnAlaLysMetGlu6570758018TyrValLysAlaAspGlyGlyGluLeuLysAsnGluSerGinPheThr859095TrpAsnLeulieGlyGlylieThrValPheArgThrThrLeuProAla100105110AsnArgAsnAsnliePheAlaGlyThrLysGinSerGinAspLysLeu115120125SerValGlylieGluLysAsnPheArgThrGlyThrTyrAlaLysLeu130135140GluAlaSerThrThrArgPheAspThrSerAlaPheGluAsnProSer145150155160ThrThrProSerAsnLeuAlaAlaLeuAlalieProProLeuTyrThr165170175GlyAlaLeuThrlieThrLeuSerGinGlulieLeuLysTyrSerPhe180185190GlyLysThrGinLysGluArgGluAlalieLeuArgGinAsnThrVal195200205lieLysArgGluGluLeulieTyrValLeuSerGinLeuValAlaGin210215220ThrLeulieGinTyrTrpSerLeuAsnlieTyrAspSerAsnValLys225230235240ThrLeuGinAspLeuGluSerAsnThrArgAsnlieArgAspLeuThr245250255ValArgLysArgAsnLeuGlyLeuSerGluGlyPheGluValAsnLeu260265270TrpAsnSerlieLeuSerGinThrAlaGlyAsnLeuGluLysAlaLys275280285ValSerArgLysGluAlaGluArgAsnLeulieArglieLeuAsnAla290295300AspProSerSerLyslieGluGlyValThrAspLeuGinGluAsnVal305310315320ProLeuAspPheAsnValGluLysAspTyrlieTyrAlaLeuAspHis325330335ArgThrAspLeuLysAsnLeuArgLysGinArgGlulieAlaGluLeu340345350AsnLeuLyslieLysGluAlaGluAspMetPi;oSerLeuLysLeuSer355360365GlyAlaTyrSerThrArgGlyGinAsnlieValSerProGinGinAsn370375380LeuThrAspGlyAsnArgGlyValAlaSerPheLysTyrProGluAla385390395400TyrAlaAlaPheGinPheSerTyrProLeuTrpAspLysGlylieLys405410415AlaAsplieArgAsnAlaLysLeuAspValGinAsnLeuGluLysLys420425430GluAlaGluLeuLysLeuSerlieLysGluGluLeuGluAsnArgTyr435440445AlaAlalieValAlaAspLysAspliePheGluGlyAla'LysLysArg450455460LysGluGluAlaAsnLysPheTyrLysGlyLeuSerGluArgPheArg465470475480GinGlyArgPheThrAlaValAlaValLysAsnAlaLeuAspAsnVal485490495lieGinSerGluLeuGinValThrGinAlaLyslieGinLeuAsnlie500505510AsplieLeuArgTyrGluLeuAlaLysAsnHisliePheGluArgPhe515520525GlyValAsnValAsnAsplielieAspArgLeuMetLysMetValAsp530535540lieAlaGinSerLysSerSerThrGluThrSerGluLys545550555<210〉2〈211〉1674〈212〉DNA<213〉Leptospirainterrogans消端螺旋體)〈400〉2atgtattacaaaaagaaaaggacattagaaaaatttctcgttttcggaaccattctactc60acgatgattcagcctacttggagtgaggacatacttccggaagaaactgttttagaagag120aataaaaaatctcccgttgaaaatttaggtgactccaaaaaaatattgagactgacttta180aaagacgcagtcaattatgttcttgagaagaatattacaatccaaaacgctaaaatggaa240tatgtaaaagcggacggtggagaacttaaaaacgaatcccaatttacttggaatctaatc300ggtggaattaccgttttcaggacaactctccctgccaatagaaataacatctttgccgga360accaaacaaagccaagataaattaagcgtcggaattgagaaaaattttegaaccggaacg420tatgcaaaattagaagcaagtactactcgttttgatacgagcgctttcgaaaacccgtcc480acaactccttccaacttagcggcgcttgcaattcctcctttatatacaggcgctttgacc540a/tcactttaagccaggaaatcttaaagtatagttttggaaaaactcagaaagaBagagaa600gccattttaagacaaaatactgtaatcaaaagagaagaat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