專利名稱：時(shí)鐘基因Bmal的表達(dá)調(diào)節(jié)劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及時(shí)鐘基因的表達(dá)調(diào)節(jié)劑，更具體涉及時(shí)鐘基因Bmal的表達(dá)調(diào)節(jié)劑及包含所述表達(dá)調(diào)節(jié)劑的晝夜節(jié)律調(diào)節(jié)劑。
_2] 相關(guān)領(lǐng)域描述地球上幾乎所有的活的生物體都具有內(nèi)在的“生物鐘”,其在約24小時(shí)的周期內(nèi)自主地波動(dòng)。生物鐘引起稱為晝夜節(jié)律的生物學(xué)上的每日波動(dòng)，其被認(rèn)為控制多種生物學(xué)現(xiàn)象(活性)的晝間變化，所述生物學(xué)現(xiàn)象不僅包括生物的睡-醒周期，還包括體溫、血壓、激素分泌、新陳代謝、以及心理活動(dòng)和身體活動(dòng)、進(jìn)食等。近年來已指出晝夜節(jié)律紊亂是多種心身癥狀(psychosomatic symptom)或疾病狀況(包括睡眠障礙、皮膚疾病、與生活方式有關(guān)的疾病和神經(jīng)精神障礙諸如抑郁等)的致病因素。 如圖I中所闡明，生物鐘由節(jié)律產(chǎn)生系統(tǒng)控制，所述系統(tǒng)包括一組稱為“時(shí)鐘基因”的基因。在哺乳動(dòng)物中時(shí)鐘的分子機(jī)制的核心是由編碼四個(gè)蛋白質(zhì)CLOCK、BMALUPERIOD和CRYPT0CHR0ME的基因的轉(zhuǎn)錄的促進(jìn)/抑制所組成的反饋回路。晝夜節(jié)律由該反饋回路的波動(dòng)產(chǎn)生，周期為約24小時(shí)。雖然晝夜節(jié)律的控制中心(中樞時(shí)鐘)位于下丘腦中的視交叉上核，但已經(jīng)變得清楚的是時(shí)鐘基因甚至在肝、腎、皮膚和其他的外周組織中表達(dá)，在其中通過相似的系統(tǒng)產(chǎn)生晝夜節(jié)律。外周的時(shí)鐘基因的表達(dá)通過來自視交叉上核的信號(hào)調(diào)節(jié)。已經(jīng)進(jìn)一步證實(shí)外周組織和細(xì)胞中的時(shí)鐘基因的表達(dá)直接受信號(hào)刺激因子如糖皮質(zhì)激素、兒茶酚胺、血管緊張素II和其它信號(hào)刺激因子控制以產(chǎn)生生理節(jié)律。近年來，通過在體外使用刺激因子如糖皮質(zhì)激素、福斯高林、血清和其它刺激因子誘導(dǎo)時(shí)鐘基因表達(dá)的晝夜節(jié)律，以同步表達(dá)節(jié)律，并通過使用它們的表達(dá)作為標(biāo)準(zhǔn)評(píng)價(jià)晝夜節(jié)律，對(duì)培養(yǎng)細(xì)胞諸如成纖維細(xì)胞的晝夜節(jié)律進(jìn)行了研究(非專利文件1、2和3)。時(shí)鐘基因直接控制作為轉(zhuǎn)錄因子的其他基因的表達(dá)節(jié)律，并通過調(diào)節(jié)激素分泌等間接控制更多的基因的晝間表達(dá)。已經(jīng)變得清楚的是生物中時(shí)鐘基因的表達(dá)節(jié)律的破壞引起身體器官或內(nèi)分泌系統(tǒng)的問題，其導(dǎo)致多種疾病，包括與生活方式有關(guān)的疾病諸如高血壓(非專利文件4)。例如，已報(bào)導(dǎo)患有肥胖癥的人顯示時(shí)鐘基因的異常表達(dá)，還報(bào)道了與抑郁和癌癥的關(guān)聯(lián)性。另外，已經(jīng)闡明時(shí)鐘基因調(diào)節(jié)皮膚的多種生理功能的晝夜節(jié)律。在使用正常人皮膚成纖維細(xì)胞的試驗(yàn)中，報(bào)道了 I型膠原基因以晝夜節(jié)律表達(dá)，其表達(dá)模式與時(shí)鐘基因Period 2的表達(dá)模式相似(非專利文件5)。通過調(diào)節(jié)時(shí)鐘基因的表達(dá)，調(diào)整受時(shí)鐘基因控制的活的生物體的多種行為節(jié)律和生理功能的晝夜節(jié)律是可能的。因此對(duì)開發(fā)能調(diào)節(jié)時(shí)鐘基因的表達(dá)的活性劑有強(qiáng)烈的需求。[非專利文件I]H. Okamura, “細(xì)胞時(shí)鐘中的時(shí)鐘基因作用、功能和奧秘(Clock Genes in CellClocks: Roles, Actions, and Mysteries)，，，Journal of Biological Rhythms,第 19 卷，第 5 期，第 388-399 頁，2004。
[非專利文件2]A. Balsalobre等人，“血清性休克誘導(dǎo)哺乳動(dòng)物組織培養(yǎng)細(xì)胞中晝夜節(jié)律基因的表達(dá)(A Serum Shock Induces Circadian Gene Expression in Mammalian TissueCulture Cells) ” , Cell,第 93 卷，第 929-937 頁，1998。[非專利文件3]K. Yagita等人，“在培養(yǎng)的成纖維細(xì)胞中的生物鐘的分子機(jī)制(MolecularMechanisms of the Biological Clock in Cu·ltured Fibroblasts)，，，Science,第 292卷，第 278-281 頁，2001。[非專利文件4]M. Hastings等人，“晝夜節(jié)律鐘內(nèi)分泌和代謝節(jié)律的調(diào)節(jié)劑(Circadianclocks: regulators of endocrine and metabolic rhythms)，，，Journal ofEndocrinology,第 195 卷,第 187-198 頁,2007。[非專利文件5]K. Izumi等人，“具有晝夜節(jié)律表達(dá)的皮膚生理基因的分析(Gaijitsu rizumuwo motsu hifuseiriidennshi no tansaku) ”，日本分子生物學(xué)會(huì)，第32屆年會(huì)，摘要2P-0009, 2009。

發(fā)明內(nèi)容
鑒于上述情況，本發(fā)明的目的是提供能調(diào)節(jié)作為生物鐘核心基因的Bmal基因的表達(dá)的活性劑。由于本發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)某些植物提取物或精油具有誘導(dǎo)時(shí)鐘基因Bmal的表達(dá)節(jié)律以及促進(jìn)其表達(dá)的特性，所以發(fā)明人完成了本發(fā)明。本發(fā)明的Bmal基因的表達(dá)調(diào)節(jié)劑包含作為活性成分的一種或多種選自以下的物質(zhì)日本扁柏提取物(hinoki cypress extract)、小球藻提取物(chlorella extract)、酒花提取物(hop extract)、花椒提取物(Zanthoxylum extract)、刺柏油(juniper oil)、熏衣草油、桉樹油、乳香、柏木油(cypress oil)、玫瑰草油(palmarosa oil)、松針油、玫瑰油、依蘭油、欖香油、卑朽1油(petitgrain oil)、胡椒油(pepper oil)、百里香油和春黃菊油。上文提及的特定的植物提取物或精油能調(diào)節(jié)時(shí)鐘基因的表達(dá)迄今為止尚未為人所知。在本發(fā)明中基因表達(dá)的調(diào)節(jié)不僅包括基因表達(dá)的促進(jìn)而且包括基因表達(dá)的節(jié)律(相或周期)的調(diào)節(jié)。本發(fā)明的晝夜節(jié)律調(diào)節(jié)劑包含上文提及的Bmal基因的表達(dá)調(diào)節(jié)劑。如上所述，時(shí)鐘基因直接或間接控制參與身體器官的功能和內(nèi)分泌系統(tǒng)的多種基因的晝間表達(dá)。通過調(diào)節(jié)作為生物鐘核心基因的Bmal基因的表達(dá)，調(diào)節(jié)受所述基因控制的活的生物體的多種行為節(jié)律和生理功能的晝夜節(jié)律是可能的。此外，本發(fā)明的發(fā)明人已經(jīng)在使用人皮膚成纖維細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)上文所述的一些的具有調(diào)節(jié)Bmal基因表達(dá)的活性的所述物質(zhì)還能夠調(diào)節(jié)透明質(zhì)酸合成酶(Has)的基因的表達(dá)。因此本發(fā)明的Bmal基因的表達(dá)調(diào)節(jié)劑被認(rèn)為能夠通過調(diào)節(jié)皮膚中透明質(zhì)酸產(chǎn)生的晝夜節(jié)律以及通過增加其產(chǎn)量而改善皮膚功能。本發(fā)明的Bmal基因的表達(dá)調(diào)節(jié)劑可單獨(dú)使用或與其它時(shí)鐘基因的表達(dá)調(diào)節(jié)劑組合使用。例如，其可與Period基因的表達(dá)調(diào)節(jié)劑(其它核心時(shí)鐘基因中的一種)組合使用。在如圖I中所示的晝夜節(jié)律產(chǎn)生系統(tǒng)中，BMALl (Bmal基因的表達(dá)產(chǎn)物)與CLOCK形成異源二聚體以促進(jìn)Period基因的轉(zhuǎn)錄，而表達(dá)的PERIOD (PER)與CRYPTOCHROME (CRY)形成異源二聚體以抑制BMAL和CLOCK活性，由此形成在24小時(shí)期間波動(dòng)的反饋回路。在哺乳動(dòng)物中，Bmal和Period基因的晝夜節(jié)律波動(dòng)的相轉(zhuǎn)換時(shí)間約12小時(shí)。Bmal表達(dá)在夜間增加，而Period表達(dá)在白天增加。因此認(rèn)為經(jīng)由Period和Bmal基因二者的表達(dá)的調(diào)節(jié)可調(diào)節(jié)生物鐘的核心回路，從而可更有效地調(diào)節(jié)晝夜節(jié)律。本發(fā)明所有的Bmal基因的表達(dá)調(diào)節(jié)劑為草藥(herbal medicine)或香料。它們可通過多種施用模式諸如透皮、經(jīng)口和吸入施用而應(yīng)用，且可用于包括藥物、醫(yī)藥部外品 (quasi-drug)、化妝品、食品、雜貨、衣物等的多種實(shí)施方案中。通過有效地調(diào)節(jié)Bmal基因的表達(dá)，改善多種由晝夜節(jié)律功能障礙導(dǎo)致的心身或皮膚癥狀或疾病是可能的。而且，在本發(fā)明的Bmal基因的表達(dá)調(diào)節(jié)劑中，調(diào)節(jié)Has表達(dá)節(jié)律的那些調(diào)節(jié)劑能促進(jìn)其表達(dá)，因此被認(rèn)為通過調(diào)節(jié)皮膚中透明質(zhì)酸產(chǎn)生的晝夜節(jié)律以及通過增加其產(chǎn)量而改善皮膚功能。附圖
簡(jiǎn)述圖I是僅顯不時(shí)鐘基因參與的晝夜節(jié)律廣生系統(tǒng)的核心回路的不意圖。圖2是顯示在培養(yǎng)的人皮膚成纖維細(xì)胞中使用氫化可的松和福斯高林誘導(dǎo)時(shí)鐘基因表達(dá)的晝夜節(jié)律的圖。圖3是顯示在培養(yǎng)的人皮膚成纖維細(xì)胞中受測(cè)試物質(zhì)調(diào)節(jié)的時(shí)鐘基因Bmall的表達(dá)的圖。 實(shí)施本發(fā)明的最佳模式本發(fā)明的Bmal基因的表達(dá)調(diào)節(jié)劑包含作為活性成分的特定的植物提取物或精油。能調(diào)節(jié)Bmal基因的表達(dá)的植物提取物包括選自日本扁柏提取物、小球藻提取物、酒花提取物和花椒提取物的草藥提取物。關(guān)于這些草藥的細(xì)節(jié)請(qǐng)參考日本化妝品成分詞典(Nihon Hann-you Keshouhin Genryou Shu)第四版(YAKUJI NIPPO LIMITED)。以上提及的草藥提取物可通過通常已知的技術(shù)獲得，例如，通過使用提取溶劑將植物材料(各提取物來自其中)浸潰或加熱至回流、隨后過濾并濃縮。通常用于提取的任何溶劑可用作提取溶劑，所述溶劑包括水、甲醇、乙醇、丙二醇、1，3-丁二醇、甘油和其他的醇類、含水醇類溶劑、氯仿、二氯乙烷、四氯化碳、丙酮、乙酸乙酯、己烷和其他的有機(jī)溶劑，這些溶劑可以單獨(dú)或組合使用。使用上文提及的溶劑獲得的提取物可原樣使用，或者可使用吸附技術(shù)(例如經(jīng)離子交換樹脂或多孔聚合物(例如Amberlite XAD-2)柱)、隨后用甲醇或乙醇洗脫、然后濃縮除去雜質(zhì)后使用。也可使用例如，使用水/乙酸乙酯等得到的提取物。所有的這些草藥提取物可商購獲得，且下文對(duì)它們中的每一個(gè)進(jìn)行簡(jiǎn)述。日本扁柏提取物(hinoki cypress extract)由柏科(Cupressacea)日本扁柏(日本扁柏(Chamaecyparis obtusa))獲得,優(yōu)選從日本扁柏的樹干(木材)用30%乙醇或類似溶劑提取得到。小球藻提取物(chlorella extract)由單細(xì)胞植物小球藻(Chlorella vuIRaris)獲得，優(yōu)選從小球藻藻本體用80%乙醇或類似溶劑提取得到。酒花提取物(hop extract)由大麻科(Cannabaceae)酒花(啤酒花(Humuluslupulus))獲得，優(yōu)選從雌花穗狀花序用80%乙醇或類似溶劑提取得到?；ń诽崛∥?Zanthoxylum extract)由花椒果實(shí)(川陜花椒(Zanthoxylumpiperitum))獲得，優(yōu)選從花椒果實(shí)的果皮用70%乙醇或類似溶劑提取得到。能調(diào)節(jié)Bmal基因表達(dá)的植物精油(芳香劑)包括刺柏油(juniper oil)、熏衣草油、桉樹油、乳香、柏木油(cypress oil)、玫瑰草油(palmarosa oil)、松針油、玫瑰油、依蘭油、欖香油、卑朽1油(petitgrain oil)、胡椒油(pepper oil)、百里香油和春黃菊油。這些香料均是商購可得的，將其簡(jiǎn)述如下。刺柏油是通過水蒸氣蒸懼刺柏(歐洲刺柏(.Tuniperus communis L),該植物是柏科(Cupressacea)的常綠樹)的枝和葉而獲得的精油。 熏衣草油是通過水蒸氣蒸懼藥用薰衣草(Lavandula officinalis)的精選的花而獲得的精油，該植物為唇形科(Lamiaceae)的矮灌木。桉樹油是通過水蒸氣蒸懼桉樹(例如藍(lán)桉(Eucalypus Rlobulus))的枝和葉而獲得的精油，該植物是屬于桃金娘科(Myrtaceae)的常綠成材木。乳香是通過水蒸氣蒸餾由灌木或低成材木諸如阿拉伯乳香樹(Boswelliacarterii Birdw,其屬于物牛兒苗目橄欖科(Burseraceae))的樹皮滲出的樹脂而獲得的精油。柏木油是通過水蒸氣蒸懼柏木(地中海柏木(Cupressus sempervirene))的枝和葉而獲得的精油。玫瑰草油是通過水蒸氣蒸懼禾本科(Poaceae)的玫瑰草(魯沙香茅(CymbopoRonmartini))的葉而獲得的精油。松針油是通過水蒸氣蒸懼松樹諸如松科(Pinaceae)歐洲赤松(Pinussylvestris)或者冷杉屬(Abies)的庫葉冷杉(Sakhalin fir)的針葉和小枝而獲得的精油。玫瑰油是通過水蒸氣蒸懼洋薔薇(百葉薔薇(Rosa centifolia L))、大馬士革薔薇(突厥薔薇(Rosa damascena Mill.))和其他薔薇花而獲得的精油。依蘭油是通過直接水蒸氣蒸懼番蒸枝科(Anonaceae)的植物依蘭(CanninRodorata)的花或者用石油醚或其他溶劑提取新鮮的花而獲得的精油。欖香油是通過水蒸氣蒸懼elemi (橄欖科橄欖屬(Canarium)的中等至高大的樹)的樹皮滲出的樹脂(含油樹脂)而獲得的精油。卑朽1油是通過水蒸氣蒸懼蕓香科(Rutaceae)苦橙(bitter orange)(酸橙(Citrus aurantium))的葉和其他部分的而獲得的精油。胡椒油是通過水蒸氣蒸懼胡椒(胡椒(Piper niRrum L.))的衆(zhòng)果而獲得的精油，該植物屬于胡椒科的多年生植物。百里香油是通過水蒸氣蒸懼百里香(磨香草(Thymus vulgaris L.))全植物而獲得的精油，該植物是唇形科的多年生草本植物。春黃菊油是通過水蒸氣蒸懼黃春菊(Ornemis mutticaulls)而獲得的精油。本發(fā)明的Bmal基因的表達(dá)調(diào)節(jié)劑可包含一種或多種的上文提及的植物的提取物(草藥)或精油(香料)。例如，所述表達(dá)調(diào)節(jié)劑可包含一種或多種的上文提及的草藥與一種或多種的上文提及的香料的組合。本發(fā)明的晝夜節(jié)律的調(diào)節(jié)劑包含一種或多種的作為Bmal基因的表達(dá)調(diào)節(jié)劑的上文提及的植物提取物或精油。Bmal基因的表達(dá)調(diào)節(jié)劑可單獨(dú)使用或與具有調(diào)節(jié)其它的時(shí)鐘基因表達(dá)的作用的活性劑組合使用。其它的時(shí)鐘基因的實(shí)例包括Period 基因(Periodl、Period2、Period3)、Clock基因、Cryptochrome基因、白蛋白D位點(diǎn)結(jié)合蛋白(Dbp)基因、E4BP4基因、Npas2基因和Rev-erb基因。然而，Bmal基因的表達(dá)調(diào)節(jié)劑優(yōu)選與Period、Clock和/或Cryptochrome
基因、生物鐘的其它核心基因的表達(dá)調(diào)節(jié)劑組合使用，尤其優(yōu)選與一種或多種Period基因的表達(dá)調(diào)節(jié)劑組合施用。Period基因的表達(dá)調(diào)節(jié)劑包括但不限于草藥諸如，阿尼菊(arnica)、日本萍蓬草(nuphar)、黑茶提取物、花椒(Zanthoxylum)和其它的提取物；和香料，諸如刺柏油、雪松油(cedar oil)、熏衣草油、丁香花蕾油(clove bud oil)、柏木油、玫瑰油、依蘭油、格蓬油(galbanum oil)、卑朽1油、胡椒油、百里香油、羅勒油、β-石竹烯和其它的精油。已確認(rèn)這些草藥或香料能在培養(yǎng)的皮膚成纖維細(xì)胞中誘導(dǎo)Period基因的表達(dá)節(jié)律或促進(jìn)其表達(dá)。此外，Bmal基因的表達(dá)調(diào)節(jié)劑和本發(fā)明的晝夜節(jié)律調(diào)節(jié)劑可單獨(dú)使用或可包含在各種不同的物體中。根據(jù)物體的種類，所述物體可補(bǔ)充地包含任何成分以及上文提及的必需成分。例如，當(dāng)所述物體為應(yīng)用于皮膚的外用制劑，根據(jù)其劑型(例如液體制劑、粉末制劑、顆粒劑、氣霧劑、固體制劑、凝膠劑、貼劑、栓劑等)或其產(chǎn)品形式(例如化妝品、藥物、醫(yī)藥部外品等)可包含通常存在于這樣的外用制劑中的任何成分以及上文提及的Bmal基因的表達(dá)調(diào)節(jié)劑。應(yīng)用于皮膚的外用制劑包括通常應(yīng)用于皮膚(包括頭部皮膚、頭發(fā)和指甲)的組合物，且包括化妝品諸如護(hù)膚品、美容品、護(hù)發(fā)產(chǎn)品、洗面產(chǎn)品、洗發(fā)產(chǎn)品等，以及各種藥物和醫(yī)藥部外品諸如軟膏劑、貼劑、栓劑、牙膏等。所述劑型包括但不限于基于水的系統(tǒng)、增溶系統(tǒng)、乳劑、基于油的系統(tǒng)、凝膠劑、糊劑、軟膏劑、氣霧劑、水-油兩相系統(tǒng)、水-油-粉末三相系統(tǒng)等。當(dāng)應(yīng)用于皮膚的外用制劑為化妝品時(shí)，其包括香水、淡香水(eauxde toilet)、古龍香水(eaux de cologne)、霜、乳狀液、化妝水、粉底化妝品、擦臉粉、唇膏、肥阜、洗發(fā)劑和護(hù)發(fā)素、沐浴露(body shampoo)、沐浴乳(body rinse)、爽身粉、浴阜等。本發(fā)明的Bmal基因的表達(dá)調(diào)節(jié)劑可包含在空氣清新劑、除臭劑、芳香蠟燭、香(incense)、文具、錢包、包、鞋和任何其它的雜貨；內(nèi)衣、全套服裝(outfit)、帽子、長(zhǎng)襪、短襪和任何其它衣物中；或在粉末、顆粒劑、膠囊劑和多種其他制劑中作為食物補(bǔ)充劑；和在零食、飲料和任何其它食品中。此外，當(dāng)本發(fā)明的Bmal基因的表達(dá)調(diào)節(jié)劑包含上文提及的精油(香料)時(shí)，其可用于吸入劑諸如藥物吸入產(chǎn)品和霧化劑中，只要本發(fā)明產(chǎn)生其作用即可。在本說明書中舉例闡述了本發(fā)明的Bmal基因的表達(dá)調(diào)節(jié)劑的實(shí)施方案。然而本發(fā)明不僅限于說明書中描述的實(shí)施方案，而且可采用于任何應(yīng)用模式，條件是產(chǎn)生本發(fā)明的作用。根據(jù)具體的應(yīng)用模式，可將具有調(diào)節(jié)晝夜節(jié)律作用的其它活性劑與本發(fā)明的Bmal基因的表達(dá)調(diào)節(jié)劑組合，條件是不妨礙本發(fā)明的作用。
在物體中的本發(fā)明的Bmal基因的表達(dá)調(diào)節(jié)劑的含量不被特別限制，且可根據(jù)所用的草藥或香料的種類和形式、該物體等適當(dāng)?shù)剡M(jìn)行選擇，例如為該物體的總質(zhì)量的O. 00001質(zhì)量％至100質(zhì)量％、優(yōu)選O. 0001質(zhì)量％至50質(zhì)量％、且更優(yōu)選O. 0001質(zhì)量％至
20質(zhì)量％。本發(fā)明的Bmal基因的表達(dá)調(diào)節(jié)劑或晝夜節(jié)律的調(diào)節(jié)劑以及包含所述調(diào)節(jié)劑的物體的具體應(yīng)用不被特別限制，只要與晝夜節(jié)律的調(diào)節(jié)相關(guān)即可。例如，其可應(yīng)用于飛行時(shí)差反應(yīng)綜合征、輪班制工作綜合征(shift work syndrome)、睡眠時(shí)相延遲綜合征、非24小時(shí)型睡眠-覺醒障礙、與晝夜節(jié)律睡眠障礙有關(guān)的抑郁等、以及失眠、身體狀況不佳(poorphysical conditions)、注意力缺陷、情感淡漠(apathy)、皮膚粗糙(rough skin)和各種其它的與晝夜節(jié)律失調(diào)相關(guān)的癥狀的預(yù)防、改善、治療等。[實(shí)施例]
下文將使用實(shí)施例詳細(xì)敘述本發(fā)明，但本發(fā)明不限于這些實(shí)施例。皮膚成纖維細(xì)胞、上皮細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、色素細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞和各種其它類型的細(xì)胞可用作培養(yǎng)細(xì)胞。然而在實(shí)施例中使用人皮膚成纖維細(xì)胞進(jìn)行評(píng)價(jià)。因?yàn)闀r(shí)鐘基因的核心系統(tǒng)是所有物種的生物和所有類型的細(xì)胞所共有的，所以認(rèn)為由人皮膚成纖維細(xì)胞得到的評(píng)價(jià)結(jié)果應(yīng)當(dāng)可適用于其它物種的生物和其它類型的細(xì)胞。在人類中，有兩種基因被稱為Bmal基因Bmall和Bmal2。由于它們屬于同一基因家族，所以認(rèn)為它們的表現(xiàn)相似。在以下的實(shí)施例中，以Bmall表達(dá)作為代表進(jìn)行測(cè)定。對(duì)于使用培養(yǎng)的人皮膚成纖維細(xì)胞的時(shí)鐘基因表達(dá)節(jié)律的評(píng)價(jià)系統(tǒng)的研究已證實(shí)能夠在使用培養(yǎng)的人皮膚成纖維細(xì)胞的系統(tǒng)中評(píng)價(jià)時(shí)鐘基因表達(dá)節(jié)律。購買了來自正常人皮膚的成纖維細(xì)胞作為培養(yǎng)的人成纖維細(xì)胞(CellApplication, Inc.)并將其用于試驗(yàn)中。將它們接種于DMEM培養(yǎng)基(補(bǔ)充有10%FBS、20mMHEPES、Glutamax和抗菌劑)中，并在37° C、5%C02條件下培養(yǎng)。在培養(yǎng)的第6天，添加50ng/mL氫化可的松或10 μ M福斯高林，并在O時(shí)間后的多個(gè)時(shí)間點(diǎn)收獲各樣品，所述O時(shí)間定義為一經(jīng)添加氫化可的松或福斯高林后的時(shí)間。使用商購可得的RNA提取試劑盒從細(xì)胞提取RNA,并使用商購可得的PCR引物(Perfect Real Time Primer, Takara Bio)通過RT-PCR技術(shù)測(cè)定目標(biāo)基因的表達(dá)的量。對(duì)于時(shí)鐘基因，測(cè)定PeriocK由Periodl代表)和Bmall (它們包括在所述核心系統(tǒng)中)的表達(dá)的量。相似地，定量測(cè)定管家基因RPLPO的表達(dá)的量，并用作內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)以計(jì)算目標(biāo)基因相對(duì)于RPLPO的表達(dá)。在活的生物體中，糖皮質(zhì)激素諸如氫化可的松與在外周組織等中調(diào)節(jié)生物鐘相關(guān)，而且認(rèn)為當(dāng)在早上覺醒時(shí)，氫化可的松的血液濃度升高以重置生物鐘。在培養(yǎng)的細(xì)胞中，單獨(dú)的細(xì)胞通常獨(dú)立地保持它們的節(jié)律。通過使用信號(hào)刺激因子諸如氫化可的松或福斯高林進(jìn)行刺激能同步時(shí)鐘基因的表達(dá)節(jié)律以誘導(dǎo)晝夜節(jié)律。結(jié)果在圖2中顯示。證實(shí)了 Bmall和Periodl表達(dá)分別在刺激后約16小時(shí)和約2小時(shí)出現(xiàn)高峰，且這兩種基因均以約24小時(shí)周期的晝夜節(jié)律循環(huán)表達(dá)。測(cè)試物質(zhì)對(duì)Bmal基因的表汰調(diào)節(jié)作用的評(píng)價(jià)使用培養(yǎng)的人皮膚成纖維細(xì)胞的評(píng)價(jià)系統(tǒng)的以上提及的結(jié)果證明Bmall顯示了在使用試劑刺激后約16小時(shí)具有基因表達(dá)的高峰的晝夜節(jié)律?；谠诖碳ず?6小時(shí)的基因表達(dá)的量評(píng)價(jià)測(cè)試物質(zhì)對(duì)Bmal基因的表達(dá)調(diào)節(jié)作用。為證實(shí)對(duì)Bmal基因的表達(dá)節(jié)律的誘導(dǎo)，還測(cè)定了 Bmal基因在刺激后2小時(shí)的表達(dá)的量。根據(jù)與上文所使用的相似的方法接種來自正常人皮膚的成纖維細(xì)胞(CellApplication, Inc.)。在培養(yǎng)的第6天加入各個(gè)測(cè)試物質(zhì),最終濃度IOOppm,并在刺激后2和16小時(shí)收獲細(xì)胞。使用商購可得的RNA提取試劑盒從細(xì)胞提取RNA。使用商購可得的PCR 引物(Perfect Real Time Primer, Takara Bio)通過 RT-PCR 技術(shù)測(cè)定 Bmal 基因的表
達(dá)的量。此外，還針對(duì)透明質(zhì)酸合成酶(HAS)類似地測(cè)定了基因表達(dá)，透明質(zhì)酸合成酶與透明質(zhì)酸的生成相關(guān)，透明質(zhì)酸在保持皮膚水分方面起重要作用。HAS1、HAS2和HAS3被稱為HAS，且將HAS2作為透代表性的明質(zhì)酸合成酶進(jìn)行了測(cè)定。定量測(cè)定管家基因RPLPO的基因表達(dá)的量，并將其用作內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)以計(jì)算目標(biāo)基因相對(duì)于RPLPO的相對(duì)表達(dá)。對(duì)得到的各測(cè)定結(jié)果進(jìn)行Dunnett的多重比較檢驗(yàn)，與對(duì)照相比 具有單向的5%的顯著性水平的測(cè)定結(jié)果被認(rèn)定為是顯著有效的。圖3顯示在添加各種測(cè)試物質(zhì)和作為陽性對(duì)照的氫化可的松或福斯高林2和16小時(shí)后Bmall基因的基因表達(dá)的相對(duì)量。下表I顯不在16小時(shí)后Bmall基因的基因表達(dá)的相對(duì)量。對(duì)于一些測(cè)試物質(zhì)，Has2基因的基因表達(dá)的相對(duì)量也顯示表I中。[表 I]
權(quán)利要求
1.晝夜節(jié)律的調(diào)節(jié)劑，其包含作為活性成分的一種或多種選自以下的物質(zhì)日本扁柏提取物、小球藻提取物、酒花提取物、花椒提取物、刺柏油、熏衣草油、桉樹油、乳香、柏木油、玫瑰草油、松針油、玫瑰油、依蘭油、欖香油、卑檸油、胡椒油、百里香油和春黃菊油。
2.Bmal基因的表達(dá)調(diào)節(jié)劑，其包含作為活性成分的一種或多種選自以下的物質(zhì)日本扁柏提取物、小球藻提取物、酒花提取物、花椒提取物、刺柏油、熏衣草油、桉樹油、乳香、柏木油、玫瑰草油、松針油、玫瑰油、依蘭油、欖香油、卑檸油、胡椒油、百里香油和春黃菊油。
3.依據(jù)權(quán)利要求2的Bmal基因的表達(dá)調(diào)節(jié)劑，其中所述表達(dá)調(diào)節(jié)劑與Period基因的表達(dá)調(diào)節(jié)劑組合使用。
全文摘要
本發(fā)明提供了能有效調(diào)節(jié)Bmal基因的表達(dá)的物質(zhì)，其具有廣泛的應(yīng)用。所述Bmal基因的表達(dá)調(diào)節(jié)劑包含作為活性成分的一種或多種選自以下的物質(zhì)日本扁柏提取物、小球藻提取物、酒花提取物、花椒提取物、刺柏油、熏衣草油、桉樹油、乳香、柏木油、玫瑰草油、松針油、玫瑰油、依蘭油、欖香油、卑檸油、胡椒油、百里香油和春黃菊油。
文檔編號(hào)A61P25/00GK102858355SQ20118001728
公開日2013年1月2日 申請(qǐng)日期2011年3月30日 優(yōu)先權(quán)日2010年3月31日
發(fā)明者合津陽子, 土師信一郎, 森圭子, 海鹽健一 申請(qǐng)人:株式會(huì)社資生堂