血紅蛋白組合物及其使用方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了經(jīng)修飾的血紅蛋白氧運輸劑，其可用于治療缺氧和相關(guān)狀況。該組合物主要由碳水化合物保護(hù)的血紅蛋白或是雜合血紅蛋白分子構(gòu)成，從而在缺氧階段運輸氧。所述碳水化合物保護(hù)的血紅蛋白療法基于氧化生理學(xué)，該療法被認(rèn)為在局部缺血、貧血和其它與缺氧相關(guān)的狀況中起關(guān)鍵作用。
【專利說明】血紅蛋白組合物及其使用方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及對患者施用的用于治療缺氧和相關(guān)狀況的氧運輸劑。更具體而言，本 發(fā)明涉及在缺氧情況下將氧輸送至細(xì)胞的雜合血紅蛋白分子，所述雜合血紅蛋白分子通過 碳水化合物分子的連接而受到保護(hù)。

【背景技術(shù)】
[0002] 由心血管疾病引起的發(fā)病率和死亡率主要是由于冠狀和/或外周血管中運輸血 液的血管部分或完全阻塞而產(chǎn)生的結(jié)果。當(dāng)這種血管部分阻塞時，血流缺乏導(dǎo)致由該血管 供血的肌肉組織局部缺血，結(jié)果抑制了肌肉收縮及其正常功能。血流的完全阻塞會引起肌 肉組織壞死。肌肉組織壞死會引起瘢痕形成，導(dǎo)致心臟重構(gòu)和衰竭。
[0003] 血管阻塞通常是通過在受影響的血管中機(jī)械地增強(qiáng)血流來進(jìn)行治療。這樣的機(jī)械 增強(qiáng)通常是通過采用外科技術(shù)將天然或合成導(dǎo)管連接至該阻塞區(qū)域的近端和遠(yuǎn)端，從而提 供旁路移植物，或是通過各種方法在阻塞點物理性地增大血管腔而使得血管再生成。這些 血管再生術(shù)涉及諸如充氣球囊（balloons)、血管內(nèi)刀（endovascular knives)和血管內(nèi)鉆 (endovascular drills)等裝置。不利的是，外科方法伴隨著顯著的發(fā)病率甚至是死亡率， 而許多情況下由于復(fù)發(fā)性狹窄使血管成形術(shù)類型的技術(shù)更復(fù)雜化。
[0004] 在某些個體中，由于自然過程，使得血管阻塞得到部分補(bǔ)償，其中新血管形成(稱 為"血管生成"）并且小血管增大(稱為"動脈生成")，從而替代受損血管的功能。這些新血 管可有利于缺血組織中的血流恢復(fù)，從而在阻塞血管的周圍形成"天然旁路"。然而，某些個 體不能生成足夠的側(cè)支血管來充分地補(bǔ)償由心血管疾病引起的血流減少。因此，期望能夠 提供這樣的組合物，所述組合物能補(bǔ)償由于冠狀和外周動脈中的阻塞所引起的血流減少， 從而治療局部缺血。在由于這些機(jī)械性阻塞而引起缺血狀況的阻塞區(qū)域中，作為血液中的 天然的氧運輸組分，血紅蛋白的供應(yīng)可能短缺。需要對血紅蛋白進(jìn)行某種形式的化學(xué)修飾， 以使其適合于用作改進(jìn)的氧運輸劑，從而能夠補(bǔ)償缺血狀況下血流供應(yīng)的降低。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本申請公開了一種用于治療缺氧和相關(guān)狀況的方法和組合物。在所公開的范圍 內(nèi)，想到可將局部缺血、貧血和創(chuàng)傷稱為缺氧情況。不受限于任何特定的理論，據(jù)信，缺氧誘 導(dǎo)了改變細(xì)胞新陳代謝和促進(jìn)新生血管生成的基因的轉(zhuǎn)錄激活。
[0006] 根據(jù)本申請公開的組合物為經(jīng)修飾的血紅蛋白氧運輸劑。本申請公開了一種在 缺氧階段輸送氧的方法和組合物，其中所述組合物主要由被碳水化合物保護(hù)的血紅蛋白 (carbohydrate shielded hemoglobin, CSH?)構(gòu)成。根據(jù)本申請公開的組合物基于氧化化 學(xué)，該組合物被認(rèn)為在局部缺血和貧血中起關(guān)鍵作用并且具有以下通式結(jié)構(gòu)：
[0007] CSH=A[x]-B[y]_C[z]
[0008] A.交聯(lián)的穩(wěn)定的血紅蛋白
[0009] B.連接
[0010] c.天然果膠衍生物
[0011] 根據(jù)本申請公開的組合物為被碳水化合物保護(hù)的血紅蛋白（CSH?)，其中[X]單位 的A與[y]單位的B連接，并且B與[z]單位的C連接。A為四聚體血紅蛋白，并且[X]為 1乃至最多6個四聚體單位。C為果膠的天然衍生物，并且[z]為1乃至最多12個單位。B 為在A和C之間起橋接作用的化學(xué)或物理實體、或是它們的組合，并且[y]為2乃至最多24 個所定的連接。
[0012] 在本申請公開的一個方面，所述血紅蛋白雜合分子含有碳水化合物，以穩(wěn)定作為 氧的通用載體的血紅蛋白的交聯(lián)四聚體亞單元的催化活性。
[0013] 在本申請公開的另一個方面，所述血紅蛋白雜合分子通過靜脈注射在血液中循 環(huán)，從肺中攝取氧然后自身定位至特定的缺氧器官或受損器官或病變器官，在此，存在于膜 表面上的生物標(biāo)記或受體誘導(dǎo)將氧釋放至所述器官。在本申請公開的范圍內(nèi)，想到了可利 用其他的給藥途徑。
[0014] 在本申請公開的另一個方面，組分A和C通過化學(xué)橋連或/和物理橋連(通過離子 或/和疏水或范德華力[或范德華相互作用]的多重相互作用）而橋接。由于共價鍵或/ 和靜電相互作用或/和范德華力所導(dǎo)致的血紅蛋白分子(或者該分子的若干部分)和天然果 膠衍生物之間的橋接力，在雜合血紅蛋白分子的優(yōu)異的穩(wěn)定性和催化活性(氧運輸）中起到 根本性作用。
[0015] 在本申請公開的另一個方面，所述血紅蛋白雜合分子進(jìn)入細(xì)胞并在細(xì)胞中釋放 氧。一旦該細(xì)胞變得充滿了氧，它們的缺氧情況就會被逆轉(zhuǎn)。
[0016] 在本申請公開的又一個方面，所述血紅蛋白雜合分子具有這樣的作用機(jī)制：其用 于對缺氧進(jìn)行直接的治療性藥物干預(yù)。根據(jù)本申請公開的雜合血紅蛋白分子具有類似于人 類紅血細(xì)胞的氧親和性或高于人類紅血細(xì)胞的氧運輸能力，并且不會引起與之前所開發(fā)的 經(jīng)修飾的血紅蛋白相關(guān)的任何不良反應(yīng)。
[0017] 在本申請公開的另一個方面，所述血紅蛋白雜合分子與所有血型均相容，并且可 以直接施用。
[0018] 在本申請公開的另一個方面，所述血紅蛋白雜合分子是穩(wěn)定的組合物，其具有約 為2年的保存期限。
[0019] 在本申請公開的另一個方面，所述血紅蛋白雜合分子能在室溫下儲存而所述組合 物的氧運輸親和力基本上不會降低。
[0020] 在本申請公開的又一個方面，所述經(jīng)修飾的血紅蛋白分子可適配于治療與缺氧相 關(guān)的退行性疾病的治療效果。
[0021] 在本發(fā)明的另一方面，認(rèn)為實體瘤的生長和轉(zhuǎn)移極度依賴于腫瘤血管生成。腫瘤 募集附加血管的主要刺激是細(xì)胞缺氧。缺氧會誘導(dǎo)基因的轉(zhuǎn)錄激活，其改變細(xì)胞新陳代謝 并促進(jìn)新生血管生成。大多數(shù)末期癌癥患者體內(nèi)的腫瘤處于缺氧狀態(tài)并且緩慢地分裂，并 且對大多數(shù)抗癌藥物沒有反應(yīng)。因此，本發(fā)明的一個方面在于提供根據(jù)本申請公開的組合 物，以抑制新生血管生成并使癌細(xì)胞恢復(fù)正常的分裂(這將使抗癌藥物更有效地起作用）。
[0022] 在本申請公開的又一個方面，所述血紅蛋白雜合分子自身定位至癌細(xì)胞膜表面上 的特異性受體，從而進(jìn)入細(xì)胞并在癌細(xì)胞中釋放氧。一旦癌細(xì)胞變得充滿了氧并且它們的 缺氧情況被逆轉(zhuǎn)，抗癌藥物就會具有更高的效率。 附圖簡要說明
[0023] 本申請所描述的實施方案在附圖的圖中示出，所述附圖旨在示例而不限制本發(fā) 明，其中相同的標(biāo)記是指相同或?qū)?yīng)的部分，并且其中：
[0024] 圖1示出了包括α和β亞單元的位置的血紅蛋白的結(jié)構(gòu)。

【具體實施方式】
[0025] 用于本發(fā)明的組合物中的血紅蛋白優(yōu)選為人血紅蛋白，其來自紅血細(xì)胞。然而，其 它類型的形成氧運輸劑的基礎(chǔ)的血紅蛋白（如動物血紅蛋白，特別是牛血紅蛋白和豬血紅 蛋白等，以及來自于細(xì)胞培養(yǎng)的血紅蛋白)在本發(fā)明中也是適用的。根據(jù)本申請公開的雜合 血紅蛋白分子具有以下通式結(jié)構(gòu)：
[0026] CSH=A[x]-B[y]_C[z]
[0027] Α·交聯(lián)的穩(wěn)定的血紅蛋白
[0028] B.連接
[0029] C.天然果膠衍生物
[0030] 根據(jù)本申請公開的組合物為被碳水化合物保護(hù)的血紅蛋白（CSH?)，其中[X]單位 的A與[y]單位的B連接，并且B與[z]單位的C連接。A為四聚體血紅蛋白，并且[X]為 1乃至最多6個四聚體單位。C為果膠的天然衍生物，并且[z]為1乃至最多12個單位。B 為在A和C之間起橋接作用的化學(xué)或物理實體、或是它們的組合，并且[y]為2乃至最多24 個所定的連接。
[0031] 組分 A:
[0032] A為交聯(lián)的穩(wěn)定的血紅蛋白結(jié)構(gòu)
[0033] 血紅蛋白結(jié)構(gòu)
[0034] Hiinefeld在1840年發(fā)現(xiàn)了攜氧蛋白血紅蛋白。1851年，Otto Funke發(fā)表了一系 列文章，其中他描述了通過用諸如純水、醇或醚等溶劑連續(xù)稀釋紅血細(xì)胞、然后從所得蛋白 質(zhì)溶液中緩慢蒸發(fā)溶劑，來生長血紅蛋白晶體。
[0035] 若干年之后，F(xiàn)elix Hoppe-Seyler描述了血紅蛋白的可逆氧合。血紅蛋白在血液 中的作用是由生理學(xué)家Claude Bernard闡明的。名詞"血紅蛋白"是亞鐵血紅素和球蛋白 的混成詞，反映了血紅蛋白的每個亞單元為具有嵌入式亞鐵血紅素（或血紅素）基團(tuán)的球蛋 白。每個亞鐵血紅素基團(tuán)包含一個鐵原子，其能夠通過離子誘導(dǎo)偶極力結(jié)合一個氧分子。哺 乳動物中最常見的血紅蛋白類型包含4個這樣的亞單元。
[0036]

【權(quán)利要求】
1. 一種制備雜合血紅蛋白分子的方法，能用于由血紅蛋白溶液中包含的血紅蛋白形成 穩(wěn)定的血液替代品，該方法包括以下步驟： a) 對所述血紅蛋白溶液進(jìn)行脫氧； b) 將所述脫氧的血紅蛋白溶液與巰基化合物混合； c) 將所述的巰基化合物和血紅蛋白的溶液與交聯(lián)劑混合，從而形成聚合反應(yīng)混合物； d) 使所述聚合反應(yīng)混合物發(fā)生聚合，從而形成聚合血紅蛋白溶液； e) 使所述聚合血紅蛋白溶液與連接劑反應(yīng)，從而將羧基轉(zhuǎn)移到胺反應(yīng)性Sulfo-NHS酯 上，形成前體活性分子；以及 f) 使所述前體活性分子與多糖反應(yīng)。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述血紅蛋白溶液包含哺乳動物血紅蛋白。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述哺乳動物血紅蛋白溶液是由選自由人血紅蛋 白、牛血紅蛋白、羊血紅蛋白、豬血紅蛋白構(gòu)成的組中的血紅蛋白形成的。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述脫氧的血紅蛋白溶液的氧合血紅蛋白含量小 于約10%。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中權(quán)利要求1所述的多糖為天然果膠衍生物。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述多糖為實質(zhì)性甲氧基化的鼠李糖半乳糖醛 酸。
7. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述巰基化合物選自由N-乙?；?L-半胱氨酸、 D，L-半胱氨酸、谷胱甘肽、γ -谷氨?；?半胱氨酸、2, 3-二巰基-1-丙醇、巰基乙酸酯或 鹽、以及1，4- 丁二硫醇、或者通式硫醇-[CH0]n-硫醇構(gòu)成的組，從而形成所述巰基化合物 和所述血紅蛋白的溶液。
8. -種治療宿主中的缺氧器官的方法，該缺氧器官由于不可控的增殖而存在氧不均一 性，并且在向所述宿主施用治療劑時會對所述器官有不良影響，所述方法包括： a) 對所述宿主施用雜合血紅蛋白分子溶液，其量為足夠提高所述治療劑的治療效果的 量；以及 b) 對所述宿主施用有效量的所述治療劑。
9. 權(quán)利要求5所述的方法，其中所述雜合血紅蛋白分子為碳水化合物保護(hù)的穩(wěn)定的血 紅蛋白。
10. -種用于在器官具有降低的輸氧量時提高組織氧合從而增強(qiáng)脊椎動物的器官功能 的方法，其中所述器官具有降低的輸氧量是由于所述脊椎動物的循環(huán)系統(tǒng)內(nèi)的血管的至少 一種部分性梗阻而導(dǎo)致的，并且其中所述脊椎動物具有血量正常的血容量以及至少為正常 的體循環(huán)血管阻力，所述方法包括： 向所述脊椎動物的所述循環(huán)系統(tǒng)引入治療有效量的雜合血紅蛋白分子，從而增強(qiáng)所述 器官的功能。
11. 權(quán)利要求8所述的方法，其中所述雜合血紅蛋白分子為碳水化合物保護(hù)的穩(wěn)定的 血紅蛋白。
12. 權(quán)利要求8所述的方法，其中所述器官為選自由肌肉、心臟、腦、肺和皮膚構(gòu)成的組 中的創(chuàng)傷性器官。
13. 權(quán)利要求12所述的方法，其中所述心臟具有選自由血管狹窄、瓣膜狹窄、心臟開口 狹窄以及心腔狹窄構(gòu)成的組中的部分性狹窄。
14. 一種用于在器官具有降低的輸氧量時提高組織氧合從而增強(qiáng)脊椎動物的器官功能 的方法，其中所述器官具有降低的輸氧量是由于所述脊椎動物的循環(huán)系統(tǒng)內(nèi)的血管的至少 一種部分性梗阻而導(dǎo)致的，并且其中所述脊椎動物具有至少為約30%的主血管血細(xì)胞比容 以及至少為正常的體循環(huán)血管阻力，所述方法包括： 向所述脊椎動物的所述循環(huán)系統(tǒng)引入治療有效量的雜合血紅蛋白分子溶液，從而增強(qiáng) 所述器官的功能。
【文檔編號】A61K38/42GK104105705SQ201180066849
【公開日】2014年10月15日 申請日期:2011年12月8日 優(yōu)先權(quán)日:2010年12月8日
【發(fā)明者】大衛(wèi)·普拉特 申請人:波士頓治療公司