用于預防和治療癌癥和癌細胞遷移的抗ccl25抗體和抗ccr9抗體的制作方法
【專利摘要】本申請公開了在受試者中預防或抑制癌細胞的生長或轉移的方法。一種方法包括向受試者施用治療有效量的趨化因子CCL25和/或趨化因子受體CCR9的抗體的步驟。另一種方法包括向受試者施用治療有效量的表達趨化因子CCL25和/或趨化因子受體CCR9的抗體的表達載體的步驟。
【專利說明】用于預防和治療癌癥和癌細胞遷移的抗CCL25抗體和抗
CCR9抗體
[0001]本申請要求享有于2011年9月29日提交的美國專利申請第13/248，904號、于2011年9月15日提交的美國專利申請第13/233，769號以及于2010年12月14日提交的美國專利申請第12/967，273號的優(yōu)先權。所有上述申請的全部內容通過引用的方式并入本文中。
【技術領域】
[0002]本申請主要涉及抗體領域。特別是，本申請涉及用于抑制或預防癌細胞生長和/或遷移的抗趨化因子和/或抗趨化因子受體抗體的應用。
【背景技術】
[0003]盡管在癌癥研究的最新進展，用于治療惡性腫瘤的細胞特異性療法仍然是難以捉摸的。許多的復雜的因素(能夠使惡性細胞發(fā)生突變，逃避免疫保護和促進血管發(fā)生，從而為迅速生長的細胞提供營養(yǎng))使靶向治療方式的發(fā)展復雜化。目前的療法有多種不良副作用。例如，化療導致多種痛苦，有時甚至引起致命的副作用。生物技術的進步促進了具有較少副作用的靶向生物制劑的發(fā)展。
[0004]宿主細胞具有與信號的配體聯(lián)合的表面受體，并導致宿主細胞活動。表皮生長因子受體有助于控制細胞的生長和轉移。許多腫瘤細胞比正常細胞表達更高數(shù)量的表皮生長因子受體。一種新的治療特定的頂C-225是專門設計用來靶向和阻斷表皮生長因子受體，從而阻止細胞分裂和修復。最近，曲妥單抗(這是一種HER-2-特異性單克隆抗體)已被證明有效治療轉移性乳腺癌。該抗體阻斷在抑制細胞生長的癌細胞上的相互作用。但是，HER-2在僅約25%到3 0%的乳腺癌細胞上被發(fā)現(xiàn)。
[0005]趨化因子是小的細胞因子樣蛋白質的超家族，細胞因子樣蛋白質對水解具有抗性，促進新生血管形成或者內皮細胞生長抑制，誘導細胞支架重排，活化或鈍化淋巴細胞，并且通過與G蛋白偶聯(lián)受體的相互作用調節(jié)趨向性。趨化因子可以調節(jié)表達其受體的宿主細胞的生長和遷移。
[0006]趨化因子(C-C基序)配體25 (CCL25)，也已知為胸腺表達的趨化因子(TECK)，是屬于CC趨化因子家族的小細胞因子。CCL25對胸腺細胞、巨噬細胞和樹突細胞具有趨化性。CCL25通過結合趨化因子受體CCR9發(fā)揮其作用，并且被認為是對T細胞的發(fā)育起到了作用。所產生的人CCL25是一種包含151個氨基酸的蛋白前體。CCL25的基因(scya25)位于人第19號染色體上。
[0007]趨化因子(C-C基序)受體9 (CCR9)，也已知為GPR9-6，在胸腺(在未成熟和成熟T細胞上)中高表達，而在淋巴結和脾臟中低表達。CCR9也豐富地存在于消化道中，其表達與腸的T細胞相關。請注意，結合蛋白D6的趨化因子先前已經被稱作CCR9，但是這個分子是清道夫受體，而不是真正的(信號)趨化因子受體。
【發(fā)明內容】

[0008]本申請的一個方面涉及一種在受試者中治療胚細胞瘤、癌、白血病、淋巴瘤、黑素瘤、骨髓瘤、肉瘤或生殖細胞瘤的方法。在一個實施方式中，所述方法包括向受試者施用治療有效量的抗CCL25抗體、抗CCR9抗體、或它們的組合的步驟，其中，所述治療有效量為大約0.5至50mg/kg。在另一個實施方式中，所述方法包括用有效量的作為蛋白質、肽或編碼基因的CCL25和/或CCR9免疫原來誘導抑制CCL25和/或CCR9的生物活性的抗體以使受試者免疫的步驟。
[0009]本申請的另一個方面涉及在受試者中治療癌癥的方法，其包括:向所述受試者施用有效量的在受試者中表達抗CCL25抗體、抗CCR9抗體、或它們的組合的表達載體，其中，所述癌癥是胚細胞瘤、癌、白血病、淋巴瘤、黑素瘤、骨髓瘤、肉瘤或生殖細胞瘤。
[0010]本申請的另一個方面涉及在受試者中治療或預防癌癥的方法，其包括:向所述受試者施用有效量的表達下列試劑的表達載體:(I)抑制CCL25和/或CCR9表達的試劑，或
(2)抑制CCL25和CCR9間的相互作用的試劑，或(3)抑制CCL25和/或CCR9的生物活性的試劑，其中，所述癌癥是胚細胞瘤、癌、白血病、淋巴瘤、黑素瘤、骨髓瘤、肉瘤或生殖細胞瘤。
[0011]本申請的另一個方面涉及一種用于預防或抑制具有CCL25和/或CCR9表達升高的癌細胞在受試者中的遷移或轉移的方法。在一個實施方式中，所述方法包括向受試者施用治療有效量的抗CCL25抗體、或抗CCR9抗體、或它們的組合的步驟，其中，所述治療有效量為大約0.5至50mg/kg。在另一個實施方式中，所述方法包括用有效量的作為蛋白質、肽或編碼基因的CCL25和/或CCR9免疫原來誘導抑制CCL25和/或CCR9的生物活性的抗體以使受試者免疫的步驟。在 另一個實施方式中，所述方法包括向受試者施用表達抗CCL25抗體、抗CCR9抗體、或它們的組合的表達載體的步驟。
[0012]本申請的另一個方面涉及一種提高化療效果的方法。在一個實施方式中，所述方法包括向正在進行化療以治療癌癥的受試者施用有效量的抗CCL25抗體、或抗CCR9抗體、或它們的組合的步驟，其中，所述有效量為大約0.5至50mg/kg，其中，所述癌癥是胚細胞瘤、癌、白血病、淋巴瘤、黑素瘤、骨髓瘤、肉瘤或生殖細胞瘤。在另一個實施方式中，所述方法包括用有效量的作為蛋白質、肽或編碼基因的CCL25和/或CCR9免疫原來誘導抑制CCL25和/或CCR9的生物活性的抗體以使受試者免疫的步驟。在另一個實施方式中，所述方法包括向受試者施用在受試者中表達抗CCL25抗體、或抗CCR9抗體、或它們的組合的表達載體的步驟。
[0013]本申請的另一個方面涉及一種提高化療效果的方法。所述方法包括向正在進行化療以治療癌癥的受試者施用有效量的能夠表達下列試劑的表達載體:(I)抑制CCL25和/或CCR9表達的試劑，或⑵抑制CCL25和CCR9間的相互作用的試劑，或(3)抑制CCL25和/或CCR9的生物活性的試劑，其中，所述癌癥是胚細胞瘤、癌、白血病、淋巴瘤、黑素瘤、骨髓瘤、肉瘤或生殖細胞瘤。
[0014]本申請的另一個方面涉及一種藥物組合物，該藥物組合物包含藥學上可接受的載體和能夠表達下列試劑的表達載體:(I)抑制CCL25和/或CCR9表達的試劑，或(2)抑制CCL25和CCR9間的相互作用的試劑，或(3)抑制CCL25和/或CCR9的生物活性的試劑。
【專利附圖】

【附圖說明】[0015]圖1顯示了乳腺癌組織的CCL25表達。
[0016]圖2顯示了 CCL25抑制了順鉬誘導的乳腺癌細胞系生長的減少。
[0017]圖3A-B顯示了 CCL25保護乳腺癌細胞免受順鉬誘導的凋亡。
[0018]圖4A-B顯示了乳腺癌細胞系中CCL25-CCR9相互作用導致的PI3K和Akt活化。
[0019]圖5A-B顯示了乳腺癌細胞系的CCL25處理之后的GSK-3 β和FKHR的磷酸化。
[0020]圖6顯示了卵巢癌組織的CCR9和CCL25表達。
[0021]圖7Α-Β顯示了卵巢癌組織的CCL25表達的分析。
[0022]圖8Α-Β顯示了卵巢癌組織的CCR9表達的分析。
[0023]圖9Α-Β顯示了卵巢癌細胞系的CCR9和CCL25表達。
[0024]圖10Α-Β顯示了卵巢癌細胞的缺氧調節(jié)的CCR9mRNA和表面蛋白表達。
[0025]圖1lA-B顯示了 SK0V-3細胞的缺氧介導的和CCL25介導的遷移和侵襲。
[0026]圖12A-B顯示了 SK0V-3細胞的CCL25誘導的膠原蛋白酶表達。
[0027]圖13A-B顯示了 SK0V-3細胞的CCL25誘導的明膠酶表達。
[0028]圖14A-B顯示了 SK0V-3細胞的CCL25誘導的基質降解酶表達。
[0029]圖15顯示了前列腺癌細胞的CCR9表達。
[0030]圖16A-D顯示了前列腺組織的CCR9表達。
[0031]圖17A-D顯示了前列腺癌組織的CCL25表達。
[0032]圖18顯示了正常健康供體或者患有前列腺疾病的患者的血清CCL25水平。
[0033]圖19A-C顯示了小鼠骨髓細胞的CCL25表達。
[0034]圖20A-B顯示了 CCR9介導的前列腺癌細胞遷移和侵襲。
[0035]圖21顯示了前列腺癌細胞系的CCL25誘導的活性MMP表達。
[0036]圖22A-F顯示了 CCR9基因敲減(knockdown)抑制PC3前列腺癌細胞系的骨轉移。
[0037]圖23顯示了肺癌細胞患者的血清CCL25水平。
[0038]圖24A-C顯示了非腫瘤肺和肺癌組織的CCR9表達。
[0039]圖25A-C顯示了結腸癌組織的CCR9-CCL25表達。
【具體實施方式】
[0040]提供如下詳細描述以使本領域技術人員實施和使用本發(fā)明。為了解釋說明的目的，所提及的特定命名提供了對于本發(fā)明的徹底理解。但是，很明顯，本領域技術人員應該理解，這些具體細節(jié)對于實施本發(fā)明不是必需的。提供特定應用的描述僅作為示例性實施例。不應認為本發(fā)明限于所示實施方式，而應給予與在此所公開的原理和特征相一致的最寬的可能的范圍。
[0041]除非另有定義，所使用的與本申請有關的科學和技術術語應該具有本領域技術人員常規(guī)理解的含義。此外，除非上下文需要，單數(shù)術語應該包括復數(shù)，并且復數(shù)術語應該包括單數(shù)。
[0042]定義
[0043]如在此所使用的，如下術語應該具有下面的含義:
[0044]本文所用術語“治療(treat、treating或treatment) ”指的是減輕或消除病癥和/或伴隨癥狀的方法。本文所用術語“預防(prevent、preventing或prevention) ”指的是阻止受試者得到病癥和/或伴隨癥狀的方法。在某些實施方式中，術語“預防”指的是減小得到病癥和/或伴隨癥狀的風險的方法。
[0045]本文所用術語“抗體”是指免疫球蛋白分子和免疫球蛋白(Ig)分子的免疫活性部分，即，包含特異性結合抗原(與抗原發(fā)生免疫反應)的抗原結合位點的分子。術語“抗體”使用了廣義含義，并且具體地包括單克隆抗體(包括全長單克隆抗體)、多克隆抗體、多特異性抗體(例如，雙特異性抗體)和抗體片段，只要它們顯示所需的生物活性即可。“特異性結合”或者“與…發(fā)生免疫反應”是指，抗體與所需抗原的一個或者多個抗原決定簇反應，并且不會與其它多肽反應(即，結合)或者與其它多肽以非常低的親和力結合。術語“抗體”也包括抗體片段，所述抗體片段包含全長抗體的一部分，通常是其抗原結合或可變區(qū)?？贵w片段的實例包括Fab，F(xiàn)ab’、F (ab’)2和Fv片段；雙體；線性抗體；單鏈抗體(scFv)分子；以及由抗體片段形成的多特異性抗體。在本發(fā)明的某些實施方式中，合意的是，例如，使用抗體片段，而不是完整抗體，以提高腫瘤穿透性。在這種情況下，合意的是，使用已通過本領域任何已知方式修飾以提高其血清半衰期的抗體片段。
[0046]在此所使用的術語“單克隆抗體”是指從基本上同系的抗體的群體獲得的抗體，也就是說，除了可以以較小量存在的可能的自然發(fā)生的突變，包括所述群體的單個抗體是相同的。在此所述的單克隆抗體特別包括“嵌合”抗體以及這些抗體的片段，在“嵌合”抗體中，重鏈和/或輕鏈的一部分與源自特定種或者屬于特定抗體類別或亞類的抗體中的相應的序列相同或者同系，而鏈的其余部分與源自其它種或者屬于其它抗體類別或亞類的抗體中相應的序列相同或者同系，只要它們顯示所需的生物活性即可。
[0047]非人抗體的“人化”形式是包含源自非人免疫球蛋白的最小序列的嵌合抗體。對于絕大部分，人化抗體是人免疫球蛋白(受體抗體)，其中，將來自受體高變區(qū)的殘基用來自具有所需特異性、親和性和/或容量的非人種(供體抗體)(例如，小鼠、大鼠、兔子或者非人靈長動物)的高變區(qū)的殘基來替代。制備人化抗體和其它嵌合抗體的方法為本領域已知的方法。
[0048]“雙特異性抗體”是對于至少兩個不同抗原具有結合特異性的抗體。在當前情況下，所述結合特異性中的一種是對于CXCL16或CXCR6的。第二結合靶為任何其它抗原，并且有利地為細胞表面蛋白或者受體或受體亞單元。制備雙特異性抗體的方法為本領域已知的方法。
[0049]“非同性結合抗體(heteroconjugate antibody) ”的使用也在本發(fā)明的范圍內。非同性結合抗體由兩種共價結合的抗體組成。例如，這種抗體已經被提出靶向免疫系統(tǒng)細胞至不該有的細胞(美國專利第4，676，980號)。應該注意到，可以利用已知的合成蛋白質化學的方法(包括涉及到交聯(lián)劑的那些方法)在體外制備抗體。
[0050]本發(fā)明還考慮使用“免疫結合物”，包括與細胞毒性劑(如毒素(例如，細菌、真菌、植物或動物來源的酶促活性毒素或其片段))或放射性同位素(即放射性結合物(radioconjugate))結合的抗體。可以使用的酶促活性毒素及其片段包括:白喉A鏈，白喉毒素的非結合活性片段，外毒素A鏈(來自銅綠假單胞菌)，蓖麻毒素A鏈，相思子毒素A鏈,蒴蓮根毒素A鏈，巨曲霉蛋白毒素(a-sarcin),油桐蛋白，石竹素蛋白，垂序商陸(Phytolaca americana)蛋白(PAP1、PAPII 和 PAP-S),苦瓜抑制劑(momordicacharantia inhibitor),麻瘋樹毒蛋白，巴豆毒蛋白，肥阜草抑制劑，白樹毒素，米托潔林(mitogellin)，局限曲菌素，酚霉素，依諾霉素和新月毒素。各種放射性核素可用于制備放射性結合的抗體。實例包括212Bi，131I，131In，90Y和186Re。
[0051]在藥理學意義上說，在本發(fā)明的上下文中，抗體的“治療有效量”指的是就抗體對治療是有效的而言在疾病的預防或治療中有效的量。“疾病”是將從用抗體治療中獲益的任何狀態(tài)，包括癌和化學抗性。這包括慢性和急性疾病或病癥，包括正在討論的那些使哺乳動物易患病的病理狀態(tài)。
[0052]本文所用的術語“腫瘤”是指通過細胞異常生長形成的贅生物或實體性病變。腫瘤可以是良性的、惡變前的或惡性的。
[0053]術語“癌癥”被定義為惡性贅生物或惡性腫瘤，是細胞族群表現(xiàn)出不受控制的生長、侵入并破壞相鄰組織的浸潤并且有時通過淋巴或血液轉移或擴散到體內的其他位置的一類疾病。癌癥的這三種惡性屬性使其有別于良性腫瘤，良性腫瘤不侵入或轉移。示例性的癌癥包括:癌，黑素瘤，肉瘤，淋巴瘤，白血病，生殖細胞瘤，和胚細胞瘤。
[0054]在此所用的術語“癌”是指侵襲性惡性腫瘤，其由變異的上皮細胞或者未知組織發(fā)生的變異的細胞組成，但是其具有與上皮細胞相關的特定分子或者組織特性，例如，細胞角蛋白或者細胞間橋的生成。本申請的示例性的癌包括卵巢癌、陰道癌、子宮頸癌、子宮癌、前列腺癌、肛門癌、直腸癌、結腸癌、胃癌、胰腺癌、胰島素瘤、腺癌、腺鱗癌、神經內分泌腫瘤、乳腺癌、肺癌、食管癌、口腔癌、腦癌、髓母細胞瘤、神經外胚層瘤、膠質瘤、垂體瘤和骨癌。
[0055]在此所用的術語“淋巴瘤”是指免疫系統(tǒng)的淋巴細胞的癌癥。淋巴瘤通常表現(xiàn)為實體瘤。示例性淋巴瘤包括:小淋巴細胞性淋巴瘤、淋巴漿細胞淋巴瘤、Waldenstrom巨球蛋白血癥、脾邊緣區(qū)淋巴瘤、漿細胞瘤、結外邊緣區(qū)B細胞淋巴瘤、MALT淋巴瘤、結節(jié)邊緣區(qū)B細胞淋巴瘤(NMZL)、濾泡性淋巴瘤、外套細胞淋巴瘤、彌漫性大B細胞淋巴瘤、縱隔(胸腺)大B細胞淋巴瘤、血管內大B細胞淋巴瘤、原發(fā)性滲出性淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、B細胞慢性淋巴細胞性淋巴瘤、典型性霍杰金淋巴瘤、結節(jié)性淋巴細胞為主型霍杰金淋巴瘤、成人T細胞淋巴瘤、結外NK/T細胞淋巴瘤(鼻型)、腸病型T細胞淋巴瘤、肝脾T細胞淋巴瘤、亞頂極NK細胞淋巴瘤、真菌病真菌瘤、塞扎里綜合征、原發(fā)性侵犯皮膚CD30陽性T細胞淋巴增生性障礙、原發(fā)性侵犯皮膚間變性大細胞淋巴瘤、淋巴瘤樣丘疹病、血管免疫母細胞性T細胞淋巴瘤、非特異性外周T細胞淋巴瘤和間變性大細胞淋巴瘤。典型性霍杰金淋巴瘤的示例形式包括:結節(jié)性硬化型、混合細胞型、富淋巴細胞型和淋巴細胞耗盡型或者淋巴細胞不耗盡型。
[0056]在此所使用的術語“肉瘤”為由胚胎中胚層發(fā)展成的許多組織之中的一種組織中的變異細胞引起的癌癥。因此，肉瘤包括骨、軟骨、脂肪、肌肉、血管和造血組織的腫瘤。例如，骨肉瘤來源于骨，軟骨肉瘤來源于軟骨，脂肪肉瘤來源于脂肪，以及平滑肌肉瘤來源于平滑肌。示例性的肉瘤包括:Askin瘤、葡萄狀肉瘤、軟骨肉瘤、尤因原始神經外胚葉瘤(Ewing’ s-PNET )、惡性血管內皮細胞瘤、惡性神經鞘瘤、骨肉瘤、軟組織肉瘤。軟組織肉瘤的亞類包括軟組織腺泡狀肉瘤、血管肉瘤、葉狀囊肉瘤、皮膚纖維肉瘤韌帶樣纖維瘤、結締組織增生性小圓細胞腫瘤、上皮樣肉瘤、骨外軟骨肉瘤、骨外骨肉瘤、纖維肉瘤、血管外皮細胞瘤、血管肉瘤、卡波西肉瘤、平滑肌肉瘤、脂肪肉瘤、淋巴管肉瘤、淋巴肉瘤、惡性纖維組織細胞瘤、神經纖維肉瘤、橫紋肌肉瘤和滑膜肉瘤。
[0057]在此所使用的術語“白血病” 是指以白細胞異常增加為特征的血液或骨髓的癌癥。白血病是覆蓋一類疾病譜的廣義術語。反過來，其是稱為血液腫瘤的更寬泛疾病組的一部分。白血病細分為許多大組；第一分組在白血病的急性和慢性形式之間。急性白血病的特征在于，不成熟血細胞的數(shù)量迅速增加。由這些細胞導致的擁擠現(xiàn)象使骨髓不能產生健康血細胞。慢性白血病的特征在于，相對成熟但仍不正常的白細胞過度增長。通常在數(shù)月或數(shù)年間發(fā)展，所述細胞較比正常細胞以快得多的速率產生，從而導致血液中存在許多不正常的白細胞。白血病還通過受感染的細胞來細分。這一分級將白血病分為成淋細胞性白血病或者淋巴細胞性白血病，以及髓細胞性白血病或者骨髓性粒細胞性白血病。在成淋細胞性白血病或者淋巴細胞性白血病中，癌性變化發(fā)生在通常持續(xù)形成淋巴細胞的髓細胞類型中。在髓細胞性白血病或者骨髓性粒細胞性白血病中，癌性變化發(fā)生在通常持續(xù)形成紅細胞、一些其它類型白細胞和血小板的髓細胞類型中。結合這兩種分類方法提供了全部四種主要的分類。在這四種分類中的每一類中，通常存在幾種典型的亞類。也有在這種分類法之外的罕見類型。示例性的白血病包括:急性成淋巴細胞性白血病(ALL)、慢性淋巴細胞性白血病(CLL)、急性骨髓性白血病(AML)、慢性髓細胞性白血病(CML)、毛細胞性白血病(HCL)、T細胞前淋巴細胞性白血病、大顆粒淋巴細胞性白血病、少年型粒-單核細胞型白血病、B細胞前淋巴細胞性白血病、Burkitt白血病和成人T細胞性白血病。
[0058]在此所使用的術語“黑素瘤”為黑素細胞的癌癥或惡性腫瘤。黑素細胞是產生深色色素、黑色素的細胞，其是造成皮膚的顏色的原因。它們主要出現(xiàn)在皮膚中，但是也被發(fā)現(xiàn)在身體的其它部位，包括腸和眼睛。黑素瘤分為以下類型和亞型:惡性雀斑樣痣、惡性雀斑樣痣黑素瘤、淺表擴散性黑素瘤、肢端黑素瘤、黏膜黑素瘤、結節(jié)性黑素瘤、息肉狀黑素瘤、結締組織增生性黑素瘤、無黑素性黑素瘤、軟組織黑素瘤、具有小痣狀細胞的黑素瘤、具有Spitz痣特征的黑素瘤和色素層黑素瘤。
[0059]在此所使用的術語“生殖細胞瘤(GCT) ”為由生殖細胞獲得的贅生物。生殖細胞瘤可以是癌性的或非癌性的腫瘤。生殖細胞通常出現(xiàn)在生殖腺(卵巢和睪丸)的內部。起源于生殖腺外部的生殖細胞瘤可以是由胚胎發(fā)育過程中的錯誤導致的出生缺陷。生殖細胞瘤大概分為兩類:生殖細胞瘤的或精原細胞瘤的生殖細胞瘤以及非生殖細胞瘤的或非精原細胞瘤的生殖細胞瘤。示例性的生殖細胞瘤的或精原細胞瘤的生殖細胞瘤包括:生殖細胞瘤、無性細胞瘤和精原細胞瘤。示例性的非生殖細胞瘤的或非精原細胞瘤的生殖細胞瘤包括:胚胎性癌、內胚層竇瘤或卵黃囊瘤(EST，YST)、絨毛膜癌、成熟型畸胎瘤、皮樣囊腫、末成熟畸胎瘤、畸胎瘤伴惡變、多胚瘤、性腺胚細胞瘤和混合GCT。
[0060]在此所用術語“轉移”是指腫瘤或癌從一個器官或部位擴散到其它不鄰近的器官或部位。
[0061]術語“哺乳動物”是指任何被分類為哺乳動物的動物，包括人類，非人類靈長類動物，家畜和農場動物，動物園動物，競技動物，或寵物動物，例如，狗，馬，貓，牛等。優(yōu)選地，所述哺乳動物是人。
[0062]術語“抑制”是相對術語，與參考試劑相比，如果在施用一種試劑之后一種反應或狀態(tài)在數(shù)量上減少，或者如果在施用試劑之后其減少，則該試劑抑制了該反應或狀態(tài)。同樣地，術語“防止”并不一定意味著試劑完全消除了該反應或狀態(tài)，只要反應或狀態(tài)的至少一種特性被消除即可。因此，減少或防止感染或反應(如病理反應)的組合物能夠，但不一定，完全消除這種感染或反應，只要感染或反應被適度地減少即可，例如，減少了在沒有試劑的情況下或者在與參考試劑相比的情況下的至少約50%，如至少約70%，或約80%，或甚至約90% (即10%以下)的感染或反應。
[0063]術語“增加水平”是指高于相關領域中通常定義或使用的正?；驅φ账降乃健＠?，在組織中免疫染色的增加水平為被本領域普通技術人員認為高于在對照組織中的免疫染色水平的免疫染色水平。
[0064] 術語“CXCL13免疫原”和“CXCR5免疫原”指的是一種免疫原組合物，其包含(I)得自CXCL13或CXCR5的免疫原肽和/或⑵編碼并且能夠表達得自CXCL13或CXCR5的免疫原肽的表達載體。得自CXCL13或CXCR5的免疫原肽可被融合到另一部分以增強其免疫原性。CXCL13免疫原肽的實例包括，但不限于，由選自RSSSTLPVPVFKRKIP(SEQID NO:45), PRGNGCPRKEIIVffKK (SEQ ID NO:46), LPRGNGCPRKEIIVffK(SEQ IDNO:47) , QILPRGNGCPRKEIIV(SEQ ID NO:48)、ILPRGNGCPRKEIIVW(SEQ ID NO:49),RIQILPRGNGCPRKEI(SEQ ID NO:50) , RGNGCPRKE11VffKKN(SEQ ID NO:51),KRSSSTLPVPVFKRKI(SEQ ID NO:52)、IQILPRGNGCPRKEII(SEQ ID NO:53),DRIQILPRGNGCPRKE(SEQ ID NO:54)、RKRSSSTLPVPVFKRK(SEQ ID NO:55),RCRCVQESSVFIPRRF(SEQ ID NO:56) , GNGCPRKEIIVffKKNK(SEQ ID NO:57),CVQESSVFIPRRFIDR(SEQ ID NO:58)、IDRIQILPRGNGCPRK(SEQ ID NO:59),LRCRCVQESSVFIPRR(SEQ ID NO:60)、FIDRIQILPRGNGCPR (SEQ ID NO:61),RCVQESSVFIPRRFID(SEQ ID NO:62)、CRCVQESSVFIPRRFI(SEQ ID NO:63),QESSVFIPRRFIDRIQ (SEQ ID NO:64)、RFIDRIQILPRGNGCP (SEQ ID NO:65),VQESSVFIPRRFIDRI(SEQ ID NO:66)、ESSVFIPRRFIDRIQI(SEQ ID NO:67),SLRCRCVQESSVFIPR(SEQ ID NO:68), NGCPRKEIIVffKKNKS(SEQ ID NO:69),PQAEffIQRMMEVLRKR(SEQ ID NO:70)、RRFIDRIQILPRGNGC(SEQ ID NO:71),LRKRSSSTLPVPVFKR (SEQ ID NO: 72)、VQESSVF I PRR ( SEQ ID NO: 73 ,EffIQRMMEVLRKRSSSTLPVPVFKRK (SEQ ID NO: 74)、KKNK (SEQ ID NO: 75)、RKRSSS (SEQ IDNO:76)、RGNGCP(SEQ ID NO:77)、VYYTSLRCRCVQESSVFIPRR(SEQ ID NO:78)、DRIQILP(SEQID NO: 79)、RKEIIVW (SEQ ID NO:80)和 KSIVCVDPQ (SEQ ID N0:81)中的一種或多種序列組成的肽，或者含有選自 RSSSTLPVPVFKRKIP (SEQ ID NO: 45)、PRGNGCPRKEIIVffKK (SEQID N0:46), LPRGNGCPRKEIIVffK (SEQ ID NO:47)、QILPRGNGCPRKEIIV(SEQ IDNO:48), ILPRGNGCPRKEIIVff(SEQ ID NO:49)、RIQILPRGNGCPRKEI (SEQ ID NO:50),RGNGCPRKEIIVffKKN(SEQ ID NO:5 I)、KRSSSTLPVPVFKRKI(SEQ ID NO:52),IQILPRGNGCPRKEII(SEQ ID NO:53)、DRIQILPRGNGCPRKE(SEQ ID NO:54),RKRSSSTLPVPVFKRK (SEQ ID NO:55)、RCRCVQESSVFIPRRF (SEQ ID NO:56),GNGCPRKEIIVffKKNK (SEQ ID NO:57)、CVQESSVFIPRRFIDR (SEQ ID NO:58),IDRIQILPRGNGCPRK(SEQ ID NO:59)、LRCRCVQESSVFIPRR(SEQ ID N0:60)、FIDRIQILPRGNGCPR(SEQ ID NO:6 I)、RCVQESSVFIPRRFID(SEQ ID N0:62)、CRCVQESSVFIPRRFI(SEQ ID NO:63)、QESSVFIPRRFIDRIQ (SEQ ID NO:64),RFIDRIQILPRGNGCP (SEQ ID NO:65)、VQESSVFIPRRFIDRI (SEQ ID NO:66),ESSVFIPRRFIDRIQI(SEQ ID NO:67)、SLRCRCVQESSVFIPR(SEQ ID NO:68),NGCPRKEIIVffKKNKS(SEQ ID NO:69)、PQAEWIQRMMEVLRKR(SEQ ID NO:70),RRFIDRIQILPRGNGC(SEQ ID NO:71)、LRKRSSSTLPVPVFKR(SEQ ID NO:72)、VQESSVFIPRR(SEQID NO: 73, EWIQRMMEVLRKRSSSTLPVPVFKRK(SEQ ID NO: 74)、KKNK (SEQ ID N0:75)、RKRSSS(SEQ ID NO:76)、RGNGCP(SEQ ID NO:77)、VYYTSLRCRCVQESSVFIPRR(SEQ ID NO:78)、DRIQILP (SEQ ID NO:79), RKEI IVff (SEQ ID NO:80)和 KSIVCVDPQ (SEQ ID NO:81)中的一種或多種序列的肽。CXCR5免疫原肽的實例包括，但不限于，由選自TSLVENHLCPATE (SEQID NO:82), EGSVGffVLGTFLCKT(SEQ ID NO:83)、LPRCTFS(SEQ ID NO:84)、LARLKAVDNT(SEQID NO:85)和MASFKAVFVP(SEQ ID NO:86)中的一種或多種序列組成的肽，或者含有選自 TSLVENHLCPATE (SEQ ID NO:82), EGSVGffVLGTFLCKT (SEQ ID NO: 83)、LPRCTFS (SEQ IDNO: 84)、LARLKAVDNT (SEQ ID NO:85)和 MASFKAVFVP (SEQ ID NO:86)中的一種或多種序列的肽。
[0065]術語“CXCL16免疫原”和“CXCR6免疫原”指的是一種免疫原組合物，其包含⑴得自CXCL16或CXCR6的免疫原肽和/或(2)編碼并且能夠表達得自CXCL16或CXCR6的免疫原肽的表達載體。得自CXCL16或CXCR6的免疫原肽可以以融合蛋白的形式以增強其免疫原性。CXCL16免疫原肽的實例包括，但不限于，由選自 AAGPEAGENQKQPEKN(SEQ ID NO:87)、SQASEGASSDIHTPAQ(SEQ IDN0:88)、STLQSTQRPTLPVGSL(SEQ ID NO:89), SffSVCGGNKDPffVQEL(SEQ ID NO:90)、GPTARTSATVPVLCLL(SEQ ID NO:91)、SGIVAHQKHLLPTSPP(SEQ ID NO:92)、RLRKHL(SEQ IDNO:93)、LQSTQRP(SEQ ID NO:94)、SSDKELTRPNETT(SEQ ID NO:95)、AGENQKQPEKNA(SEQ IDNO:96)、NEGSVT(SEQ ID NO:97)、ISSDSPPSV(SEQ ID NO:98), CGGNKDPff (SEQ ID NO:99),LLPTSPPISQASEGASSDIHT(SEQ ID NO:100)、 STQRPTLPVGSLSSDKELTRPNETTIHT(SEQ IDNO: 101), SLAAGPEAGENQKQPEKNAGPTARTSA(SEQ ID NO: 102), TGSCYCGKR(SEQ ID NO: 103)、DSPPSVQ(SEQ ID NO: 104), RKHLRAYHRCLYYTRFQLLSffSVCGG(SEQ ID NO: 105)、WVQELMSCLDLKECGHAYSGIVAHQKHLLPTSPPISQ(SEQ ID NO: 106), SDIHTPAQMLLSTLQ(SEQ ID NO:107)、RPTLPVGSL(SEQ ID NO:108)、TAGHSLAAG(SEQ ID NO:109)、GKRISSDSPPSVQ(SEQ ID NO:110)和
[0066]KDPWVQELMSCLDLKECGHAYSGIVAHQKH(SEQ ID NO: 111)中的一種或多種序列組成的肽，或者含有選自 AAGPEAGENQKQPEKN(SEQ ID NO: 87)、SQASEGASSDIHTPAQ (SEQID N0:88)、STLQSTQRPTLPVGSL(SEQ ID NO:89), SffSVCGGNKDPffVQEL(SEQ ID NO:90)、GPTARTSATVPVLCLL (SEQ ID NO: 91)、SGIVAHQKHLLPTSPP (SEQ ID NO: 92)、RLRKHL (SEQ IDNO: 93)、LQSTQRP (SEQ ID NO: 94)、SSDKELTRPNETT (SEQ ID NO: 95)、AGENQKQPEKNA (SEQ IDNO: 96)、NEGSVT (SEQ ID NO: 97)、ISSDSPPSV (SEQ ID NO:98), CGGNKDPff (SEQ ID NO:99),LLPTSPPISQASEGASSDIHT(SEQ ID NO:100)、 STQRPTLPVGSLSSDKELTRPNETTIHT(SEQ IDNO: 101)、SLAAGPEAGENQKQPEKNAGPTARTSA (SEQ ID NO: 102)、TGSCYCGKR (SEQ ID NO: 103)、DSPPSVQ (SEQ ID NO: 104), RKHLRAYHRCLYYTRFQLLSffSVCGG (SEQ ID NO: 105)、WVQELMSCLDLKECGHAYSGIVAHQKHLLPTSPPISQ (SEQ ID NO: 106), SDIHTPAQMLLSTLQ(SEQ ID NO:107)、RPTLPVGSL(SEQ ID NO:108)、TAGHSLAAG(SEQ ID NO:109)、GKRISSDSPPSVQ(SEQ ID NO:110)和
[0067]KDPWVQELMSCLDLKECGHAYSGIVAHQKH(SEQ ID NO: 111)中的一種或多種序列的肽。CXCR6免疫原肽的實例包括，但不限于，由選自HQDFLQFSKV(SEQ IDNO: 112) , AGIHEffVFGQVMCK (SEQ ID NO: 113)、PQIIYGNVFNLDKLICGYHDEAI (SEQ IDNO: 114)和YYAMTSFHYTIMVTEA(SEQ ID NO: 115)中的一種或多種序列組成的肽，或者含有選自 HQDFLQFSKV(SEQ ID NO: 112), AGIHEffVFGQVMCK(SEQ ID NO: 113)、PQIIYGNVFNLDKLICGYHDEAI (SEQ ID NO: 114)和YYAMTSFHYHMVTEA(SEQ ID NO: 115)中的一種或多種序列的肽。
[0068]術語“CCL25免疫原”和“CCR9免疫原”指的是一種免疫原組合物，其包含(I)得自CCL25或CCR9的免疫原肽和/或(2)編碼并且能夠表達得自CCL25或CCR9的免疫原肽的表達載體。得自CCL25或CCR9的免疫原肽可以以融合蛋白的形式以增強其免疫原性。CCL25免疫原肽的實例包括，但不限于，由選自LAYHYPIGWAVL(SEQ ID NO: 116)、KRHRKVCGNPKSREVQRAMKLLDARNKVFAKLHH(SEQ ID NO: 117), FEDCCLAYHYPIGffAVLRRA(SEQ IDNO: 118), IQEVSGSCNLPAAIFYLPKRHRKVCGN(SEQ ID NO: 119)、AMKLLDAR(SEQ ID NO: 120)、KVFAKLHHN(SEQ ID NO:121)、QAGPHAVKKL(SEQ ID NO: 122)、FYLPKRHRKVCGNP(SEQID NO:123)YLPKRHRKVCGNPK(SEQ ID NO:124)、LPKRHRKVCGNPKS(SEQ ID NO:125),PKRHRKVCGNPKSR(SEQ ID NO:126),CGNPKSREVQRAMK(SEQ ID NO:127),GNPKSREVQRAMKL(SEQID NO: 128), KFSNPISSSKRNVS(SEQ ID NO: 129)、PKSREV (SEQ ID NO: 130)、LHHNTQT (SEQID NO: 131)和SSSKRN(SEQ ID NO: 132)中的一種或多種序列組成的肽，或者含有選自 LAYHYPIGWAVL(SEQ ID NO: 116)、KRHRKVCGNPKSREVQRAMKLLDARNKVFAKLHH(SEQ IDNO: 117), FEDCCLAYHYPIGffAVLRRA(SEQ ID NO:118)、IQEVSGSCNLPAAIFYLPKRHRKVCGN(SEQID NO: 119)、AMKLLDAR(SEQ ID NO: 120)、KVFAKLHHN (SEQ ID NO: 121)、QAGPHAVKKL (SEQID NO: 122)、FYLPKRHRKVCGNP(SEQ ID NO:123)YLPKRHRKVCGNPK(SEQ ID NO:124),LPKRHRKVCGNPKS(SEQ ID NO:125)、PKRHRKVCGNPKSR(SEQ ID NO:126),CGNPKSREVQRAMK(SEQID NO: 127), GNPKSREVQRAMKL (SEQ ID NO: 128)、KFSNPISSSKRNVS (SEQ ID NO: 129),PKSREV(SEQ ID NO: 130)、LHHNTQT (SEQ ID NO: 131)和 SSSKRN(SEQ ID NO: 132)中的一種或多種序列的肽。CCR9免疫原肽的實例包括，但不限于，由選自QFASHFLPP(SEQ ID NO: 133)、MADQffKFQ(SE Q ID NO: 134)、TFMCKWNSM(SEQ ID NO: 135)、IAICTMVYPS(SEQ ID NO: 136)和VQTIDAYAMFISNCAVSTNIDICFQ(SEQ ID NO: 137)中的一種或多種序列組成的肽，或者含有選自 QFASHFLPP(SEQ ID NO: 133) ,MADQffKFQ(SEQ ID NO: 134)、TFMCKWNSM(SEQ ID NO: 135)、IAICTMVYPS(SEQ ID NO: 136)和 VQTIDAYAMFISNCAVSTNIDICFQ (SEQ ID NO: 137)中的一種或多種序列的肽。
[0069]本文所用術語“生物樣本”，是指生物來源的材料，其可以是體液或身體產物，例如，血液、血漿、尿液、唾液、脊髓液、糞便、汗液或呼吸物。生物樣本還包括組織樣本和細胞樣本。
[0070]本文中，范圍可被表示為從“大約”一個特定的值和/或到“大約”另一個特定的值。當表示這樣的范圍時，另一個實施方式包括從一個特定的值和/或到另一個特定的值。同樣地，當值通過使用先行詞“大約”表示為近似值時，將被理解的是，該特定的值形成另一個實施方式。其將進一步理解的是，范圍的各端點，無論是與另一端點有關，還是獨立于另一端點，都是顯著的。還應該理解，在本文中公開了一些值，而每個值在此又被公開為除該值自身之外的“大約”該特定值。例如，如果公開了“10”這個值，那么“大約10”也被公開了。還應該理解，當公開一個值“小于或等于”某值時，如本領域技術人員適當?shù)乩斫獾?，“大于或等于某值”以及在某些值之間的可能的范圍也被公開。例如，如果公開了“10”這個值，貝IJ “小于或等于10”，以及“大于或等于10”也被披露。
[0071]通過針對CCL25和/或CCR9進行免疫來治療或預防癌癥
[0072]CCL25是CCR9趨化因子受體的配體。趨化因子和受體出現(xiàn)在癌癥的轉移和侵襲的調控中發(fā)揮作用。與正常組織相比，CCL25和CCR9在多種癌組織類型中都局部上調，包括卵巢癌、肺癌、乳腺癌、前列腺癌、結腸癌、骨癌和胰腺癌。在患有這些癌癥的患者的血清中，CCL25的水平也被增加。此外，可溶性CCL25趨化因子在體內和體外都增強癌細胞的增殖和遷移。
[0073]CCR9是G蛋白偶聯(lián)受體(GPCRs)的趨化因子受體家族的成員，其會在癌細胞生存中具有不同的作用，假定使其免受化療藥物的作用。CCR9與CCL25的相互作用調芐基質金屬蛋白酶(MMP)的表達，并增強癌細胞的遷移和侵襲潛能。這表明CCR9-CCL25的相互作用有助于腫瘤細胞遷移和侵襲。因此，阻斷此軸線有可能抑制癌細胞轉移。
[0074]本申請的一個方面涉及一種通過針對CCL25和/或CCR9進行免疫來治療或預防癌癥的方法。所述方法包括用有效量的作為蛋白質、肽或編碼CCL25和/或CCR9的多核苷酸的CCL25和/或CCR9免疫原來誘導抑制CCL25和/或CCR9的生物活性的抗體以使受試者免疫的步驟，其中，所述癌癥是胚細胞瘤、癌、白血病、淋巴瘤、黑素瘤、骨髓瘤、或肉瘤。
[0075]在另一個實施方式中，所述方法包括用有效量的下列物質使受試者免疫的步驟:
(I)作為蛋白質、肽或編碼CCL25和CCR9的多核苷酸的一種或多種CCL25和CCR9免疫原，和(2)作為蛋白質、肽或編碼CXCL13和CXCR5的多核苷酸的一種或多種CXCL13和CXCR5免疫原，和/或作為蛋白質、肽或編碼CXCL16和CXCR6的多核苷酸的一種或多種CXCL16和CXCR6免疫原。
[0076]抗CCL25抗體和抗CCR9抗體用于治療或預防癌癥的應用
[0077]本申請的另一個方面涉及抗CCL25抗體和/或抗CCR9抗體用于治療或預防癌癥的用途。所述用途包括向需要這種治療的受試者施用治療有效量的抗CCL25抗體、抗CCR9抗體、或他們的組合，其中，所述癌癥是胚細胞瘤、癌、白血病、淋巴瘤、黑素瘤、骨髓瘤或肉瘤。
[0078]在另一個實施方式中，所述受試者被診斷患有導致癌細胞中的CCL25和/或CCR9表達升高的癌癥。這種癌癥的實例包括，但不限于，胚細胞瘤、癌、白血病、淋巴瘤、黑素瘤、骨髓瘤、肉瘤和生殖細胞腫瘤。在一個實施方式中，所述受試者被診斷患有腦癌。在另一個實施方式中，所述受試者被診斷患有骨癌。在另一個實施方式中，所述受試者被診斷患有垂體腫瘤。在又一個實施方式中，所述受試者被診斷患有卵巢癌。
[0079]在另一個實施方式中，所述方法進一步包括:確定來自受試者的組織中的CCL25和/或CCR9表達水平，以及如果檢測到CCL25和/或CCR9的水平提高，則向受試者施用治療有效量的抗CCL25抗體、抗CCR9抗體、或它們的組合。
[0080]在另一個實施方式中，所述方法進一步包括:確定來自受試者的組織中的CCL25和/或CCR9表達水平，以及 如果檢測到CCL25和/或CCR9的水平提高，則用有效量的作為蛋白質、肽或編碼基因的CCL25和/或CCR9免疫原來誘導抑制CCL25和/或CCR9的生物活性的抗體以使受試者免疫。
[0081]在另一個實施方式中，所述方法進一步包括:確定來自受試者的組織中的CCL25和/或CCR9表達水平，以及如果檢測到CCL25和/或CCR9的水平提高，則用有效量的下列物質使受試者免疫:(I)作為蛋白質、肽或編碼基因的一種或多種CCL25和CCR9免疫原，和
(2)作為蛋白質、肽或編碼基因的一種或多種CXCL13和CXCR5免疫原，和/或作為蛋白質、肽或編碼基因的一種或多種CXCL16和CXCR6免疫原。
[0082]本申請的一種優(yōu)選的抗體是與人CCL25結合并且優(yōu)選(部分或完全)阻斷CCL25與受體(包括，但并不限于，CCR9)結合的能力的抗體。本申請的另一種優(yōu)選的抗體是這樣一種抗體，其與人CCR9結合并且優(yōu)選(部分或完全)阻斷在其細胞表面表達CCR9的趨化因子受體的細胞(如腫瘤或癌細胞)與配體(包括，但不限于，CCL25)結合的能力。本申請的又一種優(yōu)選的抗體是這樣一種抗體，其與人CCR9結合并且優(yōu)選(部分或完全)阻斷可溶的CCR9的趨化因子受體與配體(包括，但不限于，CCL25)結合的能力。
[0083]在一個實施方式中，抗CCL25抗體和/或抗CCR9抗體是單克隆抗體。在另一個實施方式中，抗CCL25抗體和/或抗CCR9抗體是人化抗體。在另一個實施方式中，抗CCL25抗體和/或抗CCR9抗體是人化的抗體片段。
[0084]在本申請的特定的實施例中，在使用治療有效量的至少一種特異性針對另一種抗原的其他抗體對受試者進行治療之前、同時或者之后，聯(lián)合使用抗CCL25和/或抗CCR9抗體對受試者進行治療。在一個實施方式中，所述另一種抗原是另一種趨化因子或趨化因子受體，如 CXCL1、CXCL2、CXCL3、CXCL4、CXCL5、CXCL6、CXCL7、CXCL8、CXCL9、CXCLlO、CXCLl1、CXCLl2, CXCLl3, CXCL14、CXCLl5, CXCL16、CXCRl、CXCR2、CXCR3、CXCR4、CXCR5a、CXCR5b、CXCR6、CXCR7、CCL1、CCL2、CCL3、CCL4、CCL5、CCL6、CCL7、CCL8、CCL9、CCLIO、CCL11、CCL12、CCL13、CCL14、CCLl5, CCL16、CCL17、CCL18、CCL19、CCL20、CCL21、CCL22、CCL24、CCL27、CCL28、CCRl、CCR2、CCR3、CCR4、CCR5、CCR6、CCR7、CCR8、CCR10、CCRl1、XCLl、XCL2、XCRl、CX3CR1 或 CX3CL1。
[0085]在另一個實施方式中，所述另一種抗原是與癌相關的趨化因子或趨化因子受體，并且選自 CCLl、CCL2、CCL4、CCL17、CCL19、CCL21、CCL22、CXCLl2, CXCLl3, CXCL16、CCR2、CCR7、CCR8、CXCR4、CXCR5、CXCR6、CXCR7 和 CX3CR1。
[0086]在另一個實施方式中，所述另一種抗原是與黑素瘤相關的趨化因子或趨化因子受體，并且選自 CCL27、CXCLU CXCL2、CXCL3、CXCL5、CXCL6、CXCL7、CXCL8、CXCLl2, CXCLl3,CXCL16、CX3CL1、CCR10、CXCR1、CXCR2、CXCR4、CXCR5、CXCR6、CXCR7、CX3CL1 和 CX3CR1。
[0087]在另一個實施方式中，所述另一種抗原是與白血病相關的趨化因子或趨化因子受體，并且選自 CCL1、CCL4、CCL17、CCL19、CCL21、CCL2 2、CXCL12、CCR7、CCR8、CXCR4、CXCR7 和CX3CR1。
[0088]其他的示例性抗原包括:分子，如腎素；生長激素，包括人生長激素和牛生長激素；生長激素釋放因子；甲狀旁腺激素；促甲狀腺激素；脂蛋白；α -1-抗胰蛋白酶；胰島素A鏈；胰島素B鏈；胰島素原；促卵泡激素；降鈣素；促黃體生成激素；胰高血糖素；凝血因子，如VIII因子，IX因子，組織因子和血管假性血友病因子；抗凝血因子，如蛋白C ;心房鈉尿因子；肺表面活性劑；纖溶酶原激活劑，如尿激酶或人體尿液或組織型纖溶酶原激活劑(t-PA);鈴蟾肽；凝血酶；造血生長因子；腫瘤壞死因子-α和腫瘤壞死因子；腦啡肽酶；血清白蛋白，如人血清白蛋白；抑制繆勒管物質(Muellerian-1nhibitingsubstance);松弛素A鏈；松弛素B鏈；松弛素原(prorelaxin);小鼠促性腺素相關肽；微生物蛋白，如β -內酰胺酶；DNA酶；IgE ;細胞毒性T淋巴細胞相關抗原(CTLA)，如CTLA-4 ；抑制素；活化素；血管內皮生長因子(VEGF);激素或生長因子的受體；蛋白質A或D ;類風濕因子；神經營養(yǎng)因子，如骨源性神經營養(yǎng)因子(BDNF)，神經營養(yǎng)因子-3，神經營養(yǎng)因子-4，神經營養(yǎng)因子_5或神經營養(yǎng)因子_6 (NT-3，NT4，NT-5，或NT-6)，或神經生長因子，如神經生長因子-β ;血小板衍生生長因子(I3DGF);成纖維細胞生長因子，如FGF和bFGF ;表皮生長因子(EGF) ；ErbB受體家族的成員，如EGF受體；轉化生長因子(TGF)，如TGF- α和TGF- β，包括TGF-β 1、TGF-β 2、TGF-β 3、TGF-β 4或TGF-β 5 ;胰島素樣生長因子-1和胰島素樣生長因子-1I (IGF-1和IGF-1I) ；des (1-3)-1GF-1 (腦IGF-1)，胰島素樣生長因子結合蛋白；CD蛋白，如CD3, CD4, CD8,⑶19，CD20和CD34 ;促紅細胞生成素；骨誘導因子；免疫毒素；骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP);干擾素，如干擾素-α，干擾素-β和干擾素-Y ;集落刺激因子(CSFs)，例如，M-CSF, GM-CSF 和 G-CSF ;白介素(ILs)，例如，IL-U IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9和/或IL-1O ;超氧化物歧化酶；Τ細胞受體；表面膜蛋白；衰變加速因子；病毒抗原，如，例如，AIDS包封的部分；運輸?shù)鞍踪|；歸巢受體；地址素；調節(jié)蛋白；α V/ β 3 整聯(lián)蛋白，包括其 a 或b 亞單位，如 CDlla、CDllb、CDllc、CD18、ICAM、VLA_4 和 VCAM ；前列腺特異性抗原(PSA);腫瘤相關抗原，如癌胚抗原(CEA)、CK2、CA125、TA90、HER2、HER3或HER4受體；血型抗原；flk2/flt3受體；肥胖(OB)受體；mpl受體;CTLA_4 ;蛋白C ;從典型凝集素或替代補體途徑 中的任一種蛋白質；和以上列出的任何多肽的片段。
[0089]可以使用公知的方法，例如，以推注或通過在一段時間內連續(xù)輸注的靜脈內施用，通過肌內、腹膜內、腦脊髓內、皮下、關節(jié)內、滑膜內、鞘內、口服、外用或吸入途徑，將抗體施用到受試者。在某些實施例中，所述抗體被直接施用到腫瘤或癌癥組織，包括在侵入操作過程中直接施用到瘤床。還可以將所述抗體放在針對受影響的組織的目標趨化因子施用的固體載體(如海綿或紗布)上。
[0090]本發(fā)明的抗體可以在通常接受的藥學上可接受的載體中被施用?？山邮艿妮d體包括，但不限于，鹽水，緩沖鹽水，在鹽水中的葡萄糖。固相載體、脂質體、納米粒子、微粒、納米微球或微球體，也可被用作用于施用抗體的載體。
[0091]抗體的適當劑量(“治療有效量”)將取決于，例如，將要治療的病，病的嚴重程度和病程，是否出于預防或治療的目的施用抗體，以前的治療，患者的臨床病史及對抗體的反應，所用抗體的類型，以及主治醫(yī)師的決定。所述抗體適于向患者一次或在一系列治療下使用，并且可以在從診斷開始的任何時間向患者施用。所述抗體可以以單獨治療或者聯(lián)合在治療正被討論的病中有用的其他藥物或療法進行施用。
[0092]作為一般的建議，無論通過一次或多次施用，所施用的抗體的治療有效量將在約lng/kg體重/天至約100mg/kg體重/天的范圍內。在一個特定的實施方式中，所施用的抗體的范圍是從約lng/kg體重/天至約I μ g/kg體重/天，lng/kg體重/天至約IOOng/kg體重/天，lng/kg體重/天至約10ng/kg體重/天，10ng/kg體重/天至約I μ g/kg體重/天，10ng/kg體重/天至約100ng/kg體重/天，100ng/kg體重/天至約I μ g/kg體重/天，100ng/kg體重/天至約10 μ g/kg體重/天，I μ g/kg體重/天至約10 μ g/kg體重/天，I μ g/kg體重/天至約100 μ g/kg體重/天，10 μ g/kg體重/天至約100 μ g/kg體重/天，10 μ g/kg體重/天至約lmg/kg體重/天，100 μ g/kg體重/天至約10mg/kg體重/天，lmg/kg體重/天至約100mg/kg體重/天，以及10mg/kg體重/天至約100mg/kg體重/天。[0093]在另一個實施方式中，施用抗體的劑量范圍為每次注射Ing-lOng，每次注射IOng至IOOng,每次注射IOOng至I μ g,每次注射I μ g至10 μ g,每次注射10 μ g至100 μ g,每次注射100 μ g至Img,每次注射Img至IOmg,每次注射IOmg至IOOmg,以及每次注射IOOmg至lOOOmg?？梢悦刻?每2天，每3天，每4天，每5天，每6天和每7天，或者每I周，每2周，每3周或每4周，注射抗體。
[0094]在另一個特定的實施方式中，所施用的抗體的劑量范圍為從約lng/kg至約lOOmg/kgo在又一個特定的實施方式中，所施用的抗體的范圍為從約lng/kg至約10ng/kg,約 10ng/kg 至約 100ng/kg,約 100ng/kg 至約 I μ g/kg,約 I μ g/kg 至約 10 μ g/kg,約 10 μ g/kg 至約 100 μ g/kg,約 100 μ g/kg 至約 lmg/kg,約 lmg/kg 至約 10mg/kg,約 10mg/kg 至約100mg/kg,約 0.5mg/kg 至約 30mg/kg,以及約 lmg/kg 至約 15mg/kg。
[0095]在其他的特定的實施方式中，所施用的抗體的量為或者約為0.0006、0.001、0.003,0.006,0.01,0.03,0.06,0.1,0.3,0.6、1、3、6、10、30、60、100、300、600 和 1000mg/天。如預期的，所述劑量將取決于病、患者的大小、年齡和癥狀。
[0096]可以按照適當?shù)幕蛑甘镜耐谱⒒蛲ㄟ^連續(xù)輸注的單次劑量或者通過推注或通過連續(xù)輸注的多倍劑量施用抗體。多倍劑量可被施用，例如，每天多次，每天一次，每2、3、4、5、6或7天，每周，每2，3，4，5或6周或每月。然而，其他的劑量方案可以是有用的。此療法的進展是很容易用常規(guī)技術監(jiān)測的。
[0097]在本申請的特定的實施方式中，可以向需要其作為唯一的治療劑的受試者施用治療有效量的抗CCL25和/或抗CCR9抗體。在特定的實施方式中，治療有效量的抗CCL25和/或抗CCR9抗體殺死腫瘤或 癌細胞或者促進腫瘤或癌細胞的凋亡。在另一特定的實施方式中，治療有效量的抗CCL25和/或抗CCR9抗體抑制或防止腫瘤或癌的建立。在又一特定的實施方式中，治療有效量的抗CCL25和/或抗CCR9抗體抑制或防止來自現(xiàn)存腫瘤或癌的腫瘤或癌細胞的遷移或轉移。在再一特定的實施方式中，治療有效量的抗CCL25和/或抗CCR9抗體抑制或防止腫瘤或癌細胞侵入到非癌組織中。
[0098]在本申請的特定的實施方式中，可以向需要其的患者施用治療有效量的抗CCL25和/或抗CCR9抗體和一種或多種另外的治療有效抗體，。所述一種或多種另外的治療有效抗體可以針對CCL25和/或CCR9的另外的決定子、其他趨化因子、其他趨化因子受體、其他可溶性或細胞表面配體或受體，包括，但不限于，腫瘤或癌特異性抗原，病毒，細菌或寄生蟲抗原，癌細胞的產物或凋亡殘余物。可以在使用一種或多種另外的治療有效抗體之前、同時和/或之后，施用抗CCL25和/或抗CCR9抗體。
[0099]在一個特定的實施方式中，就殺死腫瘤或癌而言，治療有效量的抗CCL25和/或抗CCR9抗體增強了所述一種或多種另外的治療有效抗體的有效性。在又一個特定的實施方式中，治療有效量的抗CCL25和/或抗CCR9抗體減少了用于殺死腫瘤或癌細胞所需的所述一種或多種另外的治療有效抗體的量。
[0100]在再一個特定的實施方式中，治療有效量的抗-CCL25和/或抗CCR9抗體抑制或防止來自建立的腫瘤或癌的腫瘤或癌細胞的遷移或轉移，提高所述一種或多種另外的治療有效抗體在殺死腫瘤或癌細胞方面的局部有效性。在又一個特定的實施方式中，治療有效量的抗CCL25和/或抗CCR9抗體抑制或防止腫瘤或癌細胞侵入到非癌組織中，提高所述一種或多種另外的治療有效抗體在殺死腫瘤或癌細胞方面的局部有效性。[0101]在另一個實施方式中，抗CCL25抗體和/或抗CCR9抗體是與細胞毒性劑結合的抗體。在另一個實施方式中，抗CCL25抗體和/或抗CCR9抗體與另一種抗癌劑(如化療藥物)一起施用。
[0102]本申請的另一個方面涉及一種抑制趨化因子CCL25與含有其受體的細胞的相互作用的方法。在一個實施方式中，所述方法包括使細胞接觸有效量的抗體或其功能片段，該抗體或其功能片段與哺乳動物CCL25或CCL25的一部分結合。在另一個實施方式中，所述方法包括用有效量的作為蛋白質、肽或編碼基因的CCL25免疫原來誘導抑制CCL25的生物活性的抗體以使受試者免疫的步驟。
[0103]本申請的另一個方面涉及一種抑制含有CCR9的細胞與其配體的相互作用的方法，所述方法包括使細胞接觸有效量的抗體或其功能片段，該抗體或其功能片段與哺乳動物CCR9或CCR9的一部分結合。
[0104]在另一個實施方式中，所述治療癌癥的方法包括向需要這種治療的受試者施用有效量的在癌或惡性細胞中表達抗CCL25抗體、抗CCR9抗體、或它們的組合的表達載體。在另一個實施方式中，所述治療癌癥的方法包括用有效量的CCL25和/或CCR9免疫原來誘導宿主產生抑制CCL25和/或CCR9的生物活性的抗體以使受試者免疫的步驟。
[0105]所述表達載體可以是能夠將編碼抗CCL25抗體和/或抗CCR9抗體的核苷酸遞送到靶細胞中并且在靶細胞中表達抗CCL25抗體和/或抗CCR9抗體的任何載體。在另一個實施方式中，所述表達載體能夠將編碼抗CCL25抗體和/或抗CCR9抗體的核苷酸遞送到靶細胞中以誘導宿主產生抗CXCL13和/或CXCR5抗體。表達載體的實例包括病毒載體和非病毒載體。表達載體的實例包括病毒載體和非病毒載體。
[0106]病毒載體包括，但不限于，逆轉錄病毒載體，腺病毒載體，腺伴隨病毒載體，以及其他大容量的病毒載體，如皰疫病毒和牛痘病毒。還包括具有這些病毒的使其適合于用作表達載體的性質的任何病毒家族。
[0107]逆轉錄病毒載體
[0108]逆轉錄病毒是一種動物病毒，屬于逆轉錄病毒科的病毒家族，包括任何類型、亞科、屬或嗜親性。在美國專利第4，868，116號和第4，980，286號；PCT申請W090/02806和W089/07136 ;以及 Mulligan (Science260:926-932 (1993))中描述了使用逆轉錄病毒載體用于基因治療的方法的實例，在此將上述文獻教導的內容通過引用的方式并入本文。
[0109]腺病毒載體
[0110]重組腺病毒已被證明在直接在體內遞送到氣道上皮細胞、肝細胞、血管內皮、CNS薄壁組織和許多其他組織部位之后實現(xiàn)高效率的基因轉移。重組腺病毒通過結合到特異細胞表面受體而實現(xiàn)基因轉導，在此之后，病毒通過受體介導的內吞作用以與野生型或復制缺陷型腺病毒相同的方式被納入。
[0111]病毒載體可為基于其中一種或多種病毒基因已被移除了的腺病毒的病毒載體，并且這些病毒體在補體細胞系(如人293細胞系)中被產生。在一個實施方式中，從腺病毒載體中移除El基因。在另一個實施方式中，從腺病毒載體中移除El和E3基因。在另一個實施方式中，從腺病毒載體中移除El和E4基因。在另一個實施方式中,所述腺病毒載體是無腸腺病毒載體。
[0112]腺相關病毒載體[0113]另一種類型的病毒載體基于腺相關病毒(AAV)。這種缺陷型細小病毒是一種優(yōu)選的載體，這是因為它可以感染許多細胞類型并且對人類是不致病的。AAV類型載體能夠運送約4-5kb，并且已知野生型AAV穩(wěn)定地插入到第19號染色體。包含這種位點特異性整合性質的載體是優(yōu)選的。這種類型的載體的特別優(yōu)選的實施方式是由Avigen, San Francisco, CA制造的P4.1C載體，其可包含單純皰疹病毒胸苷激酶基因(HSV-tk)和/或標記基因(如編碼綠色熒光蛋白(GFP)的基因)。
[0114]在另一種類型的AAV病毒中,AAV包含一對反向末端重復(ITRs),其攻擊含有與異源基因可操作地連接的指導細胞特異性表達的啟動子的至少一個盒的側翼。上下文中的異源是指不是AAV或B19細小病毒與生俱來的任何核苷酸序列或基因。
[0115]典型的AAV和B19編碼區(qū)已被刪除了，從而得到安全、無細胞毒性的載體。AAVITRs或其修飾物賦予感染性和位點特異性整合，但沒有細胞毒性，而啟動子指導細胞特異性表達。
[0116]大型有效負載病毒載體
[0117]大型人類皰疹病毒的分子遺傳實驗提供了一種方法，由此大型的異源DNA片段可以在允許使用皰疹病毒感染的細胞中被克隆、傳播和建立(Sun et al., Naturegenetics8:33-41, 1994;Cotter and Robertson, Curr Opin Mol Ther5:633-644，1999)。這些大型DNA病毒(單純皰疹病毒(HSV)和EB病毒(EBV)，具有將>150kb的人類異源DNA片段遞送到特定細胞的潛力。EBV重組體能夠在受感染的B細胞中保持大量的DNA片段作為游離基因DNA。單個克隆攜帶的高達330kb的人基因組插入物表現(xiàn)出遺傳穩(wěn)定。這些游離基因的維持需要特定的EBV核內蛋白、EBNAl、其在使用EBV感染過程中以組成型表達。此外，這些載體可用于轉染，其中，在體外可以瞬時產生大量的蛋白質。還可以使用皰疹病毒擴增子系統(tǒng)包裝>220kb的DNA片 段以及感染能夠穩(wěn)定地保持DNA作為游離基因的細胞。其它有用的系統(tǒng)包括，例如，復制和宿主限制的非復制痘苗病毒載體。
[0118]非病毒載體包括質粒表達載體。質粒載體通常包括可以向其中插入另外的DNA片段的環(huán)狀雙鏈DNA環(huán)。
[0119]在病毒和非病毒表達載體中，編碼一個抗體或多個抗體的多核苷酸通常被設置在接近并朝向適當?shù)霓D錄控制序列(啟動子，以及任選地，一種或多種增強子)以指導mRNA合成。也就是說，目的多核苷酸序列可操作地連接到適當?shù)霓D錄控制序列。這種啟動子的實例包括:病毒啟動子，如CMV、LTR或SV40啟動子的立即早期啟動子，桿狀病毒的多角體啟動子(polyhedron promoter),大腸桿菌Iac或trp啟動子,T7卩遼菌體和λ PL啟動子，以及已知在真核細胞或它們的病毒中控制基因的表達的其他啟動子。啟動子可以是組織特異性啟動子。
[0120]表達載體通常也包含用于翻譯起始的核糖體結合位點，和轉錄終止子。載體任選包括用于擴大表達的適當序列。此外，表達載體任選地包含一種或多種可選擇標記基因，以提供用于選擇轉化的宿主細胞的表型性狀，如用于真核細胞培養(yǎng)的二氫葉酸還原酶或新霉素抗性，或如在大腸桿菌中的四環(huán)素或氨芐青霉素抗性。
[0121]表達載體還可包括另外的表達元件，例如，用于提高翻譯效率。這些信號可以包括，例如，ATG起始密碼子和相鄰的序列。在某些情況下，例如，將翻譯起始密碼子和相關的序列元件與目的多核苷酸序列(例如，天然的起始密碼子)一同插入到適當?shù)谋磉_載體中。在這種情況下，另外的翻譯控制信號是不需要的。然而，在只插入多肽編碼序列或其部分的情況下，外源翻譯控制信號，包括ATG起始密碼子，要被提供。將起始密碼子放在正確的讀框中以確保目的多核苷酸序列的翻譯。外源轉錄元件和起始密碼子可以是不同來源的，包括天然和合成的。如需要，可以通過包含適于所用的細胞系統(tǒng)的增強子來進一步提高表達效率。
[0122]在一個實施方式中，所述表達載體包含誘導型或可調節(jié)的表達系統(tǒng)?？烧{節(jié)的表達系統(tǒng)的實例的簡要說明如下:
[0123]蛻皮激素系統(tǒng)。蛻皮激素系統(tǒng)是基于在果蠅(Drosophila)中發(fā)現(xiàn)的蛻皮誘導系統(tǒng)，但是為了在哺乳動物細胞中可誘導地表達而進行了改造。該系統(tǒng)使用果蠅留類激素蛻皮激素的類似物(muristerone A)通過異二聚核受體激活目的基因的表達。已報道表達水平超過基礎水平200倍，同時對哺乳動物細胞生理機能沒有影響。
[0124]孕酮系統(tǒng)。通常孕酮受體被刺激與特異性DNA序列結合并且通過與其激素配體相互作用而激活轉錄。相反，孕酮拮抗劑米非司酮(RU486)能夠阻斷激素誘導的核轉運和隨后的DNA結合。已經產生了能夠被刺激經由與RU486的相互作用而結合的孕酮受體的突變體形式。為了產生特定的、可調節(jié)的轉錄因子，已將孕酮受體的RU486結合域融合到酵母轉錄因子GAL4的DNA結合域和HSV蛋白VP16的激活域。在沒有RU486的情況下，嵌合因子無活性。然而，加入激素，誘導嵌合蛋白的構象變化，而這種變化允許結合到GAL4結合位點以及由含有GAL4結合位點的啟動子的轉錄激活。
[0125]雷帕霉素系統(tǒng)。免疫抑制劑(如FK506和雷帕霉素)通過與特異的細胞蛋白質結合并促進它們的二聚而起作用。例如，雷帕霉素與FK506結合蛋白(FKBP)的結合導致其與另一種雷帕霉素結合蛋白FRAP的異二聚化，其可通過藥物的移除而逆轉。通過加入藥物使兩種蛋白質集合在一起的能力使許多生物過程(包括轉錄)的調節(jié)成為可能。嵌合的DNA結合域已被融合到FKBP，F(xiàn)KBP能夠使融合蛋白結合到特異性DNA結合序列。轉錄激活域也已被融合到FRAP。當這兩種融合蛋白在相同細胞中共表達時，可以通過由加入雷帕霉素介導的異二聚化來形成全功能的轉錄因子。然后二聚嵌合轉錄因子可以結合至包含合成DNA結合序列的拷貝的合成啟動子序列。該系統(tǒng)已被成功地整合到腺病毒和AAV載體中。
[0126]抑制CCL25或CCR9的表達或活性的試劑用于治療或預防癌癥的用途
[0127]本申請的另一個方面涉及抑制CCL25或CCR9的表達或活性的試劑用于治療或預防癌癥的用途。在另一個實施方式中，所述用途包括向需要這種治療的受試者施用有效量的表達下列試劑的表達載體:(I)抑制CCL25和/或CCR9的表達的試劑、或(2)抑制CCL25和CCR9間的相互作用的試劑、或(3)抑制CCL25和/或CCR9的生物活性的試劑。在一個實施方式中，CCL25和CCR9的生物活性包括CCL25和CCR9間的相互作用。
[0128]在另一個實施方式中，所述受試者被診斷患有導致癌細胞中的CCL25和/或CCR9表達升高的癌癥。這種癌癥的實例包括，但不限于，胚細胞瘤，白血病，淋巴瘤，黑素瘤，骨髓瘤，肉瘤，生殖細胞瘤，以及癌，例如，卵巢癌，陰道癌，子宮頸癌，子宮癌，前列腺癌，肛門癌，直腸癌，結腸癌，胃癌，胰腺癌，胰島細胞瘤，腺癌，腺鱗癌，神經內分泌腫瘤，乳腺癌，肺癌，食道癌，口腔癌，腦癌，髓母細胞瘤，神經外胚層瘤，神經膠質瘤，垂體癌和骨癌。
[0129]在另一個實施方式中，所述方法進一步包括確定來自受試者的組織中的CCL25和/或CCR9表達的水平，以及只要檢測到組織中CCL25和/或CCR9的水平提高，則向受試者施用所述試劑。
[0130]在一個實施方式中,所述表達載體是病毒載體。在另一個實施方式中，所述表達載體是非病毒載體。在另一個實施方式中，所述表達載體能夠將編碼CCL25和/或CCR9的核苷酸遞送到靶細胞中以誘導宿主產生抗CCL25和/或CCR9抗體。
[0131]在另一個實施方式中，所述試劑是抗CCL25抗體、抗CCR9抗體、或它們的組合。
[0132]在又一個實施方式中，所述試劑是功能性核酸。功能性核酸是具有特定功能(如結合靶分子或催化特定反應)的核酸分子。該功能性核酸分子可以擔當靶分子具有的特定活性的抑制劑。功能性核酸分子可以與任何大分子(如DNA、RNA和多肽)發(fā)生相互作用。因此，功能性核酸能夠與CCL25或CCR9的mRNA或基因組DNA發(fā)生相互作用以抑制CCL25或CCR9蛋白的表達或相互作用從而抑制活性。通常，基于靶分子與功能性核酸分子之間的序列同源性，將功能性核酸設計成與其他核酸發(fā)生相互作用。在其他情況下，功能性核酸分子與靶分子之間的特異性識別不是基于功能性核酸分子與靶分子之間的序列同源性，而是基于允許發(fā)生特異性識別的三級結構的形成。功能性核酸分子的實例包括siRNA，反義分子，適體，核酶，形成三聯(lián)體的分子，和外在引導序列。
[0133]siRNA涉及RNA干擾(RNAi)，其包括兩步機制:起始步驟和效應物步驟。在第一步驟中，所加入的雙鏈(ds)RNA(siRNA)被加工成小片段，如21-23-核苷酸的‘指導序列’。RNA擴增發(fā)生在整個動物中。然后通常情況下，指導RNA可被納入形成蛋白質RNA復合物，其能夠降解RNA、核酸酶復合物，其已被稱為RNA誘導的敲減復合物(RISC)。該RISC復合物在第二效應物步驟中起作用以破壞經由堿基配對相互作用由指導RNA識別的mRNA。RNAi涉及通過將雙鏈RNA引入到細胞中，其觸發(fā)引起靶RNA降解的事件。RNAi是轉錄后基因敲減的一種形式。除本文所披露的siRNA之外，還披露了能夠在RNAi中起作用的RNA發(fā)夾。對于制造和使用RNAi分子的說明，參見,例如，Hammond et al., NatureRev Gen2:110-119(2001) ;Sharp, Genes Devl5:485-490(2001), Waterhouse et al., Proc.Natl.Acad.Sc1.USA95 (23): 13959-13964 (1998)，其公開的全部內容在此通過引用的方式并入本文并且至少構成與遞送和制造RNAi分子相關的材料。
[0134]RNAi已被證明在許多類型的細胞(包括哺乳動物細胞)中發(fā)揮作用。對于在哺乳動物細胞中的工作，優(yōu)選的是，將在RISC復合物中被用作靶向序列的RNA分子較短。例如，長度小于或等于 50 或 40 或 30 或 29、28、27、26、25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、
13、12、11或10個核苷酸。相對于將要被裂解的靶RNA，這些RNA分子也可以在3’或5’端上具有懸突。這些懸突的長度可為至少或小于或等于1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15或20個核苷酸。
[0135]反義分子被設計成通過規(guī)范或非規(guī)范的堿基配對而與靶核酸分子發(fā)生相互作用。反義分子與靶分子之間的相互作用被設計成通過例如RNA酶H介導的RNA-DNA雜合體降解來促進靶分子的破壞?；蛘?，反義分子被設計成中斷正常情況下會在靶分子上發(fā)生的加工功能，如轉錄或復制。反義分子可以基于靶分子的序列來設計。存在許多通過發(fā)現(xiàn)靶分子的最易接近區(qū)來優(yōu)化反義效率的方法。示例性的方法是使用DMS和DEPC的體外篩選實驗和DNA修飾研究。優(yōu)選的是，反義分子結合靶分子的解離常數(shù)(kd)小于或等于ΙΟ'ΙΟ'ΙΟ,或10_12。可以在下面的美國專利的非限定性列表中找到有助于反義分子的設計和使用的方法和技術的具有代表性的樣本:5, 135，917，5，994，320，6，046，319，和6，057，437，其公開的全部內容在此通過引用的方式并入本文。
[0136]適體是(優(yōu)選以特定的方式)與靶分子相互作用的分子。典型地，適體是長度范圍在15-50個堿基的小核酸，其折疊成定義的二級和三級結構，如莖環(huán)或G-四聯(lián)體。適體能夠結合趨化因子并阻斷它的功能(參見，例如，Marro et al., Biochem Biophys ResCommun.20060ctl3; 349:270-6)。在與靶分子的kd小于KT12M的情況下，適體可以非常緊密地結合。優(yōu)選的是，適體結合靶分子的kd小于10_6、10_8、10_1(1或10_12。適體可以以非常高度的特異性結合靶分子。例如，適體已被分離，在靶分子與在分子上只有單一位置處不同的另一分子之間的親合力具有大于10000倍的差異(美國專利5，543，293)。優(yōu)選的是，適體與靶分子的kd比與背景結合分子的kd低至少10、100、1000、10，000或100，000倍?？梢栽谙旅娴拿绹鴮＠姆窍薅ㄐ粤斜碇姓业饺绾沃圃旌褪褂眠m體結合多種不同的靶分子的代表性實例:5，476，766,5, 861，254,6, 030，776和6，051，698，其公開的全部內容在此通過引用的方式并入本文。
[0137]核酶是能夠催化(分子內或分子間)化學反應的核酸分子。因此核酶是催化的核酸。優(yōu)選的是，核酶催化分子間反應。有很多不同類型的核酶，其基于在自然系統(tǒng)中發(fā)現(xiàn)的核酶，例如，如錘頭核酶(參見，例如，美國專利:5, 334，711和5，861，288，W09858058和TO9718312)、發(fā)夾結構核酶(參見，例如，美國專利:5，631，115和6，022，962)以及四膜蟲屬核酶(參見，例如，美國專利:5，595，873和5，652，107)，催化核酸酶或核酸聚合酶型反應。也有一些在自然系統(tǒng)中沒有被發(fā)現(xiàn)的核酶，但是其已被重新設計成催化特定反應的(參見，例如，美國專利:5，580，967和5，910，408)。優(yōu)選的核酶切割RNA或DNA底物，且更優(yōu)選地切割RNA底物。核酶通常通過對靶底物的識別和結合及隨后切割而切割核酸底物。該識別往往是主要基于規(guī)范或不規(guī)范的堿基對相互作用。這種性質是核酶成為靶向特異性切割核酸的極好的候選者，因為靶底物的識別是基于靶底物序列?？梢栽诿绹鴮＠?5，646，042,5, 869，2 53,5, 989，906和6，017，756中找到如何制造和使用核酶催化各種不同的反應的代表性實例，其公開的全部內容在此通過引用的方式并入本文。
[0138]形成三聯(lián)體的功能性核酸分子是能夠與雙鏈或單鏈核酸相互作用的分子。當三聯(lián)體分子與靶區(qū)域發(fā)生相互作用時，形成稱為三聯(lián)體的結構，其中，根據(jù)Watson-Crick和Hoogsteen堿基配對，三鏈DNA形成復合物。三聯(lián)體分子是優(yōu)選的，這是因為它們能夠以高親和性和特異性結合靶區(qū)域。優(yōu)選的是，形成三聯(lián)體的分子結合靶分子的kd小于10_6、10_8、10-10 或 10-12?？梢栽诿绹鴮＠?5，176，996,5, 683，874,5, 874，566 和 5，962，426 中找到如何制造和使用形成三聯(lián)體的分子以結合各種不同的靶分子，其公開的全部內容在此通過引用的方式并入本文。
[0139]外在引導序列(EGS)是結合形成復合物的靶核酸分子的分子，并且該復合物被RNA酶P識別，RNA酶P切割靶分子。EGS可被設計成特異性靶向所選的RNA分子。RNA酶P有助于在細胞內加工轉移RNA (tRNA)。通過使用引起靶RNA:EGS復合物模擬天然tRNA底物的EGS，細菌RNA酶P可被募集來切割實際上任何RNA序列(參見，例如，Yale的W092/03566，和 Forster and Altman, Science238:407-409 (1990))。
[0140]同樣地，可以利用真核EGS/RNA酶P定向切割RNA來在真核細胞中切割所需的目標(Yuan et al., Proc.Natl.Acad.Sc1.USA89:8006-8010 (1992) ; Yale 的W093/22434by;Yale 的 W095/24489by;Yuan and Altman, EMBO J14:159-168(1995),和Carrara et al., Proc.Natl.Acad.Sc1.USA92:2627-2631 (1995)) ? 可以在下面的美國專利的非限定性列表中找到如何制造和使用EGS分子來促進各種不同的靶分子的切割:5，168，053,5, 624，824,5, 683，873,5, 728，521,5, 869，248 和 5，877，162，其公開的全部內容在此通過引用的方式并入本文。
[0141]預防或抑制具有CCL25和/或CCR9表達升高的癌細胞的遷移或轉移的方法
[0142]本申請的另一個方面涉及一種在受試者中預防或抑制具有CCL25和/或CCR9表達升高的癌細胞的遷移或轉移的方法。
[0143]在一個實施方式中，所述方法包括向受試者施用治療有效量的抗CCL25抗體、或抗CCR9抗體、或它們的組合的步驟。
[0144]在另一個實施方式中，所述方法包括向受試者施用在所述受試者中表達抗CCL25抗體、或抗CCR9抗體、或它們的組合的表達載體的步驟。
[0145]在另一個實施方式中，所述方法包括向受試者施用表達能夠抑制CCL25或CCR9的表達、或抑制CCL25或CCR9的生物活性、或抑制CCL25和CCR9間的相互作用的試劑的表達載體。在另一個實施方式中，所述表達載體能夠將編碼CCL25和/或CCR9的核苷酸遞送到靶細胞中以誘導宿主產生抗CCL25和/或CCR9抗體。
[0146]可以使用本領域中眾所周知的方法(例如，免疫染色或定量PCR)確定在癌細胞中的CCL25和/或CCR9的表達。已知過表達CCL25和/或CCR9的癌細胞包括，但不限于，黑素瘤細胞和上皮瘤細胞。癌的實例包括，但不限于，卵巢癌，陰道癌，子宮頸癌，子宮癌，前列腺癌，肛門癌，直腸癌，結腸癌，胃癌，胰腺癌，胰島細胞瘤，腺癌，腺鱗癌，神經內分泌腫瘤，乳腺癌，肺癌，食道癌，口腔癌，腦癌，髓母細胞瘤，神經外胚層瘤，神經膠質瘤，垂體癌，和骨癌。
[0147]在一個實施方式中，所述癌細胞是腦癌細胞。在另一個實施方式中，所述癌細胞是骨癌細胞。在另一個實施方式中，`所述癌細胞是垂體癌細胞。在又一個實施方式中，所述癌細胞是卵巢癌細胞。
[0148]提高化療效果的方法
[0149]本申請的另一個方面涉及一種提高化療效果的方法。在一個實施方式中，所述方法包括向正在進行化療以治療癌癥的受試者施用有效量的抗CCL25抗體、或抗CCR9抗體、或它們的組合。
[0150]在另一個實施方式中，所述方法包括向癥在進行化療以治療癌癥的受試者施用有效量的表達抗CCL25抗體、或抗CCR9抗體、或它們的組合的表達載體。
[0151]在另一個實施方式中，所述方法包括向正在進行化療以治療癌癥的受試者施用表達能夠抑制CCL25或CCR9的表達、或抑制CCL25或CCR9的生物活性、或抑制CCL25和CCR9間的相互作用的試劑的表達載體。在另一個實施方式中，所述表達載體能夠將編碼CCL25和/或CCR9的核苷酸遞送到靶細胞中以誘導宿主產生抗CCL25和/或CCR9抗體。
[0152]在一個實施方式中，所述受試者正在進行化療以治療胚細胞瘤、癌、白血病、淋巴瘤、黑素瘤、骨髓瘤、肉瘤或生殖細胞腫瘤。在另一個實施方式中，所述受試者正在進行化療以治療腦癌。在另一個實施方式中，所述受試者正在進行化療以治療骨癌。在另一個實施方式中，所述受試者正在進行化療以治療垂體癌。在還一個實施方式中，所述受試者正在進行化療以治療卵巢癌。[0153]治療或預防癌癥的組合物和試劑盒
[0154]本申請的另一個方面涉及用于治療或預防癌癥的組合物和試劑盒。在一個實施方式中，所述組合物包括:(I)抗CCL25抗體、抗CCR9抗體、或它們的組合，和(2)藥學上可接受的載體。在另一個實施方式中，所述組合物包括:(I)表達載體，其攜帶用于抗CCL25抗體、抗CCR9抗體、或它們的組合的編碼序列，和(2)藥學上可接受的載體。在另一個實施方式中，所述組合物包括:(I)表達載體，其攜帶用于抑制CCL25或CCR9的表達、抑制CCL25或CCR9的生物活性或抑制CCL25和CCR9間的相互作用的試劑的編碼序列，和(2)藥學上可接受的載體。
[0155]在一個實施方式中，所述組合物和試劑盒用于治療或預防母細胞瘤，癌，白血病，淋巴瘤，黑素瘤，骨髓瘤，肉瘤或生殖細胞瘤。在具體的實施方式中，所述癌選自卵巢癌、陰道癌、子宮頸癌、子宮癌、前列腺癌、肛門癌、直腸癌、結腸癌、胃癌，胰腺癌、胰島細胞瘤、腺癌、腺鱗癌、神經內分泌腫瘤、乳腺癌、肺癌、食道癌、口腔癌、腦癌、髓母細胞瘤、神經外胚層瘤、神經膠質瘤、垂體癌和骨癌中。
[0156]本申請的組合物可以包含單一類型的抗體(如單獨的抗CCL25或抗CCR9抗體)或者同時包含兩種類型的抗體。所述組合物還可包含治療有效量的特異性針對如正在被治療的特定適應癥(優(yōu)選那些不會彼此產生不利影響的互補活動的適應癥)所需的如上所述的一種或多種另外的抗原的抗體。例如，在正被治療的癌是卵巢癌的情況下，可取的是，制備在單一制劑中含有抗CCL25和/或抗CCR9抗體以及一種或多種另外的抗癌決定子抗體(如抗CEA、抗CA125或抗TA90)的治療制劑。在本申請的一些實施方式中，治療性抗體可以與化療劑或細胞毒性劑組合使用。在本申請的其它實施方式中，治療性抗體可以與抗炎劑或血栓溶解劑組合使用。在組合中，這些藥劑以對預期目的有效的量適當?shù)卮嬖凇?br> [0157]本文所用文字“藥學上可接受的載體”意欲包括與藥物施用可配合的任何及全部溶劑、增溶劑、填料、穩(wěn)定劑、粘合劑、吸收劑、堿、緩沖劑、潤滑劑、控制釋放賦形物、稀釋劑、乳化劑、濕潤劑、潤滑劑、分散介質、包衣、抗細菌或抗真菌劑、等滲吸收延遲劑等。這些用于藥學活性物質的介質和試劑的使用是本領域眾所周知的。會考慮任何常規(guī)介質或試劑在組合物中的使用，除非其與活性化合物不相容。還可以向組合物中加入補充的試劑。在某些實施方式中，藥學上可接受的載體包括血清白蛋白。
[0158]將本申請的藥物組合物配制成與其預定的施用途徑具有生物相容性。施用途徑的實例包括腸胃外，例如，鞘內，動脈內，靜脈內，皮內，皮下，經口，經皮(局部)以及經粘膜施用。在某些實施方式中，將所述藥物組合物直接施用到腫瘤組織中。
[0159]用于腸胃外、真皮內或皮下施用的溶液或混懸液可包括下列成分:無菌稀釋劑，例如，注射用水、鹽溶液、不揮發(fā)油、聚乙二醇、甘油；丙二醇或其他的合成溶劑；抗菌劑，例如，苯甲醇或尼泊金甲酯；抗氧化劑，例如，抗壞血酸或硫酸氫鈉；螯合劑，例如，乙二胺四乙酸；緩沖劑，例如，醋酸鹽、檸檬酸鹽或磷酸鹽；以及用于調節(jié)張力的試劑，例如，氯化鈉或葡萄糖?？梢允褂盟峄驂A(例如，鹽酸或氫氧化鈉)調節(jié)pH。腸胃外制劑可以封裝在由玻璃或塑料制成的安瓿、一次性注射器或多劑量小瓶中。
[0160]適合可注射使用的藥物組合物包括無菌水溶液(在水溶性的情況下)或分散劑以及用于臨時制備無菌可注射溶液或分散劑的無菌粉末。就靜脈內施用而言，適合的載體包括生理鹽水、抑菌水、Cremophor EL?(BASF, Parsippany, NJ)或磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)。在所有情況下，可注射的組合物應當是無菌的并且應當為能達到易于溶液注射程度的流體。其在制造和貯藏條件下必須是穩(wěn)定的并且必須針對如細菌和真菌的微生物污染行為進行防腐。載體可為溶劑或分散介質，例如，包括水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇和液體聚乙二醇等)以及它們的合適的混合物。例如，通過使用如卵磷脂的包衣、通過在分散的情況下保持所需的粒度以及通過使用表面活性劑，可以保持適當?shù)牧鲃有?。通過多種抗細菌和抗真菌劑(例如，對羥苯甲酸酯、三氯叔丁醇、苯酚、抗壞血酸、硫柳汞等)可以實現(xiàn)微生物行為的防止。在許多情況下，將優(yōu)選在組合物中包括等滲劑，例如，糖、多元醇(如甘露醇、山梨糖醇)和氯化鈉。通過使組合物中包含延遲吸收的試劑(例如，單硬脂酸鋁或凝膠)可以使可注射的組合物延長吸收。
[0161]在具有上述列舉的成分的一種或組合的適當?shù)娜軇┲屑尤胨枇康幕钚曰衔?例如，抗CCL25或抗CCR9抗體)來制備無菌的可注射溶液，根據(jù)需要，之后再過濾滅菌。通常，可以通過將活性化合物加入到包含基礎分散介質和所需的其他來自上述列舉的那些成分中的成分的無菌載體中來制備分散劑。在用于制備無菌可注射溶液的無菌粉末的情況中，優(yōu)選的制備方法為真空干燥和冷凍干燥，這樣可以得到活性成分加任何附加的來自其預先過濾滅菌溶液中的所需成分的粉末。
[0162]經口的組合物通常包含惰性稀釋劑或可食用的載體。可以將它們封裝在凝膠膠囊中或者壓制成片劑。為了經口治療施用，可以將活性化合物與賦形劑結合并以片劑、錠劑或膠囊的形式使用。也可以使用用作嗽口水的流體載體來制備經口的組合物，其中，流體載體中化合物經口施用、發(fā)出嗖嗖聲、咳出或吞咽?？梢园帉W可配合的結合劑和/或輔劑材料作為組合物的一部分。片劑、丸劑、膠囊、錠劑等可以包含任何下列成分或相似性質的化合物:粘合劑，例如，微晶纖維素、黃蓍樹膠或凝膠；賦形劑，例如，淀粉或乳糖；崩解劑，例如，藻酸、淀粉輕乙酸鈉(Primogel)或玉米淀粉；潤滑劑，例如，硬脂酸鎂或Stertes ;助流劑，例如，膠體二氧化硅；甜味劑，例如，蔗糖或糖精；或者調味劑，例如，薄荷、水楊酸甲酯或橙味劑。
[0163]為了通過吸入施用，將化合物以來自加壓容器或者包含適合的推進劑(例如，如二氧化碳的氣體)的分配器或噴霧器中的噴霧劑的形式遞送。
[0164]也可以通過經粘膜或經皮方式進行全身施用。就經粘膜或經皮施用而言，在制劑中使用適合透入將要穿過的屏障的滲透劑。這種滲透劑是本領域中通常已知的，并且包括，例如，就經粘膜施用而言，清潔劑、膽汁鹽和夫西地酸衍生物。通過使用鼻腔噴霧或栓劑可以實現(xiàn)經粘膜施用。就經皮施用而言，將藥物組合物配制成本領域中所熟知的軟膏劑、油膏劑、凝膠或乳膏劑。
[0165]在某些實施方式中，藥物組合物被配制成緩釋或控釋活性成分的?？梢允褂蒙锟山到獾?、生物相容的聚合物，例如，乙烯乙酸乙烯酯、聚酐、聚乙醇酸、膠原、聚原酸酯和聚乳酸。對本領域技術人員來說，這些制劑的制備方法將是明顯的。還可以商購材料，例如，從Alza公司和Nova Pharmaceuticals, Inc0脂質體混懸液(包括祀向受感染細胞的脂質體，其攜帶有針對病毒抗原的單克隆抗體)也可用作藥學上可接受的載體。根據(jù)本領域技術人員已知的方法可以制備這些，例如，按照美國專利第4，522,811中所述。
[0166]為了易于施用和劑量統(tǒng)一，制成以劑量單位形式的經口或腸胃外的組合物是特別有利的。本文中所用的劑量單 位形式包括適合作為要被治療的受試者的單位劑量的物理上的離散單位；每個單位包含預定量的計算與所需藥物載體結合產生所需治療效果的活性化合物。本發(fā)明的劑量單位形式的規(guī)格由活性化合物的獨特特性和所要實現(xiàn)的特定治療效果以及在合成這種用于個體治療的活性化合物的領域中的固有限制因素規(guī)定，或者直接取決于活性化合物的獨特特性和所要實現(xiàn)的特定治療效果以及在合成這種用于個體治療的活性化合物的領域中的固有限制因素。
[0167]在細胞培養(yǎng)物或實驗動物中通過標準藥學方法可以確定這種化合物的毒性和治療效能，例如，確定LD50 (50%群體致死的劑量)和ED50 (50%群體治療有效的劑量)。毒性和治療效果之間的劑量比為治療指數(shù)并且它可以表示為LD50/ED50比。優(yōu)選具有大的治療指數(shù)的化合物。盡管可以使用具有毒副作用的化合物，但是為了使對未受感染細胞的潛在損害減至最小并由此減少副作用，應當注意設計使這種化合物靶向受侵襲組織的部位的遞送系統(tǒng)。
[0168]從細胞培養(yǎng)測定和動物研究中得到的數(shù)據(jù)可以用于配制在人體中使用的劑量的范圍。這種化合物的劑量優(yōu)選處于包括具有很少毒性或無毒性的ED50的循環(huán)濃度的范圍內。依據(jù)所利用的劑量形式和所采用的施用途徑，所述劑量在該范圍內可以變化。對于本發(fā)明方法中使用的任何化合物，可以從細胞培養(yǎng)測定中最初估計治療的有效劑量。在動物模型中配制劑量以得到包括在細胞培養(yǎng)中測定的IC50(即達到癥狀的半最大抑制的試驗化合物的濃度)的循環(huán)血漿濃度范圍。該信息可用于更加精確地確定人體內的有用劑量。在某些實施方式中，單一劑量包含0.01 μ g至50mg的抗CCL25或抗CCR9抗體。所述藥物組合物可以與用于施用的說明書一起被包含在容器、包裝或分配器中。
[0169]本申請通過如下實施例進一步進行解釋，其不應解釋為對本申請的限制。在本申請中引用的所有參考文獻、專利和公開專利申請以及圖和表的內容在此以引用方式并入本文。
[0170]實施例1:各種癌中的CCL25和CCR9表汰和活件的體外分析
[0171]如在圖1中所示，乳腺癌組織表達CCL25。用同種型對照或抗CCL25抗體對乳腺癌組織染色。紅紫色顯示CCL25染色。具有40X物鏡的Aperio ScanScope CS系統(tǒng)捕獲數(shù)字圖像。乳腺癌的典型實例顯示了 CCL25的免疫強度。
[0172]圖2證實了 CCL25抑制了順鉬誘導的乳腺癌細胞系生長的減少。隨著增大順鉬濃度，用O或100ng/ml CCL25加同種型對照或抗CCR9Ab培養(yǎng)MDA-MB-231細胞24小時。通過BrdU合并測定細胞增殖，并且測定重復3次且平行進行三份。星號指示了在CCL25處理的和未處理的BrCa細胞之間的統(tǒng)計學顯著性差異(p〈0.01)。
[0173]圖3A-B顯示了 CCL25保護乳腺癌細胞免受順鉬誘導的細胞凋亡。僅用5mg/ml順鉬或者用O或100ng/ml CCL25加lmg/ml抗人CCR9或同種型對照培養(yǎng)MDA-MB-231細胞24小時(A) ο收獲細胞并且用錨定蛋白(annexin V)和碘化丙錠(propidium iodide, PI)染色。通過染色的細胞的流式細胞術分析區(qū)分凋亡(錨定蛋白陽性)細胞和生活(無熒光)細胞和壞死(PI陽性)細胞。星號指示在CCL25處理的和未處理的乳腺癌細胞之間的統(tǒng)計學顯著性差異(ρ〈0.01) ο用5mg/ml順鉬或用O或100ng/ml CCL25加lmg/ml的抗人CCR9或同種型對照Ab培養(yǎng)MDA-MB-231細胞系24小時(B)。使用末端脫氧核苷酰酶酸轉移酶介導的dUTP切口末端標記(TUNEL)法進行凋亡細胞的檢測。用標準熒光過濾盒(520±20nm)，凋亡細胞顯示核綠色熒光。星號指示在順鉬CCL25處理的和未處理的乳腺癌細胞系之間的統(tǒng)計學顯著性差異(p〈0.01)。
[0174]圖4A-B顯示了在乳腺癌細胞系中CCL25-CCR9相互作用的PI3K和Akt活化。在用CCL25、順鉬和特定的激酶抑制劑(渥曼青霉素和PF-573，228)處理之后，測試MDA-MB-231細胞的活化PI3K和Akt的能力。在順鉬和激酶抑制劑存在下，在CCL25刺激之前(O分鐘)或者之后(5或10分鐘)，用基于快速活化細胞的ELISA定量了原位總的和磷酸化的PI3K和Akt水平。在平行進行三份的3個獨立實驗中提供活化(磷酸化)的PI3K(A)或Akt (B)與總的PI3K(A)或Akt (B)的比例土SEM。星號指示在未處理的和CCL25處理的細胞和CCL25+順鉬處理的細胞之間的統(tǒng)計學差異。
[0175]圖5A-B顯示了乳腺癌細胞系CCL25處理后的GSK-3 β和FKHR磷酸化作用。在用CCL25、順鉬和特定的激酶抑制劑(渥曼青霉素和PF-573，228)處理之后，測試MDA-MB-231細胞的使GSK-3 β和FKHR磷酸化的能力。在順鉬和激酶抑制劑存在下，在CCL25刺激之前(O分鐘)或者之后(5或10分鐘)，用基于快速活化細胞的ELISA定量了原位總的和磷酸化的GSK-3 β和FKHR水平。在平行進行三份的3個獨立實驗中，以土 SE的方式提供磷酸化的GSK-3 0 (A)或FKHR(B)與總的GSK-3 0 (A)或FKHR(B)的比值。星號指示在未處理的和CCL25處理的細胞和CCL25+順鉬處理的細胞之間的統(tǒng)計學差異(ρ〈0.01)。
[0176]圖6顯示了卵巢癌組織CCR9和CCL25的表達。用同種型對照或者抗CCR9和CCL25抗體對源自非腫瘤的(η=8)、漿液性腺癌(η=9)、漿液性乳突狀囊腺瘤(η=1)、子宮內膜樣腺癌(η=5)、粘液腺癌(η=2)、囊腺瘤(η=3)、交界性粘液腺癌(η=1)、透明細胞癌(η=5)、粒層細胞瘤(η=3)、無性細胞瘤(η=3)、移行細胞癌(η=3)、布倫納瘤(η=1)、卵黃囊瘤(η=4)、腺癌(η=1)和纖維瘤(η=2)的卵巢癌組織進行染色。棕(DAB)色顯示了 CCR9染色并且紅紫色顯示了 CCL25。用具有40Χ物鏡的Aperio ScanScope CS系統(tǒng)捕獲各玻片的數(shù)字圖像。典型的實例顯示了 CCR9和CCL25的免疫強度。
`[0177]圖7Α-Β顯示卵巢癌組織的CCL25表達的分析。用改進的箱線圖(box plot) (A)分析和呈現(xiàn)CCL25表達。在箱線中，下線、中線和上線分別表示第一四分位數(shù)(Q1)、中值(Q2)和第三四分位數(shù)(Q3)。上和下觸須線表示中值±1.5(Q3-Q1)。在下格中指示與非腫瘤的顯著性差異。表(B)顯示非腫瘤組織(NN)與漿液性腺癌(SA)、子宮內膜樣腺癌(EC)、粘液腺癌(MA)、囊腺瘤(C)、交界性粘液腺癌(MBA)、透明細胞癌(CCC)、粒層細胞瘤(GCT)、無性細胞瘤(D)、移行細胞癌(TCC)、布倫納瘤(BT)、卵黃囊瘤(YST)、腺癌㈧和纖維瘤(F)間的各P值或顯著性差異。
[0178]圖8A-B顯示卵巢癌組織的CCR9表達的分析。用改進的箱線圖(box plot) (A)分析和呈現(xiàn)CCR9表達。在箱線中，下線、中線和上線分別表示第一四分位數(shù)(Ql)、中值(Q2)和第三四分位數(shù)(Q3)。上和下觸須線表示中值±1.5(Q3-Q1)。在下格中指示與非腫瘤的顯著性差異。表(B)顯示非腫瘤組織(NN)與漿液性腺癌(SA)、子宮內膜樣腺癌(EC)、粘液腺癌(MA)、囊腺瘤(C)、交界性粘液腺癌(MBA)、透明細胞癌(CCC)、粒層細胞瘤(GCT)、無性細胞瘤(D)、移行細胞癌(TCC)、布倫納瘤(BT)、卵黃囊瘤(YST)、腺癌(A)和纖維瘤(F)之間的各P值或顯著性差異。
[0179]圖9A-B顯示卵巢癌細胞系的CCR9和CCL25表達。將卵巢癌細胞用熒光素(FITC)結合的抗CCR9或FITC結合的同種型對照抗體染色并通過FACS分析(A)。卵巢癌細胞用FITC結合的抗CCR9染色，細胞內CCL25用藻紅蛋白(PE)結合的抗CCL25抗體染色，以及細胞核用Draq-5染色(B)。歸并數(shù)據(jù)(merged data)顯示CCR9在表面表達而CCL25在核中表達。
[0180]圖10A-B顯示卵巢癌細胞的缺氧調節(jié)的CCR9mRNA和表面蛋白表達。從處于含氧量正常的條件和含氧量低的條件下的SK0V-3細胞系中分離總RNA，或者從正常的初級卵巢組織中分離總RNA。CCR9mRNA表達的定量RT-PCR分析平行進行三份。轉錄物的拷貝數(shù)被表示為相對于18S rRNA+SE的實際拷貝數(shù)(A)。將處于常氧和缺氧的SK0V-3細胞用PE結合的同種型對照抗體(Ab)(實心直方圖)或PE結合的抗CCR9單克隆Ab (空心直方圖)染色并且通過流式細胞計量術定量(B)。顯示PE陽性細胞的平均熒光強度。符號表示在正常組織或同種型對照與OvCa細胞(@)之間或者在含氧量正常的細胞和含氧量低的細胞之間的CCR9表達的統(tǒng)計學上的顯著性(p〈0.01)差異⑷。
[0181]圖1lA-B顯示SK0V-3細胞缺氧介導的和CCL25介導的遷移和侵入。測試SK0V-3細胞的向趨化梯度的CCL25遷移的能力(A)。在遷移實驗過程中，在含氧量正常的條件或含氧量低的條件下，使用100ng/ml的CCL25，將細胞與1.0y g/ml小鼠抗CCR9抗體(Ab)或同種型對照Ab共培養(yǎng)。此外，測試SK0V-3細胞的在含氧量低的條件或含氧量正常的條件下應答100ng/ml的CCL25而侵入或轉移穿過MatrigelTM基質的能力(B)。在侵入實驗過程中，在含氧量正常的條件或含氧量低的條件下，使用使用100ng/ml的CCL25，將細胞與l.0yg/ml的抗CCR9的單克隆抗體共培養(yǎng)。用符號顯示遷移或侵入的細胞數(shù)(+SE)，該符號表示在CCL25處理的和未處理的含氧量正常的細胞(#)、CCL25處理的和未處理的含氧量低的細胞(@)、或同樣地處理的含氧量正常的和含氧量低的細胞(*)之間的顯著性(p〈0.01)差異。
[0182]圖12A-B顯示SK0V-3細胞的CCL25誘導的膠原酶表達。測試細胞表達膠原酶(ΜΜΡ-1,ΜΜΡ-8,和MMP_13)mRNA和活性蛋白質的能力。在含氧量正常的條件或含氧量低的條件下，將SK0V-3細胞單獨、使用100ng/ml的CCL25+1 μ g/ml的同種型對照抗體(Ab)、或者使用CCL25+1 μ g/ml的小鼠抗CCR9Ab來培養(yǎng)24小時。分離總RNA，并對膠原酶的mRNA表達進行定量RT-PCR分析，并且轉錄物拷貝數(shù)被表示為相對于18S rRNA的實際拷貝數(shù)(A)。在條件培養(yǎng)基中通過Fluorokine和Biotrak實驗定量活性膠原酶(B)。符號表示在CCL25處理的和未處理的含氧量正常的細胞(#)、CCL25處理的和未處理的含氧量低的細胞(O)、或同樣地處理的含氧量正常的和含氧量低的細胞(*)之間的顯著性(p〈0.01)差異。
[0183]圖13A-B顯示SK0V-3細胞的CCL25誘導的明膠酶表達。測試細胞的表達明膠酶(MMP-2和MMP-9)mRNA和活性蛋白質的能力。在含氧量正常的條件或含氧量低的條件下，將SK0V-3細胞單獨、使用100ng/ml的CCL25+1 μ g/ml的同種型對照抗體(Ab)、或者使用CCL25+1 μ g/ml的小鼠抗CCR9Ab來培養(yǎng)24小時。分離總RNA，并對明膠酶的mRNA表達進行定量RT-PCR分析，并且轉錄物拷貝數(shù)被表示為相對于18S rRNA的實際拷貝數(shù)(A)。在條件培養(yǎng)基中通過Fluorokine和Biotrak實驗定量活性明膠酶(B)。符號表示在CCL25處理的和未處理的含氧量正常的細胞(#)、CCL25處理的和未處理的含氧量低的細胞(O)、或同樣地處理的含氧量正常的和含氧量低的細胞(*)之間的顯著性(p〈0.01)差異。
[0184]圖14A-B顯示SK0V-3細胞的CCL25誘導的基質降解酶表達。測試細胞的表達基質降解酶(MMP-3，MMP-10，和MMP_ll)mRNA和活性蛋白質的能力。在含氧量正常的條件或含氧量低的條件下，將SK0V-3細胞單獨、使用100ng/ml的CCL25+1 μ g/ml的同種型對照抗體(Ab)、或者使用CCL25+1 μ g/ml的小鼠抗CCR9Ab來培養(yǎng)24小時 。分離總RNA，并對基質降解酶的mRNA表達進行定量RT-PCR分析，并且轉錄物拷貝數(shù)被表示為相對于18SrRNA的實際拷貝數(shù)(A)。在條件培養(yǎng)基中通過Fluorokine和Biotrak實驗定量活性基質降解酶(B)。符號表示在CCL25處理的和未處理的含氧量正常的細胞(#)、CCL25處理的和未處理的含氧量低的細胞(O)、或同樣地處理的含氧量正常的和含氧量低的細胞(*)之間的顯著性(ρ〈0.01)差異。
[0185]圖15顯示前列腺癌細胞系的CCR9表達。將前列腺癌細胞系(C4_2B、LNCaP、和PC3)和正常的前列腺細胞(RWPE-1)用FITC結合的抗人CCR9 (綠色)和7AAD (核染劑；紅色)染色。通過Amnis ImageStream使陽性染色細胞成像和定量。右圖顯示CCR9染色的平均熒光強度。
[0186]圖16A-D顯示前列腺組織的CCR9表達。組織微陣列(TMA)得自國立衛(wèi)生研究院(National Institutes of Health(NIH))、國立癌癥研究所(National CancerInstitute(NCI))和在伯明翰的阿拉巴馬大學并且針對CCR9進行染色。具有40X物鏡的Aperio Scan Scope系統(tǒng)捕獲各載玻片的數(shù)字圖像。指出前列腺癌(CaP) (A)、匹配的良性前列腺組織(MB) (B)和陰性對照的代表性實例，并且使用ImageScope軟件(V.6.25)對掃描和分析的全部組織的CCR9的強度進行定量。圖27D顯示在MB、良性前列腺增生(BPH)和前列腺癌(PCa)之間的CCR9免疫強度(immunointensity)。星號表示在MB、BPH和PCa組織之間的免疫強度的顯著性(p〈0.01)差異。
[0187]圖17A-D顯示前列腺癌組織的CCL25表達。內分泌-旁分泌細胞表型的神經內分泌分化頻繁地出現(xiàn)在前列腺惡性腫瘤中并且具有潛在的預后和治療含意。旁泌性細胞表型可被認為是前列腺和前列腺癌中雄激素不敏感的有絲分裂期后的亞群。圖17A圖示前列腺上皮內瘤變內的旁泌性模式中的CCL25的表達。雙頭箭頭指向產生CCL25的多重旁泌性細胞(紅色)；棕色箭頭指表達CCR9的細胞(棕色)。圖17B顯示對CCL25染色成紅色的細胞。棕色箭頭指細胞NSE。圖17A和C分別是圖17D和B高倍放大圖。
[0188]圖18顯示正常的健康供體或患有前列腺疾病的患者的血清CCL25水平。ELISA用于定量來自正常的健康供體、前列腺癌(PCa)、前列腺上皮內瘤(prostateinterepithelial neoplasia, PIN)和良性前列腺增生(BPH)的血清中的CCL25。星號表示與正常的健康供體相比CCL25水平的顯著性差異(p〈0.05)。
[0189]圖19A-C顯示小鼠骨髓細胞的CCL25表達。將來自非荷瘤(A)小鼠和荷瘤(B)小鼠的骨髓細胞用抽吸裝置抽吸并用FITC結合的抗CCL25抗體染色。用Amnis ImageStream定量陽性染色細胞(C)。使用IDEAS軟件進行基于圖像的分析并且表明在前列腺腫瘤攻擊后骨髓細胞的CCL25表達增加1.6倍。
[0190]圖20A-B顯示CCR9介導的前列腺癌細胞遷移(A)和侵入(B)。測試LNCaP細胞、PC3細胞和C4-2b細胞的遷移到無添加(空心柱)、100ng/mL的CCL25 (散列柱(hashedbar))或100ng/mL的CCL25+1 μ g/mL抗CCL25抗體(實心柱)的能力。應答CCL25 (其來自用于接種遷移和侵入室的最初的104個細胞)而遷移和侵入的細胞數(shù)(土SEM)，顯示遷移是CCL25依賴性的并且被抗CCL25抗體封閉抑制。星號表示在無添加與CCL25處理的細胞之間的顯著性差異(p〈0.01)。
[0191]圖21顯示CCL25誘導的LNCaP、PC3和C4_2b前列腺癌細胞系的活性基質金屬蛋白酶(MMP)表達。在沒有(空心箱)或具有l(wèi)OOng/mL CCL25(實心箱)的情況下培養(yǎng)細胞24小時。通過MMP活性測定法確定培養(yǎng)上清中MMP-1、MMP-2、MMP-3、MMP-9、MMP-1O和MMP-1l的蛋白水平。星號顯示CCL25處理的細胞系與未處理的細胞系相比MMP分泌的顯著性(P〈0.05)增加或減少。
[0192]圖22A-F顯示CCR9基因敲減(knockdown)對PC3前列腺癌細胞系的骨轉移的抑制。用表達螢光素酶-和多西環(huán)素(doxycyclene)-可誘導CCR9-特異性shRNA的PC3細胞系攻擊小鼠(A、D)。通過心內注射用該細胞系攻擊小鼠。隨后，小鼠接受飲料中無添加或添加多西環(huán)素(0.2mg/mL)21天。使用Caliper XenogenlOO體內成像系統(tǒng)監(jiān)測轉移和腫瘤生長。在攻擊后24小時沒有變化(B、E)，但是攻擊后三周，與CCR9陽性PC3細胞(C)相t匕，CCR9基因敲減PC3(F)細胞生長為骨轉移顯著減少。
[0193]圖23顯示肺癌患者的血清CCL25水平。進行CCL25ELISA以定量來自診斷患有腺癌(Adeno Ca;n=14)、鱗狀細胞癌(SSC;n=17)的患者和正常的健康供體(對照；n=9)的血清的CCL25水平。ELISA能夠檢測>5pg/mL的CCL25。實心圓表示個體的血清CCL25水平，而線表示各組的中值濃度。星號表示在對照組和肺癌組之間的顯著性差異(p〈0.01)。
[0194]圖24A-C顯示非腫瘤肺和肺癌組織的CCR9表達。來自非腫瘤(n=8) (A)、腺癌(n=54) (B)和鱗狀細胞癌(n=24) (C)用同種型對照或抗CCR9抗體染色。棕(DAB)色顯示CCR9染色。
[0195]圖25A-C顯示結腸癌組織的CCR9-CCL25表達。來自肺腫瘤(n=8)和腺癌(n=16)的結腸組織用同種型對照(A)、抗CCR9(B)或抗CCL25(C)抗體染色。棕色(DAB)染色表示CCR9陽性，而紅紫色染色說明CCL25陽性。
[0196]實施例2:使用實時PCR分析檢測趨化因子表達水平
[0197]引物設計
[0198]CXCL1、CXCL2、CXCL3、CXCL4、CXCL5、CXCL6、CXCL7、CXCL8、CXCL9、CXCLIO、CXCL11、CXCLl2, CXCLl3, CXCL14, CXCLl5, CXCL16、CXCRl、CXCR2、CXCR3、CXCR4、CXCR5、CXCR5a、CXCR5b、CXCR6、CXCR7、CCL1、CCL2、CCL3、CCL4、CCL5、CCL6、CCL7、CCL8、CCL9、CCLIO、CCL11、CCL12、CCL13、CCL14、CCL15、CCL16、CCL17、CCL18、CCL19、CCL20、CCL21、CCL22、CCL24、CCL25、CCL25-1、CCL25-2、CCL27、CCL28、CCR1、CCR2、CCR3、CCR4、CCR5、CCR6、CCR7、CCR8、CCR9、CCR10、CCRl1、XCLl、XCL2、XCRl、CX3CR1 或 CX3CL1 的信使 RNA 序列得自 NIH-NCBI 基因庫數(shù)據(jù)庫。使用BeaconJ2.0計算機程序設計引物。使用計算機程序:Primer PremierJ和MIT Primerf進行引物的熱力學分析。針對整個人基因組比較所得到的引物組從而確定特異性。
[0199]實時PCR分析
[0200]在附加有非必需氨基酸、L-谷氨酸和丙酮酸鈉的含有10%胎牛血清的RMP1-1640 (完全培養(yǎng)基)中培養(yǎng)癌細胞系(ATCC，Rockville, MD)。原發(fā)性腫瘤和正常配對的匹配組織得自臨床分離物(Clinomics Biosciences, Frederick, MD andUAB Tissue Procurement, Birmingham, AL)。 使用 TriReagent(Molecular ResearchCenter, Cincinnati, OH)按照制造商的說明從106個細胞中分離信使RNA(mRNA)。通過用10U/F1的無RNA酶的DNA酶(Invitrogen, San Diego, CA)在37°C處理15分鐘而從這些樣本中除去可能的基因組DNA污染。然后將RNA沉淀并重懸在RNA Secure (Ambion，Austin, TX)中。通過使用Taqman7反轉錄試劑(Applied Biosystems, Foster City, CA)按照制造商的說明反轉錄大約2 μ g的總RNA。隨后，使用SYBR7Green PCR master mix試劑(AppliedBiosystems)按照制造商的說明用針對 CXCL1、CXCL2、CXCL3、CXCL4、CXCL5、CXCL6、CXCL7、CXCL8、CXCL9、CXCLlO, CXCLl1、CXCLl2, CXCLl3, CXCL14、CXCLl5, CXCL16、CXCRl、CXCR2、CXCR3、CXCR4、CXCR5、CXCR5a、CXCR5b、CXCR6、CXCR7、CCL1、CCL2、CCL3、CCL4、CCL5、CCL6、CCL7、CCL8、CCL9、CCL10、CCL11、CCL12、CCL13、CCL14、CCL15、CCL16、CCL17、CCL18、CCL19、CCL20、CCL21、CCL22、CCL24、CCL25、CCL25-1、CCL25-2、CCL27、CCL28、CCRU CCR2、CCR3、CCR4、CCR5、CCR6、CCR7、CCR8、CCR9、CCR10、CCR11、XCL1、XCL2、XCR1、CX3CR1 或 CX3CL1 的特異性的人cDNA引物擴增cDNA。使用BioRad Icycler和軟件(Hercules, CA)，通過實時PCR分析評價這些目標的mRNA的拷貝水平。[0201 ]使用 CXCL1-、CXCL2-、CXCL3-、CXCL4-、CXCL5-、CXCL6-、CXCL7-、CXCL8-、CXCL9-、CXCL10-、CXCL11-、CXCL12-、CXCL13-、CXCL14-、CXCL15-、CXCL16-、CXCRl-、CXCR2-、CXCR3-、CXCR4-、CXCR5-、CXCR5a_、CXCR5b_、CXCR6-、CXCR7-、CCL1-、CCL2-、CCL3-、CCL4-、CCL5-、CCL6-、CCL7-、CCL8-、CCL9-、CCL10-、CCLl 1-, CCL12-、CCL13-、CCL14-、CCL15-、CCL16-、CCL17-、CCL18-、CCL19-、CCL20-、CCL21-、CCL22-、CCL24-、CCL25-、CCL25-1-、CCL25-2-、CCL27-、CCL28-、CCR1-、CCR2-、CCR3-、CCR4-、CCR5-、CCR6-、CCR7-、CCR8-、CCR9-、CCR10-、CCR11-、XCL1-、XCL2-、XCR1-、CX3CR1-或CX3CL1特異性引物組得到的RT-PCR產物，由于排除了與宿主序列(NIH-NCBI基因庫)退火的引物，不會與其他基因目標發(fā)生交叉反應。相對于導致CXCR5a對CXCR5b以及CCL25、CCL25-1對CCL25-2的多態(tài)性，引物產生不同尺寸的擴增子產物。為此，腺瘤、癌、白血病、淋巴瘤、黑素瘤和/或骨髓瘤細胞系及腫瘤組織的RT-PCR分析顯示癌細胞區(qū)別地表達趨化因子和趨化因子受體。
[0202]實施例3:抗趨化因子和抗趨化因子受體抗體在體外和體內抑制腫瘤細胞生長
[0203]抗血清制品
[0204]將來自CXCRl、CXCR2、CXCLl、CXCL2、CXCL3、CXCL5、CXCL6、CXCL7、CXCL8、CXCLl2,CXCR5a、CXCR5b、CXCLl3, CXCR6、CXCL16、CCL16、CCL25、CCL25-1、CCL25-2、CCR9、CX3CR1和 CX3CL1(SEQ ID NOS: 1-SEQ ID N0:21)的 15 種氨基酸肽合成(Sigma Genosys, TheWoodlands, TX)并結合雞卵溶菌酶(Pierce, Rockford, IL)以產生用于產生抗血清制品或單克隆抗體的后續(xù)免疫的抗原。通過顯色的鱟阿米巴樣細胞溶解物測定法(CapeCod, Inc., Falmouth, MS)定量趨化因子肽結合物的內毒素水平并顯示為<5EU/mg。對于第一次免疫，以終體積為1.0ml，連同完全弗氏佐劑Ribi佐劑系統(tǒng)(RAS) —起使用100 μ g的抗原作為免疫原。將該混合物以100ml等分皮下地施用到兔子后背的兩個位置上并且將400ml肌內地施用到各后腿肌肉中。三至四周后，對于后續(xù)3次免疫，除不完全弗氏佐劑之外，兔子還接受100 μ g的抗原。當抗CXCRl抗體、抗CXCR2抗體、抗CXCLl抗體、抗CXCL2抗體、抗CXCL3抗體、抗CXCL5抗體、抗CXCL6、抗CXCL7抗體、抗CXCL8抗體、抗CXCL12抗體、抗CXCR5a抗體、抗CXCR5b抗體、抗CXCL13抗體、抗CXCR6抗體、抗CXCL16抗體、抗CCL16抗體、抗CCL25抗體、抗CCL25-1抗體、抗CCL25-2抗體、抗CCR9抗體、抗CX3CR1抗體和抗CX3CL1抗體滴度達到1:1，000, 000時收集抗血清。隨后，將正?；蚩寡鍩釡缁畈⒃赑BS中以1:50稀釋。
[0205]單克隆抗體制品
[0206]將來自CXCRl、CXCR2、CXCLl、CXCL2、CXCL3、CXCL5、CXCL6、CXCL7、CXCL8、CXCLl2,CXCR5a、CXCR5b、CXCLl3, CXCR6、CXCL16、CCL16、CCL25、CCL25-1、CCL25-2、CCR9、CX3CR1 和CX3CL1的15種氨基酸肽合成(Sigma Genosys)并結合雞卵溶菌酶(Pierce)以產生用于產生抗血清制品或單克隆抗體的后續(xù)免疫的“抗原”。通過顯色的鱟阿米巴樣細胞溶解物測定法(Cape Cod, Inc., Falmouth, MS)定量趨化因子肽結合物的內毒素水平并顯示為〈5EU/mg ο對于第一次免疫，以終體積為200ml，連同完全弗氏佐劑Ribi佐劑系統(tǒng)(RAS) —起使用100 μ g的抗原作為免疫原。將該混合物以100ml等分皮下地施用到大鼠、小鼠或免疫球蛋白-人化的小鼠的后背的兩個位置處。兩周后，對于后續(xù)3次免疫，除不完全弗氏佐劑之外，動物還接受100 μ g的抗原。收集血清并且當抗CXCRl抗體、抗CXCR2抗體、抗CXCLl抗體、抗CXCL2抗體、抗CXCL3抗體、抗CXCL5抗體、抗CXCL6、抗CXCL7抗體、抗CXCL8抗體、抗CXCL12抗體、抗CXCR5a抗體、抗CXCR5b抗體、抗CXCL13抗體、抗CXCR6抗體、抗CXCL16抗體、抗CCL16抗體、抗CCL25抗體、抗CCL25-1抗體、抗CCL25-2抗體、抗CCR9抗體、抗CX3CR1抗體和抗CX3CL1抗體滴度達到1: 2，000, 000時，處死宿主，并分離脾細胞，以產生雜交瘤。簡言之，將來自免疫宿主的脾或淋巴結的B細胞與不死的骨髓瘤細胞系(例如，YB2/0)融合。接著在選擇性培養(yǎng)條件(即，HAT補充培養(yǎng)基)和限定雜交瘤克隆的稀釋方法之后分離雜交瘤。使用ELISA選擇產生具有所需特異性的抗體的細胞。使用通常使用的分子生物學技術使來自正常大鼠或小鼠的雜交瘤人化。在克隆高親和力和豐產的雜交瘤后，從腹水或培養(yǎng)上清中分離抗體以及調節(jié)至1:2，000，000的滴度并在PBS中以1:50稀釋。
[0207]抗血清或單克隆抗體處理
[0208]免疫缺陷的裸NIH-1II小鼠(8至12周齡，Charles RiverLaboratory, Wilmington, MA)(缺乏T細胞、B細胞和NK細胞)皮下地接受IxlO6癌細胞，從而建立腫瘤。然后，將所建立的實體瘤從宿主中移除，用于立即移植或為隨后移植而儲存在液氮中。使用外科手術 將新近分離或液氮冷凍的腫瘤組織(Ig)移植在腸內脂肪組織中以產生腫瘤。一旦異種移植腫瘤生長達到5mm大小，就使NIH-1II小鼠每三天接受200 μ I腹腔內注射抗血清或單克隆抗體并且監(jiān)測腫瘤生長的進展和退化。
[0209]數(shù)據(jù)分析
[0210]使用SigmaStat2000 (Chicago, IL)軟件分析和確認數(shù)據(jù)的統(tǒng)計顯著性。隨后，使用雙因子不成對檢驗，通過史蒂頓特氏t檢驗(Student’s t_test)分析數(shù)據(jù)。在該分析中，比較處理的樣本和未處理的對照。顯著性水平設定為P〈0.05。
[0211]體外生長研究
[0212]在具有或沒有特異性針對CXCRl、CXCR2、CXCLl、CXCL2、CXCL3、CXCL5、CXCL6CXCL7、CXCL8、CXCR4、CXCLl2, CXCR5a、CXCR5b、CXCLl3, CXCR6、CXCL16、CCL16、CCR9、CCL25、CCL25-1、CCL25-2、CX3CR1或CX3CL1的抗體的存在下，在完全培養(yǎng)基中使腺瘤、癌、白血病、淋巴瘤、黑素瘤和/或骨髓瘤細胞系生長。CXCR1、CXCR2、CXCL1、CXCL2、CXCL3、CXCL5、CXCL6、CXCL7或CXCL8的抗體抑制表達CXCRl和/或CXCR2的癌細胞系的生長。同樣地，CXCR4或CXCL12的抗體抑制表達CXCR4的癌細胞系的生長。CXCR5a、CXCR5b或CXCL13的抗體抑制表達CXCR5a或CXCR5a的癌細胞系的生長。CXCR6或CXCL16的抗體抑制表達CXCR6的癌細胞系的增殖。CCR9、CCL25、CCL25-1或CCL25-2的抗體抑制表達CCR9的癌細胞系的生長。CX3CR1或CXC3L1的抗體抑制表達CX3CR1的癌細胞系的繁殖。有興趣的是，抗可溶性配體、CXCL1、CXCL2、CXCL3、CXCL5、CXCL6、CXCL7、CXCL8、CXCL12、CXCL13、CXCL16、CCL16、CCL25、CCL25-l、CCL25-2或CX3CL1的抗體，它們針對膜受體，在生長抑制方面更加有效。
[0213]體外血管發(fā)生研究
[0214]在血管發(fā)生的體外測定法中(BD-Biocoat，Hercules, CA)，在具有或沒有特異性針對 CXCR1、CXCR2、CXCL1、CXCL2、CXCL3、CXCL5、CXCL6、CXCL7、CXCL8、CXCR4、CXCL12、CXCR5a、CXCR5b、CXCLl3, CXCR6、CXCL16、CCL16、CCR9、CCL25、CCL25-1、CCL25-2、CX3CR1 或 CX3CL1的抗體的存在下，按照供應商的說明使微血管內皮細胞細胞(Cell Systems, Kirkland, WA)生長并且使其形成微血管小靜脈?？笴XCRl、CXCR2、CXCLl、CXCL2、CXCL3、CXCL5、CXCL6、CXCL7、CXCL8、CXCR4、CXCLl2, CXCR6 或 CXCL16 的抗體抑制血管發(fā)生。
[0215]體內生長研究
[0216]將癌細胞系或原發(fā)性腫瘤組織繼承性(adoptively)轉移到NIH-1II小鼠中并使其形成目的異種移植腫瘤。針對CXCR1、CXCR2、CXCLU CXCL2、CXCL3、CXCL5、CXCL6、CXCL7、CXCL8、CXCR4、CXCL12、CXCR5a、CXCR5b、CXCL13、CXCR6、CXCL16、CCL16、CCR9、CCL2 5、CCL25-1、CCL25-2、CX3CR1或CX3CL1的抗體有區(qū)別地影響腫瘤大小的進展和退化。在某些情況下，針對 CXCR1、CXCR2、CXCLU CXCL2、CXCL3、CXCL5、CXCL6、CXCL7、CXCL8、CXCR4、CXCLl2, CXCR6或CXCL16的抗體有效地導致腫瘤生長退化并阻止腫瘤生長的進展。針對CXCR4、CXCLl2, CXCR5a、CXCR5b、CXCLl3, CCL16、CCR9、CCL25、CCL25-1、CCL25-2、CX3CR1 或CX3CL1的抗體有效地抑制腫瘤尺寸的增加。
[0217]在NIH-NCBI基因庫中記錄了本文中所用的趨化因子的蛋白質序列如下:
(I)CXCRl(ACCESS10N#NP000625), SEQ ID NO:1, (2)CXCR2 (ACCESS10N#NP001548),SEQ ID NO:2, (3)CXCLl (ACCESSION#NP00 1502), SEQ ID NO:3, (4)CXCL2(ACCESS10N#NP002080), SEQ ID N0:4, (5)CXCL3(ACCESS10N#NP002081), SEQ IDN0:5, (6)CXCL5(ACCESS10N#NP002985), SEQ ID NO:6, (7)CXCL6(ACCESS10N#NP002984),SEQ ID NO:7, (8) CXCL7(ACCESS10N#NP002695) , SEQ ID NO:8, (9)CXCL8 (IL-8，ACCESS10N#NP000575), SEQ ID N0:9, (10)CXCR4(ACCESS10N#NP003458), SEQ ID NO:10，
(II)CXCL12(ACCESS10N#NP000600),SEQ ID N0:11, (12)CXCR5A(ACCESS10N_P116743)，SEQ ID NO:12, (I 3) CXCR5B(ACCESS 10N#NP00 I 707), SEQ ID NO: 13, (14)CXCL13(ACCESS10N#NP006410), SEQ ID NO:14, (15) CXCR6(ACCESS10N#NP006555),SEQ ID NO: 15, (16)CXCL16(ACCESS 10N#NP07 I 342), SEQ ID NO: 16, (17)CCL16(ACCESS10N#NP004581), SEQ ID NO:17， (18)CCL25(ACCESS10N#NP-005615.2),SEQ ID NO: 18, (19) CCL2 5-1(ACCESS 10N#NP0056 15), SEQ ID NO:19, (20)CCL25-2(ACCESS10N#NP683686),SEQ ID NO:20,(21)CX3CR1(ACCESS10N#NP001328),SEQ IDN0:21，和(22)CX3CL1(ACCESS10N#NP002987), SEQ ID N0:22。
[0218]cDNA序列是已知的并且可以在NIH-NCBI基因庫中得到，以下列登錄號:(23)CXCRl(ACCESS10N#NM000634) , SEQ ID N0:23, (24)CXCR2 (ACCESS10N#NM001557),SEQ ID NO:24, (2 5) CXCLl(ACCESS10N#NM00 I 5 11) , SEQ ID NO:25, (26)CXCL2 (ACCESS10N#NM002089) , SEQ ID N0:26, (27) CXCL3 (ACCESS10N_M002090)，SEQ ID NO:27, (28)CXCL5(ACCESS 10N#NM002994) , SEQ ID NO:28, (29)CXCL6(ACCESS10N#NM002993), SEQ ID N0:29, (30)CXCL7(ACCESS10N#NM002704),SEQ ID NO: 30, (31)CXCL8 (IL-8，ACCESS10N#NM000584)，SEQ ID NO:31, (32)CXCR4(ACCESS10N#NM003467) , SEQ ID N0:32, (33) CXCL12 (ACCESS10N_M000609)，SEQ ID NO:33, (34)CXCR5A (ACCESS10N#NM032966), SEQ ID NO:34, (35)CXCR5B(ACCESS10N_M001716)，SEQ ID N0:35, (36) CXCL13 (ACCESS10N_M006419)，SEQ ID NO:36, (37)CXCR6(ACCESS10N#NM006564) , SEQ ID NO:37, (38)CXCL16(ACCESS10N_M022059)，SEQ ID N0:38, (39) CCL16 (ACCESS10N_M004590)，SEQ ID NO:39, (40) CCL25(ACCESS10N#NM_005624.3), SEQ ID NO:40, (41)CCL25-1 (ACCESS10N_M005624)，SEQ ID N0:41, (42) CCL25-2 (ACCESS10N_M148888)，SEQ ID NO:42, (43)CX3CR1 (ACCESS10N#NM001337) , SEQ ID NO:43,和(44)CX3CL1 (ACCESS10N#NM002996), SEQ ID NO:44。
[0219]如下表所示，大多數(shù)的所有腫瘤表達的特定趨化因子可以變化。本申請的方法可專門用于特定患者，這取決于患者自身腫瘤過表達的趨化因子?？梢允褂帽旧暾埖姆椒ㄗR別腫瘤中過表達的特定趨化因子并且施用對抗過表達的趨化因子的抗體。為癌癥患者量身定制的治療是新穎的，并且應用特別有價值。
[0220]表1顯示在所研究的特定腫瘤中過表達的特定趨化因子的不同數(shù)量。
[0221]表1.趨化因子、趨化因子受體和癌癥聯(lián)系(取決于疾病的階段)。
[0222]
【權利要求】
1.一種在受試者中治療癌癥的方法，其包括: 向所述受試者施用治療有效量的抗CCL25抗體、抗CCR9抗體、或它們的組合， 其中，所述癌癥是胚細胞瘤、癌、白血病、淋巴瘤、黑素瘤、骨髓瘤、肉瘤或生殖細胞瘤，以及 其中，所述治療有效量為大約0.5至50mg/kg。
2.權利要求1所述的方法，其中，將所述抗CCL25抗體、或抗CCR9抗體、或它們的組合直接施用到癌組織。
3.權利要求1所述的方法，其中，將所述抗CCL25抗體、或抗CCR9抗體、或它們的組合與化學治療劑一起施用。
4.權利要求1所述的方法，其中，所述癌癥是癌，并且其中，將所述抗CCL25抗體、或所述抗 CCR9 抗體、或它們的組合與選自 CCL1、CCL4、CCL17、CCL19、CCL21、CCL22、CXCLl2,CXCL13、CXCL16、CCR7、CCR8、CXCR4、CXCR5、CXCR6 和 CX3CR1 中的另外的抗趨化因子或抗趨化因子受體的抗體一起施用。
5.權利要求1所述的方法，其中，所述癌癥是黑素瘤，并且其中，將所述抗CCL25抗體、或所述抗CCR9抗體、或它們的組合與選自CCL27、CXCLU CXCL2、CXCL3、CXCL5、CXCL6、CXCL7、CXCL8、CXCLl2, CXCLl3, CXCL16、CX3CL1、CCR10、CXCRl、CXCR2、CXCR4、CXCR5、CXCR6和CX3CR1中的另外的抗趨化因子或抗趨化因子受體的抗體一起施用。
6.權利要求1所述的方法，其進一步包括: 確定所述受試者的CCL25和/或CCR9在組織中表達的水平，以及，如果檢測到CCL25和/或CCR9的水平增加，則向所述受試者施用治療有效量的所述抗CCL25抗體、所述抗CCR9抗體、或它們的組合。
7.一種在受試者中預防或抑制具有CCL25和/或CCR9表達提高的癌細胞的遷移或轉移的方法，其包括: 向受試者施用治療有效量的抗CCL25抗體、或抗CCR9抗體、或它們的組合， 其中，所述治療有效量為大約0.5至50mg/kg。
8.權利要求7所述的方法，其中，所述癌細胞是胚細胞瘤細胞、上皮瘤細胞、白血病細胞、淋巴瘤細胞、黑素瘤細胞、骨髓瘤細胞、肉瘤細胞或生殖細胞瘤細胞。
9.一種提高化學療法的效果的方法，其包括: 向正在進行化療以治療癌癥的受試者施用有效量的抗CCL25抗體、抗CCR9抗體、或它們的組合， 其中，所述有效量在大約0.5和50mg/kg之間。
10.權利要求9所述的方法，其中，所述受試者正在進行化療以治療胚細胞瘤、癌、白血病、淋巴瘤、黑素瘤、骨髓瘤、肉瘤或生殖細胞瘤。
11.一種藥物組合物，其包含: (1)有效量的抗CCL25抗體、或抗CCR9抗體、或它們的組合； (2)有效量的抗CXCL13抗體、或抗CXCR5抗體、或它們的組合；和 (3)藥學上可接受的載體。
12.權利要求11的藥物組合物，其進一步包含: 有效量的抗CXCL16抗體、或抗CXCR6抗體、或它們的組合。
13.一種藥物組合物，其包含: (1)有效量的抗CCL25抗體、或抗CCR9抗體、或它們的組合； (2)有效量的抗CXCL16抗體、或抗CXCR6抗體、或它們的組合；和 (3)藥學上可接受的載體。
14.一種藥物組合物，其包含: 能夠表達下列試劑的表達載體:(I)抑制CCL25和/或CCR9表達的試劑，或(2)抑制CCL25和CCR9間的相互作用的試劑，或(3)抑制CCL25和/或CCR9的生物活性的試劑；和 (3)藥學上可接受的載體。
15.權利要求14所述的藥物組合物，其中，所述試劑是抗CCL25抗體或抗CCR9抗體。
16.—種在受試者中治療癌癥的方法，其包括: 用有效量的CCL25免疫原和/或CCR9免疫原來誘導抑制CCL25和/或CCR9的生物活性的抗體以使受試者免疫， 其中，所述癌癥是胚細胞瘤、癌、白血病、淋巴瘤、黑素瘤、骨髓瘤、肉瘤或生殖細胞瘤。
17.權利要求16所述的方法，其中，所述CCL25免疫原是含有選自SEQID N0:116-SEQID NO: 132中的一種或多種序列的肽。
18.權利要求16所述的方法，其中，所述CCR9免疫原是含有選自SEQID N0:133-SEQID NO: 137中的一種或多種序列的肽。
19.一種在受試者中預防或抑制具有提高的CCL25和/或CCR9表達的癌細胞的遷移或轉移的方法，其包括: 用有效量的CCL25免疫原和/或CCR9免疫原誘導抑制CCL25和/或CCR9的生物活性的抗體以使受試者免疫。
20.一種在受試者中治療癌癥的方法，其包括: 檢測來自所述受試者的生物樣本中的CCL25表達和/或CCR9表達的水平，和 如果在所述生物樣本中檢測到CCL25表達和/或CCR9表達的水平升高，則用有效量的CCL25免疫原和/或CCR9免疫原來誘導抑制CCL25和/或CCR9的生物活性的抗體以使受試者免疫。
21.一種提高化療效果的方法，其包括: 向正在進行化療以治療癌癥的受試者施用有效量的CCL25免疫原和/或CCR9免疫原以誘導抑制CCL25和/或CCR9的生物活性的抗體， 其中，所述癌癥是胚細胞瘤、癌、白血病、淋巴瘤、黑素瘤、骨髓瘤、肉瘤或生殖細胞瘤。
22.—種在受試者中治療癌癥的方法，其包括: 用(I)有效量的CCL25和CCR9免疫原中的一種或多種以及(2)有效量的CXCL13免疫原、CXCR5免疫原、CXCL16免疫原和CXCR6免疫原中的一種或多種使受試者免疫， 其中，所述癌癥是胚細胞瘤、癌、白血病、淋巴瘤、黑素瘤、骨髓瘤、肉瘤或生殖細胞瘤。
【文檔編號】A61P35/02GK103619351SQ201180067126
【公開日】2014年3月5日 申請日期:2011年12月13日 優(yōu)先權日:2010年12月14日
【發(fā)明者】詹姆斯·W·利拉德, 沙伊萊什·辛格, 拉杰什·辛格 申請人:詹姆斯·W·利拉德, 沙伊萊什·辛格, 拉杰什·辛格