專利名稱：預(yù)防奶牛乳房炎用git融合蛋白的制備及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于基因工程領(lǐng)域，涉及一種預(yù)防奶牛乳房炎用GapCid-IsdBid-TRAP (以下簡稱GIT)融合蛋白的制備及應(yīng)用，特備是一種能夠制備停乳鏈球菌、無乳鏈球菌、乳房鏈球菌及金黃色葡萄球菌疫苗的GIT融合蛋白。
背景技術(shù)：
奶牛乳房炎是嚴(yán)重危害奶牛業(yè)的重要疾病，所造成的經(jīng)濟(jì)損失巨大，一直是世界性難題。該病的病因主要是細(xì)菌感染，其中以金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)和鏈球菌感染最為常見，占臨床發(fā)病率的55%_80%。隨著抗生素在細(xì)菌感染治療中的普遍使用，已出現(xiàn)了大量耐藥菌株，致使抗生素治療收效甚微，而且對無抗乳的要求也限制了抗生素的使用。因此，免疫預(yù)防便成為奶牛乳房炎的防治的最佳選擇。隨著研究不斷深入和 大量的臨床實踐證實，傳統(tǒng)疫苗如金黃色葡萄球菌全菌體滅活苗、莢膜多糖結(jié)合苗等不僅保護(hù)效果不理想，而且免疫保護(hù)效果也不穩(wěn)定。近年來研究表明，基因工程亞單位疫苗在預(yù)防金黃色葡萄球菌和鏈球菌感染方面顯現(xiàn)出令人振奮的效果，并使其成為近年來的研究熱點。但由于奶牛乳房炎是個多病原性疾病，單一的金黃色葡萄球菌亞單位苗或某一種鏈球菌亞單位苗都無法滿足臨床需要。為此，我們試圖將幾種亞單位苗混合在一起進(jìn)行免疫接種以做到一針免疫接種起到預(yù)防幾種細(xì)菌感染的效果，研究中發(fā)現(xiàn)可能是亞單位疫苗各成分相互干擾的原因，幾種亞單位苗混合在一起進(jìn)行免疫所產(chǎn)生的免疫保護(hù)作用遠(yuǎn)不及幾種抗原的融合蛋白免疫保護(hù)效果。經(jīng)過對金黃色葡萄球菌保護(hù)性抗原研究證實，金黃色葡萄球菌的TRAP蛋白和IsdB蛋白具有高度保守性和較好的免疫原性，將TRAP和IsdB免疫優(yōu)勢片段(IsdBid)串聯(lián)，所得融合蛋白的免疫保護(hù)作用顯著好于各蛋白單獨免疫接種；研究還證實，停乳鏈球菌(Streptococcus dysgalactiae) GapC蛋白能較好地預(yù)防實驗小鼠感染停乳鏈球菌(Streptococcus dysgalactiae)、無乳鏈球菌(Streptococcus agalactiae)和乳房鏈球菌(Streptococcus uberis)。因此,需要發(fā)明一種能夠綜合以上各種效果的融合蛋白作為疫苗應(yīng)用，防治奶牛乳房炎。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的第一個目的是提供預(yù)防奶牛乳房炎用GIT融合蛋白和其氨基酸序列(SEQ ID No. I )，通過將GapC免疫優(yōu)勢片段(GapCid)和IsdBid-TRAP蛋白進(jìn)行融合，制備出新的GapCid-IsdBid-TRAP融合蛋白，命名為GIT。本發(fā)明的第二個目的是提供編碼GIT的基因和其核苷酸序列(SEQ ID No. 2)。本發(fā)明的第三個目的是提供含有編碼基因的表達(dá)載體GIT_PET32a以及含有表達(dá)載體的宿主細(xì)胞。本發(fā)明的第四個目的是提供GIT的制備方法，即用表達(dá)載體GIT_PET32a轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞進(jìn)行異源表達(dá)，并對表達(dá)蛋白進(jìn)行純化。
本發(fā)明的最后一個目的是提供GIT在制備停乳鏈球菌、無乳鏈球菌、乳房鏈球菌及金黃色葡萄球菌疫苗中的應(yīng)用。本發(fā)明通過以下技術(shù)方案來實現(xiàn)本發(fā)明的GIT融合蛋白，是由停乳鏈球菌(Streptococcus dysgalactiae)的 GapC 免疫優(yōu)勢片段、金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)的IsdB免疫優(yōu)勢片段和TRAP融合而成。首先以含有停乳鏈球菌GapC基因的重組表達(dá)質(zhì)粒為模板或以提取的停乳鏈球菌DNA為模板，通過PCR方法擴(kuò)增獲得GapC基因，然后通過生物信息學(xué)分析將GapC分為2個片段，并通過免疫原性分析和免疫保護(hù)作用研究，選擇和確定GapC免疫優(yōu)勢區(qū)(GapCid)。在此基礎(chǔ)上，通過生物信息學(xué)方法設(shè)計新融合蛋白順序，通過重疊延伸PCR方法將GapCid與 IsdBid-TRAP進(jìn)行基因融合，并將該融合基因插入到表達(dá)載體pET-32a，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后可獲得表達(dá)的可溶性融合蛋白GIT。用Ni-NTA丨iis _ RindR Resin蛋白純化系統(tǒng)純化表達(dá)的GIT融合蛋白，并將純化后的融合蛋白與弗氏佐劑混合制備疫苗免疫動物，然后進(jìn)行免疫細(xì)胞分化、抗體和細(xì)胞因子水平檢測以及采用不同菌種(金黃色葡萄球菌、停乳鏈球菌、無乳鏈球菌和乳房鏈球菌)進(jìn)行攻毒實驗以驗證功能。采用上述技術(shù)方案的積極效果采用本發(fā)明的GIT融合蛋白制得的疫苗免疫小鼠后，檢測體液和細(xì)胞免疫應(yīng)答水平，并進(jìn)行攻毒，結(jié)果證實本發(fā)明融合表達(dá)的GIT蛋白具有良好的免疫原性，能有效地預(yù)防金黃色葡萄球菌、停乳鏈球菌、無乳鏈球菌和乳房鏈球菌感染，免疫范圍大，可用于預(yù)防奶牛乳房炎；另外，本發(fā)明的GIT融合蛋白在保證免疫保護(hù)作用的同時，簡化了制備過程和實際生產(chǎn)的免疫程序，縮短了融合蛋白的肽鏈長度，增強(qiáng)融合蛋白的表達(dá)，在新型疫苗的開發(fā)應(yīng)用方面具有重要的價值。


圖I為gapCl和gapC2的PCR產(chǎn)物的電泳分析。其中，I :gapCl的PCR產(chǎn)物，450bp ；
2gapC2 的 PCR 產(chǎn)物，555bp ；M DNA Marker DL2000。圖2為gapCl_pMD18和gapC2_pMD18克隆載體重組質(zhì)粒的酶切鑒定和PCR鑒定。其中，M:DNA Marker DL2000 ；1 :gapCl_pMD18 重組質(zhì)粒PCR產(chǎn)物，450bp ；2 :gapCl_pMD18 重組質(zhì)粒酶切結(jié)果；3 :gapC2-pMD18重組質(zhì)粒PCR產(chǎn)物，555bp ；4 :gapC2_pMD18重組質(zhì)粒酶切結(jié)果。圖3為gapCl_pET32a和gapC2_pET32a表達(dá)載體重組質(zhì)粒的酶切鑒定和PCR鑒定。圖 A gapCl-pET32a 和 gapC2-pET32a 質(zhì)粒酶切和 PCR 鑒定。M DNA Marker DL2000 ；I gapCl-pET32a重組質(zhì)粒酶切結(jié)果；2 gapCl-pET32a重組質(zhì)粒PCR產(chǎn)物，450bp ；3 gapC2-pET32a重組質(zhì)粒酶切結(jié)果；4 gapC2-pET32a重組質(zhì)粒PCR產(chǎn)物，555bp。圖B gapCl-pET32a 和 gapC2_pET32a 質(zhì)粒酶切和 PCR 鑒定。M =DNAMarker DL2000 ；NC 陰性對照；1 gapC-pET32a重組質(zhì)粒PCR產(chǎn)物，1005bp ；2 gapC-pET32a重組質(zhì)粒酶切結(jié)果。圖4為重組GapC、GapCl和GapC2蛋白表達(dá)及純化的SDS-PAGE電泳結(jié)果。圖AiGapCl圖B:GapC2圖CiGapC0 0:未誘導(dǎo)的重組菌；M:蛋白質(zhì)Marker ;1_5 :IPTG分別誘導(dǎo)l_5h的重組菌；P :蛋白純化結(jié)果。圖5為全菌血清Western Blotting結(jié)果。圖A停乳鏈球菌LS0312株抗血清蛋白印跡結(jié)果；圖B無乳鏈球菌抗血清蛋白印跡結(jié)果；圖C乳房鏈球菌SD0306株抗血清蛋白印
跡結(jié)果。圖6為重組蛋白的免疫保護(hù)結(jié)果。圖A實驗動物S. dysgalactiae LS0312株攻毒后存活數(shù)。圖B實驗動物S. agalactiae LS0310株攻毒后存活數(shù)；圖C實驗動物S. uberisSD0306株攻毒后存活數(shù)。圖7為小鼠免疫血清中IgG抗體消長曲線。圖A小鼠免疫血清中抗GapC IgG抗體消長曲線；圖B小鼠免疫血清中抗GapCl IgG抗體消長曲線；圖(小鼠免疫血清中抗GapC2IgG抗體消長曲線。圖8為GapC-IsdB-TRAP融合蛋白擴(kuò)增方法及引物示意圖。圖9為gapCl與剛性linker融合和擴(kuò)增過程結(jié)果。A圖帶有編碼linker基因前 50個核苷酸的gapCl的PCR擴(kuò)增結(jié)果。NC :陰性對照；1 :帶有編碼linker基因前50個核苷酸的 gapCl 的 PCR產(chǎn)物(500bp);M :DNA Marker DL2000 plus II。B 圖:帶有編碼 linker基因的gapCl的PCR擴(kuò)增結(jié)果。NC :陰性對照；1 :帶有編碼linker基因全長(+75bp)的gapCl 的 PCR 產(chǎn)物(525bp) ；2:帶有編碼 linker 基因(+50bp)的 gapCl 的 PCR 產(chǎn)物，525bp(作為 I 對照)；M DNA Marker ；DL2000 plus II。C 圖重組克隆質(zhì)粒 gapCl-linker-pMD18的PCR鑒定和雙酶切鑒定NC :陰性對照I :重組質(zhì)粒的PCR鑒定結(jié)果(525bp) ；2 :重組質(zhì)粒雙酶切鑒定結(jié)果；M DNA Marker DL2000 plus II。
圖10為重組克隆質(zhì)粒IsdBid-TRAP_pMD18的PCR鑒定和雙酶切鑒定。NC :陰性對照；1 :重組質(zhì)粒的PCR鑒定結(jié)果(1245bp) ；2 :重組質(zhì)粒雙酶切鑒定結(jié)果。圖11為GIT融合基因的連接和擴(kuò)增及TA克隆結(jié)果。圖A:GIT的PCR擴(kuò)增結(jié)果。NC:陰性對照 I :GIT 的 PCR產(chǎn)物(1770bp);M :DNA Marker III。圖 B重組克隆質(zhì)粒GIT_pMD18的PCR鑒定和雙酶切鑒定。NC :陰性對照；1 :重組質(zhì)粒的PCR鑒定結(jié)果(1770bp);2 :重組質(zhì)粒雙酶切鑒定結(jié)果。圖12為GIT-pET32表達(dá)載體重組質(zhì)粒的酶切鑒定和PCR鑒定。M DNA Marker IV ；NC:陰性對照；1 GIT-pET32a重組質(zhì)粒PCR產(chǎn)物，1770bp ；2 GIT-pET32a重組質(zhì)粒酶切結(jié)果。圖13為重組TRAP全蛋白、IsdB全蛋白和GIT蛋白表達(dá)及純化的SDS-PAGE電泳結(jié)果。圖A = TRAP全蛋白圖B=IsdB全蛋白圖C:GIT ;0:未誘導(dǎo)的重組菌；M:蛋白質(zhì)Marker; 1-6 =IPTG分別誘導(dǎo)l_6h的重組菌；P :蛋白純化結(jié)果。圖14為鏈球菌全菌血清Western blotting結(jié)果。圖A :停乳鏈球菌LS0312株抗血清蛋白印跡結(jié)果；圖B :無乳鏈球菌抗血清蛋白印跡結(jié)果；圖C :乳房鏈球菌SD0306株抗血清蛋白印跡結(jié)果。圖D金黃色葡萄球菌8511-23-1株抗血清蛋白印跡結(jié)果。圖15為圖3-11重組蛋白疫保護(hù)結(jié)果。圖A實驗動物S. dysgalactiae LS0312株攻毒后存活數(shù)。圖B實驗動物S. agalactiae LS0310株攻毒后存活數(shù)。圖C實驗動物S. uberis SD0306株攻毒后存活數(shù)。圖D實驗動物S. aureus 8511-32-1株攻毒后存活數(shù)。圖16為流式細(xì)胞術(shù)檢測T細(xì)胞分化檢測結(jié)果。圖17為免疫組及對照組鼠淋巴細(xì)胞細(xì)胞因子含量對比(SFC)。圖18為小鼠免疫血清中IgG抗體消長曲線。圖A :小鼠免疫血清中抗IsdB IgG抗體消長曲線。圖B :小鼠免疫血清中抗TRAP IgG抗體消長曲線。圖C :小鼠免疫血清中抗GapC IgG抗體消長曲線。
具體實施例方式本發(fā)明中生物材料的來源說明I、菌種無乳鏈球菌(S.agalactiae )LS0310,停乳鏈球菌(S. dysgalactiae)LS0312 株,乳房鏈球菌(S. uberis) SD0306株，無乳鏈球菌_停乳鏈球菌_乳房鏈球菌GapC蛋白的表達(dá)與免疫原性研究，車車，碩士論文，授予單位黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)，導(dǎo)師朱戰(zhàn)波教授，
公開日期2009年,并由申請人保證從本申請日起二十年內(nèi)向公眾發(fā)放該生物材料；金黃色葡萄球菌(S. aureus) HLJ/855/23-1株，金黃色葡萄球菌IsdA蛋白免疫保護(hù)性研究，王喆，碩士論文，授予單位黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)，導(dǎo)師崔玉東教授，
公開日期2010年。并由申請人保證從本申請日起二十年內(nèi)向公眾發(fā)放該生物材料。2、載體(I)含有S. dysgalactiae gapC_pQE_30質(zhì)粒大腸桿菌已在中國專利(申請?zhí)?01110270934. 3，申請日 2011. 09. 14，申請公布日 2012. 01. 04，申請公布號 CN102304174A)的專利文獻(xiàn)中公開。(2)含有IsdBid-TRAP_pET32a質(zhì)粒的大腸桿菌已在中國專利(申請?zhí)?01110231144. 4，申請日 2011. 08. 12，申請公布日 2011. 12. 14，申請公布號 CN102276730A)的專利文獻(xiàn)中公開。(3) pET-32a原核表達(dá)載體購自TaKaRa寶生物工程(大連)有限公司。(4) pMD18-T載體質(zhì)粒購自TaKaRa寶生物工程(大連)有限公司。3、引物本發(fā)明中的引物為自行設(shè)計并送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。4、作為感受態(tài)細(xì)胞的大腸桿菌Match I和大腸桿菌rosetta (DE3)購自博美科生物技術(shù)有限公司。下面結(jié)合實施例對本發(fā)明做進(jìn)一步說明，但不應(yīng)理解為對本發(fā)明的限制。實施例I本實施例說明構(gòu)建含有g(shù)apCl和gapC2的中間質(zhì)粒,具體步驟如下I、根據(jù)已發(fā)表的gapC基因序列，將該基因分為兩個片段，序列如SEQ ID No. 3和SEQ ID No. 4所示，gapCl和gapC2的氨基酸序列如SEQ ID No. 5和SEQ ID No. 6所示，應(yīng)用01igo6. 0及Gene Runner軟件設(shè)計兩對PCR引物分別命名F1、R1 (用于擴(kuò)增gapCl基因片段);F2、R2 (用于擴(kuò)增gapC2基因片段)。引物的編碼、引物位置、序列及擴(kuò)增片段長度見表I。在用于擴(kuò)增gapCl基因片段的上游引物引入BamH I限制性酶切位點，在下游引物引AHind III限制性酶切位點，用于擴(kuò)增gapC2基因片段的上游引物引入BamH I限制性酶切位點，在下游引物引入Sal I限制性酶切位點(下劃線所示)。表I引物的編碼、序列、擴(kuò)增片段長度
權(quán)利要求
1.一種預(yù)防奶牛乳房炎用GIT融合蛋白，其具有SEQ ID No. I所示的氨基酸序列，或該序列經(jīng)替換、缺失或添加一個或幾個氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列。
2.編碼權(quán)利要求I所述的GIT融合蛋白的基因，其具有SEQID No. 2所示的核苷酸序列。
3.含有權(quán)利要求2所述基因的表達(dá)載體GIT-pET32a。
4.含有權(quán)利要求3所述的表達(dá)載體的宿主細(xì)胞。
5.GIT融合蛋白的制備方法，包括用權(quán)利要求3的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化到權(quán)利要求4所述的宿主細(xì)胞進(jìn)行異源表達(dá)，并對表達(dá)蛋白進(jìn)行純化。
6.GIT融合蛋白在制備停乳鏈球菌、無乳鏈球菌、乳房鏈球菌及金黃色葡萄球菌疫苗中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種預(yù)防奶牛乳房炎用GIT融合蛋白，其具有SEQ ID No.1所示的氨基酸序列，或該序列經(jīng)替換、缺失或添加一個或幾個氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列。本發(fā)明還提供了該蛋白的核苷酸序列以及制備方法和應(yīng)用。該蛋白具有良好的免疫原性，能有效地預(yù)防金黃色葡萄球菌、停乳鏈球菌、無乳鏈球菌和乳房鏈球菌感染，免疫范圍大，可用于預(yù)防奶牛乳房炎；另外，本發(fā)明的GIT融合蛋白在保證免疫保護(hù)作用的同時，簡化了制備過程和實際生產(chǎn)的免疫程序，縮短了融合蛋白的肽鏈長度，增強(qiáng)融合蛋白的表達(dá)，在新型疫苗的開發(fā)應(yīng)用方面具有重要的價值。
文檔編號A61K39/09GK102731660SQ201210199900
公開日2012年10月17日 申請日期2012年6月18日 優(yōu)先權(quán)日2012年6月18日
發(fā)明者孫虎男, 崔玉東, 朱戰(zhàn)波, 樊自堯 申請人:黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)