eIF6用于檢測、預(yù)防或治療運(yùn)動(dòng)性疲勞或記憶力減退的用途
【專利摘要】本發(fā)明涉及β4整合素結(jié)合蛋白(eIF6)，或具有eIF6蛋白與配體的結(jié)合部位和/或eIF6蛋白的功能部位的氨基酸序列的蛋白或eIF6蛋白衍生物，包含eIF6基因核苷酸序列的核酸分子或有效抑制eIF6基因表達(dá)的核酸分子以及包含所述核酸分子的DNA表達(dá)載體在制備用于檢測、預(yù)防或治療運(yùn)動(dòng)性疲勞、記憶力減退或相關(guān)疾病的藥物以及相關(guān)疾病的檢測試劑盒中的用途。
【專利說明】e IF6用于檢測、預(yù)防或治療運(yùn)動(dòng)性疲勞或記憶力減退的用途
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及β 4 整合素結(jié)合蛋白(Integrin beta 4 binding protein, eIF6),或具有eIF6蛋白與配體的結(jié)合部位和/或eIF6的功能部位的氨基酸序列的蛋白或eIF6蛋白衍生物，包含eIF6基因核酸序列的核酸分子或有效抑制eIF6基因表達(dá)的核酸分子，以及包含所述核酸分子的DNA表達(dá)載體，用于檢測、預(yù)防或治療運(yùn)動(dòng)性疲勞、記憶力減退或記憶障礙的用途。
【背景技術(shù)】
[0002]一、運(yùn)動(dòng)性疲勞
[0003]運(yùn)動(dòng)性疲勞主要是指由運(yùn)動(dòng)引起身體能力下降的現(xiàn)象。1982年第五屆國際運(yùn)動(dòng)生化會(huì)議將疲勞的定義統(tǒng)一，運(yùn)動(dòng)性疲勞是“機(jī)體生理過程不能持續(xù)其機(jī)能在一定水平或和各器官不能維持預(yù)定的運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度”。
[0004]目前，按疲勞發(fā)生的部位，習(xí)慣上把運(yùn)動(dòng)性疲勞分為中樞疲勞和外周疲勞兩部分。其中中樞疲勞產(chǎn)生的機(jī)制包括:
[0005]I) 5-羥色胺(5-HT):5-HT是中樞神經(jīng)系統(tǒng)的一種抑制性遞質(zhì)，研究也證實(shí)，動(dòng)物進(jìn)行長時(shí)間運(yùn)動(dòng)過程中大腦5-HT含量明顯增加[1，2]。
[0006]2)多巴胺(DA)和去甲腎上腺素(NE):研究結(jié)果顯示，在運(yùn)動(dòng)過程中中腦、海馬、紋狀體和下丘腦的DA代謝增強(qiáng)[3]。Bailey等發(fā)現(xiàn)大鼠的疲勞與腦干和中腦中多巴胺的合成和代謝的減少有關(guān)，當(dāng)腦DA合成和代謝得以維持時(shí)，疲勞就會(huì)延遲。
[0007]3)乙酰膽堿(Ach):近年來，有推測認(rèn)為耐力運(yùn)動(dòng)中疲勞可能是由于運(yùn)動(dòng)中膽堿利用的衰竭、排空降低了膽堿能系統(tǒng)的活動(dòng)而引發(fā)的[4]。Wurtman等實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，運(yùn)動(dòng)員馬拉松跑后，血漿膽堿水平下降約40%，與進(jìn)食無膽堿的食物有同樣效果[4]，暗示當(dāng)中樞Ach濃度下降時(shí)，中樞疲勞就會(huì)發(fā)生。
[0008]4)谷氨酸，Y-氨基丁酸(GABA):GABA是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中主要的抑制性氨基酸，谷氨酸(Glu)是主要的興奮性氨基酸。Coiix)研究發(fā)現(xiàn)GABA可抑制腺垂體對(duì)運(yùn)動(dòng)的反應(yīng)，減弱機(jī)體對(duì)運(yùn)動(dòng)的應(yīng)激，降低機(jī)體的運(yùn)動(dòng)能力[5]。在正常生理情況下，腦內(nèi)興奮性氨基酸與抑制性氨基酸保持平衡。當(dāng)腦內(nèi)谷氨酸含量升高時(shí)，表示大腦皮層興奮過程占優(yōu)勢(shì)；當(dāng)腦內(nèi)Y-氨基丁酸含量升高時(shí)，表示大腦皮層抑制過程占優(yōu)勢(shì)，此時(shí)易出現(xiàn)疲勞。
[0009]5)氨濃度:運(yùn)動(dòng)時(shí)，肌肉可產(chǎn)生氨并釋放到血液。氨可通過血腦屏障，具有毒害作用。腦氨增多可引起多種酶活性及ATP再合成速率下降。氨還可改變腦膜對(duì)氨基酸的通透性，影響各種神經(jīng)遞質(zhì)的代謝，因此氨可能是中樞疲勞的重要原因之一。
[0010]二、學(xué)習(xí)記憶
[0011]學(xué)習(xí)記憶是大腦最基本、最重要的高級(jí)神經(jīng)功能之一，是衡量人類智能發(fā)育的重要指標(biāo)。多年來人們對(duì)學(xué)習(xí)與記憶在腦內(nèi)的定位問題進(jìn)行了大量的研究，目前認(rèn)為邊緣系統(tǒng)中的海馬是學(xué)習(xí)、記憶等高級(jí)神經(jīng)活動(dòng)的重要部位，海馬與學(xué)習(xí)記憶有著密切的聯(lián)系[6，7]。
[0012]研究發(fā)現(xiàn)給予海馬短暫重復(fù)的刺激，會(huì)引起突觸傳遞增強(qiáng)，在無損傷的動(dòng)物體實(shí)驗(yàn)中，增強(qiáng)效應(yīng)將維持?jǐn)?shù)小時(shí)，甚至數(shù)周，這種突觸傳遞的增強(qiáng)被稱作突觸傳遞長時(shí)程增強(qiáng)(Long-term potentiation, LTP)。海馬內(nèi)三條主要的興奮性突觸都能產(chǎn)生長時(shí)程增強(qiáng)(LTP) ο Richard Morris 于 1986 年首次證明長時(shí)程增強(qiáng)(Long-term potentiation, LTP)是體內(nèi)記憶形成所必需的[8]。Susumu Tonegawa于1996年證明海馬CAl區(qū)是活體老鼠空間記憶形成的關(guān)鍵[9]，海馬NMDA受體活性的增強(qiáng)能產(chǎn)生增強(qiáng)的LTP和空間學(xué)習(xí)的整體提高。2001年，Joe Tsien培育了海馬中高表達(dá)NR2B亞基而具有NMDA受體功能增強(qiáng)品系的Doogie小鼠[10] ,Doogie小鼠不僅長時(shí)程增強(qiáng)(Long-term potentiation,LTP)較強(qiáng)而且在空間學(xué)習(xí)任務(wù)中也表現(xiàn)出色，進(jìn)一步加強(qiáng)了 LTP對(duì)海馬依賴性記憶形成中的重要性。目前認(rèn)為，LTP產(chǎn)生的分子機(jī)制為興奮性神經(jīng)遞質(zhì)谷氨酸(Glul)和其受體KA/AMPA結(jié)合，激活了 N2甲基2D2天門冬氨酸(NMDA)受體的離子通道進(jìn)而產(chǎn)生的[11]。
[0013]三、eIF6的基本特征
[0014]eIF6 基因(SEQ ID NO 2，NCBI genebank 登記號(hào)為 NM-002212)在真核生物中高度保守[12，13]，人和小鼠eIF6氨基酸序列有98%序列同源性。在人類基因組中，eIF6定位于20號(hào)染色體的長臂20qll.2區(qū)，5’端缺少TATA啟動(dòng)子結(jié)合區(qū)，CpG島，mRNA全長1108bp，含有7個(gè)外顯子和6個(gè)內(nèi)含子，開放讀框含有735個(gè)核苷酸，245個(gè)氨基酸，分子量大小為27KD[14]。eIF6蛋白分布廣泛，研究證實(shí)，在上皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞、激活的T細(xì)胞、活化的肥大細(xì)胞及肌肉組織纖維中均有eIF6蛋白的表達(dá)，也有研究證實(shí)只要表達(dá)α6β4整合素的細(xì)胞均表達(dá)eIF6[15]。細(xì)胞水平，eIF6蛋白表達(dá)在胞漿(中間絲附近)和胞核(主要位于核仁外周)[16]。
[0015]eIF6的生物學(xué)功能包括:
[0016]I)參與調(diào)控蛋白合成:在真核生物翻譯起始階段，eIF6促進(jìn)40s亞基和60s亞基結(jié)合形成80s亞基，從而啟動(dòng)蛋白質(zhì)的翻譯[17-20]。敲除eIF6基因后核糖體60s亞基丟失，證明其對(duì)核糖體60s的形成具有重要的作用[16]。并且對(duì)胞外信號(hào)的反應(yīng)中eIF6是作為最早的真核細(xì)胞翻譯起始因子參與調(diào)節(jié)蛋白的翻譯[21]。另一方面，eIF6與RISC (RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合體)結(jié)合，特異性地促進(jìn)相應(yīng)microRNA的作用，從轉(zhuǎn)錄水平上干擾mRNA形成，抑制其對(duì)應(yīng)靶蛋白的表達(dá)，反之敲除eIF6后則會(huì)解除miciORNA對(duì)靶蛋白的表達(dá)抑制作用而促進(jìn)革巴蛋白的表達(dá)[22,23]。
[0017]2)參與調(diào)節(jié)細(xì)胞黏附及細(xì)胞骨架的形成:整合素家族為黏附分子受體，參與介導(dǎo)細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)、細(xì)胞與細(xì)胞間的相互作用。細(xì)胞間的黏附作用有接合作用、橋粒連接、半橋粒連接等，半橋粒連接的細(xì)胞外基質(zhì)主要為層黏蛋白，β 4整合素為層黏蛋白受體，故其與橋粒、半橋粒的形成有密切的聯(lián)系。eIF6為β 4整合素結(jié)合蛋白，與中間絲和α6β4整合素的胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域的功能區(qū)結(jié)合，作為兩者的橋梁介導(dǎo)半橋粒的形成，介導(dǎo)細(xì)胞的黏附功能[24]。此外，eIF6還存在于核基質(zhì)中，通過與核基質(zhì)、中間絲等細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)的連接，參與了細(xì)胞骨架的形成。有實(shí)驗(yàn)已證明eIF6在中間絲和核基質(zhì)上高表達(dá)[15]，并且eIF6還可以調(diào)節(jié)Wnt信號(hào)通路中的β-聯(lián)蛋白的表達(dá)，從而影響細(xì)胞骨架[25]。
[0018]3)與腫瘤發(fā)生和轉(zhuǎn)移的關(guān)系:腫瘤最明顯的特點(diǎn)是細(xì)胞增殖異常，凋亡抑制，且容易轉(zhuǎn)移。有實(shí)驗(yàn)證實(shí)eIF6作為翻譯調(diào)節(jié)因子參與了細(xì)胞的增殖。在對(duì)分化誘導(dǎo)前后的肝癌細(xì)胞核基質(zhì)成分進(jìn)行亞細(xì)胞蛋白組學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，eIF6在分化后的細(xì)胞中高表達(dá)，提示可能參與癌細(xì)胞分化[26]。eIF6在正常粘膜細(xì)胞可以檢測到，但是在癌細(xì)胞中過表達(dá)，如在結(jié)直腸癌中eIF6的表達(dá)上調(diào)[27]，并且在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶中尤為明顯[28]，故而提示eIF6的高表達(dá)可能參與了腫瘤的增殖和轉(zhuǎn)移。[0019]從上面可以看出，eIF6在核糖體合成、細(xì)胞骨架以及腫瘤的增殖分化和轉(zhuǎn)移中具有重要的作用，但是目前對(duì)于eIF6蛋白的相關(guān)文獻(xiàn)較少，尤其是對(duì)于其與學(xué)習(xí)記憶功能的關(guān)系和在對(duì)抗記憶力減退或記憶障礙方面的作用還未見報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0020]為解決現(xiàn)有技術(shù)中存在的上述問題，做出了本發(fā)明。
[0021]在本發(fā)明中，β4整合素結(jié)合蛋白eIF6(下面簡稱為“eIF6蛋白”)涵蓋具有SEQID NO:1所示的氨基酸序列、在SEQ ID NO:1的序列的基礎(chǔ)上發(fā)生1_3個(gè)氨基酸殘基保守置換的同源氨基酸序列或與SEQ ID NO:1的序列具有至少80%以上的同源性且能與β 4整合素，優(yōu)選α6β 4整合素特異性結(jié)合的氨基酸序列的多肽。因此，在本發(fā)明中當(dāng)提及eIF6蛋白時(shí)，并不僅僅特指具有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的野生型eIF6蛋白本身，而是涵蓋來源于各種物種的eIF6蛋白的各種衍生物或同源物。
[0022]同樣，下述的“eIF6核酸分子”涵蓋包含SEQ ID NO:2所示的eIF6基因核酸序列、與SEQ ID NO:2的序列具有至少80%以上同源性的核酸序列的核酸分子。有效抑制eIF6基因表達(dá)的核酸分子(下面有時(shí)簡稱為“eIF6抑制核酸分子”)是指包含以eIF6基因序列(例如，SEQ ID NO:2所示的小鼠eIF6基因核酸序列)為靶序列的有效抑制eIF6基因表達(dá)的核酸序列的核酸分子(例如，反義核酸分子、小RNA(miRNA)、微小非編碼RNA (tncRNA)、小調(diào)節(jié) RNA (smRNA)、短干擾 RNA (siRNA)等。
[0023]此外，在本發(fā)明中，當(dāng)提及“eIF6基因”時(shí)，其不限于鼠eIF6基因，而是泛指各種種屬來源的eIF6基因，因?yàn)樵谶M(jìn)化中，eIF6基因在真核細(xì)胞中是非常保守的。
[0024]因此，在第一個(gè)方面，本發(fā)明提供了 eIF6蛋白、eIF6核酸分子或eIF6抑制核酸分子以及包含所述核酸分子的DNA載體在制備用于檢測、預(yù)防和/或治療運(yùn)動(dòng)性疲勞、記憶力減退或記憶障礙及其相關(guān)疾病的藥物中的用途。
[0025]在本發(fā)明中，包含核酸分子的DNA表達(dá)載體包括但不限于病毒載體、曬菌體載體、大腸桿菌載體、質(zhì)粒載體、藍(lán)藻穿梭載體、農(nóng)桿菌載體、酵母載體等原核和真核基因表達(dá)載體，病毒載體優(yōu)選本領(lǐng)域中常用的腺病毒載體或慢病毒載體等。
[0026]在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，以eIF6基因序列為靶序列的有效抑制eIF6基因表達(dá)的核酸分子是長度在20~30個(gè)，優(yōu)選21~27個(gè)核苷酸分子范圍內(nèi)的包含SEQ ID NO:15或和SEQ ID NO:16所示的序列的siRNA分子。
[0027]在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，以eIF6基因序列為靶序列的有效抑制eIF6基因表達(dá)的核酸分子是長度在20~40個(gè)，優(yōu)選21~28個(gè)核苷酸分子范圍內(nèi)的包含SEQ ID NO:3-8所不的序列中的任一個(gè)序列的核酸分子。
[0028]在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述記憶力減退或記憶障礙由與海馬功能受損相關(guān)的疾病或功能障礙導(dǎo)致。
[0029]在本發(fā)明中，所述記憶力減退或記憶障礙與下列因素有關(guān):衰老、神經(jīng)退行性疾病、抑郁癥、腦部腫瘤、糖尿病、阿爾茲海默病、帕金森病、腦動(dòng)脈硬化、慢性鼻竇炎、老年癡呆癥、匹克氏病(Pick’ s disease)、亨廷頓病、肝豆?fàn)詈俗冃?、精神分裂癥、肝豆?fàn)詈俗冃?、精神分裂癥、癲癇、睡眠障礙、慢性酒精中毒、甲狀腺功能低下或神經(jīng)性梅毒等(上述生理因素、疾病、疾病狀態(tài)或功能障礙在本發(fā)明中也可以稱為“與記憶力減退或記憶障礙相關(guān)的因素、疾病或疾病狀態(tài)”)。
[0030]在第二個(gè)方面，本發(fā)明涉及一種用于檢測運(yùn)動(dòng)性疲勞、記憶力減退或記憶障礙的試劑盒，所述試劑盒包括能與eIF6蛋白結(jié)合的配體或抗體(包括但不限于多克隆抗體、單克隆抗體、嵌合抗體、人源化抗體、單鏈抗體等或其功能片段)，與所述配體或抗體綴合(或偶聯(lián))或不綴合(或不偶聯(lián))的可檢測標(biāo)記物(例如，放射性同位素標(biāo)記物、可顯色物質(zhì)(例如，辣根過氧化物酶)、熒光物質(zhì)(例如熒光素)、化學(xué)發(fā)光團(tuán)或其他生物發(fā)光物質(zhì)(例如，水母發(fā)光蛋白)，和/或顯色試劑或顯色底物(例如辣根過氧化物酶底物)，以及適宜的稀釋劑、緩沖劑、洗滌劑、檢測載體(如檢測板、試紙條等)等。[0031]在第三個(gè)方面，本發(fā)明涉及用于減輕運(yùn)動(dòng)性疲勞、增強(qiáng)記憶力或預(yù)防或治療上面提及的與所述記憶力減退或記憶障礙有關(guān)的因素或疾病的藥物組合物，所述組合物包含治療有效量的eIF6蛋白抗體(包括但不限于多克隆抗體、單克隆抗體、嵌合抗體、人源化抗體、單鏈抗體等或其功能片段)、eIF6抑制核酸分子或包含所述eIF6抑制核酸分子的DNA表達(dá)載體，和適宜量的一種或多種藥用輔料。
[0032]在第四個(gè)方面，本發(fā)明涉及減輕運(yùn)動(dòng)性疲勞、增強(qiáng)記憶力或預(yù)防或治療上面提及的與所述記憶力減退或記憶障礙有關(guān)的因素或疾病的方法，所述方法包括向需要所述預(yù)防或治療的受試者施用治療有效量的eIF6蛋白抗體、eIF6抑制核酸分子或包含所述eIF6抑制核酸分子的DNA表達(dá)載體，所述受試者是哺乳動(dòng)物，優(yōu)選人。
[0033]本領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)該理解，本發(fā)明的eIF6蛋白抗體或包含eIF6蛋白抗體的藥物組合物、eIF6抑制核酸分子或包含eIF6抑制核酸分子的藥物組合物可以局部給藥，也可以通過口服、靜脈內(nèi)注射、肌內(nèi)注射等常規(guī)施用方式施用；特別地，優(yōu)選它們通過局部定向給藥，尤其是腦室內(nèi)給藥(根據(jù)需要可以海馬局部給藥)，更優(yōu)選通過本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的靶向遞送方式給藥。另外，本領(lǐng)域技術(shù)人員通過常規(guī)試驗(yàn)?zāi)軌蚍謩e確定eIF6蛋白抗體或包含eIF6蛋白抗體的藥物組合物、eIF6抑制核酸分子或包含eIF6抑制核酸分子的藥物組合物的劑量水平(例如，I μ g~100mg/kg體重)。應(yīng)該理解,關(guān)于任何具體受試者的具體劑量水平依賴于多種因素，包括受試者的年齡、體重、一般健康狀態(tài)、性別、飲食、施用時(shí)間、施用途徑和排泄率、藥物聯(lián)合和經(jīng)歷治療的具體疾病的嚴(yán)重性等。此外，eIF6蛋白抗體或包含eIF6蛋白抗體的藥物組合物、eIF6抑制核酸分子或包含eIF6抑制核酸分子的藥物組合物還可以與其記憶力減退抑制劑或記憶增強(qiáng)劑同時(shí)、或間隔一定時(shí)間進(jìn)行施用。
[0034]另外，要說明的是，在本發(fā)明中“eIF6蛋白”、“eIF6核酸分子”或“eIF6抑制核酸分子”的來源不限于鼠，還可以來自哺乳動(dòng)物，優(yōu)選人。通過clustalW2序列比對(duì)顯示，發(fā)現(xiàn)eIF6基因在真核細(xì)胞中序列高度保守。人與小鼠eIF6氨基酸序列有98%同源性(見圖
7)，人和小鼠eIF6核苷酸序列高度保守，有91%同源性(見圖8)。因此可以預(yù)期，各種真核來源的eIF6蛋白或eIF6核酸分子均可以實(shí)現(xiàn)本發(fā)明。
[0035]本發(fā)明的有益效果:
[0036]1.本發(fā)明通過Morris (Morris water maze,MWM)水迷宮系統(tǒng)檢測發(fā)現(xiàn)eIF6敲基因小鼠有較強(qiáng)學(xué)習(xí)和空間定位能力。
[0037]2.通過免疫組織化學(xué)方法顯示，eIF6蛋白在大腦皮層、海馬及其周邊組織的神經(jīng)元和神經(jīng)節(jié)中的過度表達(dá)與記憶力下降或記憶障礙有關(guān)，而eIF6蛋白的低表達(dá)則是具有明顯增強(qiáng)學(xué)習(xí)記憶作用。
[0038]3.通過轉(zhuǎn)棒式疲勞儀測試，發(fā)現(xiàn)eIF6敲基因小鼠有較強(qiáng)平衡能力和抗疲勞傾向，提示敲基因小鼠有較強(qiáng)延緩疲勞出現(xiàn)能力。
[0039]4.基于本發(fā)明的發(fā)現(xiàn)，可以通過逆轉(zhuǎn)錄定量PCT等技術(shù)篩選出了特異性抑制中樞神經(jīng)系統(tǒng)或甚至是海馬eIF6基因表達(dá)的病毒RNA干擾載體或siRNA分子，從而可以用于對(duì)抗運(yùn)動(dòng)性疲勞和/或記憶力減退的癥狀及其相關(guān)疾病或功能障礙。
[0040]5.eIF6基因在真核細(xì)胞中序列高度保守，因此除了小鼠以外，在其他物種如哺乳動(dòng)物，例如人中，eIF6抑制性病毒RNA干擾載體和siRNA分子同樣可以產(chǎn)生類似的效果。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0041]從下面結(jié)合附圖的詳細(xì)描述中，本發(fā)明的上述特征和優(yōu)點(diǎn)將更明顯，其中:
[0042]圖1.野生型和eIF6敲基因鼠曠場測試。A:小鼠在曠場中央?yún)^(qū)域停留時(shí)間。B:小鼠在曠場中央?yún)^(qū)域走過路程。C:小鼠在曠場中30分鐘內(nèi)跳躍次數(shù)。D:小鼠在曠場中走過的總路程。10-12周雄性小鼠，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物野生型12只，敲基因小鼠13只，*P < 0.05,**p
<0.01。
[0043]圖2.野生型和eIF6敲基因鼠在轉(zhuǎn)棒式疲勞儀停留時(shí)間。A:單只小鼠在疲勞儀停留時(shí)間分布。B:野生型和敲基因小鼠在疲勞儀上平均停留時(shí)間。8-10周雄性小鼠，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物野生型12只，敲基因小鼠13只，*p < 0.05，**p < 0.01。
[0044]圖3.野生型和eIF6敲基因鼠水迷宮測試。A:小鼠水迷宮中潛伏期。B:小鼠在目標(biāo)象限停留時(shí)間百分比。C:小鼠水迷宮中游泳總路程。D:小鼠水迷宮中平均游泳速度。10-12周雄性小鼠，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物野生型12只，敲基因小鼠13只，*P < 0.05,**p < 0.01。
[0045]圖4.野生型和eIF6敲基因在水迷宮中空間搜索策略。A:野生型小鼠在水迷宮中的空間搜索策略。B:敲基因小鼠在水迷宮中的空間搜索策略。
[0046]圖5.免疫組織化學(xué)檢測eIF6基因在大腦內(nèi)表達(dá)。A:eIF6在大腦海馬中表達(dá)情況。B:eIF6在大腦皮質(zhì)中表達(dá)。C:海馬中eIF6表達(dá)放大圖。D:大腦皮質(zhì)中eIF6表達(dá)放大圖。
[0047]圖6.免疫組織化學(xué)檢測eIF6基因在海馬表達(dá)。A:eIF6在大腦海馬中表達(dá)情況。B:eIF6在CA區(qū)中表達(dá)。C:eIF6在DG區(qū)中表達(dá)。D:海馬CA區(qū)中eIF6亞細(xì)胞表達(dá)情況。
[0048]圖7.大腦海馬區(qū)和非海馬區(qū)不同的蛋白表達(dá)。hippo:海馬組織，non-hippo:除海馬的大腦組織，WT:野生型小鼠，ko:敲基因型小鼠。
[0049]圖8.小鼠與人eIF6氨基酸序列同源性比對(duì)。黑色表示匹配，灰色表示不匹配。Homo:人類Mus:小鼠。
[0050]圖9.小鼠與人eIF6核苷酸序列同源性比對(duì)。黑色表示匹配，灰色表示不匹配。Homo:人類Mus:小鼠。
【具體實(shí)施方式】[0051]術(shù)語定義
[0052]記憶力減退:在本發(fā)明中，記憶力減退除與衰老相關(guān)的記憶力下降以外，還包括由心理因素和/或軀體器質(zhì)性病變引起的記憶力下降。與記憶力下降有關(guān)的疾病或疾病狀態(tài)如神經(jīng)退行性疾病、睡眠障礙、腦動(dòng)脈硬化、慢性鼻竇炎、慢性酒精中毒、腦部腫瘤、糖尿病、酒精中毒、甲狀腺功能低下或神經(jīng)性梅毒等。同時(shí)記憶與心理健康也有十分重要的關(guān)系，長期處于社會(huì)壓力大、抑郁、自卑、焦慮等心理狀態(tài)時(shí)也會(huì)引起記憶障礙。記憶力下降常常令病人陷入焦慮和緊張狀態(tài)，而抑郁也是造成病人注意力不集中的原因，表現(xiàn)為注意力下降。
[0053]記憶障礙(Impaired Memory):指個(gè)體處于一種不能記住或回憶信息或技能的狀態(tài)，有可能是由于病理生理性的或情境性的原因引起的永久性或暫時(shí)性的記憶障礙。在本發(fā)明中，當(dāng)指個(gè)體的記憶力狀態(tài)或臨床表現(xiàn)(例如，提及與記憶力減退或記憶障礙相關(guān)的因素、疾病或疾病狀態(tài))時(shí)，記憶力減退和記憶障礙兩個(gè)術(shù)語可以互換使用。
[0054]疾病狀態(tài):是指具有相關(guān)疾病的癥狀或功能障礙表現(xiàn)，但可能具有或不具有相關(guān)器官器質(zhì)性病變的狀態(tài)。
[0055]與海馬功能受損相關(guān)的疾病或功能障礙:原發(fā)或繼發(fā)引起的海馬神經(jīng)元器質(zhì)性病變(例如，死亡)和/或功能紊亂而導(dǎo)致海馬暫時(shí)或永久性功能受損的各種病因諸如創(chuàng)傷、器官萎縮、應(yīng)激或其他有害刺激、中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性或進(jìn)行性疾病或綜合征(例如，神經(jīng)退行性疾病如阿爾茲海默病，大腦認(rèn)知功能進(jìn)行性退化綜合征如老年癡呆癥等)、生理性過程(例如，衰老、睡眠障礙等)或其他疾病(例如，糖尿病、抑郁癥等)等，只要表現(xiàn)為海馬功能損害或喪失，尤其是記憶力減退或記憶障礙，甚至記憶喪失，均包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
[0056]Morris (Morris water maze, MWM)水迷宮系統(tǒng):在本發(fā)明中，采用了Morris (Morris water maze,MWM)水迷宮系統(tǒng)用于檢測受試者記憶功能。該系統(tǒng)是英國心理學(xué)家Morris于20世紀(jì)80年代初設(shè)計(jì)并應(yīng)用于學(xué)習(xí)記憶腦機(jī)制研究的，被廣泛運(yùn)用在神經(jīng)生物學(xué)領(lǐng)域的基礎(chǔ)和應(yīng)用研究`，可作為檢測實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)習(xí)記憶水平的重要工具。
[0057]以下通過實(shí)施例來進(jìn)一步闡明本發(fā)明。但是應(yīng)該理解，所述實(shí)施例只是舉例說明的目的，并不意欲限制本發(fā)明的范圍和精神。
[0058]本發(fā)明所用的實(shí)驗(yàn)儀器和材料及其來源如下:
[0059]
【權(quán)利要求】
1.具有SEQID NO:1所示的β 4整合素結(jié)合蛋白eIF6氨基酸序列、在SEQ ID N0:1的序列的基礎(chǔ)上發(fā)生1-3個(gè)氨基酸殘基保守置換的同源氨基酸序列或與SEQ ID N0:1的序列具有至少80%以上的同源性且能與β 4整合素特異性結(jié)合的氨基酸序列的多肽；具有SEQID ΝΟ:2所示的eIF6基因核酸序列、與SEQ ID NO:2的序列具有至少80%以上同源性的核酸序列的核酸分子、以eIF6基因序列為靶序列的有效抑制eIF6基因表達(dá)的核酸分子或包含所述核酸分子的DNA表達(dá)載體在制備用于預(yù)防和/或治療運(yùn)動(dòng)性疲勞、記憶力減退或記憶障礙的藥物中的用途。
2.具有SEQID NO:1所示的β 4整合素結(jié)合蛋白eIF6氨基酸序列、在SEQ ID ΝΟ:1的序列的基礎(chǔ)上發(fā)生1-3個(gè)氨基酸殘基保守置換的同源氨基酸序列或與SEQ ID ΝΟ:1的序列具有至少80%以上的同源性且能與β 4整合素特異性結(jié)合的氨基酸序列的多肽；具有SEQID NO:2所示的eIF6基因核酸序列、與SEQ ID NO:2的序列具有至少80%以上同源性的核酸序列的核酸分子、以eIF6基因序列為靶序列的有效抑制eIF6基因表達(dá)的核酸分子或包含所述核酸分子的DNA表達(dá)載體在制備用于檢測運(yùn)動(dòng)性疲勞、記憶力減退或記憶障礙的試劑盒中的用途。
3.權(quán)利要求1或2所述的用途，其特征在于所述記憶力減退或記憶障礙由與海馬功能受損相關(guān)的疾病或功能障礙導(dǎo)致。
4.權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)所述的用途，其特征在于所述記憶力減退或記憶障礙與下列因素或疾病有關(guān):衰老、神經(jīng)退行性疾病、抑郁癥、腦部腫瘤、糖尿病、阿爾茲海默病、帕金森病、腦動(dòng)脈硬化、慢性鼻竇炎、老年癡呆癥、匹克氏病(Pick’ s disease)、亨廷頓病、肝豆?fàn)詈俗冃?、精神分裂癥、肝豆?fàn)詈俗冃浴⒕穹至寻Y、癲癇、睡眠障礙、慢性酒精中毒、甲狀腺功能低下或神經(jīng)性梅毒。
5.權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)所述的用途，其特征在于所述DNA表達(dá)載體是病毒載體、噬菌體載體、大腸桿菌載體、質(zhì)粒載體、藍(lán)藻穿梭載體、農(nóng)桿菌載體或酵母載體，其中病毒載體優(yōu)選腺病毒載體或慢病毒載體等。
6.權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)所述的用途，其特征在于所述以eIF6基因序列為靶序列的有效抑制eIF6基因表達(dá)的核酸分子是長度在20~30個(gè)，優(yōu)選21~28個(gè)核苷酸分子范圍內(nèi)的包含SEQ ID NO:15或和SEQ ID NO:16所示的序列的siRNA分子。
7.權(quán)利 要求1-5中任一項(xiàng)所述的用途，其特征在于所述以eIF6基因序列為靶序列的有效抑制eIF6基因表達(dá)的核酸分子是長度在20~40個(gè)，優(yōu)選21~27個(gè)核苷酸分子范圍內(nèi)的包含SEQ ID NO:3-8所示的序列中任一個(gè)序列的核酸分子。
【文檔編號(hào)】A61P35/00GK103520703SQ201210234090
【公開日】2014年1月22日 申請(qǐng)日期:2012年7月6日 優(yōu)先權(quán)日:2012年7月6日
【發(fā)明者】崔艷艷, 吳軍, 羅高興, 桂莉, 譚江琳, 賀偉峰 申請(qǐng)人:中國人民解放軍第三軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院