一種組織工程軟骨的構(gòu)建方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種組織工程軟骨的構(gòu)建方法，所述方法包括步驟：（1）在Gelatin/PCL納米纖維電紡膜片上加軟骨細(xì)胞懸液；（2）在步驟（1）產(chǎn)生的軟骨細(xì)胞懸液上加Gelatin/PCL納米纖維電紡膜片；（3）重復(fù)步驟（1）和（2），得到復(fù)合物；（4）體外培養(yǎng)復(fù)合物得到組織工程軟骨。
【專利說明】一種組織工程軟骨的構(gòu)建方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及組織工程領(lǐng)域，尤其涉及一種應(yīng)用可降解人工合成膜片材料構(gòu)建組織工程軟骨。
【背景技術(shù)】
[0002]軟骨是一種無血管的組織，因其自我修復(fù)能力低下，所以軟骨損傷或畸形一直以來都是臨床治療的一大難題。組織工程技術(shù)為軟骨缺損修復(fù)提供了一種全新的治療手段?？山到馍镏Ъ懿牧鲜墙M織工程的基本要素之一，目前構(gòu)建軟骨常用的支架材料有聚乳酸(polyglycolicacid, PGA), I型膠原、軟骨脫細(xì)胞基質(zhì)等，其中軟骨脫細(xì)胞基質(zhì)因其良好的細(xì)胞相容性，無免疫原性等優(yōu)點(diǎn)而成為近年研究的熱點(diǎn)。軟骨脫細(xì)胞基質(zhì)具有成分天然、力學(xué)強(qiáng)度與正常軟骨組織相似等優(yōu)點(diǎn)，然而由于軟骨是非常致密的結(jié)締組織，因此存在脫細(xì)胞不全和新生細(xì)胞難以長入兩大障礙。為了解決上述難題，人們嘗試了多種方法，但效果都不理想。但大塊軟骨存在脫細(xì)胞不徹底以及細(xì)胞再次長入困難等問題，同時(shí)軟骨脫細(xì)胞膜片還存在制備過程復(fù)雜，不易標(biāo)準(zhǔn)化等問題。
[0003]因此，本領(lǐng)域迫切需要提供一種新的構(gòu)建組織工程軟骨的方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明旨在提供一種新的構(gòu)建組織工程軟骨的方法。
[0005]本發(fā)明提供了一種組織工程軟骨的構(gòu)建方法，所述方法包括步驟:
[0006](I)在Gelatin/PCL納米纖維電紡膜片上加軟骨細(xì)胞懸液；
[0007](2)在步驟(1)產(chǎn)生的軟骨細(xì)胞懸液上加Gelatin/PCL納米纖維電紡膜片；
[0008](3)重復(fù)步驟(1)和(2)，得到復(fù)合物；
[0009](4)體外培養(yǎng)復(fù)合物得到組織工程軟骨。
[0010]在另一優(yōu)選例中，所述Gelatin/PCL納米纖維電紡膜片中Gelatin和PCL的重量比為 90: 10-10: 90。
[0011]在另一優(yōu)選例中，所述Gelatin/PCL納米纖維電紡膜片中Gelatin和PCL的重量比為 70: 30-30: 70 ;更優(yōu)選為 70: 30-50: 50。
[0012]在另一優(yōu)選例中，所述Gelatin/PCL納米纖維電紡膜片的橫切面為直徑7_12mm的圓形。
[0013]在另一優(yōu)選例中，所述Gelatin/PCL納米纖維電紡膜片的厚度為10-30 y m。
[0014]在另一優(yōu)選例中，所述軟骨細(xì)胞懸液中的軟骨細(xì)胞濃度為50-150X 106/ml。
[0015]在另一優(yōu)選例中，每次所加軟骨細(xì)胞懸液為1-10 ill。
[0016]在另一優(yōu)選例中，步驟(3)中重復(fù)步驟(1)和(2) 5-15次。
[0017]在另一優(yōu)選例中，步驟(3)得到的復(fù)合物上覆蓋培養(yǎng)液后再進(jìn)行體外培養(yǎng)。
[0018]在另一優(yōu)選例中，所述軟骨細(xì)胞來自全身軟骨組織。
[0019]在另一優(yōu)選例中，所述全身軟管組織是耳廓、肋骨、或關(guān)節(jié)等。[0020]據(jù)此，本發(fā)明提供了一種新的構(gòu)建組織工程軟骨的方法。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0021]圖1是三明治法構(gòu)建軟骨組織操作示意圖。
[0022]圖2顯示了三種比例的Gelatin/PCL納米纖維電紡膜材料的大體觀，電鏡微觀結(jié)構(gòu)。
[0023]圖3顯示了經(jīng)體外培養(yǎng)Iw+體內(nèi)培養(yǎng)12w的組織工程軟骨大體觀(A)，細(xì)胞材料4h粘附率(B)，體外培養(yǎng)Iw+體內(nèi)培養(yǎng)3w的組織工程軟骨生物力學(xué)分析(C)情況。
[0024]圖4顯示了三種材料體內(nèi)外構(gòu)建組織工程軟骨的組織學(xué)分析；拼圖標(biāo)尺為500 iim，放大圖片標(biāo)尺為100 iim。
【具體實(shí)施方式】
[0025]發(fā)明人經(jīng)過廣泛而深入的研究，意外地發(fā)現(xiàn)可以使用一定比例的Gelatin (明膠)/PCL (polycaprolactone,聚己酸丙酯)納米纖維材料作為組織工程支架材料，并且通過“三明治法”將Gelatin/PCL納米纖維材料(膜片形式)和軟骨細(xì)胞按“膜片-細(xì)胞懸液_膜片-細(xì)胞懸液”的方式在培養(yǎng)皿中層 層疊加所得到的復(fù)合物，經(jīng)過體外培養(yǎng)可以有效構(gòu)建組織工程軟骨。
[0026]本發(fā)明提供的構(gòu)建組織工程軟骨的方法是將種子細(xì)胞接種于生物可降解材料上形成種子細(xì)胞-材料復(fù)合物，然后在體外培養(yǎng)條件下(例如在常規(guī)的含5%C02的37°C培養(yǎng)箱中)進(jìn)行體外培養(yǎng)可以得到可用于移植的組織工程化軟骨。也可以進(jìn)一步地，在體外培養(yǎng)后植入體內(nèi)使進(jìn)一步地生長。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，是在體外培養(yǎng)后植入哺乳動(dòng)物皮下。
[0027]在本發(fā)明提供的上述組織工程軟骨的構(gòu)建方法中，所使用的生物可降解材料是Gelatin/PCL電紡納米纖維,較佳地是Gelatin/PCL納米纖維電紡膜,其中Gelatin和PCL的重量比為 90: 10-10: 90，優(yōu)選 70: 30-30: 70，更優(yōu)選 70: 30-50: 50。
[0028]如本文所用，“Gelatin/PCL納米纖維電紡膜”是一種電紡納米纖維材料，由Gelatin和PCL構(gòu)成，成膜狀，厚度10-30 u m，優(yōu)選橫切面為直徑7_12mm的圓形。
[0029]本發(fā)明提供的上述組織工程軟骨的構(gòu)建方法中，所使用的種子細(xì)胞是軟骨細(xì)胞，可以使用本領(lǐng)域的常規(guī)方法獲得，例如但不限于，酶消化法從軟骨組織塊中消化獲得細(xì)胞。
[0030]本發(fā)明提供的上述組織工程軟骨的構(gòu)建方法中，種子細(xì)胞-材料復(fù)合物的形成過程是將Gelatin/PCL納米纖維電紡膜片和軟骨細(xì)胞按“膜片-細(xì)胞懸液_膜片_細(xì)胞懸液”的方式在培養(yǎng)皿中層層疊加。細(xì)胞懸液中軟骨細(xì)胞的濃度為50-150X 106/ml，優(yōu)選為80-120X 106/ml ;每層細(xì)胞懸液1-10 iil，優(yōu)選為3-7 ill ;疊加層數(shù)為10-30層，優(yōu)選為15-25 層。
[0031]在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，通過上述層層疊加的方式獲得復(fù)合物后，靜置0.5-2小時(shí)，將含有5-15%FBS的高糖DMEM培養(yǎng)液覆蓋復(fù)合物，再進(jìn)行體外培養(yǎng)。
[0032]在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，體外培養(yǎng)0.5-1.5周后植入哺乳動(dòng)物皮下2-4周。
[0033]本發(fā)明提到的上述特征，或?qū)嵤├岬降奶卣骺梢匀我饨M合。本案說明書所揭示的所有特征可與任何組合物形式并用，說明書中所揭示的各個(gè)特征，可以任何可提供相同、均等或相似目的的替代性特征取代。因此除有特別說明，所揭示的特征僅為均等或相似特征的一般性例子。
[0034]本發(fā)明的主要優(yōu)點(diǎn)在于:
[0035]1、本發(fā)明提供的構(gòu)建方法可以依據(jù)對(duì)于Gelatin/PCL納米纖維電紡膜片的形狀或形態(tài)的處理獲得特定大小、特定形狀的軟骨。
[0036]2、本發(fā)明證實(shí)了膜片技術(shù)構(gòu)建軟骨的可行性，理論上人工合成膜片只要具備良好的生物相容性、可降解性、通透性以及一定的力學(xué)強(qiáng)度，無論是用電紡絲技術(shù)制備還是其他技術(shù)制備的膜性材料，都適合于軟骨組織構(gòu)建。
[0037]3、人工合成的可降解材料制備可實(shí)現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)，有利于組織工程技術(shù)的推廣與 應(yīng)用。
[0038]下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件或按照制造廠商所建議的條件。除非另外說明，否則所有的百分?jǐn)?shù)、比率、比例、或份數(shù)按
重量計(jì)。
[0039]本發(fā)明中的重量體積百分比中的單位是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的，例如是指在100毫升的溶液中溶質(zhì)的重量。
[0040]除非另行定義，文中所使用的所有專業(yè)與科學(xué)用語與本領(lǐng)域熟練人員所熟悉的意義相同。此外，任何與所記載內(nèi)容相似或均等的方法及材料皆可應(yīng)用于本發(fā)明方法中。文中所述的較佳實(shí)施方法與材料僅作示范之用。
[0041]實(shí)施例
[0042]材料和方法
[0043]一、Gelatin/PCL納米纖維電紡膜的準(zhǔn)備
[0044]本實(shí)施例所用Gelatin/PCL納米纖維電紡膜材料中Gelatin:PCL比例包括30:70，50:50,70:30三種，購自東華大學(xué)生物研究所。用角膜環(huán)鉆將該材料處理成直徑為9mm的圓形膜片，經(jīng)真空冷凍干燥機(jī)24小時(shí)處理后備用(無菌)。
[0045]二、耳廓軟骨細(xì)胞培養(yǎng)
[0046]取新生豬耳廓軟骨組織，切成IX IX Imm大小，加入0.1%膠原酶消化過夜，用75 y m孔徑的濾網(wǎng)濾過后,加入高糖DMEM(Hyclone,美國)含10%胎牛血清(FBS) (Hyclone,美國)的培養(yǎng)液，置于含5%C02的37°C培養(yǎng)箱培養(yǎng)，培養(yǎng)至80%-90%融合后傳代。
[0047]三、三明治法構(gòu)建軟骨
[0048]用0.25%胰蛋白酶消化收集培養(yǎng)的軟骨細(xì)胞，用含10%FBS的DMEM培養(yǎng)液重懸至濃度100X 106/ml，將Gelatin/PCL納米纖維電紡膜片和軟骨細(xì)胞按“膜片-細(xì)胞懸液-膜片-細(xì)胞懸液”的方式在培養(yǎng)皿中層層疊加，細(xì)胞懸液每層I,共疊加20層膜片(圖1)。靜置I小時(shí)后加入含10%FBS的高糖DMEM培養(yǎng)液覆蓋復(fù)合物，置于含5%C02的37°C培養(yǎng)箱培養(yǎng)。隔天換液，體外培養(yǎng)I周后植入裸鼠皮下，體內(nèi)3周后取材。
[0049]四、細(xì)胞粘附率檢測(cè)
[0050]將軟骨細(xì)胞按照2X 104/ml/孔(24孔板)的數(shù)量接種于三種比例的Gelatin/PCL納米纖維電紡膜片。細(xì)胞-材料復(fù)合物在含5%C02的37°C培養(yǎng)箱培養(yǎng)4h后被轉(zhuǎn)移至另一24孔板，用0.25%的胰酶消化原24孔板內(nèi)貼壁細(xì)胞，與原24孔板內(nèi)培養(yǎng)液一同計(jì)數(shù)，全自動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)儀計(jì)數(shù)后得出流失細(xì)胞數(shù)。[0051]細(xì)胞粘附率=(接種細(xì)胞數(shù)-流失細(xì)胞數(shù))/接種細(xì)胞數(shù)X 100%。
[0052]五、構(gòu)建軟骨的組織學(xué)檢測(cè)
[0053]HE染色:將切片脫蠟至水后蘇木素染色8分鐘，沖洗后鹽酸酒精分化數(shù)秒，自來水洗返藍(lán)30分鐘，伊紅染色2分鐘后乙醇脫水；二甲苯透明后中性樹脂封片。
[0054]II型膠原免疫組織化學(xué)染色:切片脫蠟至水后，加入3%過氧化氫乙醇溶液室溫下放置10分鐘，(磷酸緩沖液)PBS漂洗3次，0.4%胃蛋白酶37°C消化30分鐘；PBS漂洗3次，山羊血清封閉30分鐘，吸去血清后加入1:200稀釋的一抗(abcam，美國)，4°C過夜后加入二抗，37°C溫箱I小時(shí)，后用3，3’ - 二氨基聯(lián)苯胺顯色。 [0055]Safranin’O染色:將切片脫臘至水后Safranin’O液染5分鐘；乙醇脫水；二甲苯透明后中性樹脂封片。
[0056]六、構(gòu)建軟骨的生物力學(xué)檢測(cè)
[0057]通過應(yīng)力-應(yīng)變力學(xué)測(cè)試來測(cè)定組織抗壓強(qiáng)度和壓模量。概述如下:組織放在特殊設(shè)計(jì)的一個(gè)容器中，首先加Ig壓力，并將此時(shí)作為零應(yīng)變。然后持續(xù)施加2.5%應(yīng)變的壓力一直達(dá)到80%應(yīng)變?yōu)橹埂Ｔ诿恳徊街?，均記錄壓?變形情況直到達(dá)到平衡?？箟簭?qiáng)度(平衡壓力與標(biāo)本橫截面積的比值)表征組織承受最大應(yīng)力的一個(gè)功能；通過應(yīng)力-應(yīng)變曲線中線性關(guān)系良好部分的斜率可以計(jì)算出壓模量，它同樣可作為組織生物力學(xué)的一個(gè)功能。
[0058]結(jié)果
[0059]1.Gelatin/PCL納米纖維電紡膜及其組織相容性
[0060]靜電紡絲法制備的Gelatin/PCL納米纖維電紡膜顏色純白，厚度約20 ii m，具有良好的抗拉伸強(qiáng)度，用9mm角膜環(huán)鉆處理后成圓片狀，形狀規(guī)則，未出現(xiàn)皺縮現(xiàn)象(圖2A)。電鏡掃描顯示:納米纖維均勻、光滑、連續(xù)，其平均直徑(纖維橫切面的直徑)在379±146nm左右，接近于正常膠原纖維50-500nm的直徑，能很好地仿生了天然細(xì)胞外基質(zhì)膠原的纖維細(xì)度(圖2B)，纖維中由于包含明膠成分，故具有良好的組織相容性，細(xì)胞粘附率檢測(cè)結(jié)果提示，PCL含量為30%與50%的材料細(xì)胞粘附率較高，且兩者不存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(圖3B)。
[0061]2.構(gòu)建軟骨的大體觀及力學(xué)強(qiáng)度
[0062]體內(nèi)培養(yǎng)3周后取材顯示三組膜片均形成軟骨樣組織(圖3A)，Gelatin/PCL70:30和50:50組形成軟骨彈性好，力學(xué)強(qiáng)度分析顯示他們的楊氏膜量顯著高于Gelatin/PCL30:70 組(圖 3C)
[0063]3.構(gòu)建軟骨的組織學(xué)檢測(cè)
[0064]經(jīng)體外培養(yǎng)I周后移植入裸鼠皮下3周取材，組織學(xué)結(jié)果顯示，不同比例的Gelatin/PCL納米纖維電紡膜構(gòu)建軟骨的質(zhì)量明顯不同。Gelatin/PCL70:30和50:50組形成軟骨質(zhì)量好，材料膜片之間的軟骨細(xì)胞大量增殖，軟骨陷窩結(jié)構(gòu)清晰，Safranin 0和Collagen II免疫組織化學(xué)染色結(jié)果提示分泌細(xì)胞外基質(zhì)能力旺盛。Gelatin/PCL70:30組軟骨質(zhì)量較差，組織不均一，軟骨陷窩較少，Safranin 0和Collagen II免疫組織化學(xué)染色結(jié)果提示分泌細(xì)胞外基質(zhì)較少。(圖4)。
[0065]以上所述僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例而已，并非用以限定本發(fā)明的實(shí)質(zhì)技術(shù)內(nèi)容范圍，本發(fā)明的實(shí)質(zhì)技術(shù)內(nèi)容是廣義地定義于申請(qǐng)的權(quán)利要求范圍中，任何他人完成的技術(shù)實(shí)體或方法，若是與申請(qǐng)的權(quán)利要求范圍所定義的完全相同，也或是一種等效的變更，均將被視為涵蓋于該權(quán)利要求范圍之中。
【權(quán)利要求】
1.一種組織工程軟骨的構(gòu)建方法，其特征在于，所述方法包括步驟: (1)在Gelatin/PCL納米纖維電紡膜片上加軟骨細(xì)胞懸液； (2)在步驟(1)產(chǎn)生的軟骨細(xì)胞懸液上加Gelatin/PCL納米纖維電紡膜片； (3 )重復(fù)步驟(1)和(2 )，得到復(fù)合物； (4)體外培養(yǎng)復(fù)合物得到組織工程軟骨。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述Gelatin/PCL納米纖維電紡膜片中Gelatin 和 PCL 的重量比為 90: 10-10: 90。
3.如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述Gelatin/PCL納米纖維電紡膜片中Gelatin 和 PCL 的重量比為 70: 30-30: 70 ;優(yōu)選為 70: 30-50: 50。
4.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述Gelatin/PCL納米纖維電紡膜片的橫切面為直徑7-12_的圓形。
5.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述Gelatin/PCL納米纖維電紡膜片的厚度為 10-30 u m。
6.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述軟骨細(xì)胞懸液中的軟骨細(xì)胞濃度為50-150 XlOVml o
7.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，每次所加軟骨細(xì)胞懸液為1-10yl。
8.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(3)中重復(fù)步驟(1)和(2)5-15次。
9.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(3)得到的復(fù)合物上覆蓋培養(yǎng)液后再進(jìn)行體外培養(yǎng)。
10.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述軟骨細(xì)胞來自全身軟骨組織。
【文檔編號(hào)】A61L27/24GK103622764SQ201210303026
【公開日】2014年3月12日 申請(qǐng)日期:2012年8月23日 優(yōu)先權(quán)日:2012年8月23日
【發(fā)明者】張文杰, 薛繼鑫, 周廣東, 劉偉, 曹誼林 申請(qǐng)人:上海國睿生命科技有限公司