專利名稱：具有抗氧化活性的車前草多酚的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于中藥、食品技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
植物多酚是廣泛分布于植物之中的一類復(fù)雜化合物，現(xiàn)代研究表明，很多疾病如組織器官老化等都與體內(nèi)過剩的自由基有關(guān)，多酚通過清除自由基能對自由基誘發(fā)的生物大分子損傷起保護作用，因此，多酚類化合物在抗衰老、抗腫瘤、抗輻射、抑制高血壓、降血脂等很多方面具有良好的生理活性。車前草是車前科植物車前(Plantago asiatica L.)的干燥全草,是一味傳統(tǒng)中藥，也是衛(wèi)生部規(guī)定可以用于保健食品的植物之一，具有清熱利尿、滲濕通淋、明目、祛痰之功效，還具有保肝、降壓、抑菌、降低血清膽固醇等多種藥理作用。具有很好的醫(yī)療保健價值。 近年來，國內(nèi)外對多酚的應(yīng)用研究在逐漸增多，枇杷多酚(申請?zhí)?專利號201010538005)、蘋果多酚(申請?zhí)?專利號201010171146)、茶多酚(申請?zhí)?專利號200810181108)等已申請專利。而對車前草多酚的研究較少。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種具有抗氧化活性的車前草多酚的制備方法，它是從車前草植物中提取、純化車前草多酚的方法。本發(fā)明的制備方法是
I、車前草多酚的提取，將車前草粉碎成20目-40目的粗粉，用乙醇溶液回流提取，車前草回流提取所用的乙醇溶液量按重量比為6-10倍，乙醇溶液濃度60-80%，回流提取時間為O. 5-2h，提取后回收乙醇，加水制成O. 5g車前草/mL的提取溶液，5000rpm/min離心30min，棄去沉淀，得到車前草多酚提取溶液。2、車前草多酚的純化，車前草多酚提取溶液上到DlOl大孔樹脂柱(上樣量20-30mL/g樹脂)上，上樣速度2-4BV/h，吸附時間l_3h，洗脫溶劑10-90%乙醇溶液，洗脫速度2-6BV/h。經(jīng)吸附，乙醇洗脫得到車前草多酚洗脫液，回收乙醇，凍干，得到車前草多酚。車前草多酚的提取過程中，車前草回流提取所用的乙醇溶液量按重量比優(yōu)選為8倍；乙醇溶液濃度優(yōu)選為70% ;回流提取時間為lh。車前草多酚的純化過程中，車前草多酚提取液上樣速度優(yōu)選為3BV/h ;吸附時間優(yōu)選為2 h ;洗脫溶劑乙醇溶液，優(yōu)選為30% ;洗脫速度優(yōu)選為4BV/h。本發(fā)明的有益效果是利用車前草為原料經(jīng)乙醇溶液提取，采用大孔吸附樹脂進行富集純化，制備得到車前草多酚。大孔吸附樹脂具有物理化學(xué)穩(wěn)定性高、吸附容量大、選擇性好、吸附速度快、再生處理方便、使用期長、節(jié)省費用等諸多優(yōu)點。適合于工業(yè)生產(chǎn)。制備得到車前草多酚具有清除自由基、抗氧化的功能。在食品、醫(yī)藥、化妝品及功能食品方面具有很大開發(fā)潛力。


圖I是本發(fā)明車前草多酚對D-半乳糖誘導(dǎo)氧化損傷小鼠肝組織MDA水平的影響； 圖2是本發(fā)明車前草多酚對D-半乳糖誘導(dǎo)氧化損傷小鼠肝組織GSH-Px活力的影響； 圖3是本發(fā)明車前草多酚對D-半乳糖誘導(dǎo)氧化損傷小鼠肝組織T-AOC活性的影響； 圖4是本發(fā)明車前草多酚對D-半乳糖誘導(dǎo)氧化損傷小鼠肝組織SOD活性的影響；
圖5是本發(fā)明車前草多酚對D-半乳糖誘導(dǎo)氧化損傷小鼠腦組織MAO活力的影響。
具體實施例方式實施例I
(I)車前草多酚的提取
車前草粗粉100g，加入800mL的70%乙醇溶液回流提取3次，每次I小時，過濾，合并濾 液，回收乙醇，加水制成200mL的提取液，5000rpm/min離心30min,棄去沉淀,得到車前草
多酚提取溶液。(2)車前草多酚的純化
車前草多酚提取液以3BV/h的速度上到DlOl大孔樹脂柱上(上樣量20-30mL/g樹脂)，吸附2小時后，先用蒸餾水洗脫至流出液無色，再用30%乙醇作為洗脫溶劑，以4BV/h速度洗脫至無色，收集洗脫液，回收乙醇、凍干，即得到車前草多酚3. Sg。實施例2
(I)車前草多酚提取
車前草粗粉200g，加入1600 mL的70%乙醇溶液回流提取3次，每次I小時，過濾，合并濾液，回收乙醇，加水制成400mL的提取液，5000rpm/min離心30min,棄去沉淀,得到車前草多酚提取溶液。(2)車前草多酚的純化
車前草多酚提取液以3BV/h的速度上到DlOl大孔樹脂柱上(上樣量20-30mL/g樹脂)，吸附2小時后，先用蒸餾水洗脫至流出液無色，再用30%乙醇作為洗脫溶劑，以4BV/h速度洗脫至無色，收集洗脫液，回收乙醇、凍干，即得到車前草總多酚Sg。實施例3
(I)車前草多酚提取
車前草粗粉300g，加入2400 mL的70%乙醇溶液回流提取3次，每次I小時，過濾，合并濾液，回收乙醇，加水制成600mL的提取液，5000rpm/min離心30min,棄去沉淀,得到車前草多酚提取溶液。(2)車前草多酚的純化
車前草多酚提取液以3BV/h的速度上到DlOl大孔樹脂柱上(上樣量20-30mL/g樹脂)，吸附2小時后，先用蒸餾水洗脫至流出液無色，再用30%乙醇作為洗脫溶劑，以4BV/h速度洗脫至無色，收集洗脫液，回收乙醇、凍干，即得到車前草多酚10g。實施例4
(I)車前草多酚提取
車前草粗粉500g，加入4000 mL的80%乙醇溶液回流提取3次，每次I小時，過濾，合并濾液，回收乙醇，加水制成IOOOmL的提取液，5000r/min離心30min,棄去沉淀,得到車前草
多酚提取溶液。(2)車前草多酚的純化
車前草多酚提取液以3BV/h的速度上到DlOl大孔樹脂柱上(上樣量20-30mL/g樹脂)，吸附2小時后，先用蒸餾水洗脫至流出液無色，再用30%乙醇作為洗脫溶劑，以4BV/h速度洗脫至無色，收集洗脫液，回收乙醇、凍干，即得到車前草多酚17. 2g。試驗例I車前草多酚的體外抗氧化試驗
(I)清除DPPH自由基能力的測定(DPPH法)
方法在試管中加入I. 95mL質(zhì)量濃度為24mg/L的DPPH乙醇溶液和O. 05mL 95%的乙醇溶液,混勻后,用Icm比色皿在517nm波長處測吸光值(A)，記為A0。另取試管分別 加入I. 95mL質(zhì)量濃度為24mg/L的DPPH乙醇溶液和O. 05mL不同濃度的提取物溶液，混勻后，記錄加入提取物溶液后不同時間的吸光度值直到吸光度穩(wěn)定。用穩(wěn)定后的吸光值A(chǔ)t計算提取物對DPPH自由基的清除能力SR%，繪制清除率曲線，計算IC5Q。 SR%= [ (A0-At) / A0] X 100%
式中Atl — DPPH乙醇溶液的吸光值。At—加入提取物溶液后的DPPH乙醇溶液的最終吸光度值。IC50=O. 2848 mg/mL。此結(jié)果可以看出車前草多酚對DPPH自由基有一定的清除作用。(2) OH ·自由基能力的測定
方法-M 7支具塞試管，分別加入O. 75mmoL · L-1鄰二氮菲溶液lmL、PH=7. 4的PBS緩沖溶液3. 8mL，充分混勻后再加入O. 75 mmoL · T1FeSO4溶液I. 5mL，立即混勻。然后向其中5支試管分別加入一定量的車前草多酚溶液(每管加的體積不同)，混再分別加入O. 01%的H2O2溶液lmL，混勻，另取2支分別為損傷和未損傷管，不加車前草多酚溶液，在損傷管中加入O. 01% H2O2溶液ImL,未損傷管不加H2O2,最后用蒸懼水補至相同體積IOmL, 7支試管于37°保溫Ih，測A536，計算OH ·清除率，繪制清除率曲線。OH ·清除率=(A2-A1) / (A0-A1)
式中=Atl—未損傷管的吸光度；A1—損傷管的吸光度；A2—加車前草多酚溶液的吸光度。IC50=O. 2469 mg/mL,車前草總多酹對H202/Fe2+體系通過Fenton反應(yīng)所產(chǎn)生的OH ·具有清除作用。(3)光化學(xué)發(fā)光法(PCL)
PCL法分析原理是由光化學(xué)法生成自由基，并利用化學(xué)發(fā)光法檢測自由基，抗氧化活性是用相當(dāng)于抗壞血酸的納摩爾數(shù)來計算。方法配制混合液為I. O mL反應(yīng)緩沖液，包括O. I moL/L Sodium Carbonate和
O.lmmoL/LNa2-EDTA; I. 5 mLACff-diLuent (water) ; I mmoL/L Lu-minoL (25 μ L)，作為光敏劑激發(fā)反應(yīng)分子，使其迅速產(chǎn)生自由基，同時又作為光致化學(xué)發(fā)光物質(zhì)。樣品和標(biāo)準(zhǔn)品均為10 μ L。每個樣品平行測試2次。不同物質(zhì)的量(0，0. 5，I, 2和3nmoL)的抗壞血酸)得到標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果表明，車前草多酹清除作用相當(dāng)于抗壞血酸2. 122575 nmoL/mgo試驗例2車前草多酚對D-半乳糖誘導(dǎo)氧化損傷模型小鼠的保護作用
I、動物分組及模型建立
試驗前小鼠自由攝食飲水，適應(yīng)性飼養(yǎng)一周后，隨機分為6組，每組10只，如表I所示。D-半乳糖亞急性氧化損傷模型小鼠的給藥方式采用頸背部皮下注射。除正常對照組每日頸背部皮下注射生理鹽水外，各實驗組每日皮下注射5% (w/v)的D-半乳糖500mg/kg/d,建立模型，連續(xù)6周。造模同時，正常對照組和衰老模型組小鼠灌胃生理鹽水；陽性對照組小鼠灌胃5mg/mL維生素E ;高劑量、中和低劑量組分別灌胃車前草多酚100、50和25mg/kg/d。2組織樣品的制備
第六周末次灌胃和注射D-半乳糖24h后，乙醚麻醉動物，摘除眼球取血，37°C放置lh，4°C放置3h，離心(4000171^11，101^11，4°0分離血清后-201保存?zhèn)溆?。采血后頸椎脫臼處死動物，摘取腦、肝、腎、脾和心臟，稱重，與動物終體重的比值即為臟器指數(shù)。肝和腦分別制成10% (w/v)的組織勻衆(zhòng),離心(4000r/min, IOmin)取上清液，-20°C保存。蛋白采用Lowry·的方法測定。3生化指標(biāo)測定
肝組織的MDA含量、GSH-Px活性和T-AOC活性，血清的SOD活性，及腦組織的MAO活力采用比色法測定，按試劑盒說明書操作MDA測定采用硫代巴比妥酸法；GSH-Px)測定根據(jù)GSH-Px可以促進過氧化氫與還原型谷胱甘肽(GSH)反應(yīng)，生成氧化型谷胱甘肽，通過在412nm處測定還原型谷胱甘肽消耗量，計算酶活；T_A0C活性根據(jù)機體中抗氧化物質(zhì)能使Fe3+還原成Fe2+，后者與菲林類物質(zhì)形成有色絡(luò)合物，在520nm處測定吸光度值；S0D活力分析采用黃嘌呤氧化酶法；ΜΑ0測定以芐胺為底物，在MAO作用下，生成芐醛，在242nm下測定吸光度，計算酶活。4統(tǒng)計分析
采用SPSS12. O軟件完成統(tǒng)計處理。計量資料以x±s表示；計量資料組間差異比較采用t檢驗。差異顯著水平為P < O. 05,極顯著水平為P < O. 01。(I)車前草多酚對小鼠肝組織MDA水平的影響
如圖I所示，D-半乳糖誘導(dǎo)氧化損傷模型組小鼠肝組織中MDA濃度顯著高于正常對照組。與氧化損傷模型組比較，車前草多酚各劑量組，特別是高劑量組小鼠肝組織MDA濃度顯著降低(P < 0.05)。而車前草多酚降低小鼠肝組織MDA水平與陽性對照組(維生素E)相當(dāng)，與正常對照組比較，差異不顯著(P > O. 05)，說明車前草多酚對恢復(fù)D-半乳糖誘導(dǎo)衰老模型小鼠肝組織MDA水平具有一定的作用。(2)車前草多酚對小鼠肝組織GSH-Px活性的影響
GSH-Px是機體內(nèi)一種重要的催化過氧化氫分解的酶，其特異的催化還原型谷胱甘肽(GSH)對過氧化氫的還原反應(yīng)，可以保護細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)和功能完整的作用[12]。衰老模型組小鼠血清GSH-Px活性顯著低于對照組，三個車前草多酚處理組小鼠血清GSH-Px活性均明顯高于模型組。與模型組比較，車前草多酚能顯著提高小鼠肝組織GSH-Px活性(P < O. 05)(圖2)。說明車前草多酚對提高D-半乳糖誘導(dǎo)衰老小鼠肝組織GSH-Px活性具有良好的效果。但與正常對照組比較，差異不顯著(P >0.05)。(3)車前草多酚對小鼠肝組織T-AOC能力的影響
總抗氧化能力(T-AOC)能有效反應(yīng)機體非酶抗氧化系統(tǒng)的作用。從圖3中可知，衰老模型組肝組織總抗氧化(T-AOC)能力最低，與正常對照組相比差異達(dá)極顯著水平(P < O. 01)，說明D-半乳糖小鼠衰老模型造模成功；車前草多酚處理高、中和低劑量組及陽性對照組肝組織T-AOC活性高于模型組，但低于正常對照組。(4)車前草多酚對小鼠血清SOD活性的影響
車前草多酚對D-半乳糖誘導(dǎo)氧化損傷模型小鼠血清SOD活力分析結(jié)果如圖4所示，車前草多酚處理高劑量組SOD活力明顯高于模型組(P < O. 05)，但低劑量組與模型組差異不顯著，說明車前草多酚能提高D-半乳糖誘導(dǎo)衰老小鼠血清SOD活力，且呈劑量依賴關(guān)系。車前草多酚處理高劑量組與陽性對照組SOD活力相當(dāng)，與正常對照組差異不顯著(P > O. 05)。(5)車前草多酚對小鼠腦組織MAO活性
腦組織單胺氧化酶(MAO)活性結(jié)果如圖5所示，陽性對照組及低、中和高劑量組腦組織MAO活力降低，但與衰老組相比差異未達(dá)到顯著水平(P > O. 05);氧化損傷模型組腦組織MAO活力顯著高于正常對照組，差異達(dá)到顯著性水平(P < O. 05);正常對照組、陽性對照組及車前草多酚各劑量組間腦組織MAO活力差異不顯著(P > O. 05)。
權(quán)利要求
1.一種具有抗氧化活性的車前草多酚的制備方法，其制備方法是 a、車前草多酚的提取，將車前草粉碎成20目-40目的粗粉，用乙醇溶液回流提取，車前草回流提取所用的乙醇溶液量按重量比為6-10倍，乙醇溶液濃度60-80%，回流提取時間為O. 5-2h，提取后回收乙醇，加水制成O. 5g車前草/mL的提取溶液，5000rpm/min離心30min，棄去沉淀，得到車前草多酚提取溶液； b、車前草多酚的純化，車前草多酚提取溶液上到DlOl大孔樹脂柱上，上樣速度2-4BV/h，吸附時間l_3h，洗脫溶劑10-90%乙醇溶液，洗脫速度2-6BV/h ;經(jīng)吸附，乙醇洗脫得到車前草多酚洗脫液，回收乙醇，凍干，得到車前草多酚。
2.如權(quán)利要求I所述的一種具有抗氧化活性的車前草多酚的制備方法，其制備方法是 車前草多酚的提取過程中，車前草回流提取所用的乙醇溶液量優(yōu)選為8倍；乙醇溶液濃度優(yōu)選為70% ;回流提取時間為Ih ； 車前草多酚的純化過程中，車前草多酚提取液上樣速度優(yōu)選為3BV/h ;吸附時間優(yōu)選為2 h ;洗脫溶劑乙醇溶液，優(yōu)選為30% ;洗脫速度優(yōu)選為4BV/h。
全文摘要
一種具有抗氧化活性的車前草多酚的制備方法，屬于中藥、食品技術(shù)領(lǐng)域其制備方法是a、將車前草粉碎成粗粉，用乙醇溶液回流提取，回流提取時間為0.5-2h，提取后回收乙醇，加水制成提取溶液，棄去沉淀，得到車前草多酚提取溶液；b、車前草多酚提取溶液上到D101大孔樹脂柱上，吸附時間1-3h，洗脫溶劑10-90%乙醇溶液，洗脫速度2-6BV/h；乙醇洗脫得到車前草多酚洗脫液，回收乙醇，凍干，得到車前草多酚。有益效果是大孔吸附樹脂具有物理化學(xué)穩(wěn)定性高、吸附容量大、選擇性好、吸附速度快、再生處理方便、使用期長、節(jié)省費用等，適合于工業(yè)生產(chǎn)。制備得到車前草多酚具有清除自由基、抗氧化的功能。在食品、醫(yī)藥、化妝品及功能食品方面具有很大開發(fā)潛力。
文檔編號A61P39/06GK102895321SQ20121045250
公開日2013年1月30日 申請日期2012年11月13日 優(yōu)先權(quán)日2012年11月13日
發(fā)明者劉春明, 王強, 王晶, 馬冰 申請人:長春師范學(xué)院