錦燈籠宿萼皂苷在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了以錦燈籠宿萼皂苷為活性成分的藥物，其可單獨(dú)與藥用輔料或與其它藥物聯(lián)合制備成藥物，本發(fā)明還提供了其在制備藥物方面的應(yīng)用，具體地提供了其在制備抗腫瘤藥物方面的應(yīng)用。
【專利說明】錦燈籠宿萼皂苷在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用
[0001]摘要
本發(fā)明提供了以錦燈籠宿萼皂苷為活性成分的藥物，其可單獨(dú)與藥用輔料或與其它藥物聯(lián)合制備成藥物，本發(fā)明還提供了其在制備藥物方面的應(yīng)用，具體地提供了其在制備抗腫瘤藥物方面的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]錦燈籠(Physalisalkekengi, L.var.francheti (Mast.) Makino )又名紅姑娘、掛金燈、紅燈籠、燈籠果，為爺科(Solanaceae)酸衆(zhòng)屬植物，廣泛分布于歐亞大陸，如俄羅斯、中國、日本以及朝鮮等國家。錦燈籠為帶果實(shí)的宿萼，秋季果實(shí)成熟，果實(shí)球形、味甘、微酸，可作水果，營養(yǎng)豐富；宿萼微苦，成熟時(shí)呈紅色或橙紅色。錦燈籠果實(shí)不僅可以食用，而且是我國的傳統(tǒng)中藥。錦燈籠含有內(nèi)酯類、黃酮類、萜類、生物堿類、留醇類、氨基酸類及無機(jī)元素等幾大類化學(xué)成分。已有的研究表明，錦燈籠有多方面的藥理作用，如酸漿苦素B是錦燈籠的主要抗炎成分，常用于上呼吸道感染疾病的治療；木犀草素對心血管系統(tǒng)、祛痰及體外抗柯薩奇均具較好療效。然而有關(guān)錦燈籠宿萼皂苷抗腫瘤活性的研究尚未見報(bào)道，我們發(fā)現(xiàn)其抗腫瘤作用明顯，是一種有開發(fā)前途的抗腫瘤藥物。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]本發(fā)明提供了錦燈籠宿萼皂苷在制備抗腫瘤藥物方面的應(yīng)用。
[0004]本發(fā)明提供的化合物的制備方法為:將干燥的成熟錦燈籠宿萼粉碎，乙醇浸泡過夜；水浴回流提取，過濾，取上清，共提取3次；將3次的濾液合并，離心，取上清棄沉淀；將上清水浴旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)并回收乙醇.將上述上清液與配制好的水飽和正丁醇在分液漏斗上反復(fù)充分震蕩混合，過夜；然后將下層水層放入燒杯中，正丁醇層保留，將水層重復(fù)上述萃取步驟兩次；合并上層正丁醇層，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)回收正丁醇至黏稠狀；用少量甲醇溶解沉淀，加入乙醚洗滌，離心，洗滌數(shù)次至上清無色；沉淀物在真空干燥箱中干燥過夜得粗皂苷；將錦燈籠宿萼粗皂苷配制成10 mg/mL的水溶液，充分溶解、離心后，將上清液上樣于大孔樹脂層析柱洗脫:首先用蒸餾水洗脫，將洗脫液進(jìn)行薄層層析(TLC)檢測，直至硅膠G薄層層析檢驗(yàn)沒有顯色反應(yīng)為止，洗脫至無寡糖存在；然后以乙醇溶液進(jìn)行洗脫，將洗脫液進(jìn)行三氯醋酸顯色，直至無顏色反應(yīng)，將洗脫液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至一定體積，水浴蒸發(fā)去除存留的少量乙醇后，將濃縮液冰凍干燥，即得分離純化后的錦燈籠宿萼皂苷。
[0005]本發(fā)明提供的含有化合物的藥物，可以通過將化合物添加藥學(xué)上可接受的輔料或可選的其它成分而制成適于臨床使用的藥物組合物。
[0006]本發(fā)明的化合物在制備治療腫瘤藥物中的應(yīng)用，是通過以下的藥效實(shí)驗(yàn)得到證實(shí)的。 【具體實(shí)施方式】
[0007]制備例1:錦燈籠宿萼皂苷的制備取600g干燥的成熟錦燈籠宿萼粉碎，加入70%的乙醇，浸泡過夜；60°C水浴回流提取2 h,過濾，取上清，共提取3次；將3次的濾液合并，3 500 r/min離心10 min,取上清棄沉淀；將上清水浴旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)并回收乙醇.將上述上清液與配制好的水飽和正丁醇在分液漏斗上反復(fù)充分震蕩混合，過夜；然后將下層水層放入燒杯中，正丁醇層保留，將水層重復(fù)上述萃取步驟兩次；合并上層正丁醇層，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)回收正丁醇至黏稠狀；用少量甲醇溶解沉淀，加入5倍乙醚洗漆，3 000 r/min離心15 min,洗漆數(shù)次至上清無色；沉淀物在真空干燥箱中干燥過夜得粗皂苷；將錦燈籠宿萼粗皂苷配制成10 mg/mL的水溶液，充分溶解、離心后，將上清液上樣于D-101大孔樹脂層析柱(4 cm X 40 cm),靜止0.5 h后進(jìn)行洗脫.洗脫:首先用蒸餾水洗脫，將洗脫液進(jìn)行薄層層析(TLC)檢測，直至硅膠G薄層層析檢驗(yàn)沒有顯色反應(yīng)為止(薄層層析方法:用正丁醇-甲酸-水(4:6:1，體積比)為展開劑，5%硫酸乙醇溶液為顯色劑，100°C條件下2 min即可顯色)，洗脫至無寡糖存在；然后以60%的乙醇溶液進(jìn)行洗脫，將洗脫液進(jìn)行三氯醋酸顯色，直至無顏色反應(yīng)，將洗脫液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至一定體積，水浴蒸發(fā)去除存留的少量乙醇后，將濃縮液冰凍干燥，即得分離純化后的錦燈籠宿萼皂苷。
[0008]實(shí)驗(yàn)例1:錦燈籠宿萼皂苷對體外腫瘤細(xì)胞的抑制作用 材料和試劑
藥物及試劑:
錦燈籠宿萼皂苷，白色粉末，按照制備例I方法制備；
注射用硫酸長春新堿，上海華聯(lián)制藥有限公司，規(guī)格Irng/支；
RPMI1640培養(yǎng)基:GIBC0公司生產(chǎn)；
新生牛血清(超級)，杭州四季青生物工程材料有限公司；
胰蛋白酶，Sigma公司生產(chǎn)；
橫基羅丹明 B (sulforhadamine B, SRB), Sigma 公司；
注射用鏈霉素，山東瑞陽制藥有限公司，Ig (100萬單位)/支；
注射用青霉素鈉，山東魯抗醫(yī)藥股份有限公司，80萬單位/支；
其它常用化學(xué)試劑為國產(chǎn)分析純。
[0009]細(xì)胞株:人肝癌細(xì)胞株SMMC-7721、Bel-7402、人卵巢癌細(xì)胞株H08910、人前列腺癌胞PC-3M、人肺腺癌細(xì)胞株A549、人結(jié)腸癌細(xì)胞株HCT-8、人食管癌細(xì)胞株CaEs_17、人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞株U251、人胃癌細(xì)胞株BGC-823、人胃腺癌細(xì)胞株SGC-7901，均購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京腫瘤研究所藥理室。
[0010]儀器:C02培養(yǎng)箱，超凈工作臺，酶標(biāo)儀，倒置顯微鏡，細(xì)胞培養(yǎng)瓶(Costar，USA),96孔細(xì)胞培養(yǎng)板(Costar，USA)。
[0011]軟件:MicrosoftExcel 7.0 統(tǒng)計(jì)分析軟件；Microcal Origin 6.0 數(shù)據(jù)處理軟件。
[0012]實(shí)驗(yàn)方法
藥物及試劑配制:
RPMI1640培養(yǎng)基一袋加水一升，補(bǔ)加2克碳酸氫鈉，10萬單位青霉素和IOOmg鏈霉素，調(diào)節(jié)pH值至7.4，用0.22Mm除菌濾膜過濾除菌。90ml培養(yǎng)基加滅活新生牛血清IOml即為完全培養(yǎng)液。胰蛋白酶用D-hanks緩沖液配成0.25%溶液后過濾除菌。[0013]準(zhǔn)確稱取錦燈籠宿萼皂苷20.0 mg于滅菌離心管中，加入DMSO 1ml，配成20 mg/ml原液。取10 μ?原液加到IOml的完全培養(yǎng)液中，即成為20 μδ/πι1應(yīng)用液，再分別用完全培養(yǎng)液稀釋為10、5、2.5和1.25μδ/πι1的應(yīng)用液。
[0014]細(xì)胞培養(yǎng)及傳代:
所有細(xì)胞均貼壁培養(yǎng)于含IOml完全培養(yǎng)液細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，于37°C、5%C02、飽合濕度下培養(yǎng)。細(xì)胞長滿瓶底后用滅菌D-hanks液洗兩次，加0.25%胰蛋白酶消化細(xì)胞2分鐘，倒掉胰蛋白酶，待輕搖細(xì)胞能完全脫落后，加完全培養(yǎng)液30ml后，用移液管吹散細(xì)胞，分裝于3個(gè)新的細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，繼續(xù)培養(yǎng)。
[0015]藥物處理:取剛剛長滿的細(xì)胞一瓶，胰蛋白酶消化后加IOml完全培養(yǎng)液懸浮細(xì)胞，用移液管吹打均勻，取兩滴細(xì)胞懸液于顯微鏡下計(jì)數(shù)細(xì)胞數(shù)目，用完全培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞數(shù)目至IO5個(gè)細(xì)胞/毫升。取96孔板一塊,用移液槍吸取IOOul細(xì)胞懸液加到96孔板中，每株細(xì)胞加4列，一塊培養(yǎng)板可加3株不同細(xì)胞。另用一培養(yǎng)板同樣細(xì)胞懸液各四個(gè)孔做本底對照。加完細(xì)胞的培養(yǎng)板于CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12小時(shí)后倒掉原培養(yǎng)液,96孔板中A行加入新鮮完全培養(yǎng)液200 μ1，Β行加入200μ1含0.02% 二甲基亞砜(DMSO)的完全培養(yǎng)液作溶劑對照，C行加入200 μ?含25 Pg/ml長春新堿的完全培養(yǎng)液作陽性對照，D行到H行加入含不同濃度錦燈籠宿萼皂苷的完全培養(yǎng)液200ul，最高濃度為20 Pg/ml，按0.5倍倍比稀釋，分別為10、5、2.5、1.25 Pg/ml。加完藥后培養(yǎng)板置于CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
[0016]上述實(shí)驗(yàn)均在嚴(yán)格無菌條件下進(jìn)行。
[0017]結(jié)果測定:將對照用培養(yǎng)板取出于含細(xì)胞孔中輕輕加入25ul 50%預(yù)冷的三氯醋酸溶液于培養(yǎng)液面上，靜置5分鐘后，在4°C冰箱放置I小時(shí)，棄去上層液體，用去離子水洗5遍，置空氣中干燥后留待與加藥培養(yǎng)板一并染色分析。
`[0018]細(xì)胞加藥培養(yǎng)48小時(shí)后，取出培養(yǎng)板，于每孔加入50ul預(yù)冷的50%三氯醋酸，靜置5分鐘后移入4°C冰箱中靜置I小時(shí)，取出用去離子水洗5遍，空氣中干燥，待完全干燥后每孔加入1%的乙酸配制的0.4%的SRB IOOul，染色20分鐘后倒掉染液，用1%乙酸洗5次，去除未結(jié)合的染料。空氣中干燥后用pH 10.5的10mmol/L的非緩沖Tris堿液150ul溶解，在平板振蕩器上振蕩5分鐘，在BioRad酶標(biāo)儀上測定各孔在490nm的光吸收。本底對照板的細(xì)胞同樣處理測定0D490。
【權(quán)利要求】
1.錦燈籠宿萼皂苷在制備藥物方面的應(yīng)用。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于錦燈籠宿萼皂苷在制備抗腫瘤藥物方面的應(yīng)用。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，起特征在于錦燈籠宿萼皂苷在制備治療抗肝癌、卵巢癌、前列腺癌、結(jié)腸癌、胃 癌、食管癌的藥物中的應(yīng)用。
【文檔編號】A61K36/81GK103800543SQ201210459820
【公開日】2014年5月21日 申請日期:2012年11月15日 優(yōu)先權(quán)日:2012年11月15日
【發(fā)明者】黃振寶 申請人:青島恒潤源通果蔬專業(yè)合作社