專利名稱：組織再生材料的制作方法和組織再生材料的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及向多孔質(zhì)的支撐體(多孔質(zhì)體)導(dǎo)入細胞懸液來進行接種的組織再生材料的制作方法和組織再生材料。
背景技術(shù)：
組織工程領(lǐng)域中正使用在具有連通的多孔質(zhì)結(jié)構(gòu)的支撐體即多孔質(zhì)體中接種有細胞的組織再生材料。重要的是，在多孔質(zhì)體中，直至中心部以三維連通的方式存在用于培養(yǎng)細胞的小孔。實際上，難以使細胞、培養(yǎng)液、培養(yǎng)液中混合有細胞的溶液(以下有時稱為“細胞懸液”)完全滲透到多孔質(zhì)體的小孔中，僅僅向多孔質(zhì)體中滴加細胞懸液或者將多孔質(zhì)體浸潰到細胞懸液中，細胞懸液也不會進入到多孔質(zhì)體的中心部。對此，專利文獻I中，例如如權(quán)利要求8中記載的那樣，提出了一種通過使多孔質(zhì)體沉入細胞懸液中并置于減壓或真空下而使細胞懸液滲透到多孔質(zhì)體中的方法。專利文獻2、3中公開了通過使多孔質(zhì)體中預(yù)先含有水并同時將該水與細胞懸液交替而將細胞懸液導(dǎo)入多孔質(zhì)體中的方法。專利文獻4中，為了使形成在多孔質(zhì)體中的孔較大而使細胞懸液容易進入并且即使為這樣較大的孔也能使細胞懸液保留在多孔質(zhì)體內(nèi)，公開了一種向細胞懸液中添加膠原、明膠等增稠成分的方法。由此，認為能夠在多孔質(zhì)體中導(dǎo)入細胞懸液并使其保留在多孔質(zhì)體中。專利文獻1:日本特表2006-508717號公報專利文獻2:日本特開2007-181459號公報專利文獻3:日本特開2009-195682號公報專利文獻4:日本特開2003-038635號公報但是，對于專利文獻I記載的技術(shù)而言，即使利用負壓，實際上也難以使細胞懸液滲透到整個多孔質(zhì)體中，因此，需要利用激光等形成使細胞懸液滲透的路徑。另外，利用負壓而使壓力發(fā)生較大變化對于細胞而言未必是理想的狀態(tài)。
對于專利文獻2、3公開的技術(shù)而言，雖然能夠在整個多孔質(zhì)體中接種細胞，但是，一部分細胞懸液會流出，因此，存在導(dǎo)入的細胞的數(shù)量不準確的缺點。特別是對于專利文獻f 3記載的技術(shù)而言，存在如下問題:多孔質(zhì)體的小孔較小，從而使以水作為主要成分的細胞懸液無法充分地滲透至多孔質(zhì)體的中心部。因此，如果使用具有較大孔(孔徑180 μ πΓ3500 μ m、平均孔徑350 μ πΓ2000 μ m)的小孔結(jié)構(gòu)的多孔質(zhì)體，則能夠使細胞懸液容易地滲透至中心。但是，在這種較大孔徑的情況下，細胞懸液容易從多孔質(zhì)體中通過，從而使細胞懸液難以保留在多孔質(zhì)體內(nèi)。對此，根據(jù)專利文獻4記載的技術(shù)，雖然能夠使細胞懸液容易滲透至多孔質(zhì)體的中心，但是，增稠成分會殘留在多孔質(zhì)體中，因此，存在難以更換新的培養(yǎng)液的問題。

發(fā)明內(nèi)容
因此，本發(fā)明的課題在于提供一種組織再生材料的制作方法，其能夠穩(wěn)定且不浪費地向具有較大的孔(孔徑180 μ πΓ3500 μ m、平均孔徑350 μ πΓ2000 μ m)、即不易使細胞懸液保留在多孔質(zhì)體內(nèi)的小孔的多孔質(zhì)體中導(dǎo)入細胞懸液從而接種細胞。此外，本發(fā)明提供組織再生材料。以下，對本發(fā)明進行說明。在此，為了便于理解，將附圖中所附的參考標號用括號括起而一并進行記載，但本發(fā)明并不限定于此。第一發(fā)明為一種組織再生材料的制作方法，其中，使多孔質(zhì)體(11)的底面與保持板(I)的表面接觸，所述保持板(I)是對于水的接觸角為15、0°的樹脂板或玻璃板，所述多孔質(zhì)體(11)由細胞密度為5X IO6 I X IO8個細胞/ml的細胞懸液(12)充滿，厚度為2 100mm，具有孔徑為180 3500 μ m、平均孔徑為350 2000 μ m的連通的小孔結(jié)構(gòu)，氣孔率為6(Γ95%，壓縮強度為0.05 lMPa，并且由生物體吸收性高分子材料構(gòu)成；然后，在從重力方向觀察時保持板在多孔質(zhì)體的上側(cè)并且保持板的重量不施加于多孔質(zhì)體的狀態(tài)下在氣體中靜止來接種細胞。第二發(fā)明為一種組織再生材料(10)，其中，在多孔質(zhì)體(11)中以5X106 1X108個細胞/ml的 濃度接種有細胞(13)，所述多孔質(zhì)體的厚度為2 100mm，具有孔徑為180^3500 μ m、平均孔徑為350 2000 μ m的連通的小孔結(jié)構(gòu)，氣孔率為60 95%，壓縮強度為
0.05 IMPa，并且由生物體吸收性高分子材料構(gòu)成。第三發(fā)明為如第二發(fā)明所述的組織再生材料(10)，其中，多孔質(zhì)體(11)的氣孔率為80 90%。第四發(fā)明為如第二發(fā)明或第三發(fā)明所述的組織再生材料(10)，其中，多孔質(zhì)體
(11)的平均孔徑為540^1200 μ Hio第五發(fā)明為如第二發(fā)明至第四發(fā)明中任一項所述的組織再生材料(10)，其中，多孔質(zhì)體(11)中將會相接觸地配置到保持板(I)上的表面即底面的面積為0.5 200cm2。發(fā)明效果根據(jù)本發(fā)明，能夠向具有較大的孔、即不易使細胞懸液保留在其內(nèi)側(cè)的小孔的多孔質(zhì)體中導(dǎo)入細胞懸液，并且能夠穩(wěn)定且不浪費地在該多孔質(zhì)體中接種細胞。


圖1是對組織再生材料的制作方法SlO的步驟進行說明的圖。圖2是對組織再生材料的制作方法SlO的步驟進行說明的另一圖。圖3是表示多孔質(zhì)體的另一實施方式例的圖。圖4是對組織再生材料的制作方法S20的步驟進行說明的圖。圖5是對組織再生材料的制作方法S20的步驟進行說明的另一圖。標號說明I保持板2預(yù)載置板10組織再生材料11多孔質(zhì)體
12細胞懸液
具體實施例方式通過接下來進行說明的具體實施方式
來明確本發(fā)明的上述作用和優(yōu)勢。以下，基于附圖所示的實施方式對本發(fā)明進行說明。但是，本發(fā)明并不限定于這些實施方式。圖1、圖2是對一個實施方式的組織再生材料的制作方法SlO (以下有時記為“制作方法S10”)進行說明的圖。圖1、圖2是表示制作方法SlO的步驟中的情形的圖。在此，組織再生材料10是指接種有細胞的多孔質(zhì)體11。制作方法SlO具有載置步驟SI 1、細胞懸液導(dǎo)入步驟S12和翻轉(zhuǎn)步驟S13。如圖1 (a)所示，載置步驟Sll為在保持板I上載置多孔質(zhì)體11的步驟。在此，保持板I優(yōu)選為對于水的接觸角為15°、0°的樹脂板或玻璃板。對于這種保持板I而言，可以通過將以往作為對細胞進行靜置培養(yǎng)的容器使用的培養(yǎng)皿、燒瓶、多孔板等中使用的玻璃材料或聚苯乙烯、聚乙烯、聚對苯二甲酸乙二醇酯等樹脂材料加工成板狀后使用。這些材料的疏水性高，因此，優(yōu)選根據(jù)需要預(yù)先通過電暈、Y射線、氬射線等的等離子體處理等化學(xué)方法對要使多孔質(zhì)體11接觸的表面導(dǎo)入極性基團來提高親水性，從而使對于水的接觸角達到15°、0°。另外，可以在所要接觸的表面上形成陶瓷被膜。優(yōu)選所要接觸的表面是平滑的，但也可以設(shè)置有高度為數(shù)百微米的凹槽或條狀突起等。多孔質(zhì)體11由生物體吸收性高分子材料形成，并且厚度(在載置于保持板I上的狀態(tài)下的上下方向的尺寸)為2mnTl00mm,優(yōu)選為2.lmnT70mm。多孔質(zhì)體11具有孔徑為180 μ πΓ3500 μ m、平均孔徑為350 μ πΓ2000 μ m的連通的小孔結(jié)構(gòu)，氣孔率為60% 95%。另夕卜，以多孔質(zhì)體11的壓縮強度達到0.05MPa lMPa的方式構(gòu)成。需要說明的是，本發(fā)明中的多孔質(zhì)體的孔的孔徑是指在不考慮小于10 μ m這樣的僅使液體通過的微小氣孔的情況下在整個多孔質(zhì)體中10 μ m以上的氣孔的80%以上為孔徑180 μ πΓ3500 μ m。需要說明的是，在此，“氣孔率”為由相同體積的多孔質(zhì)體的重量相對于所使用的生物體吸收性高分子材料的原料塊的重量計算得到的值。在此，氣孔率小于60%時，細胞培養(yǎng)的效率降低，而超過95%時，多孔質(zhì)體的強度降低。因此，氣孔率進一步優(yōu)選為80°/Γ90%。另外，孔徑小于180 μ m時，難以使細胞自由通過，從而無法將細胞充分地接種到多孔質(zhì)體的內(nèi)部。另一方面，孔徑大于3500 μ m時，多孔質(zhì)體的強度降低。另外，平均孔徑優(yōu)選為540 μ πΓ 200 μ m。關(guān)于上述壓縮強度，壓縮強度低于0.05MPa時，多孔質(zhì)體會因添加細胞懸液時的表面張力、培養(yǎng)細胞時受到的來自細胞懸液的細胞的伸展應(yīng)力而產(chǎn)生收縮。另一方面，制作超過IMPa的多孔質(zhì)體在技術(shù)上來說較困難。需要說明的是，在此，“壓縮強度”是指將直徑IOmmX高度2mm的圓柱形試驗體以Imm/分鐘的十字頭速度壓縮時的壓縮斷裂強度。關(guān)于多孔質(zhì)體的厚度，由于是以使細胞懸液充分地滲透至多孔質(zhì)體的中心部作為目的，因此，使用厚度小于2mm的多孔質(zhì)體的必要性較小。另一方面，超過IOOmm時，難以導(dǎo)入細胞或者難以進行長時間培養(yǎng)。對于上述多孔質(zhì)體的形狀而言 ，如圖1、圖2所示基本上為立方體，此外也優(yōu)選半圓形或穹頂形，但只要能夠如后所述經(jīng)過翻轉(zhuǎn)步驟S13后在從重力方向觀察時上述保持板I在上側(cè)并且保持板I的重量不施加于多孔質(zhì)體的狀態(tài)下在氣體中靜止來接種細胞則沒有特別限定。例如如圖3所示可以為圓板狀。優(yōu)選為此時的多孔質(zhì)體的底面積(與保持板I相接觸的表面的面積)相對于厚度具有充分大小的面積的形狀。具體而言，在多孔質(zhì)體的體積lcnT50000Cm3的范圍內(nèi)，底面積優(yōu)選為0.5cnT200cm2。小于0.5cm2或超過200cm2時，難以在懸掛于保持板上的狀態(tài)下進行接種。需要說明的是，可以在多孔質(zhì)體的生物體吸收性高分子材料內(nèi)分散粉末狀磷酸鈣，例如羥基磷灰石或β -三磷酸鈣。構(gòu)成多孔質(zhì)體的材料為生物體吸收性高分子材料，只要能夠在體內(nèi)維持其形態(tài)一定時間則可以沒有特別限定地使用。可以例示例如選自以往使用的聚乙醇酸、聚乳酸、乳酸-乙醇酸共聚物、聚-ε -己內(nèi)酯、乳酸-ε -己內(nèi)酯共聚物、聚氨基酸、聚原酸酯以及它們的共聚物中的至少一種。其中，從被美國食品藥品監(jiān)督管理局(FDA)批準為對人體無害的高分子及其實際效果的方面出發(fā)，最優(yōu)選聚乙醇酸、聚乳酸、乳酸-乙醇酸共聚物。生物體吸收性高分子材料的重均分子量優(yōu)選為5000 2000000，更優(yōu)選為10000 500000。多孔質(zhì)體的制作方法沒有特別限定，可以列舉例如下述制作方法:在將生物體吸收性高分子材料溶解于有機溶劑中而成的溶液中，大致均勻地混合不溶于該有機溶劑、并且能夠用不溶解生物體吸收性高分子材料的液體溶解的、粒徑為100 μ πΓ2000 μ m的粒狀物質(zhì)，并對其進行冷凍。然后，進行干燥而除去有機溶劑，由此制作含有粒狀物質(zhì)的、具有孔徑為5 μ πΓ50 μ m的小孔結(jié)構(gòu)的多孔質(zhì)生物體吸收性高分子。然后，將該多孔質(zhì)生物體吸收性高分子用磨機等粉碎后，利用不溶解生物體吸收性高分子的液體溶解粒狀物質(zhì)而除去，然后，過篩而得到平均粒徑為100 μ πΓ3000 μ m的生物體吸收性顆粒狀多孔物質(zhì)，將上述生物體吸收性顆粒狀多孔物質(zhì)裝入到預(yù)定形狀的容器內(nèi)，進行加壓加熱。接下來對制作方法SlO進行說明。通過載置步驟Sll，形成保持板I的表面上載置有多孔質(zhì)體11的狀態(tài)，接著，在細胞懸液導(dǎo)入步驟S12中，如圖1(b)所示，通過例如滴加或注入等方法向多孔質(zhì)體11中導(dǎo)入細胞懸液12。由此,如圖2(a)所示,形成細胞懸液12滲透到多孔質(zhì)體11內(nèi)并且多 孔質(zhì)體11由細胞懸液12完全充滿的狀態(tài)。此時,相對于多孔質(zhì)體11的體積，細胞懸液12的量過多時，存在后述的翻轉(zhuǎn)步驟S13難以進行或者培養(yǎng)的效率降低的趨勢，因此，優(yōu)選導(dǎo)入可浸透整個多孔質(zhì)體11且不從多孔質(zhì)體11中過量漏出的量的細胞懸液。導(dǎo)入的細胞懸液的細胞密度為5X IO6個細胞/mf I X IO8個細胞/ml。另外，被培養(yǎng)的細胞可以自由地使用各種細胞?？梢允褂美?表皮細胞、角質(zhì)形成細胞、脂肪細胞、肝細胞、神經(jīng)細胞、神經(jīng)膠質(zhì)細胞、星形膠質(zhì)細胞、上皮細胞、乳房表皮細胞、胰島細胞、內(nèi)皮細胞、間質(zhì)細胞、真皮成纖維細胞、間皮細胞、造骨細胞、平滑肌細胞、橫紋肌細胞、韌帶成纖維細胞、跟腱成纖維細胞和軟骨細胞、骨髓細胞、成骨細胞、牙胚細胞、牙周膜細胞、牙髓細胞、成體干細胞或ES細胞等。接著，通過翻轉(zhuǎn)步驟S13，從圖2 (a)所示的狀態(tài)翻轉(zhuǎn)至保持板I在上且含有細胞懸液12的多孔質(zhì)體11在下而形成圖2(b)所示的狀態(tài)。即，在從重力方向觀察時保持板I在多孔質(zhì)體11的上側(cè)并且保持板I的重量不施加于多孔質(zhì)體11的狀態(tài)下在氣體中靜止。在該狀態(tài)下維持靜止，使導(dǎo)入的細胞貼附到多孔質(zhì)體11的孔的內(nèi)壁上而完成接種，從而形成組織再生材料10。為了使細胞貼附到多孔質(zhì)體上而在氣體中靜止的時間根據(jù)多孔質(zhì)體的材質(zhì)、細胞的種類而不同，一般為20分鐘 300分鐘。根據(jù)如上所述的制作方法S10，由于多孔質(zhì)體11具有較大的孔，因此能夠使細胞懸液適度地滲透至多孔質(zhì)體11的內(nèi)部。而且，通過如上所述在從重力方向觀察時保持板I在多孔質(zhì)體11的上側(cè)并且保持板I的重量不施加于多孔質(zhì)體11的狀態(tài)下在氣體中靜止，能夠最終以細胞懸液12不從多孔質(zhì)體11中漏出的方式保持細胞懸液。于是，能夠穩(wěn)定且不浪費地導(dǎo)入細胞懸液12而將細胞接種到多孔質(zhì)體中。之后，接種有細胞的多孔質(zhì)體即組織再生材料10可以通過現(xiàn)有的方法來進行細胞培養(yǎng)。另外，為了實現(xiàn)上述制作方法，優(yōu)選使用如上所述的接種有細胞懸液的多孔質(zhì)體。由此，能夠制成可實現(xiàn)上述效果的組織再生材料。圖4、圖5是對另一實施方式的組織再生材料的制作方法S20(以下有時記為“制作方法S20”)進行說明的圖。圖4、圖5是表示制作方法S20的步驟中的情形的圖。需要說明的是，本實施方式中，對與上述實施方式中已說明的部分共通的部分標記相同標號并省略說明。制作方法S20具有預(yù)載置步驟S21、細胞懸液導(dǎo)入步驟S22、夾持步驟S23和保持步驟S24。預(yù)載置步驟S21為在拒水性高的板狀構(gòu)件即預(yù)載置板2上載置多孔質(zhì)體11的步驟。預(yù)載置板2優(yōu)選為對于水的接觸角大于90°的樹脂板或玻璃板。細胞懸液導(dǎo)入步驟S22與上述細胞懸液導(dǎo)入步驟S12 —樣，向多孔質(zhì)體11導(dǎo)入細胞懸液12。由此，如圖4(b)所示，形成細胞懸液12滲透而充滿整個多孔質(zhì)體11的狀態(tài)。如圖5(a)所示，夾持步驟S23為以將由細胞懸液充滿的多孔質(zhì)體11夾在保持板I與預(yù)載置板2之間的方式使多孔質(zhì)體11與保持板I的表面相接觸的步驟。

如圖5(b)所示，保持步驟S24為將與多孔質(zhì)體11相接觸的保持板I向上提起而使多孔質(zhì)體11保持在保持板I側(cè)并從預(yù)載置板2上脫離的步驟。由此，多孔質(zhì)體11與上述實施方式同樣地在從重力方向觀察時保持板I在多孔質(zhì)體11的上側(cè)并且保持板I的重量不施加于多孔質(zhì)體11的狀態(tài)下在氣體中靜止。在該狀態(tài)下維持靜止，使導(dǎo)入的細胞貼附到多孔質(zhì)體11的內(nèi)壁上而完成接種,從而形成組織再生材料10。在此，預(yù)載置板2由具有拒水性的板構(gòu)成，保持板I由具有親水性的板構(gòu)成，因此，能夠適當(dāng)進行由細胞懸液充滿的多孔質(zhì)體的如上所述的保持、脫離。實施例以下，通過實施例對本發(fā)明更具體地進行說明，但本發(fā)明并不受這些實施例的限定。<移植細胞的準備>移植細胞A:從人髂骨骨髓液中提取的間質(zhì)干細胞將從人髂骨骨髓液中提取的細胞用10%FBS、DMEM培養(yǎng)基混懸，然后，以有核細胞數(shù)為I X IO5個細胞/IOcm直徑的培養(yǎng)皿進行接種。在37°C下、在5% 二氧化碳存在下進行培養(yǎng)。在第3天更換培養(yǎng)基，并除去非貼壁細胞(造血系細胞)。之后，每3天更換一次培養(yǎng)基。從第5天開始以3ng/ml向培養(yǎng)基中添加bFGF。10天左右增殖至大致鋪滿的程度。將上述培養(yǎng)皿用胰蛋白酶(0.05%) + EDTA(0.2mM)孵育5分鐘，分離出細胞。用Coulter計數(shù)儀(Zl '> >>，庫爾特公司制造)計測細胞數(shù)，以5000個細胞/cm2的密度接種細胞。重復(fù)該操作，使用從達到大致鋪滿(->卜)的程度的第二代傳代培養(yǎng)皿中得到
的第三代細胞。移植細胞B:從人顎骨骨髓液中提取的間質(zhì)干細胞將從人顎骨骨髓液中提取的細胞用10%FBS、DMEM培養(yǎng)基混懸，然后，以有核細胞數(shù)為I X IO5個細胞/IOcm直徑的培養(yǎng)皿進行接種。在37°C下、在5% 二氧化碳存在下進行培養(yǎng)。在第3天更換培養(yǎng)基，并除去非貼壁細胞(造血系細胞)。之后，每3天更換一次培養(yǎng)基。從第5天開始以3ng/ml向培養(yǎng)基中添加bFGF。10天左右增殖至大致鋪滿的程度。將上述培養(yǎng)皿用胰蛋白酶(0.05%) + EDTA(0.2mM)孵育5分鐘，分離出細胞。用Coulter計數(shù)儀(Zl '> >>，庫爾特公司制造)計測細胞數(shù)，以5000個細胞/cm2的密度接種細胞。重復(fù)該操作，重復(fù)該操作，使用從達到大致鋪滿(- > 7 > - >卜)的程度的第二代傳代培養(yǎng)皿中得到的第三代細胞。移植細胞C:從人耳廓軟骨中提取的軟骨細胞用手術(shù)刀將人耳廓軟骨細細切碎，用膠原酶在37°C下處理30分鐘而得到細胞懸液，將該懸液用10%FBS、DMEM培養(yǎng)基混懸，然后，以有核細胞數(shù)為I X IO5個細胞/IOcm直徑的培養(yǎng)皿進行接種。在37°C下、在5% 二氧化碳存在下進行培養(yǎng)。在第3天更換培養(yǎng)基，并除去非貼壁成分(細胞+組織片)。之后，每3天更換一次培養(yǎng)基。從第5天開始以3ng/ml向培養(yǎng)基中添加bFGF。10天左右增殖至大致鋪滿的程度。將上述培養(yǎng)皿用胰蛋白酶(0.05%) + EDTA (0.2mM)孵育5分鐘，分離出細胞。用Coulter計數(shù)儀(Zl '> >夕>，庫爾特公司制造)計測細胞數(shù)，以5000個細胞/cm2的密度接種細胞。重復(fù)該操作，使用從達到大致鋪滿(- > 7 > - >卜)的程度的第二代傳代培養(yǎng)皿中得到的第三代細胞。<多孔質(zhì)體的準備>多孔質(zhì)體A:聚乳酸乙醇酸共聚物(PLGA)塊使分子量為250000的DL-乳酸/乙醇酸共聚物溶解在二囉燒中，然后，與粒徑約為500 μ m的氯化鈉混合，并冷凍干燥，粉碎并脫鹽，將由此得到粉末狀材料壓縮加熱成形，由此，制作平均孔徑為540 μ m、氣孔率為90%、壓縮強度為0.2MPa、直徑為9mm且厚度為3mm的由生物體吸收性合成高分子構(gòu)成的塊狀多孔質(zhì)體。多孔質(zhì)體B:聚乳酸乙醇酸共聚物(PLGA)塊使分子量為250000的DL-乳酸/乙醇酸共聚物溶解在二燒中，然后，使粒徑為10 μ m的羥基磷灰石粉分散，與粒徑約為500 μ m的氯化鈉混合，并冷凍干燥，粉碎并脫鹽，將由此得到粉末狀材料壓縮加熱成形，由此，制作平均孔徑為540μπκ氣孔率為90%、壓縮強度為0.2MPa、直徑為13mm且厚度為5mm的由生物體吸收性合成高分子和磷酸鈣材料構(gòu)成的塊狀多孔質(zhì)體。<實施例1>使多孔質(zhì)體A的圓盤狀底面與玻璃板(尺寸為IOOmmX IOOmmX 2mm,相對于水的接觸角為28° )的上表面接觸而載置。將在軟骨分化用培養(yǎng)液((1|^1、葡萄糖4.511^/1111、1(Γ7Μ地塞米松、50 μ g/ml的抗壞血酸_2_磷酸、10ng/ml的TGF-β、6.25 μ g/ml的胰島素、
6.25 μ g/ml的轉(zhuǎn)鐵蛋白、6.25ng/ml的硒酸、5.33 μ g/ml的亞油酸、1.25mg/ml的牛血清白蛋白)中以2 X IO7個細胞/ml的密度混懸而得到的0.19ml的移植細胞A滴加到多孔質(zhì)體A中來進行導(dǎo)入。在將玻璃板翻轉(zhuǎn)而呈倒置的狀態(tài)下，在37°C、濕度為100%、5%C02的條件下用30分鐘使細胞貼附到材料上，由此將細胞接種到多孔質(zhì)體A上，得到組織再生材料。然后，裝入到充滿軟骨分化用培養(yǎng)液的50ml離心管中，在37°C下每3天更換一次培養(yǎng)基來培養(yǎng)4周，制作了軟骨組織再生用細胞移植體。<實施例2>使多孔質(zhì)體B的圓盤狀底面與等離子體處理聚苯乙烯板(尺寸為50mmX50mmX2mm，相對于水的接觸角為71° )的上表面接觸而載置。將在骨分化用培養(yǎng)液(a MEM、葡萄糖4.5mg/ml、10%的FBS> IO^7M地塞米松、50 μ g/ml的抗壞血酸~2~磷酸、IOmM的β -甘油磷酸)中以5Χ IO7個細胞/ml的密度混懸而得到的0.67ml的移植細胞B滴加到多孔質(zhì)體B中來進行導(dǎo)入。在將等離子體處理聚苯乙烯板翻轉(zhuǎn)而呈倒置的狀態(tài)下，在37°C、濕度為100%、5%C02的條件下用100分鐘使細胞貼附到材料上，由此將細胞接種到多孔質(zhì)體B上，得到組織再生材料。然后，裝入到充滿骨分化用培養(yǎng)液的50ml離心管中，在37°C下每3天更換一次培養(yǎng)基來培養(yǎng)2周，制作了骨組織再生用細胞移植體?！磳嵤├?>使多孔質(zhì)體B的圓盤狀底面與等離子體處理丙烯酸板(尺寸為50mmX 50mmX 2mm,相對于水的接觸角為58° )的上表面接觸而載置。將在軟骨分化用培養(yǎng)液(α MEM、葡萄糖4.5mg/ml、10_7M 地塞米松、50 μ g/ml 的抗壞血酸 ~2~ 磷酸、10ng/ml 的 TGF- β、6.25 μ g/ml白勺胰島素、6.25 μ g/ml的轉(zhuǎn)鐵蛋白、6.25ng/ml的硒酸、5.33 μ g/ml的亞油酸、1.25mg/ml的牛血清白蛋白)中以2X IO7個細胞/ml的密度混懸而得到的0.67ml的移植細胞C滴加到多孔質(zhì)體B中來進行導(dǎo)入。在將等離子體處理丙烯酸板翻轉(zhuǎn)而呈倒置的狀態(tài)下，在37°C、濕度為100%、5%C02的條件下用30分鐘使細胞貼附到材料上，由此將細胞接種到多孔質(zhì)體B上，得到組織再生材料。然后，裝入到充滿軟骨分化用培養(yǎng)液的50ml離心管中，在37°C下每3天更換一次培養(yǎng)基來培養(yǎng)4周，制作了軟骨組織再生用細胞移植體。<實施例4>將多孔質(zhì)體A放置到拒水處理后的玻璃板(尺寸為50mmX50mmX2mm，相對于水的接觸角為114° )上。將在骨分化用培養(yǎng)液(0|^11、葡萄糖4.51^/1111、10%的？83、10-^地塞米松、50 μ g/ml的抗壞血酸-2-磷酸、IOmM的β甘油磷酸)中以5 X IO7個細胞/ml的密度混懸而得到的0.19ml的移植細胞B滴加到多孔質(zhì)體A中來進行導(dǎo)入。自放置有多孔質(zhì)體A的玻璃板的上方平穩(wěn) 地放下等離子體處理聚苯乙烯板(尺寸為50mmX 50mmX 2mm,相對于水的接觸角為71° )，從而以輕輕地夾持的方式使多孔質(zhì)體A與等離子體處理聚苯乙烯板面接觸。將接觸后的等離子體處理聚苯乙烯板慢慢向上提拉，使多孔質(zhì)體A保持在等離子體處理聚苯乙烯板側(cè)并從玻璃板上脫離。使多孔質(zhì)體A在從重力方向觀察時等離子體處理聚苯乙烯板為上側(cè)并且等離子體處理聚苯乙烯板的重量不施加于多孔質(zhì)體A的狀態(tài)下在氣體中靜止，并在倒置的狀態(tài)下在37°C、濕度為100%、5%C02的條件下用100分鐘使細胞貼附到材料上，由此將細胞接種到多孔質(zhì)體A上，得到組織再生材料。然后，裝入到充滿骨分化用培養(yǎng)液的50ml離心管中，在37°C下每3天更換一次培養(yǎng)基來培養(yǎng)2周，制作了骨組織再生用細胞移植體。
權(quán)利要求
1.一種組織再生材料的制作方法，其中，使多孔質(zhì)體的底面與保持板的表面接觸，所述保持板是對于水的接觸角為15、0°的樹脂板或玻璃板，所述多孔質(zhì)體由細胞密度為5 X IO6 I X IO8個細胞/ml的細胞懸液充滿，厚度為2 100mm，具有孔徑為18(Γ3500μπι、平均孔徑為35(Γ2000 μ m的連通的小孔結(jié)構(gòu)，氣孔率為60 95%，壓縮強度為0.05 IMPa，并且由生物體吸收性高分子材料構(gòu)成； 然后，在從重力方向觀察時所述保持板在所述多孔質(zhì)體的上側(cè)并且所述保持板的重量不施加于所述多孔質(zhì)體的狀態(tài)下在氣體中靜止來接種細胞。
2.一種組織再生材料，其中，在多孔質(zhì)體中以5X IO6 I X IO8個細胞/ml的濃度接種有細胞，所述多孔質(zhì)體的厚度為2 100mm，具有孔徑為180 3500 μ m、平均孔徑為350 2000 μ m的連通的小孔結(jié)構(gòu)，氣孔率為6(Γ95%，壓縮強度為0.05 IMPa，并且由生物體吸收性高分子材料構(gòu)成。
3.如權(quán)利要求2所述的組織再生材料，其中，所述多孔質(zhì)體的氣孔率為80、0%。
4.如權(quán)利要求2或3所述的組織再生材料，其中，所述多孔質(zhì)體的所述平均孔徑為540 1200 μ m。
5.如權(quán)利要求2 4中任一項所述的組織再生材料，其中，所述多孔質(zhì)體中將會相接觸地配置到保持板上 的表面即底面的面積為05 200cm2。
全文摘要
本發(fā)明提供一種組織再生材料的制作方法和組織再生材料。本發(fā)明的制作方法，使多孔質(zhì)體(11)的底面與保持板(1)的表面接觸，所述保持板是對于水的接觸角為5~90°的樹脂板或玻璃板，所述多孔質(zhì)體由細胞密度為5×106~1×108個細胞/ml的細胞懸液(12)充滿，厚度為2~100mm，具有孔徑為180~3500μm、平均孔徑為350~2000μm的連通的小孔結(jié)構(gòu)，氣孔率為60~95%，壓縮強度為0.05~lMPa，并且由生物體吸收性高分子材料構(gòu)成；然后，在從重力方向觀察時保持板在多孔質(zhì)體的上側(cè)且保持板的重量不施加于多孔質(zhì)體的狀態(tài)下在氣體中靜止來在多孔質(zhì)體中接種細胞。
文檔編號A61L27/56GK103157142SQ201210528469
公開日2013年6月19日 申請日期2012年12月10日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月16日
發(fā)明者山中克之, 山本克史, 坂井裕大, 重光勇介 申請人:株式會社Gc