專利名稱：一種制備鴨出血性卵巢炎滅活疫苗的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種利用激流灌注式生物反應(yīng)器制備鴨出血性卵巢炎滅活疫苗的方法，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域
背景技術(shù)：
鴨出血性卵巢炎(Duck Hemorrhagic Ovaritis, DH0)是一種急性、高度接觸性鴨傳染病，是因感染鴨出血性卵巢炎病毒(Duck Hemorrhagic Ovaritis Virus, DH0V)所致，DHOV屬于黃病毒科成員，可引起不同日齡鴨采食量、產(chǎn)蛋率急劇下降，甚至癱瘓。剖解主要可見卵巢出血、萎縮，卵泡變形、變性，卵黃、睪丸、輸卵管和輸精管萎縮。2010年，鴨出血性卵巢炎疾病首次發(fā)現(xiàn)于中國浙江，隨后在江蘇、山東、河北和北京等地區(qū)發(fā)生。主要見于開產(chǎn)蛋鴨，感染鴨群發(fā)病率幾乎100%，死亡率為5% 30%，產(chǎn)蛋率可下降至1(Γ30%甚至10%以下，給養(yǎng)鴨業(yè)帶來巨大的經(jīng)濟(jì)損失，由于該病是病毒性疾病，目前無特效治療方法，及時(shí)注射疫苗及預(yù)防性接種是防治該病唯一有效手段。目前，國內(nèi)已有利用分離的流行毒株制備鴨出血性卵巢炎疫苗的研究報(bào)道，其生產(chǎn)工藝均為傳統(tǒng)的轉(zhuǎn)瓶生產(chǎn)方式，利用生物反應(yīng)器制備鴨出血性卵巢炎滅活疫苗的方法未見報(bào)道。生物反應(yīng)器作為一種新型工具，能夠有效提高細(xì)胞及病毒產(chǎn)量，穩(wěn)定疫苗批間差異，因此研究利用生物反應(yīng)器制備鴨出血性卵巢炎滅活疫苗符合行業(yè)發(fā)展趨勢(shì)。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是提供一種利用激流灌注式生物反應(yīng)器制備鴨出血性卵巢炎滅活疫苗的方法。本發(fā)明所述技術(shù)問題是由以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的?！N制備鴨出血性卵巢炎滅活疫苗的方法，它利用激流灌注式生物反應(yīng)器為培養(yǎng)系統(tǒng)，所述激流灌注式生物反應(yīng)器包括第一蠕動(dòng)泵、第二蠕動(dòng)泵，第一硅膠管、第二硅膠管、激流罐、灌注袋、有孔硅膠管和聚酯纖維紙片載體；所述灌注袋為內(nèi)含聚酯纖維紙片載體的細(xì)胞培養(yǎng)袋，兩個(gè)灌注袋結(jié)構(gòu)與功能完全相同，以相同的方式與激流罐連接，通過外源泵實(shí)現(xiàn)物質(zhì)交換；
滅活疫苗的制備按以下步驟進(jìn)行:
a.制苗用細(xì)胞的培養(yǎng)
將細(xì)胞懸液即種子細(xì)胞和細(xì)胞生長液混合液接種至激流灌注式生物反應(yīng)器的灌注袋
(6)，使細(xì)胞貼附在聚酯纖維紙片載體(8)上，接種密度為:每克載體接種0.8 1.2 X IO7個(gè)細(xì)胞，設(shè)定設(shè)備參數(shù):溫度 Tl:37 37.5°C、T2:40 45°C、T3:35 36°C，pH:7.0 7.4，DO:40% 70%，振蕩速度30 50r/min，空氣流量100ml/min 1000ml/min，啟動(dòng)細(xì)胞培養(yǎng)程序，進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，得到制苗用細(xì)胞；
b.病毒接種與培養(yǎng)
當(dāng)細(xì)胞單日耗糖趨于平穩(wěn)時(shí)，表明細(xì)胞達(dá)到接毒要求，排空反應(yīng)器內(nèi)液體，將鴨出血性卵巢炎病毒種毒接種制苗用細(xì)胞，設(shè)定設(shè)備參數(shù):溫度Tl:36.5 37.5°C、T2:39 41°C、T3:34 35°C，pH:7.2 7.4，DO:40% 70%，振蕩速度 30 50 r/min,空氣流量 400ml/min 4000ml/min,啟動(dòng)病毒培養(yǎng)程序,擴(kuò)增培養(yǎng)鴨出血性卵巢炎病毒；
c.病毒液收獲
病毒培養(yǎng)42 46h后，收獲激流罐(5)與灌注袋(6)內(nèi)的病毒液，將灌注袋(6)反復(fù)凍融2 3次后收獲上清液,混合后_20°C保存?zhèn)溆?；檢測(cè)病毒液效價(jià)；
d.病毒液滅活
收獲的病毒液中加入甲醛滅活劑，滅活病毒；
e.疫苗制備
滅活的病毒液加入佐劑，乳化制備成鴨出血性卵巢炎滅活疫苗。上述制備鴨出血性卵巢炎滅活疫苗的方法，步驟a中，種子細(xì)胞為幼倉鼠腎傳代細(xì)胞BHK21，為經(jīng)過有限稀釋法克隆純化篩選的細(xì)胞；應(yīng)用有限稀釋法將待篩選細(xì)胞進(jìn)行單克隆化，擴(kuò)大培養(yǎng)建立單克隆化細(xì)胞庫，通過TCID5tl篩選鴨出血性卵巢炎病毒疫苗株的高適應(yīng)性單克隆化細(xì)胞株。上述制備鴨出血性卵巢炎滅活疫苗的方法，步驟a中，細(xì)胞培養(yǎng)過程中采用階段流加方式補(bǔ)充細(xì)胞生長液，當(dāng)殘?zhí)橇康陀?g/L時(shí)，流加補(bǔ)充細(xì)胞生長液，流加量以培養(yǎng)液殘?zhí)橇坎坏陀趌g/L為準(zhǔn)，當(dāng)培養(yǎng)液體積達(dá)到有效培養(yǎng)體積時(shí)，進(jìn)行換液。上述制備鴨出血性卵巢炎滅活疫苗的方法，步驟a中，逐日增大空氣流量，每24h增加 100ml/min 1000ml/min。上述制備鴨 出血性卵巢炎滅活疫苗的方法，步驟b中，病毒接種前將種毒混于細(xì)胞維持液中，種毒與細(xì)胞維持液按V/V 0.5% 2%混合，病毒接種時(shí)將混有病毒液的細(xì)胞維持液泵入反應(yīng)器系統(tǒng)中，無需吸附，直接啟動(dòng)病毒培養(yǎng)程序擴(kuò)增培養(yǎng)病毒。上述制備鴨出血性卵巢炎滅活疫苗的方法，步驟b中，病毒培養(yǎng)12h時(shí)開始持續(xù)流加補(bǔ)充η倍濃縮DMEM液和200g/L葡萄糖，流加速度以培養(yǎng)液殘?zhí)橇坎坏陀趌g/L為準(zhǔn)；所述η等于2 5。上述制備鴨出血性卵巢炎滅活疫苗的方法，所述η倍濃縮DMEM液配制方法為:1份DMEM干粉培養(yǎng)基按照使用說明書用量加入去離子水配置成I XDMEM液后，再加入(η_1)份無Na-DMEM干粉培養(yǎng)基，溶解即成；所述η等于2 5。上述制備鴨出血性卵巢炎滅活疫苗的方法，步驟d中，收獲病毒液中按V/V1% 10%加入質(zhì)量濃度為37%的甲醛溶液，70 140r/min，2-8°c滅活12 24h。上述制備鴨出血性卵巢炎滅活疫苗的方法，步驟e中，在滅活的病毒液中按水相與油相佐劑V/V 3:1緩慢加入ISA 28 VG或MF59佐劑，乳化制備成水包油型鴨出血性卵巢炎滅活疫苗。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下有益效果:
1.本發(fā)明應(yīng)用生物反應(yīng)器培養(yǎng)并增殖鴨出血性卵巢炎病毒，與傳統(tǒng)的轉(zhuǎn)瓶生產(chǎn)工藝相t匕，提供了更大的表面積，增加了細(xì)胞密度，提高了病毒產(chǎn)量及滴度，自動(dòng)化控制了細(xì)胞培養(yǎng)環(huán)境，穩(wěn)定疫苗批間差異。2.在本發(fā)明中，制苗用細(xì)胞經(jīng)過純化篩選，提高了細(xì)胞對(duì)病毒的敏感性，保證了種子細(xì)胞的狀態(tài)均一，減少細(xì)胞批次間差異，確保生產(chǎn)工藝參數(shù)和產(chǎn)品質(zhì)量的穩(wěn)定。
3.在本發(fā)明中，與常規(guī)激流灌注式生物反應(yīng)器培養(yǎng)系統(tǒng)相比，增加了一個(gè)灌注袋，有效增大了細(xì)胞貼壁面積，細(xì)胞數(shù)量增加近一倍，大幅提高病毒液產(chǎn)量。4.本發(fā)明細(xì)胞接種至反應(yīng)器后，逐日增加空氣流量，可以加快系統(tǒng)內(nèi)氣體循環(huán)，有利于培養(yǎng)液內(nèi)CO2的溢出，減少NaHCO3的使用量。5.本發(fā)明中，鴨出血性卵巢炎病毒接種時(shí)采用同步接種法，無需吸附，簡化操作，節(jié)省人力。6.本發(fā)明在接毒后補(bǔ)充訂制的濃縮營養(yǎng)液和葡萄糖，可以倍增多種氨基酸含量，為病毒繁殖提供了充足的營養(yǎng)，有利于提高病毒產(chǎn)量。7.本發(fā)明在半成品滅活中中采用高濃度甲醛低溫滅活鴨出血性卵巢病毒，一方面，更好的保持病毒良好的抗原性，另一方面又快速滅活病毒，減少病毒的失活損失。8.本發(fā)明中采用進(jìn)口水包油型佐劑，具有單位疫苗抗原含量高，產(chǎn)生免疫反應(yīng)快，免疫后廣2周就能較好對(duì)抗強(qiáng)毒攻擊，適合于緊急免疫預(yù)防接種。



圖1是激流灌注式生物反應(yīng)器的液體循環(huán)系統(tǒng)組成示意 圖2是本發(fā)明的工藝路線 圖3病毒液時(shí)間滴度曲線圖。附圖或文中中各標(biāo)號(hào)清單為:1.第一蠕動(dòng)泵(灌注出液泵)，2.第二蠕動(dòng)泵(灌注進(jìn)液泵)，3.第一硅膠管、4.第二硅膠管，5.激流罐，6.灌注袋，7.有孔硅膠管，8.聚酯纖維紙片載體；
Tl為激流罐內(nèi)液體溫度，T2為激流罐加熱膜的溫度，T3為灌注袋外環(huán)境溫度，pH為激流罐內(nèi)液體PH值，DO為激流罐內(nèi)液體溶氧率，振蕩速度為激流罐的振蕩速度，空氣流量為激流罐內(nèi)空氣流通量。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施方式
對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說明，其中各實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而并非限定本發(fā)明的專利保護(hù)范圍。實(shí)施例1有限稀釋法克隆純化篩選制苗用細(xì)胞(倉鼠腎細(xì)胞BHK21)
幼倉鼠腎細(xì)胞BHK21購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所。鴨出血性卵巢炎病毒疫苗株為鴨出血性卵巢炎病毒HB株，于2011年7月I日保藏在中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏號(hào)為CCTCC V201122 ;保藏地址為:中國，武漢大學(xué)。所述病毒是ssRNA病毒,有囊膜；病毒顆粒大體呈球狀,直徑40 60nm ;該病毒對(duì)外界環(huán)境的抵抗力較強(qiáng)，在4°C中存放幾周，在_20°C中存放幾個(gè)月，其感染力均不受影響；該病毒對(duì)乙醚、氯仿敏感；大多數(shù)去污劑能將它迅速滅活；在37°C條件下，用0.1 %福爾馬林熏蒸6h便可把它滅活；該病毒不能凝集雞、鴨、火雞的紅細(xì)胞，可以凝集1%鴿紅血球；所述病毒可在9 13日齡鴨胚尿囊腔、胚絨毛尿囊膜，9 10日齡雞胚尿囊腔、胚絨毛尿囊膜，6日齡雞胚卵黃囊，7 8日齡鴨胚卵黃囊中培養(yǎng)。細(xì)胞生長液的配方為體積百分含量90%高糖DMEM液，10%新生牛血清，調(diào)整PH值為 7.4 ;細(xì)胞維持液為體積百分含量96%高糖DMEM液，4%新生牛血清，調(diào)整PH值為7.5 ;
A.單克隆細(xì)胞株制備 a.細(xì)胞懸液的制備
細(xì)胞瓶中培養(yǎng)倉鼠腎細(xì)胞BHK21，待細(xì)胞長滿為致密的單層、輪廓清晰時(shí)，用0.05%胰酶進(jìn)行消化，制成懸液。b.細(xì)胞的有限稀釋
對(duì)所制備的倉鼠腎細(xì)胞BHK21懸液進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，加入無血清的DMEM培養(yǎng)液稀釋細(xì)胞懸液，使得細(xì)胞密度約為1.0X IO5個(gè)/ml ;用無血清DMEM培養(yǎng)液將稀釋后的倉鼠腎細(xì)胞BHK21懸液10倍梯度稀釋至IO3個(gè)/ml，再用細(xì)胞生長液10倍梯度稀釋到IO1個(gè)/ml，即每
0.1ml I個(gè)細(xì)胞。c.細(xì)胞的克隆培養(yǎng)
將上述稀釋好的細(xì)胞懸液加入96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，0.1ml/孔，顯微鏡下觀察，棄去非單一細(xì)胞并且細(xì)胞狀態(tài)不佳的細(xì)胞孔，置于37°C 5% CO2培養(yǎng)，每天觀察細(xì)胞生長狀態(tài)并及時(shí)換液，待細(xì)胞增殖為克隆群落，選取生長狀態(tài)良好的細(xì)胞孔，用0.05%胰酶進(jìn)行消化，制成懸液，重復(fù)上述克隆方法廣2次，直至篩選出單克隆生長孔。d.單克隆化細(xì)胞株的擴(kuò)大培養(yǎng)
選取單克隆生長孔，用0.05%胰酶消化，以小牛血清中和，以細(xì)胞生長液重懸，轉(zhuǎn)移至24孔細(xì)胞培養(yǎng)板進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞增殖到匯合度約為80%時(shí)，用0.05%胰酶消化，加入細(xì)胞生長液，接種于細(xì)胞培養(yǎng)瓶中擴(kuò)大培養(yǎng)，培養(yǎng)6 10瓶，進(jìn)行單克隆細(xì)胞的凍存及細(xì)胞庫的建立。B.鴨出血性卵巢炎病毒高適應(yīng)性細(xì)胞株的篩選 a.BHK21單克隆細(xì)胞株的消化鋪板
將長滿單層的BHK21單克隆細(xì)胞株用0.05%胰酶消化并計(jì)數(shù)，每株單克隆細(xì)胞鋪24孔細(xì)胞培養(yǎng)板，設(shè)復(fù)孔，30000個(gè)細(xì)胞/孔。置于37°C，5% CO2培養(yǎng)24h。b.BHK21單克隆細(xì)胞株接種鴨出血性卵巢炎病毒
棄去24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中的細(xì)胞生長液，加入0.1M PBS,0.8ml/孔，吹洗2 3遍后，按V: V 0.3%接種量接種鴨出血性卵巢炎病毒疫苗株，1.0ml/孔，置于37。。，5% CO2培養(yǎng)，72h后-20°C反復(fù)3次凍融，并收獲病毒液。c.鴨出血性卵巢炎病毒疫苗株感染BHK21單克隆細(xì)胞株的TCID5tl檢測(cè)
按常規(guī)方法將收獲病毒液用細(xì)胞維持液作10_卜10_9倍系列稀釋，接種于長滿BHK21單克隆細(xì)胞單層的96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，0.1ml/孔，每個(gè)稀釋度接種8孔，置37°C培養(yǎng)箱中觀察5d，以出現(xiàn)典型CPE為判定依據(jù)，按Reed-Muench法計(jì)算TCID5(I。C.結(jié)果
a.BHK21單克隆細(xì)胞株的培養(yǎng)
通過有限稀釋法進(jìn)行倉鼠腎 細(xì)胞BHK21的克隆純化，經(jīng)過3次純化，篩選出45株BHK21單克隆細(xì)胞株。2鴨出血性卵巢炎病毒疫苗株高適應(yīng)性BHK21單克隆細(xì)胞株的篩選
通過鴨出血性卵巢炎病毒疫苗株感染BHK21單克隆細(xì)胞株72h后的TCID5tl測(cè)定，篩選出I株效價(jià)最高的BHK21單克隆細(xì)胞株:第40株，其在45株中病毒滴度最高，為IO7 8TCID5tl/ml，與鴨出血性卵巢炎病毒感染普通倉鼠腎細(xì)胞BHK21的TCID5tl ( 106 5 IO7 4)相比，病毒效價(jià)可提高約2 10倍。由此，篩選獲得第40株為鴨出血性卵巢炎病毒疫苗株高適應(yīng)性BHK21單克隆細(xì)胞株，并標(biāo)號(hào)為B40。B40號(hào)倉鼠腎細(xì)胞BHK21于2012年11月14日保藏在中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏號(hào)為CCTCC NO C2012181 ;保藏地址為:中國武漢大學(xué)。
實(shí)施例2 AP20C型激流灌注式生物反應(yīng)器制備鴨出血性卵巢炎滅活疫苗本實(shí)施例中所用的AP20C型激流灌注式生物反應(yīng)器，灌注袋6體積為8L (兩個(gè)灌注袋的體積均為4L)，激流罐5體積為13L，灌注袋6內(nèi)含有300g聚酯纖維紙片載體8 (兩灌注袋各含150g載體)；理論有效培養(yǎng)體積為21L。細(xì)胞同實(shí)施例1中菌種保藏的倉鼠腎細(xì)胞BHK21 ；
種毒同實(shí)施例1，某一批次鴨出血性卵巢炎病毒HB株種毒，病毒效價(jià)為107 7TCID5Q/ml。細(xì)胞生長液的配方為體積百分含量92%高糖DMEM液，8%新生牛血清，調(diào)整PH值為7.3 ；
細(xì)胞維持液為體積百分含量98%高糖DMEM液，2%新生牛血清，調(diào)整PH值為7.4 ;
無Na-DMEM干粉培養(yǎng)基為不含有NaCl和酚紅的高糖DMEM培養(yǎng)基，由InvitrogenCorporation生產(chǎn)銷售。A、準(zhǔn)備工作:
檢驗(yàn)系統(tǒng)氣密性，校準(zhǔn)電極，PBS處理紙片載體8，連接灌注袋6與激流罐5，用細(xì)胞生長液浸泡紙片載體8，平衡系統(tǒng)。B、制備工作，具體步驟如下: a.制苗用細(xì)胞的復(fù)蘇與前期培養(yǎng)
從液氮罐中取出凍存的倉鼠腎細(xì)胞BHK21復(fù)蘇后，用細(xì)胞生長液于37°C培養(yǎng)，長成良好單層后消化轉(zhuǎn)至IOL轉(zhuǎn)瓶中培養(yǎng)、備用。b.制苗用細(xì)胞在生物反應(yīng)器中的接種、培養(yǎng)
取8個(gè)長滿單層細(xì)胞的轉(zhuǎn)瓶，用0.05%胰酶消化細(xì)胞，制備細(xì)胞懸液IOL (含細(xì)胞和細(xì)胞生長液)，細(xì)胞總數(shù)約3.1 X IO9個(gè)。細(xì)胞接種采用兩步接種法，第一步:兩灌注袋中各從下部打入細(xì)胞懸液4.0L，靜置吸附Ih ;第二步:將兩灌注袋中的液體各打出1L，再從兩灌注袋上部深層管各打入IL剩余細(xì)胞懸液，靜置吸附0.5h ;同時(shí)在激流罐5內(nèi)補(bǔ)充5L細(xì)胞生長液預(yù)熱；細(xì)胞接種密度為:每克載體接種1.0X IO7個(gè)細(xì)胞。吸附過程完成后，設(shè)置設(shè)備參數(shù)如下:T1:37.5°C, T2:44°C, T3:36°C, PH:7.2，DO:40 70%，振蕩速度45r/min，循環(huán)速度400ml/min，空氣流量100ml/min。啟動(dòng)細(xì)胞培養(yǎng)
程序，進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)。每日取樣2次測(cè)殘?zhí)橇浚?jì)算單日耗糖量。逐日增大空氣流量，每24h增加IOOml/min。細(xì)胞生長液循環(huán)灌注速度隨培養(yǎng)時(shí)間的增加逐漸增大，使硅膠管3、硅膠管4內(nèi)液體顏色保持基本一致。細(xì)胞培養(yǎng)48h培養(yǎng)液殘?zhí)橇康陀?g/L，開始流加補(bǔ)充細(xì)胞生長液，流加速度為10ml/mino細(xì)胞培養(yǎng)60h時(shí)，泵出培養(yǎng)液13L， 補(bǔ)入細(xì)胞生長液2L后流加補(bǔ)充細(xì)胞生長液，流加速度改為為13ml/min。細(xì)胞培養(yǎng)60h時(shí)培養(yǎng)液體積接近有效體積21L，將培養(yǎng)液全部打出，換入20L新鮮細(xì)胞生長液繼續(xù)培養(yǎng)。c.鴨出血性卵巢炎病毒接種制苗用細(xì)胞，繼續(xù)培養(yǎng)
細(xì)胞接種后第4日(96h)單日耗糖量達(dá)到3.68g/L/24h，且趨于平穩(wěn)，確定細(xì)胞密度達(dá)到了接毒要求。排空反應(yīng)器內(nèi)液體，將含細(xì)胞維持液15L和病毒液300ml的種毒懸液打入系統(tǒng)中，設(shè)置設(shè)備參數(shù)如下:T1:37.3°C, T2:41°C, T3:35.5°C, pH:7.2，DO:40 70%，振蕩速度45r/min,循環(huán)速度400ml/min,空氣流量400ml/min,啟動(dòng)病毒培養(yǎng)程序開始培養(yǎng)。病毒接種12h后開始流加補(bǔ)充200g/L葡萄糖、3倍濃縮DMEM液(I份DMEM干粉培養(yǎng)基按照使用說明書用量加入去離子水配置成I XDMEM液后，再加入2份無Na-DMEM干粉培養(yǎng)基，溶解而成)，3倍濃縮DMEM液流加速度為2.4ml/min，葡萄糖流加速度為0.16ml/min。d.收獲病毒液,滅活病毒
分別在30h、32h、32h、34h、36h、38h、40h、42h培養(yǎng)的病毒液取樣，測(cè)定各時(shí)間點(diǎn)病毒效價(jià)(病毒滴度)，并繪制時(shí)間滴度曲線圖(見圖3 )。病毒培養(yǎng)42h后，收獲激流罐5和灌注袋6內(nèi)的病毒液，灌注袋6凍融3次后收獲上清液，將收獲的全部病毒液混勻，共得20.4L病毒液，備用。收獲的病毒液測(cè)定效價(jià)，每Iml含病毒108_ 1TCID500
收獲的20.4L病毒液內(nèi)加入2.04L質(zhì)量濃度為37%甲醛溶液至終濃度為10%，100r/m 4°C滅活12h。上述滅活病毒液用無菌0.1M pH7.2的PBS稀釋10倍，再用50KD膜包濃縮至20L。e.疫苗制備
將檢驗(yàn)合格的滅活病毒液置于乳化罐中，按水相與油佐劑V/V3:l的比例緩慢加入油佐劑6.67L ISA 28 VG，邊加邊攪拌，然后以800r/min攪拌30min，制成水包油型鴨出血性卵巢炎滅活疫苗。f.安全檢驗(yàn)
取5 8周齡SPF鴨10只，隨機(jī)分為2組，每組5只，一組按2倍劑量(1.0ml)經(jīng)胸部肌肉接種疫苗，另一組不接種疫苗，作為對(duì)照，在同等條件下隔離飼養(yǎng)。觀察14天，免疫組和對(duì)照組均未出現(xiàn)精神沉郁、采食量下降和拉綠色或白色稀便的臨床癥狀。g.疫苗效力檢驗(yàn)
取取200日北京鴨20只，隨機(jī)分為2組，每組10只，一組各胸部肌肉注射疫苗0.5ml/只，另I組用相同劑量的無病毒細(xì)胞液乳化劑接種作為陰性對(duì)照，在同等條件下隔離飼養(yǎng)。14日后，對(duì)所有免疫鴨及對(duì)照鴨攻擊鴨出血性卵巢炎病毒HB株，攻毒后5d剖殺，免疫組攻毒保護(hù)率為90%，對(duì)照組全部未保護(hù)。與轉(zhuǎn)瓶工藝比較:轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)工藝每瓶收獲體積1L，病毒效價(jià)一般為107_° TCID50/ml左右；本次實(shí)驗(yàn)病毒總產(chǎn)量與200個(gè)IOL轉(zhuǎn)瓶產(chǎn)量持平。實(shí)施例3 AP200型激流灌注式生物反應(yīng)器制備鴨出血性卵巢炎滅活疫苗 本實(shí)施例中所用的激流灌注式生物反應(yīng)器包括AP20C型和AP200型兩種。AP20C型激流灌注式生物反應(yīng)器同實(shí)施例2。
制苗用細(xì)胞、種毒均同實(shí)施例2。AP200型灌注袋6體積為80L(兩個(gè)灌注袋的體積均為40L)，激流罐5體積為130L，灌注袋6內(nèi)含有3000g聚酯纖維紙片載體8 (兩灌注袋各含1500g載體)；理論有效培養(yǎng)體積為210L。A、準(zhǔn)備工作:
選用AP20C型和AP200型兩種激流灌注式生物反應(yīng)器，做培養(yǎng)細(xì)胞前準(zhǔn)備工作。B、制備工作，具體步驟如下:
a.制苗用細(xì)胞的培養(yǎng)
按照實(shí)施例2方法，在AP20C型生物反應(yīng)器內(nèi)培養(yǎng)制苗用細(xì)胞96h，至細(xì)胞耗糖量增至
3.7g/L/24h且趨于平穩(wěn)時(shí)，用0.05%胰酶消化一個(gè)灌注袋6內(nèi)細(xì)胞，制得細(xì)胞懸液100L，內(nèi)含倉鼠腎細(xì)胞BHK21約2.7X101(I個(gè)。將制得的細(xì)胞懸液分兩步接種于AP200型生物反應(yīng)器灌注袋6內(nèi):第一步:兩灌注袋中各從下部打入細(xì)胞懸液40L，靜置吸附Ih ;第二步:將兩灌注袋中的液體各打出10L，再從兩灌注袋上部深層管各打入IOL剩余細(xì)胞懸液，靜置吸附0.5h ;同時(shí)在激流罐5內(nèi)補(bǔ)充50L細(xì)胞生長液預(yù)熱；細(xì)胞接種密度為:每克載體接種
0.9 X IO7個(gè)細(xì)胞。吸附過程完成后，設(shè)置設(shè)備參數(shù)如下:T1:37.5°C, T2:43°C, T3:36°C, PH:7.2，DO:40 70%，振蕩速度43r/min，循環(huán)速度4000ml/min，空氣流量1000ml/min。啟動(dòng)細(xì)胞培
養(yǎng)程序，進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)。

每日取樣2次測(cè)殘?zhí)橇?，?jì)算單日耗糖量，逐日增大空氣流量，每24h增加IOOOml/min。細(xì)胞生長液循環(huán)灌注速度隨培養(yǎng)時(shí)間的增加逐漸增大，使硅膠管3、硅膠管4內(nèi)液體顏色保持基本一致。細(xì)胞培養(yǎng)48h培養(yǎng)液殘?zhí)橇康陀?g/L，開始流加補(bǔ)充細(xì)胞生長液，流加速度為100ml/mino細(xì)胞培養(yǎng)60h時(shí)，泵出培養(yǎng)液130L，補(bǔ)入細(xì)胞生長液20L后流加補(bǔ)充細(xì)胞生長液，流加速度改為為130ml/min。細(xì)胞培養(yǎng)72h時(shí)培養(yǎng)液體積接近有效體積210L，將培養(yǎng)液全部打出，換入200L新鮮細(xì)胞生長液繼續(xù)培養(yǎng)。b.鴨出血性卵巢炎病毒接種制苗用細(xì)胞，繼續(xù)培養(yǎng)
細(xì)胞接種后第4日(96h)單日耗糖量達(dá)到3.58g/L/24h，且趨于平穩(wěn)，確定細(xì)胞密度達(dá)到了接毒要求。排空反應(yīng)器內(nèi)液體，將含細(xì)胞維持液150L和病毒液3L的種毒懸液(效價(jià)為IO7.7TCID50/ml)打入系統(tǒng)中，設(shè)置設(shè)備參數(shù)如下:T1:37°C, T2:40°C, T3:35.5°C, pH:7.2，DO:40 70%，振蕩速度45r/min，循環(huán)速度4000ml/min，空氣流量4000ml/min，啟動(dòng)病毒培養(yǎng)程序開始培養(yǎng)。病毒接種12h后開始流加補(bǔ)充200g/L葡萄糖、3倍濃縮DMEM液(I份DMEM干粉培養(yǎng)基按照使用說明書用量加入去離子水配置成I XDMEM液后，再加入2份無Na-DMEM干粉培養(yǎng)基，溶解而成)，3倍濃縮DMEM液流加速度為24ml/min，葡萄糖流加速度為1.6ml/min。c.收獲病毒液,滅活病毒
病毒培養(yǎng)40h后，收獲激流罐5和灌注袋6內(nèi)的病毒液，灌注袋6凍融3次后收獲上清液，將收獲的全部病毒液混勻，共得約207L病毒液，備用。
收獲的病毒液測(cè)定效價(jià)，每Iml含病毒108_ 3TCID5tlt5收獲的207L病毒液內(nèi)加入2.07L質(zhì)量濃度為37%甲醛溶液至終濃度為1%，140r/min，4°C滅活24h。上述滅活病毒液用無菌0.1M pH7.2的PBS稀釋4倍，再用50KD膜包濃縮至207L。d.疫苗制備
將檢驗(yàn)合格的滅活病毒液置于乳化罐中，按水相與油佐劑V/V3:l的比例緩慢加入MF59油佐劑69L，邊加邊攪拌，然后以1000r/min攪拌30min，制成水包油型鴨出血性卵巢炎
滅活疫苗。e.安全檢驗(yàn)
取5 8周齡SPF鴨10只，隨機(jī)分為2組，每組5只，一組按2倍劑量(1.0ml)經(jīng)胸部肌肉接種疫苗，另一組不接種疫苗，作為對(duì)照，在同等條件下隔離飼養(yǎng)。觀察14天，免疫組和對(duì)照組均未出現(xiàn)精神沉郁、采食量下降和拉綠色或白色稀便的臨床癥狀。f.疫苗效力檢驗(yàn)
取200日北京鴨20只，隨機(jī)分為2組，每組10只，一組各胸部肌肉注射疫苗0.5ml/只，另I組用相同劑量的無病毒細(xì)胞液乳化劑接種作為陰性對(duì)照，在同等條件下隔離飼養(yǎng)。14日后，對(duì)所有免疫鴨及對(duì)照鴨攻擊鴨出血性卵巢炎病毒HB株，攻毒后5d剖殺，免疫組攻毒保護(hù)率為90%，對(duì)照組全部未保護(hù)。與轉(zhuǎn)瓶工藝比較:轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)工藝每瓶收獲體積1L，病毒效價(jià)一般為107_° TCID50/ml左右；本次實(shí)驗(yàn)病毒總產(chǎn)量與 2000個(gè)IOL轉(zhuǎn)瓶產(chǎn)量持平。
權(quán)利要求
1.一種制備鴨出血性卵巢炎滅活疫苗的方法，其特征在于，它利用激流灌注式生物反應(yīng)器為培養(yǎng)系統(tǒng)，所述激流灌注式生物反應(yīng)器包括第一蠕動(dòng)泵(I)、第二蠕動(dòng)泵(2)，第一硅膠管(3)、第二硅膠管(4)、激流罐(5)、灌注袋(6)、有孔硅膠管(7)和聚酯纖維紙片載體(8);所述灌注袋(6)為內(nèi)含聚酯纖維紙片載體的細(xì)胞培養(yǎng)袋，兩個(gè)灌注袋結(jié)構(gòu)與功能完全相同，以相同的方式與激流罐(5)連接，通過外源泵實(shí)現(xiàn)物質(zhì)交換； 滅活疫苗的制備按以下步驟進(jìn)行: a.制苗用細(xì)胞的培養(yǎng) 將細(xì)胞懸液即種子細(xì)胞和細(xì)胞生長液混合液接種至激流灌注式生物反應(yīng)器的灌注袋(6)，使細(xì)胞貼附在聚酯纖維紙片載體(8)上，接種密度為:每克載體接種0.8 1.2 X IO7個(gè)細(xì)胞，設(shè)定設(shè)備參數(shù):溫度 Tl:37 37.5°C、T2:40 45°C、T3:35 36°C，pH:7.0 7.4，DO:40% 70%，振蕩速度30 50r/min，空氣流量100ml/min 1000ml/min，啟動(dòng)細(xì)胞培養(yǎng)程序，進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，得到制苗用細(xì)胞； b.病毒接種與培養(yǎng) 當(dāng)細(xì)胞單日耗糖趨于平穩(wěn)時(shí)，表明細(xì)胞達(dá)到接毒要求，排空反應(yīng)器內(nèi)液體，將鴨出血性卵巢炎病毒種毒接種制苗用細(xì)胞，設(shè)定設(shè)備參數(shù):溫度Tl:36.5 37.5°C、T2:39 41°C、T3:34 35°C，pH:7.2 7.4，DO:40% 70%，振蕩速度 30 50 r/min,空氣流量 400ml/min 4000ml/min,啟動(dòng)病毒培養(yǎng)程序,擴(kuò)增培養(yǎng)鴨出血性卵巢炎病毒； c.病毒液收獲 病毒培養(yǎng)42 46h后 ，收獲激流罐(5 )與灌注袋(6 )內(nèi)的病毒液，將灌注袋(6 )反復(fù)凍融2 3次后收獲上清液,混合后_20°C保存?zhèn)溆?；檢測(cè)病毒液效價(jià)； d.病毒液滅活 收獲的病毒液中加入甲醛滅活劑，滅活病毒； e.疫苗制備 滅活的病毒液加入佐劑，乳化制備成鴨出血性卵巢炎滅活疫苗。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備鴨出血性卵巢炎滅活疫苗的方法，其特征在于，步驟a中，種子細(xì)胞為幼倉鼠腎傳代細(xì)胞BHK21，為經(jīng)過有限稀釋法克隆純化篩選的細(xì)胞；應(yīng)用有限稀釋法將待篩選細(xì)胞進(jìn)行單克隆化，擴(kuò)大培養(yǎng)建立單克隆化細(xì)胞庫，通過TCID5tl篩選鴨出血性卵巢炎病毒疫苗株的高適應(yīng)性單克隆化細(xì)胞株。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的制備鴨出血性卵巢炎滅活疫苗的方法，其特征在于，步驟a中，細(xì)胞培養(yǎng)過程中采用階段流加方式補(bǔ)充細(xì)胞生長液，當(dāng)殘?zhí)橇康陀?g/L時(shí)，流加補(bǔ)充細(xì)胞生長液，流加量以培養(yǎng)液殘?zhí)橇坎坏陀趌g/L為準(zhǔn)，當(dāng)培養(yǎng)液體積達(dá)到有效培養(yǎng)體積時(shí)，進(jìn)行換液。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的制備鴨出血性卵巢炎滅活疫苗的方法，步驟a中，逐日增大空氣流量，每 24h 增加 100ml/min 1000ml/min。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的制備鴨出血性卵巢炎滅活疫苗的方法，其特征在于，步驟b中，病毒接種前將種毒混于細(xì)胞維持液中，種毒與細(xì)胞維持液按V/V 0.5% 2%混合，病毒接種時(shí)將混有病毒液的細(xì)胞維持液泵入反應(yīng)器系統(tǒng)中，無需吸附，直接啟動(dòng)病毒培養(yǎng)程序擴(kuò)增培養(yǎng)病毒。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的制備鴨出血性卵巢炎滅活疫苗的方法，其特征在于，步驟b中，病毒培養(yǎng)12h時(shí)開始持續(xù)流加補(bǔ)充η倍濃縮DMEM液和200g/L葡萄糖，流加速度以培養(yǎng)液殘?zhí)橇坎坏陀趌g/L為準(zhǔn)；所述η等于2 5。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的制備鴨出血性卵巢炎滅活疫苗的方法，其特征在于，所述η倍濃縮DMEM液配制方法為:1份DMEM干粉培養(yǎng)基按照使用說明書用量加入去離子水配置成I XDMEM液后，再加入(η-1)份無Na-DMEM干粉培養(yǎng)基，溶解即成；所述η等于2 5。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，步驟d中，收獲病毒液中按V/V1°/Γ10%加入質(zhì)量濃度為37%的甲醛溶液，70 140r/min，2-8°C滅活12 24h。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的制備鴨出血性卵巢炎滅活疫苗的方法，步驟e中，在滅活的病毒液中按水相與油相佐劑V/V 3:1緩慢加入ISA 28 VG或MF59佐劑，乳化制備成水包油型鴨出血性卵巢 炎滅活疫苗。
全文摘要
一種制備鴨出血性卵巢炎滅活疫苗的方法，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。所述方法包括以下步驟a.制苗用細(xì)胞的培養(yǎng)；b.病毒接種與培養(yǎng)；c.病毒液收獲；d.病毒液滅活；e.疫苗制備。本發(fā)明對(duì)制苗用細(xì)胞進(jìn)行了篩選，加強(qiáng)了細(xì)胞與病毒的匹配性；使用激流灌注式生物反應(yīng)器培養(yǎng)體系提高了病毒的增殖滴度及收獲量；而且整個(gè)生產(chǎn)工藝不涉及其他生物安全和公共衛(wèi)生問題，適合于大規(guī)模生產(chǎn)。
文檔編號(hào)A61P31/14GK103157102SQ20121057800
公開日2013年6月19日 申請(qǐng)日期2012年12月27日 優(yōu)先權(quán)日2012年12月27日
發(fā)明者劉月煥, 何平有, 毛雅元, 劉濤, 鄭朝朝, 韓春華, 林健, 徐倩倩, 楊保收, 梁武, 郁宏偉, 李建麗 申請(qǐng)人:瑞普(保定)生物藥業(yè)有限公司, 北京市農(nóng)林科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所