專利名稱：甘草苷在制備大腸桿菌氟喹諾酮外排泵抑制劑中的應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明屬于藥學領域，涉及甘草苷的一種制藥新用途。
背景技術：
伴隨著抗菌藥物的廣泛和不當使用，各種類型的耐藥菌不斷出現(xiàn)，抗感染治療面臨著嚴峻的挑戰(zhàn)。文獻報道，目前病原菌對大多數(shù)喹諾酮類藥物的耐藥率已達50%以上，個別地區(qū)個別藥物的耐藥率甚至達到100%，細菌耐藥問題已經(jīng)到了十分嚴峻的地步。對養(yǎng)殖業(yè)來說，細菌耐藥使抗菌藥物的治療效果嚴重降低，治療成本升高，養(yǎng)殖風險增大，養(yǎng)殖效益明顯下降。為了增強藥物的治療效果，部分養(yǎng)殖場開始加大劑量使用抗菌藥物，這不僅增加了藥物的毒副作用，更嚴重的是可能導致藥物殘留等食品安全問題，進而危及人類健康。
控制細菌耐藥性的方法有一、停止使用現(xiàn)有的抗菌藥物；二、研發(fā)新的抗菌藥物；三、提高現(xiàn)有抗菌藥物的治療效果，通過消除耐藥質粒、配合使用外排泵抑制劑等方式控制或逆轉細菌耐藥?？尚行苑治鲲@示，在我國完全停止使用現(xiàn)有的抗菌藥物，將使養(yǎng)殖業(yè)遭受到毀滅性的打擊，而新藥研發(fā)需要耗費大量的人力、物力、財力且周期長，開發(fā)出的新藥也可能很快產(chǎn)生耐藥性，因此，這兩種方法很難從根本上解決當前細菌耐藥日益嚴重的問題。從近期研究成果來看，耐藥質粒僅能導致喹諾酮類藥物的低水平耐藥，并不是細菌對喹諾酮類藥物耐藥的主要原因，因此，耐藥質粒的消除對于逆轉細菌對喹諾酮類藥物的耐藥實際意義不大，配合使用外排泵抑制劑可能才是現(xiàn)階段行之有效的控制方案。外排泵抑制劑不但能夠有效抑制細菌中藥物轉運蛋白(又稱外排泵)的活性，阻止藥物外排，恢復細菌對藥物的敏感性，而且可以使細菌在藥物環(huán)境中不被誘導耐藥。因此，開發(fā)高效、安全的外排泵抑制劑，對于抗感染治療來說具有重要意義和良好的市場前景。中藥是我國特有的天然資源，具有資源廣、毒副作用低等特點，在治療感染、逆轉(或抑制)腫瘤細胞耐藥性等方面顯示了獨特的作用，可以從中藥中尋找既有良好耐藥消除效果又沒有毒副作用或毒副作用較低的細菌外排泵抑制劑。

發(fā)明內容
有鑒于此，本發(fā)明的目的在于從中藥中尋找高效、安全的細菌外排泵抑制劑。為達到上述目的，本發(fā)明提供如下技術方案
甘草苷在制備大腸桿菌{Escherichia coli )氟喹諾酮外排泵抑制劑中的應用。進一步，所述氟喹諾酮外排泵包括acrA外排泵。進一步，所述氟喹諾酮為氧氟沙星、左氧氟沙星、環(huán)丙沙星或恩諾沙星。本發(fā)明的有益效果在于本發(fā)明公開了甘草苷在制備大腸桿菌氟喹諾酮外排泵抑制劑中的應用，研究結果顯示，甘草苷可以使耐藥大腸桿菌(氟喹諾酮主動外排表型且acrA基因高表達菌株)的氟喹諾酮最低抑菌濃度明顯降低、菌體內藥物蓄積濃度明顯增加、夕卜排泵基因acrA表達量明顯降低，從而可以提高耐藥大腸桿菌對氟喹諾酮的敏感性，降低藥物使用量，降低治療成本，減少藥物殘留等食品安全問題；同時，甘草苷為植物中存在的天然化合物，無致畸、致癌等副作用，安全無毒。從市場應用前景來看，以生豬養(yǎng)殖為例，按全國生豬存欄量56000萬頭、發(fā)病率為30%計算，有16800萬頭需要使用抗菌藥物，按每次使用抗菌藥物8mL、每天使用2次、連用2 3天計算，抗菌藥物需要量為53760(Γ806400萬毫升，按每IOmL售價I元、平均耐藥率為50%計算，因為細菌耐藥造成的直接經(jīng)濟損失高達2. 69^4. 03億元，而根據(jù)本發(fā)明，將甘草苷與氟喹諾酮類藥物配合使用，可以較大幅度地挽回上述經(jīng)濟損失。因此，本發(fā)明不僅拓寬了甘草苷的應用領域，提高了甘草苷的市場價值，并且為抗感染治療提供了一種高效、安全的細菌外排泵抑制劑，具有重要的社會意義和良好的市場前景。


圖1為氧氟沙星在大腸桿菌ATCC 25922和大腸桿菌73_2體內的蓄積濃度隨時間變化曲線圖，其中OF表示氧氟沙星。圖2為acrA基因和gapA基因的標準曲線。
圖3為acrA基因和gapA基因的溶解曲線。
具體實施例方式為了使本發(fā)明的目的、技術方案和優(yōu)點更加清楚，下面通過具體實施例并參照附圖對本發(fā)明進行詳細的描述。實施例中使用的大腸桿菌ATCC 25922為非耐藥大腸桿菌，購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所。實施例中使用的大腸桿菌73-2為耐藥大腸桿菌(氟喹諾酮主動外排表型且acrA基因高表達)，由發(fā)明人所在研究室分離鑒定與保存，已在文獻(張靜等.中藥提取物對耐藥大腸桿菌MIC及acrA基因表達量的影響.中國獸醫(yī)學報.2012，32(5) : 728- 732)中公開，公眾可以通過西南大學榮昌校區(qū)動物醫(yī)學系藥學教研室獲得該菌株。其具體分離鑒定方法如下
a.多重耐藥大腸桿菌的篩選
于2007年7月至2008年5月，從重慶市榮昌、大足、銅梁、合川、北碚、長壽、涪陵、武隆、黔江、綦江、江津共11個區(qū)縣的規(guī)?；B(yǎng)豬場采集了 157份仔豬黃白痢病料，從中分離鑒定出138株大腸桿菌，對其中96株致病性大腸桿菌進行了 34種常用抗菌藥物(利福平、鏈霉素、慶大霉素、呋喃唑酮、阿米卡星、卡那霉素、壯觀霉素、四環(huán)素、米諾環(huán)素、妥布霉素、呋喃妥因、氨芐西林、氨芐西林/舒巴坦、氯霉素、復方新諾明、多粘菌素B、環(huán)丙沙星、氧氟沙星、左氟沙星、氟哌酸、頭孢氨芐、頭孢噻吩、頭孢唑啉、頭孢拉定、頭孢克洛、氨曲南、頭孢噻肟、頭孢哌酮、頭孢曲松、頭孢吡肟、頭孢他啶、頭孢西丁、亞胺培南、頭孢呋肟)的耐藥性分析，藥敏試驗按照2005年美國臨床實驗室標準化研究所(CLSI/NCCLS)出版的藥敏試驗手指南M100-S15中推薦的Kirby-Bauer紙片瓊脂擴散法進行，以大腸桿菌ATCC 25922為質控菌株，并按照CLSI推薦的耐藥(R)、中介(I)、敏感(S)分界點判斷結果，最終從96株致病性大腸桿菌中篩選出80株多重耐藥菌株。b.靶位基因突變的耐藥大腸桿菌的排除
文獻報道，大腸桿菌對抗菌藥物產(chǎn)生高度耐藥的主要原因包括靶位基因突變和外排基因高水平表達。為此，對篩選出的80株多重耐藥大腸桿菌進行靶位基因測序，以排除存在靶位基因突變的菌株。設計并委托上海生工生物工程技術有限公司合成以下 2 對引物GyrA_F :5，-gagggatagcggttagatgagc-3’ (SEQ ID No.1), GyrA-R 5，-ccgttcaccagcaggttagg-3J (SEQ ID No. 2)；ParC-F :5，- aatgagcgatatggcagagcg-3，(SEQ ID No. 3), ParC-R :5，-ttggcagacgggcaggtag-3’ (SEQ ID No. 4)。提取耐喹諾酮類大腸桿菌的染色體DNA作為模板，分別用上述2對引物PCR擴增GyrA基因和ParC基因，反應程序如下95°C預變性10分鐘，然后94°C變性30秒，54°C退火30秒，72°C延伸30秒，共30個循環(huán)，最后72°C延伸10分鐘。PCR產(chǎn)物純化后委托上海生工生物工程技術有限公司進行測序，并將測序結果與GenBank公開的GyrA基因序列和ParC基因序列進行比較，最終從80株多重耐藥大腸桿菌中篩選出5株不存在靶位基因突變的菌株。c.大腸桿菌氟喹諾酮主動外排表型陽性菌的篩選
文獻報道，細菌對喹諾酮類藥物蓄積濃度減少的主要影響因素包括細菌膜通透性降低和細菌膜上藥物主動外排泵激活。為此，以碳酰氰氯苯腙(CCCP)為外排泵抑制劑，以氧氟沙
星、環(huán)丙沙星為氟喹諾酮類藥物模型，對篩選出的5株不存在靶位基因突變的耐藥大腸桿菌進行CCCP加入前后氧氟沙星、環(huán)丙沙星攝入量的比較研究，以進一步篩選出氟喹諾酮主動外排表型陽性菌。菌體內氧氟沙星攝入量的測定采用高效液相色譜-熒光檢測法，色譜條件如下色譜柱為Diamonsil C18柱(250 mmX4. 6mm, 5 μ m),流動相為O. 05mol/L枸櫞酸水溶液與乙腈的混合液(體積比為79:21)并用乙醇胺調節(jié)pH至4. 0，流速為1. Oml/min，進樣量為20 μ L，激發(fā)波長為295nm，發(fā)射波長為505nm，柱溫為40°C。將氧氟沙星用O. lmol/L、pH3. O的鹽酸甘氨酸緩沖液溶解制成濃度分別為IX 10_5、5 X 10_5、2 X 10_4、I X 10'2 X 10'IX 10_2、2X 10_2、1X KTmg/L的溶液，采用上述高效液相色譜_熒光檢測法測定氧氟沙星的峰面積，繪制峰面積與氧氟沙星濃度的標準曲線；然后設置對照組和實驗組，并以大腸桿菌ATCC 25922為質控菌株，兩組分別將待檢菌株接種于20mL LB肉湯培養(yǎng)基中，37°C搖床培養(yǎng)至指數(shù)生長中期(0D650= O. 7 O. 8)，4°C、4000rpm離心10分鐘，收集菌體，稱重，用50mmol/L、pH7. O的PBS洗滌兩次并重懸至細菌濃度為40mg/mL，37°C溫浴10分鐘，實驗組加入CCCP至終濃度為40 μ g/mL,對照組不加入任何試劑,然后兩組分別加入氧氟沙星至終濃度為10mg/L，在氧氟沙星加入后第30、60、120、180、300、600、900、1500秒分別取樣
O.25mL,立即加入1. 25mL預冷的50mmol/L、pH7. O的PBS, 4°C>8000rpm離心5分鐘，收集菌體，用O. lmol/L、pH3. O的鹽酸甘氨酸緩沖液洗滌后，加入O. lmol/L、pH3. O的鹽酸甘氨酸緩沖液ImL重懸，26°C水浴2小時，離心取上清，用上述高效液相色譜-熒光檢測法測定氧氟沙星的峰面積，再根據(jù)上述峰面積與氧氟沙星濃度的標準曲線計算出氧氟沙星的濃度。菌體內環(huán)丙沙星攝入量的測定也采用高效液相色譜-熒光檢測法，色譜條件如下色譜柱為Welch ultimate poIar-RP C18 柱(250mmX 4. 6mm, 5 μ m),流動相為 0. 025mol/L 憐酸溶液與乙腈的混合液(體積比為79:21)并用三乙胺調節(jié)pH至3. 5，流速為1. OmL/min，進樣量為20 μ L，激發(fā)波長為280nm，發(fā)射波長為450nm，柱溫為30°C。測定方法與上述氧氟沙星攝入量的測定方法相同，只是用環(huán)丙沙星替代氧氟沙星。根據(jù)上述實驗結果，最終從5株不存在靶位基因突變的耐藥大腸桿菌中篩選出3株氟喹諾酮主動外排表型陽性菌。d.外排泵基因acrA高表達大腸桿菌的篩選
文獻報道，acrA外排泵是大腸桿菌最主要的外排泵之一，且該外排泵底物廣泛，可以外排吖啶橙、結晶紫、溴乙啶、鐮孢菌酸、四環(huán)素、氯霉素、新霉素、紅霉素、夫西地酸、SDS、萘啶酸、氯比西林、氟喹諾酮類、內酰胺類、利福平等多種藥物。當acrA基因高水平表達時，大腸桿菌往往會產(chǎn)生高水平耐藥。為此，對篩選出的3株氟喹諾酮主動外排表型陽性菌進行acrA基因表達量檢測，以進一步篩選出acrA基因高表達菌株。實驗以大腸桿菌ATCC 25922為質控菌株。根據(jù)GenBank中登錄的大腸桿菌acrA基因的保守序列，合成其特異性引物acrA_F :5，-acgttgatgtgacccagtcc-3’ (SEQ ID No. 5), acrA-R :5’-gctttgccgttctcttgtttc-3’ (SEQ ID No. 6);同時，以大腸桿菌看家基因 gapA 作為內參基因，合成其特異性引物gapA_F :5’ - cagaacatcatcccgtcctctac-3’ (SEQ ID No. 7),gapA-R :5，-taccagtcagtttgccattcagtt-3，(SEQ ID No. 8)。用總 RNA 提取試劑盒(上海生工生物工程技術有限公司)提取待檢菌株的總RNA，用TaKaRa反轉錄試劑盒將總RNA反轉錄為cDNA，再以該cDNA為模板，分別采用上述特異性引物，熒光定量PCR 擴增acrA基因和gapA基因，計算acrA基因表達量。PCR反應體系如下SYBR Premix EXXTaq II (2X)
12.5μ ,上下游引物(10 μ mol/L)各 μ ，cDNA模板2μ ，DH2O (滅菌雙蒸水)8. 5μ ,總體積為25μ ;反應程序如下95°C預變性30秒，95°C變性5秒，60°C退火30秒，共40個循環(huán)。根據(jù)上述實驗結果，最終從3株氟喹諾酮主動外排表型陽性菌中篩選出I株acrA基因高表達的菌株，將其命名為大腸桿菌73-2?！⒏什蒈战档湍退幋竽c桿菌73-2的氟喹諾酮最低抑菌濃度(MIC)
1、氟喹諾酮和甘草苷分別對大腸桿菌73-2的MIC的測定
米用試管二倍稀釋法取10支無菌試管,標記1-10后，I至7號管各加入滅菌肉湯2mL,然后I號管加入藥液2mL，混勻，再吸取2mL至2號管中，混勻，再從2號管中吸取2mL至3號管中，如此依次倍比稀釋至7號管，混勻后吸取2mL棄去，最后各管加入100 μ L菌液，震蕩混勻 ’另8號管加入滅菌肉湯2mL作為空白對照，9號管加入藥液2mL作為藥液對照，10號管加入菌液100 μ L作為菌液對照；37°C培養(yǎng)16-18小時，無菌生長的最低濃度即為MIC。實驗以大腸桿菌ATCC 25922作為質控菌株。結果見表I。表I氟喹諾酮和甘草苷分別對大腸桿菌73-2的MIC ( μ g/mL)
權利要求
1.甘草苷在制備大腸桿菌iEscherichiacoli)氟喹諾酮外排泵抑制劑中的應用。
2.根據(jù)權利要求1所述的應用，其特征在于，所述氟喹諾酮外排泵包括acrA外排泵。
3.根據(jù)權利要求1或2所述的應用，其特征在于，所述氟喹諾酮為氧氟沙星、左氧氟沙星、環(huán)丙沙星或恩諾沙星。
全文摘要
本發(fā)明公開了甘草苷在制備大腸桿菌氟喹諾酮外排泵抑制劑中的應用，研究結果顯示，甘草苷可以使耐藥大腸桿菌(氟喹諾酮主動外排表型且acrA基因高表達菌株)的氟喹諾酮最低抑菌濃度明顯降低、菌體內藥物蓄積濃度明顯增加、外排泵基因acrA表達量明顯降低，從而可以提高耐藥大腸桿菌對氟喹諾酮的敏感性，降低藥物使用量，降低治療成本，減少藥物殘留等食品安全問題；同時，甘草苷為植物中存在的天然化合物，無致畸、致癌等副作用，安全無毒；本發(fā)明不僅拓寬了甘草苷的應用領域，提高了甘草苷的市場價值，而且為抗感染治療提供了一種高效、安全的細菌外排泵抑制劑。
文檔編號A61P31/04GK102988400SQ201210582420
公開日2013年3月27日 申請日期2012年12月28日 優(yōu)先權日2012年12月28日
發(fā)明者吳俊偉, 張靜, 劉三俠, 宋小紅, 林永樂, 馬保瑞, 曾楊梅, 樂小麗, 楊成竹, 劉晴晴 申請人:西南大學