對乙型肝炎病毒感染或其與丁型肝炎病毒感染及相關(guān)肝臟疾病結(jié)合的治療的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及親環(huán)蛋白抑制劑在治療乙型肝炎及丁型肝炎病毒感染中的用途，其任選地與干擾素或替比夫定、拉米夫定、恩曲他濱、恩替卡韋、阿德福韋或替諾福韋聯(lián)合使用。
【專利說明】對乙型肝炎病毒感染或其與丁型肝炎病毒感染及相關(guān)肝臟疾病結(jié)合的治療
【背景技術(shù)】
[0001]本發(fā)明涉及結(jié)合親環(huán)蛋白(cyclophilin)的非免疫抑制性環(huán)孢素類似物，即親環(huán)蛋白抑制劑，尤其涉及其在治療單獨的乙型肝炎病毒(HBV)或其結(jié)合丁型肝炎病毒(HDV)感染及由此類感染引起的肝臟疾病中的制藥用途。
[0002]環(huán)孢素及非免疫抑制性類似物包含一類結(jié)構(gòu)上獨特的環(huán)狀聚-N-甲基化十一肽，其通常具有藥理學(xué)活性，尤其是免疫抑制或消炎活性。被分離的環(huán)孢素首先為天然存在的真菌代謝物環(huán)孢素(Ciclosporin)或環(huán)孢靈(Cyclosporine),也稱為環(huán)孢素A (CsA)。已識別強烈結(jié)合親環(huán)蛋白但不具有免疫抑制性的環(huán)孢素。PCT/EP2004/009804、W02005/021028或TO2006/071619(其以全文引用的方式并入本文中)揭示結(jié)合親環(huán)蛋白且也已發(fā)現(xiàn)對丙型肝炎病毒(HCV)具有抑制作用的非免疫抑制性環(huán)孢素。W02006/038088(以全文引用的方式并入本文中)描述在HCV`治療中使用阿拉泊韋(alisporivir)的方法及組合物。阿拉泊韋(DEB025或Debio-025)為親環(huán)蛋白(Cyp)抑制劑，且其作為抗HCV試劑的作用模式為經(jīng)由抑制與HCV復(fù)制直接有關(guān)的宿主蛋白，尤其親環(huán)蛋白A。
[0003]乙型肝炎病毒(HBV)為最小的人類DNA病毒(I)。HBV基因組為具有編碼HBV蛋白的重迭閱讀框的部分雙鏈環(huán)狀DNA:包膜蛋白-1)小，乙型肝炎表面抗原(HBsAg) ；ii)中等-preS2加上HBsAg ；iii)大-preSl加上preS2加上HBsAg:核衣殼蛋白,乙型肝炎核心抗原(HBcAg)。乙型肝炎e抗原(HBeAg)為HBV復(fù)制期間產(chǎn)生的與核衣殼HBcAg共享90%氨基酸的非結(jié)構(gòu)性蛋白。已確定HBV的八個基因型(指定為A至H)，各自具有不同的地理分布。病毒為非細(xì)胞致病性的，其中病毒特異性細(xì)胞免疫性為暴露于HBW6個月消退肝臟疾病的急性感染或常常與進行性肝臟損傷有關(guān)的長期HBV感染)的結(jié)果的主要決定因素。通過常規(guī)診斷免疫分析法在血清中檢測到HBsAg為感染HBV的關(guān)鍵診斷標(biāo)記，且在血清中持續(xù)檢測到HBsAg超過6個月為慢性HBV感染標(biāo)志(2，3，4)。臨床上顯著的HBV復(fù)制的最佳標(biāo)記為血清中的HBV DNA含量，如通過基于敏感聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)的分析所檢測的。
[0004]全世界超過3.5億人長期感染HBV，且因此發(fā)展成嚴(yán)重肝臟疾病(諸如慢性肝炎、肝硬化、肝臟衰竭及肝細(xì)胞癌(HCC))的風(fēng)險增大。慢性HBV感染的自然演變包括四個連續(xù)階段:(I)早期“免疫耐受”階段-高度病毒復(fù)制及最少肝臟炎癥；⑵免疫反應(yīng)性階段-肝臟炎癥明顯及血清轉(zhuǎn)氨酶增多；其中一些患者進展至(3) “非復(fù)制”階段-血清轉(zhuǎn)化至抗HBe ;病毒血癥不可檢測或程度低(通過基于PCR的分析低于2000IU/ml);肝臟炎癥消退；及(4)HBeAg陰性慢性乙型肝炎-歸因于防止HBeAg產(chǎn)生但并不妨礙病毒復(fù)制的特異性病毒突變的出現(xiàn)。該形式的CHB特征在于血清HBV DNA及血清轉(zhuǎn)氨酶(ALT及AST)含量波動及進行性肝臟疾病。重要的是注意到慢性乙型肝炎(CHB)可能以乙型肝炎e抗原(HBeAg)陽性或HBeAg陰性CHB的形式存在。CHB患者的縱向研究指示發(fā)展成肝硬化的5年累積發(fā)生率介于8%至20%范圍內(nèi)。肝臟失代償?shù)?年累積發(fā)生率為約20%(2)。在世界范圍內(nèi)HCC的發(fā)生率已增加且目前構(gòu)成最常見癌癥的第五位(2，3，4)。每年HBV相關(guān)HCC的發(fā)生率很高，當(dāng)確定為肝硬化時，在2%至5%范圍內(nèi)(2)。[0005]CHB治療的主要目標(biāo)為永久抑制HBV復(fù)制并改善肝臟疾病。臨床上重要的短期目標(biāo)為實現(xiàn)HBeAg血清轉(zhuǎn)化、血清ALT及AST正常化、消退肝臟炎癥及防止肝臟失代償(2)。治療的最終目標(biāo)為實現(xiàn)持久應(yīng)答以防止肝硬化、肝癌的發(fā)展并延長存活。由于感染肝細(xì)胞核中病毒共價閉合環(huán)狀DNA(ccc HBV DNA)的特定形式的持久性，HBV感染不能完全根除。然而，治療誘發(fā)的血清HBsAg清除為慢性HBV感染終止的標(biāo)記且與最佳長期結(jié)果有關(guān)(2，3)。
[0006]當(dāng)前七種藥物可用于治療CHB-常規(guī)的干擾素、聚乙二醇化干擾素及直接抗病毒劑。直接抗病毒劑(核苷/酸類似物(nucleos/tide analogue))屬于三種類別:L_核苷(拉米夫定(Iamivudine)、替比夫定(telbivudine)及恩曲他濱(emtricitabine));脫氧鳥苷類似物(恩替卡韋(entecavir))及核苷膦酸酯(阿德福韋(adefovir)及替諾福韋(tenofovir))，其主要作為鏈終止劑直接干擾HBV DNA復(fù)制(2，3，4)。在HBeAg陽性患者中，當(dāng)用以下藥物治療一年時病毒治療應(yīng)答率(無法檢測到血清HBV DNA)為:peg-干擾素25% ;拉米夫定36%-40% ;恩替卡韋67% ;替比夫定60% ;替諾福韋74%(2)。一年后HbsAg損失極低-在O與3%之間。在HBeAg陰性CHB患者中，當(dāng)用以下藥物治療一年時無法檢測到HBV DNA的應(yīng)答率為:peg-干擾素63% ;拉米夫定72% ;恩替卡韋90% ;替比夫定88% ;替諾福韋91%。使用任何直接抗病毒劑時，HBsAg損失為0%。當(dāng)前可獲得的治療為次優(yōu)的且需要更佳療法以滿足CHB的治療 目標(biāo)。干擾素治療的關(guān)鍵限制為顯著的副作用、HBV DNA抑制速率低及ALT正?；俾实停皇褂弥苯涌共《緞┑闹委煹年P(guān)鍵限制為:抗性發(fā)展；在停止療法之后HBV復(fù)制重新開始，因而需要長期(終生)療法；HBsAg清除速率極低；使用長期(終生)療法時發(fā)生不良事件的風(fēng)險增大。
[0007]一部分慢性HBV感染(血清HBsAg陽性)患者將共感染丁型肝炎病毒(HDV)。HDV為具有單鏈環(huán)狀RNA基因組的缺陷病毒，其僅可聯(lián)合乙型肝炎病毒一起引起急性或慢性肝臟疾病(I)。由HDV RNA表達(dá)的唯一蛋白為丁型肝炎抗原，其為病毒的核衣殼。HDV并不編碼其自身包膜蛋白(HBsAg)且必須自乙型肝炎病毒“借”該包膜蛋白。因此，感染HDV僅發(fā)生在HBV存在時-與HBV同時(共感染)或隨后發(fā)生，感染的持續(xù)時間由HBsAg陽性的持續(xù)時間確定。在HBsAg陽性患者中，HDV主動感染是由在血清中檢測到HDV RNA、對肝細(xì)胞中的丁型肝炎抗原進行免疫組織化學(xué)染色、或在血清中檢測到IgM抗HDV而證實(2)。
[0008]在世界范圍內(nèi)，HDV在地中海國家、南非及中非地區(qū)及南美具有最高地域分布。估計所有乙型肝炎病毒攜帶者中有5%感染HDV(5)。在HBV流行率低的國家(諸如北美及北歐)，HDV感染主要局限于處于非經(jīng)腸HBV暴露風(fēng)險中的人群，如靜脈內(nèi)藥物使用者。自具有高HDV地域性的地區(qū)移民已使若干歐洲國家的流行率增加，最近在慢性HBV患者中占約10%。
[0009]慢性丁型肝炎的唯一批準(zhǔn)療法為結(jié)果不能令人滿意的干擾素α。添加利巴韋林至干擾素中并不改善應(yīng)答。阻斷HBV復(fù)制的直接抗病毒劑顯示對HDV復(fù)制無影響。與單獨干擾素相比，干擾素加上拉米夫定或干擾素加上阿德福韋的組合并不改善應(yīng)答(2，3，6)。因此，慢性丁型肝炎的治療仍為主要的未滿足的醫(yī)學(xué)需要，因為HDV誘發(fā)的肝臟損壞會引起肝硬化、肝臟失代償及在一些情況下由于肝衰竭而死亡。
[0010]因此，本發(fā)明的目標(biāo)為提供治療僅具有乙型肝炎病毒感染的患者或具有乙型肝炎病毒及丁型肝炎病毒感染及通過此類感染誘發(fā)的肝臟疾病或病癥(諸如慢性肝炎、肝硬化、肝臟失代償及HCC)的患者的新方法。[0011]我們已意外發(fā)現(xiàn)親環(huán)蛋白抑制劑(尤其阿拉泊韋)具有針對乙型肝炎病毒的抗病毒性質(zhì)，其可有效地用于治療HBV感染。尤其是，我們已發(fā)現(xiàn)阿拉泊韋會消除(或干擾)HBV復(fù)制且減少肝細(xì)胞中HbsAg產(chǎn)生。此外，親環(huán)蛋白抑制劑(尤其阿拉泊韋)也可用于治療慢性丁型肝炎。
[0012]因此，本發(fā)明提供使用阿拉泊韋的新的抗HBV及抗HDV治療。
[0013]此外，本發(fā)明提供治療患者中HBV及/或HDV感染及所誘發(fā)肝臟疾病的方法，其包含單獨施用或與直接抗病毒劑或干擾素_α組合施用有效量的親環(huán)蛋白抑制劑(尤其阿拉泊韋)。本發(fā)明進一步提供用于治療HBV感染及相關(guān)肝臟疾病且也用于治療感染HBV及HDV的患者及相關(guān)肝臟疾病的阿拉泊韋。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0014]進一步地，描述 以下內(nèi)容:
[0015]1.1.一種治療患者中乙型肝炎病毒感染及HBV誘發(fā)病癥的方法，其包含向該患者施用阿拉泊韋。
[0016]1.2.一種抑制HBV復(fù)制及HBsAg產(chǎn)生的方法，其包含施用阿拉泊韋。
[0017]1.3.一種治療患者中的丁型肝炎病毒感染及HDV誘發(fā)病癥的方法，其包含向該患者施用阿拉泊韋。
[0018]1.4.一種抑制HDV復(fù)制及HBsAg產(chǎn)生的方法，其包含施用阿拉泊韋。
[0019]1.5.一種減少HBV或HDV誘發(fā)的肝臟損壞及減少肝臟細(xì)胞死亡的方法，其包含施用阿拉泊韋。
[0020]1.6.一種使血清ALT含量正?；姆椒?，其包含施用阿拉泊韋。
[0021]1.7.一種減輕或消退肝臟炎癥的方法，其包含施用阿拉泊韋。
[0022]2.阿拉泊韋在制備用于如以上所定義的任何方法中的藥物組合物的用途。
[0023]3.阿拉泊韋在制備用于如以上所定義的任何方法中的藥物的用途。
[0024]4.阿拉泊韋與抑制HBV復(fù)制的直接抗病毒劑組合在制備用于如以上所定義的任何方法的藥物的用途。
[0025]5.阿拉泊韋與干擾素組合在治療HBV感染及相關(guān)肝臟疾病的患者及感染HBV及HDV及相關(guān)肝臟疾病的患者中的用途。
[0026]附圖簡要說明
[0027]圖1顯示用5微克/毫升濃度的阿拉泊韋觀察到細(xì)胞內(nèi)HBV DNA含量明顯下降(于72小時下降10倍)。
[0028]如圖2中可見，當(dāng)與ΝΜ811的作用相比時，5.0微克/毫升濃度的阿拉泊韋在減少細(xì)胞培養(yǎng)上清液中的HBV DNA含量中顯示更大作用。
[0029]圖3說明在DEB025存在下，自經(jīng)瞬時轉(zhuǎn)染細(xì)胞(Huh7)或自經(jīng)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染(HepG2215)細(xì)胞分泌的HBV DNA呈現(xiàn)劑量依賴性減少。
[0030]圖4說明在DEB025存在下，在Huh7及H印G2215細(xì)胞中的細(xì)胞質(zhì)HBV DNA呈現(xiàn)劑量依賴性減少。
[0031]圖5說明在DEB025 (DEB)、替比夫定(TELB)及DEB+TELB存在下H印G2215細(xì)胞中分泌的HBV DNA減少。[0032]圖6說明在DEB025(DEB)、替比夫定(TELB)及DEB+TELB存在下，！fepG2215細(xì)胞中的細(xì)胞HBV DNA減少。
[0033]發(fā)明詳細(xì)描述
[0034]如本文中所用，“乙型肝炎病毒感染患者”意指感染任何乙型肝炎病毒基因型(例如基因型A、B、C、D等)的患者。在一些實施例中，患者感染丁型肝炎病毒。在一些實施例中，乙型肝炎病毒感染患者可也感染丁型肝炎病毒。
[0035]在本發(fā)明中，干擾素可為聚乙二醇化或非聚乙二醇化的且可包括如下干擾素，諸如:Intron-A?，干擾素 a-2b (Schering Corporation, Kenilworth, NJ) ;PEG_ Intron?，peg 干擾素 a-2b (Schering Corporlntrontion, Kenilworth, NJ) ; Roferon?,重組干擾素 a -2a(Hoffmann-La Roche, Nutley, NJ) ； Pegasys?，peg 干擾素 a-2a(Hoffmann-LaRoche, Nutley, NJ) ； Berefor?，可獲得的干擾素 α 2 (Boehringer Ingelheim Pharmaceutical, Inc., Ridgefield, CT) ； Sumiferon?，天然 α 干擾素的經(jīng)純化慘合物(Sumitomo, Japan) ； Wellferon?，淋巴細(xì)胞樣干擾素 a nl (GlaxoSmithKline)；Intergen?，復(fù)合 α 干擾素(InterMune Pharmaceuticals, Inc.，Brisbane, CA 及Amgen, Inc., Newbury Park, CA) ； Alferon.?,天然 α 干擾素的混合物(InterferonSciences 及 Purdue Frederick C0., CT) ； Viraferon?；及此類干擾素的組合。
[0036]可使用的綴合干擾素包括例如與人類白蛋白綴合的Albuferon(Human GenomeScience)。干擾素與諸如聚 乙二醇(PEG)或聚丙二醇、聚氧乙烯化多元醇的水溶性聚合物或聚烷醚均聚物、其共聚物及其嵌段共聚物綴合。作為基于聚烷醚的聚合物的替代物，可有效使用非抗原性材料，諸如葡聚糖、聚乙烯吡咯啶酮、聚丙烯酰胺、聚乙烯醇、基于碳水化合物的聚合物及其類似物。干擾素-聚合物結(jié)合物描述于US4766106、US4917888、EPA O 236987,EPA O 510 356及W095/13090中。由于聚合修飾充分地降低抗原應(yīng)答，故外來干擾素?zé)o需為完全自體的。用于制備聚合物綴合物的干擾素可自哺乳動物提取物(諸如人類、反芻動物或牛干擾素)制備或重組產(chǎn)生。其他形式的干擾素包括干擾素β、Y、τ及ω，諸如由Serono制造的Rebif (干擾素β Ia)、由Viragen制造的Omniferon (天然干擾素)或由Boehringer Ingelheim制造的ω干擾素?？诜蓴_素，諸如由Amarillo Biosciences制造的口服干擾素α。
[0037]可使用的干擾素的其他實例包括聚乙二醇化干擾素α，例如聚乙二醇化干擾素a -2a、聚乙二醇化干擾素a _2b、聚乙二醇化復(fù)合干擾素或聚乙二醇化純化干擾素-α產(chǎn)物。聚乙二醇化干擾素a-2a描述于歐洲專利593，868(以全文引用的方式并入本文)中，且可以例如商標(biāo)名PEGASYS? (Hoffmann-La Roche)購得。聚乙二醇化干擾素a _2b描述于例如歐洲專利975，369 (以全文引用的方式并入本文)中，且例如以商標(biāo)名PEG-1NTRON A? (Schering Plough)購得。聚乙二醇化復(fù)合干擾素描述于W096/11953 (以全文引用的方式并入本文)中。
[0038]在優(yōu)選實施例中，在本發(fā)明方法中所用的干擾素為聚乙二醇化干擾素。在其他實施例中，干擾素選自干擾素a-2a、干擾素a _2b、復(fù)合干擾素、經(jīng)純化干擾素α產(chǎn)物或聚乙二醇化干擾素a _2a、聚乙二醇化干擾素a-2b及聚乙二醇化復(fù)合干擾素、天然α的混合物及其組合。
[0039]使用干擾素α的方法優(yōu)選使用聚乙二醇化干擾素a _2b，且聚乙二醇化干擾素a -2b的量為以每周、一周三次、每隔一天或每天計每周0.5微克/公斤至2.0微克/公斤。
[0040]如本文中所用，“微克/公斤”意指每公斤欲治療哺乳動物(包括人類)的體重以微克計的藥物。
[0041]如本文中所用，術(shù)語“治療(treatment/treat) ”是指防治性或預(yù)防性治療以及治愈性或疾病改善性治療，包含治療處于感染疾病的風(fēng)險中或疑似已感染疾病的患者以及生病或已經(jīng)診斷為患有疾病或醫(yī)學(xué)病狀的患者，且包括抑制臨床復(fù)發(fā)。可向具有醫(yī)學(xué)病癥或最終可患該病癥的個體施用治療，以預(yù)防病癥或復(fù)發(fā)病癥、治愈病癥或復(fù)發(fā)病癥、延遲其發(fā)作、減輕其嚴(yán)重程度或改善其一或多種癥狀，或者以延長個體的存活至超出未使用該治療時的預(yù)期存活。
[0042]“治療方案”意指疾病的治療模式，例如HBV療法期間所用的給藥模式。治療方案可包括誘導(dǎo)方案及維持方案。
[0043]詞組“誘導(dǎo)方案”或“誘導(dǎo)期”是指用于疾病的初始治療的治療性方案(或治療性方案的一部分)。誘導(dǎo)方案的一般目標(biāo)為在治療方案的初期期間 向患者提供高含量的藥物。誘導(dǎo)方案可(部分或完全)使用“載藥方案”，其可包括施用比醫(yī)師在維持方案期間會使用的劑量更大劑量的藥物、比醫(yī)師在維持方案期間施用藥物更頻繁地施用藥物或兩者皆有。
[0044]詞組“維持方案”或“維持期”是指在治療疾病期間用于維持患者的治療性方案(或治療性方案的一部分)，例如以便使患者長時間(數(shù)月或數(shù)年)保持緩解狀態(tài)。維持方案可使用連續(xù)療法(例如以規(guī)則時間間隔(例如每周、每月、每年等)施用藥物)或間歇療法(例如間斷治療、間歇治療、復(fù)發(fā)時治療或達(dá)到特定預(yù)定標(biāo)準(zhǔn)[例如疼痛、疾病表現(xiàn)等]后治療)。
[0045]如本文中所用，除非上下文另有指示，否則使用術(shù)語“約”意指+10%或-10%的范圍。
[0046]在其他實施方案中，干擾素α為聚乙二醇化干擾素a _2a，且所施用聚乙二醇化干擾素a -2a的量為以每周、一周三次、每隔一天或每天計，每周20微克/公斤至250微克/公斤。干擾素peg_IFNa2a優(yōu)選以180微克的量每周施用一次。
[0047]在特定實施方案中，在本文方法中使用的示例性干擾素為選自以下的干擾素:Intron-A? ；:PEG-1ntron? ； Roferon? ； Pegasys? ; Bereibr? ； Sumiferon? ;
Wellferon i< Infergen? ； Alferon? ； Viraferon? ； Albuferon? (Human GenomeScience) ；Rebif ；Omniferon ;0mega 及其組合。
[0048]在一些實施方案中，使用阿拉泊韋來治療患者中的乙型肝炎病毒感染及/或治療患者中的丁型肝炎病毒感染。在另一方面，阿拉泊韋與直接抗病毒劑或干擾素組合施用。
[0049]在一些其他實施方案中，描述一種治療患者中的乙型肝炎病毒感染的方法，其包括施用有效量的阿拉泊韋及任選地向患者施用干擾素或直接抗病毒劑。在另一方面，阿拉泊韋用于改善肝臟炎癥、減少肝臟細(xì)胞死亡(如通過ALT含量所評估)及預(yù)防肝臟疾病的進展。[0050]在另一實施方案中，描述了用于本文所披露的任何方法的包含阿拉泊韋的藥物組合物，及包含該藥物組合物以及施用該組合物的說明書的包裝。
[0051]在另一實施方案中，阿拉泊韋可與其他促進療法治療的抗病毒功效的標(biāo)準(zhǔn)治療藥劑一起施用。
[0052]本文中使用直接抗病毒劑來意指干擾乙型肝炎病毒(HBV)復(fù)制周期中的特定步驟的藥劑。抑制HBV復(fù)制的直接抗病毒劑可為例如任何當(dāng)前批準(zhǔn)用于治療HBV的抗HBV藥劑，也即替比夫定、拉米夫定、恩曲他濱、恩替卡韋、阿德福韋及替諾福韋。
[0053]在上述治療中，有效劑量的標(biāo)準(zhǔn)治療藥劑以組合物形式施用，也即其可一起(也即同時)施用，但也可獨立或依序施用。一般而言，組合療法通常一起施用，基本原理為該同時施用在病毒上誘發(fā)同時多重壓力。給定的特定劑量將取決于藥物的吸收、失活及排泄率以及其他因素。應(yīng)注意，劑量值也將隨欲減輕的病狀的嚴(yán)重程度而變化。如本文中所用，術(shù)語“共施用”或“組合施用”或“與...組合施用”或其類似術(shù)語意在涵蓋向單一患者施用所選治療劑，且意欲包括藥劑不必通過同一施用途徑或在同一時間施用的治療方案。固定組合也屬于本發(fā)明的范疇內(nèi)。與僅應(yīng)用一種藥學(xué)活性成分的單一療法相比或與當(dāng)前的標(biāo)準(zhǔn)治療療法相比，施用本發(fā)明的醫(yī)藥組合會產(chǎn)生有益效果，例如協(xié)同或加成治療效果。本文所述方法中所用的治療可通過任何常規(guī)途徑施用。一或多種組分可非經(jīng)腸施用，例如呈可注射溶液或懸浮液的形式或呈可注 射沉積制劑的形式。阿拉泊韋優(yōu)選將以膠囊、片劑或供飲用溶液或懸浮液的形式經(jīng)口施用。包含阿拉泊韋的供經(jīng)口施用的藥物組合物通常另外包含一或多種藥學(xué)上可接受的載體物質(zhì)。此類組合物通常為濃縮的且施用之前需要與適當(dāng)稀釋劑(例如水)組合。供非經(jīng)腸施用的藥物組合物通常也包括一或多種賦形劑。任選的賦形劑包括等張劑、緩沖劑或其他PH控制劑及防腐劑?？商砑哟祟愘x形劑以便維持組合物及獲得優(yōu)選范圍的PH值(約6.5-7.5)及容積滲透濃度(約300mOsm/L)。
[0054]如本文中所描述的阿拉泊韋是以單一劑型或一種以上劑型施用；可每天每次施用一或多種經(jīng)口劑型。在一些實施方案中，阿拉泊韋是以200mg至IOOOmg的劑量施用。
[0055]可使用標(biāo)準(zhǔn)方案監(jiān)測治療方案的功效。治療后可測定血清中的HBV含量及量測血清ALT含量。舉例而言，可評估患者血清中HBV DNA的存在。在治療期間可以規(guī)則時間間隔量測HBV DNA(IU/mL)，例如在第I天(給藥前及給藥后4、8及12小時)及在第2天、第3天、第8天、第15天、第29天給藥前及在第12周、第24周、第36周、第48周、第72周(若適用)及在追蹤時。
[0056]將使用國際上接受的參數(shù)(2，3，4)監(jiān)測療法的功效:
[0057]1.1.監(jiān)測具有乙型肝炎病毒的患者中的應(yīng)答
[0058]a)使用基于靈敏定量PCR的分析監(jiān)測血清HBV DNA含量以評估對病毒復(fù)制的影響。
[0059]b)在HBeAg陽性患者中-HBeAg連同相應(yīng)抗HBe —起經(jīng)監(jiān)測以確定是否已發(fā)生HBe-血清轉(zhuǎn)化。
[0060]c)監(jiān)測血清ALT及/或AST含量以評估對肝臟炎癥及肝臟細(xì)胞死亡的影響。
[0061]d)監(jiān)測血清HBsAg-定性及定量，因為HBsAg清除將指示最佳治療結(jié)果。
[0062]e)賦予對所用治療的抗性的HBV基因組中的突變的發(fā)展。
[0063]1.2監(jiān)測具有丁型肝炎病毒的患者中的應(yīng)答。除以上所列用于HBV感染的標(biāo)記外，也將使用以下HDV特異性測試:
[0064]a)監(jiān)測血清HDV RNA含量以評估對丁型肝炎病毒復(fù)制的影響。
[0065]b)通過免疫組織化學(xué)在肝臟組織中檢測到D抗原可提供其他指示正在進行的HDV復(fù)制的信息。
[0066]以下實施例說明上文中描述的本發(fā)明。
實施例
[0067]實驗設(shè)計及人類細(xì)胞株:
[0068]實驗已使用若干已確定為活體外研究乙型肝炎病毒或丁型肝炎病毒生命周期的模型的源自人類肝細(xì)胞瘤的細(xì)胞株:HepG2及HuH-7 (HBV陰性)、PLC/PRF/5 (HBV陽性，僅產(chǎn)生HBsAg)及H印G2.2.15 (HBV陽性，支持完全HBV復(fù)制)，且評估各種化合物對病毒復(fù)制及病毒蛋白質(zhì)生成的影響。
[0069]A)研究親環(huán)蛋白抑制劑尤其是DEB025(阿拉泊韋)對乙型肝炎病毒復(fù)制及HBsAg生成的抗病毒活性
[0070]HeDG2215細(xì)朐株(源自HepG2細(xì)朐)經(jīng)HBV DNA穩(wěn)定轉(zhuǎn)染且支持完全HBV復(fù)制，產(chǎn)生感染性病毒粒子及HBsAg。如先前所述(7，8)，添加親環(huán)蛋白抑制劑之前在12孔培養(yǎng)盤中培養(yǎng)H印G2215細(xì)胞7天。
[0071]以0.25微克/毫升、1.0微克/毫升或5.0微克/毫升的NM811或DEB025處理細(xì)胞；在基線、分別添加NM811或DEB025后的6、24、48及72小時分別采集細(xì)胞及上清液。
[0072]為評估親環(huán)蛋白A在HBV復(fù)制中的作用，用針對親環(huán)蛋白A的&1?嫩轉(zhuǎn)染!1印62215細(xì)胞且僅用培養(yǎng)基或用添加NM811或DEB025的培養(yǎng)基培育。類似地，將通過對親環(huán)蛋白B、C及D具特異性的siRNA評估CypB、C及D在HBV及HDV復(fù)制中的作用。
[0073]用含有具有亞型adw2的L 5個HBV DNA基因組的pBlueScript KS (+)載體的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染 HuH-7 細(xì)胞。使用 10 μ I Superfect 試劑(Qiagen, Crawley, UK)以每個 60_mm 直徑培養(yǎng)皿5 μ g質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染亞匯合HuH-7細(xì)胞。如(7)所述，轉(zhuǎn)染后18小時用補充有10%FCS的培養(yǎng)基替代上清液，且培養(yǎng)細(xì)胞3天。
[0074]PLC/PRF/5細(xì)朐(Alexander細(xì)朐株)含有經(jīng)糖合的HBV DNA片段且僅產(chǎn)生HBsAg，但不支持完全HBV復(fù)制(9)。其類似于作為非活性HBsAg攜帶者的患者(也即慢性HBV感染的非復(fù)制階段)中的肝細(xì)胞。采用該細(xì)胞株以特定地評估親環(huán)蛋白抑制劑獨立于完全病毒粒子產(chǎn)生對HBsAg生成的影響。
[0075]結(jié)果
[0076]I)圖1:親環(huán)蛋白抑制劑NM811及DEB025均使細(xì)胞內(nèi)HBV核衣殼關(guān)聯(lián)的HBV DNA含量降低。與NM811或DEB025不存在下的H印G2215細(xì)胞相比，HBV DNA減少在2倍與10倍之間。觀察到使用DEB025 (5微克/毫升)時細(xì)胞內(nèi)HBV DNA含量最顯著減少(72小時的時減少10倍)，其大于使用NIM811在72小時觀察到的減少。
[0077]2)圖2:與NIM811的作用相比時，DEB025 (5.0微克/毫升)在減少細(xì)胞培養(yǎng)上清液中的HBV DNA含量中顯示更大作用。
[0078]B)研究親環(huán)蛋白抑制劑尤其是DEB025(阿拉泊韋)對丁型肝炎病毒復(fù)制的抗病毒[0079]丁型肝炎病毒(HDV)的感染始終與輔助病毒-乙型肝炎病毒的存在有關(guān)。該依賴性的基礎(chǔ)為HBV包膜蛋白是HDV進入肝細(xì)胞及新HDV粒子裝配所需要的。一旦進入易感染細(xì)胞內(nèi)部，HDV的單鏈環(huán)狀RNA基因組可使用宿主RNA聚合酶的再定向通過RNA定向的RNA合成而復(fù)制?；铙w外，可研究不存在輔助HBV的情況下所培養(yǎng)細(xì)胞株內(nèi)的HDV基因組復(fù)制。舉例而言，當(dāng)細(xì)胞經(jīng)HDV序列的cDNA形式轉(zhuǎn)染時引發(fā)復(fù)制(10)。此外，可通過與針對SAg的mRNA—起共轉(zhuǎn)染HDV RNA來滿足需要(11)。
_0] C)研究親環(huán)蛋白抑制劑(特別是DEB025(阿拉泊韋))與靶向HBV-DNA聚合酶的肓接抗病毒劑(替比夫定)的組合對乙型肝炎病毒復(fù)制的抗病毒活性
[0081]用一定濃度范圍(0.25微克/毫升、1.0微克/毫升、5.0微克/毫升或20微克/毫升)的單獨的阿拉泊韋、單獨的替比夫定或阿拉泊韋與替比夫定的組合處理產(chǎn)生完全HBV病毒粒子及HBsAg粒子的經(jīng)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染0fepG2215)及經(jīng)瞬時轉(zhuǎn)染(HUH-7)的細(xì)胞。為確定各親環(huán)蛋白的參與性，用對親環(huán)蛋白(Cyp) A、C或D具特異性的siRNA轉(zhuǎn)染!fepG2215細(xì)胞且另外用阿拉泊韋處理此類細(xì)胞。在基線、處理后24、48及72小時采集細(xì)胞質(zhì)提取物及上清液。通過定量細(xì)胞內(nèi)及分泌的HBV-DNA(實時qPCR)及HBsAg含量(ELISA)評估抗病毒活性的動力學(xué)。
[0082]在H印G2215及HUH-7細(xì)胞中，阿拉泊韋處理法在所有時間點均導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)及分泌的HBV-DNA的劑量依賴性減少，與未經(jīng)處理的對照相比分別減少70% (p=0.004)及63%(ρ〈0.001)。阿拉泊韋與替比夫定的組合在減少細(xì)胞內(nèi)(ρ=0.001)及分泌的(ρ=0.028)HBV-DNA中具有更大作用，且相較于單獨的阿拉泊韋或替比夫定，HBsAg的減少>3倍。在用相應(yīng)siRNA轉(zhuǎn)染后，CypA, C或D表現(xiàn)明顯降低，其與HBV-DNA及HBsAg含量明顯下降(ρ〈0.001)有關(guān)。阿拉泊韋處理CypA、C或D的沉默細(xì)胞使HBV-DNA及HBsAg含量進一步降低，在CypC或CypD沉默細(xì)胞中的抗病毒作用大于CypA沉默細(xì)胞(silenced cell)(ρ〈0.001)。`
[0083]此類結(jié)果顯示，阿拉泊韋干擾多個位點的HBV復(fù)制，且其抗病毒活性與靶向病毒DNA聚合酶的直接抗病毒劑(諸如替比夫定)具有協(xié)同作用。
[0084]1.細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染
[0085]如此前所述(12)，在補充有10%胎牛血清、青霉素及鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基(Dulbecco's modified Eagle’s medium)中培養(yǎng)人類肝癌細(xì)胞株 HuH7 且在 37°C 下 5%C02中培育。對于轉(zhuǎn)染研究，在6孔培養(yǎng)盤或60-mm直徑petri培養(yǎng)皿中接種細(xì)胞培養(yǎng)物一夜，且根據(jù)制造商的說明書使用DMRIE-C試劑(Gibco BRL)分別用5 μ g及10 μ g的HDAg mRNA與HDV RNA(基因組長度的1.2倍)的50:50混合物轉(zhuǎn)染。在轉(zhuǎn)染后，培育培養(yǎng)物一夜，更換培養(yǎng)基，且繼續(xù)培育長達(dá)再2至7天。
[0086]2.定量細(xì)胞質(zhì)及細(xì)胞上清液中的HBV DNA
[0087]如先前所述(8，9)，通過定量細(xì)胞培養(yǎng)上清液中的病毒核衣殼關(guān)聯(lián)HBV DNA (細(xì)胞質(zhì))及HBV DNA含量評估HBV復(fù)制。提取核衣殼HBV DNA且通過TaqMan實時PCR (ABIPrism7700)定量。使用b肌動蛋白作為看家基因(house-keeping gene)使細(xì)胞內(nèi)HBVDNA正?；?。用QIAmp DNA微型試劑盒(Qiagen, Sussex, UK)提取分泌的HBV DNA且也通過TaqMan定量。如(9，10)所描述，用HBV DNA質(zhì)粒的連續(xù)稀釋液以及EuroH印HBV DNA標(biāo)準(zhǔn)物驗證每一操作中HBV DNA定量的靈敏度。[0088]3.HBsAg 定量
[0089]使用已知量的HBsAg的連續(xù)稀釋液以Elisa(Abazyme, Needham, MA)定量細(xì)胞培養(yǎng)上清液(來自2215及PLC/PRF/5細(xì)胞)中的HBsAg含量(9)。
[0090]4.SiRNA 轉(zhuǎn)染
[0091]使用siRNA (Dharmacon Inc., Lafayette, CO)以 50% 密度接種 HepG2215 細(xì)胞且培育48小時。隨后，洗滌細(xì)胞且添加NM811或DEB025(BL)。在6小時、24小時(更換培養(yǎng)基)及48小時收集細(xì)胞及上清液樣品。如上所述，自樣品中提取總DNA且通過實時PCR定量HBV DNA?？俁NA以苯酹、氯仿提取。用Quantitect逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Qiagen)逆轉(zhuǎn)錄RNA 且用 SYBR Green Quantitect 試劑盒使用 Quantitect 引物(Qiagen, Sussex, UK)定量cDNA。
[0092]5.HBsAg的免疫印跡分析
[0093]48小時后，以胰蛋白酶處理細(xì)胞(PLC/PRF/5或H印G2215細(xì)胞)并在磷酸鹽緩沖生理食鹽水中洗滌兩次且再懸浮于溶解緩沖液中。如所描述立1，在單克隆抗HBsIgG存在或不存在下培養(yǎng)的細(xì)胞中，通過western印跡法分析PLC/PRF/5細(xì)胞中人類IgG及HBsAg的存在。
[0094]6.丁型肝炎RNA的體外轉(zhuǎn)錄
[0095]如先前所描述(13)，在用限制酶NotI線性化后，用T7MEGAscript試劑盒(Ambion)自質(zhì)粒 pBS δ 1.2G、pBS δ 1.2AG、pBS δ 1.2G(2xS)及 pBS δ 1.2AG(2xS)轉(zhuǎn)錄 1.2倍基因組長度的HDV RNA0在用HindIII線性化后，通過使用T7m-Message m_Machine試劑盒(Ambion)自質(zhì)粒pX9_I/II轉(zhuǎn)錄HD Ag的加帽mRNA (Capped mRNA)。在通過PstI消化線性化后，用T7MEGAscript自ρΤΜ δ SalA及ρΤΜ δ SalB轉(zhuǎn)錄未經(jīng)標(biāo)記單體基因組及反基因組HDV RNA。
[0096]7.HDV RNA 的 Northern 分析
[0097]使用QIAamp病毒RNA微型試劑盒(QIAGEN, Valencia, Calif)根據(jù)制造商的說明書純化來自接種物或血清的病毒RNA(14，15)。接著在1.9M乙二醛(FisherScientific, Fair Lawn, N.J) -7.1mM 磷酸鈉(ρΗ6.8)-4.5mM EDTA_35%DMS0 存在下，在 55°C下培育各種量的RNA50分鐘。接著將樣品加至含有IOmM磷酸鈉(pH6.8)的1.5%瓊脂糖凝膠上，且在150mA下經(jīng)電泳4小時。對于上清液，使用一半RNA，而對于細(xì)胞RNA，加樣5μ g。RNA經(jīng)毛細(xì)管轉(zhuǎn)移隔夜至ξ探針(Bio-Rad，Richmond，Calif)膜。轉(zhuǎn)移后，烘烤或使用Stratalinker (Stratagene)UV交聯(lián)該膜。如詳細(xì)描述(15),使印跡雜交。雜交后,在70°C下相繼用 400ml2XSSPE-0.1%SDS,400ml I X SSPE-0.1%SDS 及 200ml0.1 X SSPE-0.1%SDS 洗漆印跡。在70°C下干燥該膜且使其經(jīng)受自動放射線成像及磷屏成像(Molecular Dynamics)分析。
[0098]8.血清樣品中的實時PCR定量(如先前所述(16))
[0099]HDV RNA是通過使用QIAamp MinElute病毒真空裝置(QIAGEN, Courtaboeuf, France)自250 μ I血清或血衆(zhòng)提取。如先前所述，合成cDNA且用Montage PCR 離心過濾裝置(Millipore, Molsheim, France)純化。
[0100]選擇正向引物靶向基因組的核酶區(qū)域，且反向引物靶向反基因組核酶的區(qū)域I。雜交至與反向引物相同的區(qū)域的探針經(jīng)設(shè)計以與反基因組序列退火，以避免與反向引物堿基配對。引物及探針的名稱及序列如下:Delta-F(正向引物)，5’-GCATGGTCCCAGCCTCC-3’ ；Delta-R(反向引物)，5’-TCTTCGGGTCGGCATGG-3’ ；及Delta-P (探針)，5’ -FAM-ATGCCCAGGTCGGAC-MGB-3’。由于存在與 HDV-3 基因組序列的一個錯配，特別設(shè)計以下第二直接引物用于擴增HDV-3分離株:T3-Delta-F，5’ -GCATGGCCCCAGCCTCC-3’。
[0101]通過使用TaqMan通用PCR母板混合物(AppliedBiosystems, Courtaboeuf, France)執(zhí)行實時PCR。反應(yīng)由一個5(TC下2分鐘的起始步驟、隨后95°C下10分鐘及接著包括95°C下15秒及60°C下I分鐘的45個擴增循環(huán)組成。用ABI PRISM7000序列檢測系統(tǒng)(Applied Biosystems, Courtaboeuf, France)執(zhí)行反應(yīng)、數(shù)據(jù)獲取及分析。
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【權(quán)利要求】
1.用于治療患者中乙型肝炎病毒感染的阿拉泊韋。
2.用于治療患者中丁型肝炎病毒感染的阿拉泊韋。
3.如權(quán)利要求1或2所述用途的阿拉泊韋，其中阿拉泊韋與直接抗病毒劑組合施用。
4.如權(quán)利要求1或2所述用途的阿拉泊韋，其中所述直接抗病毒劑選自基本上由替比夫定、拉米夫定、恩曲他濱、恩替卡韋、阿德福韋及替諾福韋組成的群。
5.如權(quán)利要求1或2所述用途的阿拉泊韋，其中阿拉泊韋與干擾素組合施用。
6.用于治療患者中乙型肝炎病毒感染及丁型肝炎病毒感染的阿拉泊韋。
7.如權(quán)利要求6所述用途的阿拉泊韋，其中阿拉泊韋與直接抗病毒劑或干擾素組合施用。
8.治療患者中乙型肝炎病毒感染的方法，其包括施用有效量的阿拉泊韋，及任選地向該患者施用干擾素或直接抗病毒劑。
9.治療患者中感染丁型肝炎病毒的感染的方法，其包括施用有效量的阿拉泊韋，及任選地向該患者施用干擾素或直接抗病毒劑。
10.預(yù)防患者中肝臟疾病進展的方法，其包括施用阿拉泊韋。
11.藥物組合物，其 包含如權(quán)利要求1至7中任一項所述用途的阿拉泊韋。
【文檔編號】A61K38/13GK103458913SQ201280017298
【公開日】2013年12月18日 申請日期:2012年3月30日 優(yōu)先權(quán)日:2011年4月1日
【發(fā)明者】N·納烏莫夫 申請人:諾華股份有限公司