多核巨核細(xì)胞以及血小板的制造方法
【專利摘要】本發(fā)明的目的在于提供促進(jìn)巨核細(xì)胞的多核化、制備更加多核化的多核巨核細(xì)胞的方法，進(jìn)一步地從多核巨核細(xì)胞有效地產(chǎn)生血小板的方法等。本發(fā)明提供制造多核巨核細(xì)胞的方法，包括在多核化前的巨核細(xì)胞中使抗細(xì)胞凋亡基因強(qiáng)制表達(dá)，培養(yǎng)該細(xì)胞的工序。
【專利說(shuō)明】多核巨核細(xì)胞以及血小板的制造方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及使多核化前的巨核細(xì)胞有效地進(jìn)行多核化的方法、以及從該巨核細(xì)胞制造血小板的方法等。
【背景技術(shù)】
[0002]在與血液有關(guān)的疾病的治療或外科治療中，需要較多的血液細(xì)胞。在血液細(xì)胞中，血小板作為血液凝固以及止血所需的細(xì)胞，是尤為重要的血液細(xì)胞中的一種。血小板在白血病、骨髓移植、抗癌治療等治療中需要的量多，且穩(wěn)定供給的必要性高。以往，為了確保血小板的供給，除了通過(guò)從獻(xiàn)血者的血液提取的方法外，采用了給予如TPO樣類似物(mimetics)制劑的方法、從臍帶血或骨髓細(xì)胞分化巨核細(xì)胞的方法等。近年來(lái)，也已研發(fā)出將ES細(xì)胞或iPS細(xì)胞等多功能干細(xì)胞在體外(in vitro)進(jìn)行分化誘導(dǎo)，制備血小板等血液細(xì)胞的技術(shù)。
[0003]
【發(fā)明者】們確立了從人類ES細(xì)胞分化誘導(dǎo)巨核細(xì)胞以及血小板的技術(shù)，揭示了 ES細(xì)胞作為血小板的來(lái)源(source)的有效性(專利文獻(xiàn)I以及非專利文獻(xiàn)I)。并且，
【發(fā)明者】們建立了從iPS細(xì)胞制備巨核細(xì)胞以及血小板的方法，能夠解決在ES細(xì)胞來(lái)源的血小板的輸血中難以避免的白細(xì)胞抗原(human I eukocyte anti gen, HLA )相容性問(wèn)題(專利文獻(xiàn)2 )。
[0004]進(jìn)一步地，
【發(fā)明者】們對(duì)于從干細(xì)胞制備的血小板等細(xì)胞的量性問(wèn)題，通過(guò)探索基于干細(xì)胞建立永生化的巨核前體細(xì)胞株的方法而制備血小板，為了在體外大量制備血小板等細(xì)胞而研發(fā)出了重要的技術(shù)(專利文獻(xiàn)3 )。
[0005]在機(jī)體中，巨核細(xì)`胞形成被稱為前血小板(proplatelets)的偽足狀(pseudopodial formation),其細(xì)胞質(zhì)裂解(fragmentation)而釋放出血小板。被認(rèn)為巨核細(xì)胞釋放血小板為止，通過(guò)核內(nèi)有絲分裂(endomitosis)進(jìn)行多核化。巨核細(xì)胞的核內(nèi)有絲分裂不會(huì)伴隨分裂溝形成以及紡錘體延伸，是基于異常的核分裂以及細(xì)胞質(zhì)分裂的多極性有絲分裂，其結(jié)果，形成含有幾個(gè)分葉的核的細(xì)胞。反復(fù)發(fā)生這種核內(nèi)有絲分裂，誘導(dǎo)巨核細(xì)胞的多核化。
[0006]關(guān)于巨核細(xì)胞的多核化，迄今為止多次報(bào)道過(guò)研究結(jié)果。Lodier等人(非專利文獻(xiàn)I)闡明了在巨核細(xì)胞的核內(nèi)有絲分裂中，雖然形成分裂溝但觀察不到局部存在于收縮環(huán)中的非肌肉II型肌球蛋白，在收縮環(huán)形成以及紡錘體延伸中發(fā)生缺陷。并且，揭示了這些收縮環(huán)、紡錘體延伸的異常，抑制RhoA以及Rock的活性，使得這種異常更加明顯(非專利文獻(xiàn)2)。RhoA儲(chǔ)積于分裂溝，促進(jìn)包含Rho激酶(Rock)、citron激酶、LIM激酶以及mDia/formins等幾個(gè)效應(yīng)子的活化。這些結(jié)果給予這樣的啟示:通過(guò)抑制RhoA以及Rock等參與收縮環(huán)形成等的因子的活性，促進(jìn)巨核細(xì)胞的核內(nèi)有絲分裂。并且，還報(bào)道有如果位于integrin alpha2/betal的下流的Rho的信號(hào)被增強(qiáng),則抑制未成熟的未多核化的巨核細(xì)胞的前血小板(proplatelet)的形成。
[0007]報(bào)道有轉(zhuǎn)錄因子的全反式維甲酸(all trans retinoic acid, ATRA)、作為組蛋白去乙?；?histone deacetylase)的抑制劑而得知的丙戍酸,參與巨核細(xì)胞的分化。Schweinfurth等人發(fā)現(xiàn)用全反式維甲酸或丙戊酸處理未成熟的巨核細(xì)胞，則會(huì)促進(jìn)多核化(非專利文獻(xiàn)3)。進(jìn)一步地，還報(bào)道有如果敲減癌抑制基因產(chǎn)物的p53，則會(huì)促進(jìn)巨核細(xì)胞的多核化(非專利文獻(xiàn)4)。
[0008]另外，還揭示了以下對(duì)于巨核細(xì)胞的分化過(guò)程的影響，即，在高于通常的培養(yǎng)溫度的39°C下培養(yǎng)未成熟的巨核細(xì)胞，則會(huì)促進(jìn)多核化的成熟巨核細(xì)胞的誘導(dǎo)以及前血小板(proplatelet)的形成(非專利文獻(xiàn)5)等。
[0009]現(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)
[0010]專利文獻(xiàn)
[0011]專利文獻(xiàn)1:TO2008/041370
[0012]專利文獻(xiàn)2:TO2009/122747
[0013]專利文獻(xiàn)3:W02011/034073
[0014]非專利文獻(xiàn)
[0015]非專利文獻(xiàn)1:Takayama 等，Blood, 111:5298-53062008`[0016]非專利文獻(xiàn)2 =Lordier 等，Blood, 112:3164-31742009
[0017]非專利文獻(xiàn)3:Schweinfurth 等,Platelets, 21:648-6572010
[0018]非專利文獻(xiàn)4 =Fuhrken 等，J.Biol.Chem.，283:15589-156002008
[0019]非專利文獻(xiàn)5:Proulx 等,Biotechnol.Bioeng., 88:675-6802004

【發(fā)明內(nèi)容】

[0020]技術(shù)問(wèn)題
[0021]本發(fā)明的
【發(fā)明者】們發(fā)現(xiàn)能夠從沒有進(jìn)行“多核化”的巨核細(xì)胞獲得功能性血小板(是保持止血作用等機(jī)體內(nèi)活性的血小板，表征為CD42b+)的量，與用于實(shí)施臨床應(yīng)用開展所需的量相比非常之少，因此認(rèn)為為了在體外有效地生成功能性血小板，需要促進(jìn)巨核細(xì)胞的多核化。
[0022]因此，本發(fā)明的目的在于提供促進(jìn)巨核細(xì)胞的多核化、制備更加多核化的多核巨核細(xì)胞的方法，進(jìn)一步地從多核巨核細(xì)胞有效地產(chǎn)生血小板的方法等。
[0023]技術(shù)方案
[0024]鑒于上述目的，本發(fā)明的
【發(fā)明者】們嘗試了促進(jìn)從多功能干細(xì)胞(ES細(xì)胞、iPS細(xì)胞等)制備的未進(jìn)行多核化的巨核細(xì)胞的多核化。首先，本發(fā)明的
【發(fā)明者】們利用從自發(fā)研制的多功能干細(xì)胞制備的永生化巨核前體細(xì)胞株(參照專利文獻(xiàn)3)而進(jìn)行了上述的嘗試。該永生化巨核前體細(xì)胞株，是通過(guò)在從多功能干細(xì)胞誘導(dǎo)的巨核細(xì)胞的前體細(xì)胞內(nèi)使MYC等癌基因以及BMIl等基因表達(dá)，由此提聞了增殖能力的、株化(7欠生化)的細(xì)胞株。
[0025]本發(fā)明的
【發(fā)明者】們?yōu)榱死迷撚郎藓饲绑w細(xì)胞株而促進(jìn)多核化，在進(jìn)行癌基因以及多梳基因的表達(dá)抑制時(shí)，通過(guò)使抗細(xì)胞凋亡基因強(qiáng)制表達(dá)，由此在有效進(jìn)行多核化中取得了成功。
[0026]并且，確認(rèn)了在強(qiáng)制表達(dá)抗細(xì)胞凋亡基因的基礎(chǔ)上，通過(guò)抑制p53基因產(chǎn)物的表達(dá)或功能，會(huì)進(jìn)一步提高多核化的效率。并且，確認(rèn)出對(duì)上述巨核前體細(xì)胞株進(jìn)行R0CK(Rho相關(guān)的卷曲螺旋形成蛋白激酶(Rho-associated coiled-coil forming kinase)/Rho結(jié)合激酶)抑制劑、HDAC抑制劑、39°C下的培養(yǎng)等的處理，也能有效地誘導(dǎo)多核化，進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，如果用肌動(dòng)球蛋白復(fù)合物(肌動(dòng)蛋白和肌球蛋白的復(fù)合物)的功能抑制劑進(jìn)行處理，則會(huì)更加高度促進(jìn)多核化。
[0027]并且，本發(fā)明的
【發(fā)明者】們發(fā)現(xiàn)根據(jù)本發(fā)明而生成的被促進(jìn)多核化的巨核細(xì)胞，4N或8N以上的巨核細(xì)胞的比率與已知的比率相比更高，并且，與機(jī)體內(nèi)生成的成熟巨核細(xì)胞相比，其比率也非常高。
[0028]進(jìn)一步地，本發(fā)明的
【發(fā)明者】們發(fā)現(xiàn)對(duì)于充分地多核化的成熟巨核細(xì)胞，通過(guò)抑制上述抗細(xì)胞凋亡基因的強(qiáng)制表達(dá)，從一個(gè)巨核細(xì)胞生成的血小板的數(shù)量會(huì)飛躍性地增加，并且確認(rèn)通過(guò)在培養(yǎng)基中添加ROCK抑制劑進(jìn)行培養(yǎng)等，可以進(jìn)一步提高血小板生成率，并且研究培養(yǎng)天數(shù)、培養(yǎng)溫度等的最適條件，由此完成了本發(fā)明。
[0029]SP，本發(fā)明涉及以下〔I〕~〔19〕。
[0030]〔I〕一種方法，是制造多核巨核細(xì)胞的方法，包括工序:在多核化前的巨核細(xì)胞中使抗細(xì)胞凋亡基因強(qiáng)制表達(dá)，培養(yǎng)該細(xì)胞。
[0031]〔2〕如〔I〕所述的方法，所述抗細(xì)胞凋亡基因?yàn)锽CL-XL基因。
[0032]〔3〕如〔I〕或〔2〕所述的方法，在所述的培養(yǎng)工序中，抑制p53基因產(chǎn)物的表達(dá)或功能。
[0033]〔4〕如〔I〕至〔3〕中任意一項(xiàng)所述的方法，在所述的培養(yǎng)工序中，對(duì)多核化前的巨核細(xì)胞進(jìn)行以下(a)至(C)中的至少一個(gè)處理:
[0034](a)由肌動(dòng)球蛋白復(fù)合物功能抑制劑的處理；
[0035](b)由ROCK抑制`劑的處理；以及
[0036](c)由HDAC抑制劑的處理。
[0037]〔5〕如〔4〕所述的方法，所述ROCK抑制劑為Y27632，所述HDAC抑制劑為丙戊酸，所述肌動(dòng)球蛋白復(fù)合物功能抑制劑是Blebbistatin。
[0038]〔6〕如〔I〕至〔5〕中任意一項(xiàng)所述的方法，在高于37°C的溫度下進(jìn)行所述的培養(yǎng)工序。
[0039]〔7〕如〔I〕至〔6〕中任意一項(xiàng)所述的方法，所述多核化前的巨核細(xì)胞是通過(guò)以下工序而獲得的:在從造血前體細(xì)胞到多核化前的巨核細(xì)胞的分化階段的任意階段，在該細(xì)胞中使癌基因與以下(i )至(iii )中的任意基因強(qiáng)制表達(dá)，培養(yǎng)該細(xì)胞并使其增殖，
[0040](i)抑制pl6基因或者pl9基因表達(dá)的基因、
[0041](ii)抑制Ink4a/Arf基因表達(dá)的基因、以及
[0042](iii)多梳基因。
[0043]〔8〕如〔7〕所述的方法,作為所述癌基因而使用c-MYC基因，作為所述(i)至(iii)的基因而使用BMII。
[0044]〔9〕如〔7〕或〔8〕所述的方法,所述造血前體細(xì)胞來(lái)源于iPS細(xì)胞、ES細(xì)胞，以及來(lái)源于從由臍帶血、骨髓血或末梢血來(lái)源的造血干細(xì)胞以及造血干細(xì)胞構(gòu)成的組中選擇的細(xì)胞。
[0045]〔10〕包含根據(jù)〔I〕至〔9〕中任意一項(xiàng)所述的方法而制造的多核巨核細(xì)胞的血液細(xì)胞組合物。
[0046](11) 一種方法，是血小板的制造方法,包括工序:
[0047]通過(guò)〔I〕至〔9〕中任意一項(xiàng)所述的方法而獲得多核巨核細(xì)胞，培養(yǎng)該細(xì)胞；[0048]從所述多核巨核細(xì)胞的培養(yǎng)物回收血小板。
[0049]〔12〕如〔11〕所述的方法，所述的培養(yǎng)多核巨核細(xì)胞的工序是通過(guò)抑制抗細(xì)胞凋亡基因的強(qiáng)制表達(dá)或者從細(xì)胞去除所述抗細(xì)胞凋亡基因而進(jìn)行的。
[0050]〔13〕如〔11〕或〔12〕所述的方法，所述的培養(yǎng)多核巨核細(xì)胞的工序是在沒有血清和/或沒有飼養(yǎng)細(xì)胞的條件下進(jìn)行的。
[0051]〔14〕如〔11〕至〔13〕中任意一項(xiàng)所述的方法，所述的培養(yǎng)多核巨核細(xì)胞的工序進(jìn)行I到15天。
[0052]〔15〕如〔11〕至〔14〕中任意一項(xiàng)所述的方法，所述的培養(yǎng)多核巨核細(xì)胞的工序在37 °C下進(jìn)行。
[0053]〔16〕如〔11〕至〔15〕中任意一項(xiàng)所述的方法，在所述的培養(yǎng)多核巨核細(xì)胞的工序中，在培養(yǎng)基中添加ROCK抑制劑和/或肌動(dòng)球蛋白復(fù)合物功能抑制劑。
[0054]〔 17〕如〔16〕所述的方法，所述ROCK抑制劑為Y27632，所述肌動(dòng)球蛋白復(fù)合物功能抑制劑是Blebbistatin。
[0055]〔18〕根據(jù)〔11〕至〔17〕中任意一項(xiàng)所述的方法制造的血小板。
[0056]〔 19〕包含〔18〕所述的血小板的血液制劑。
[0057]有益效果
[0058]根據(jù)本發(fā)明，能夠人為地促進(jìn)巨核細(xì)胞的多核化。尤其，本發(fā)明對(duì)于已知的在體外(in vitro)制備的巨核細(xì)胞，也具有促進(jìn)其多核化的效果，能夠獲得即使與從機(jī)體能獲得的巨核細(xì)胞相比多核化程度更高的巨核細(xì)胞(例如，4N以上的巨核細(xì)胞的比率較高的巨核細(xì)胞群)。
`[0059]并且，根據(jù)本發(fā)明，能夠顯著增加從每一個(gè)多核化的巨核細(xì)胞生成的血小板的數(shù)量。
[0060]從干細(xì)胞誘導(dǎo)多核化前的巨核細(xì)胞，利用例如專利文獻(xiàn)3中所記載的方法使該多核化前的巨核細(xì)胞增殖，根據(jù)本發(fā)明的方法，使該多核化前的巨核細(xì)胞進(jìn)行多核化而生成血小板，由此能夠飛躍性地縮短從干細(xì)胞制造血小板所需的時(shí)間，能夠進(jìn)行大規(guī)模制備。進(jìn)一步地，可獲得的血小板呈⑶42b陽(yáng)性，在臨床應(yīng)用中也將會(huì)有重大的貢獻(xiàn)。
【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0061]圖1A表示為了研究iMKPC-型I的增殖的細(xì)胞因子依賴性而進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)的概要說(shuō)明。
[0062]圖1B表示按照?qǐng)D1A所示的實(shí)驗(yàn)計(jì)劃(Schedule)，將SCF和TPO (S + T)、SCF和EPO (S + E)、SCF (S)、TP0 (T)以及EPO (E)加入到培養(yǎng)基而培養(yǎng)iMKPC-型I時(shí)的、細(xì)胞數(shù)的變化。
[0063]圖1C表示在圖1A所示的實(shí)驗(yàn)計(jì)劃的第8天，通過(guò)流式細(xì)胞儀分析iMKPC-型I的表面標(biāo)記的表達(dá)的結(jié)果。
[0064]圖1D表示在臍帶血來(lái)源⑶34陽(yáng)性細(xì)胞中使c-MYC和BMIl強(qiáng)制表達(dá)，促進(jìn)多核化前的巨核細(xì)胞的增殖的結(jié)果。
[0065]圖2A表示調(diào)查研究細(xì)胞因子對(duì)iMKPC-型II的增殖的影響的結(jié)果。
[0066]圖2B表示調(diào)查研究在iMKPC-型II中的⑶41a和⑶42b的表達(dá)的結(jié)果。[0067]圖3表示通過(guò)顯微鏡觀察在iMKPC-型II中，進(jìn)行BCL-XL的強(qiáng)制表達(dá)以及p53基因的表達(dá)抑制時(shí)的多核化、以及向培養(yǎng)基進(jìn)一步添加Blebbistatin時(shí)的多核化的結(jié)果。
[0068]圖4表示調(diào)查研究BCL-XL對(duì)iMKPC-型II的增殖的影響的結(jié)果。
[0069]圖5表示ROCK抑制劑對(duì)巨核細(xì)胞多核化的影響。抑制巨核細(xì)胞中的MYC/BMI1表達(dá)后(在多西環(huán)素存在、雌二醇不存在下的培養(yǎng))、添加ROCK抑制劑(Y27632) (10 μ Μ),培養(yǎng)7天，然后調(diào)查研究了多核化的程度。A表示將沒有添加ROCK抑制劑的細(xì)胞(載體對(duì)照，vehicle)和添加的細(xì)胞(Rock i)用染色核的赫斯特進(jìn)行染色后,用抗⑶41a抗體染色作為巨核細(xì)胞的標(biāo)記的CD41a，通過(guò)流式細(xì)胞儀進(jìn)行分析的結(jié)果。B為將A結(jié)果用圖表表示的圖。
[0070]圖6表示調(diào)查研究在39°C下培養(yǎng)時(shí)的、與巨核細(xì)胞的成熟相關(guān)的基因的表達(dá)量的結(jié)果。抑制巨核細(xì)胞中的MYC/BMI1的表達(dá)后，在39°C下培養(yǎng)5天，然后通過(guò)定量PCR(q-PCR)方法研究對(duì)巨核細(xì)胞的成熟所必需的基因組(GATA1 (A)、PF4 (B)、NFE2 (C)、β -微管蛋白(D))的表達(dá)量。表達(dá)量表示相對(duì)于GAPDH的表達(dá)量的比率。
[0071]圖7表示研究作為抗細(xì)胞凋亡基因的一種的BCL-XL對(duì)巨核細(xì)胞的多核化的影響的結(jié)果。抑制巨核細(xì)胞中的MYC/BMI1的表達(dá)，在ROCL抑制劑(10 μ Μ)的存在下，使BCL-XL表達(dá)，培養(yǎng)7天后，調(diào)查研究了多核化的程度。A表示對(duì)MYC/BMI1表達(dá)細(xì)胞(左圖)、抑制了MYC/BMI1的表達(dá)并用ROCK抑制劑處理過(guò)的細(xì)胞(中間圖)、經(jīng)過(guò)MYC/BMI1表達(dá)抑制以及ROCK抑制劑處理并且使BCL-XL表達(dá)的細(xì)胞(右圖)，分別用染色核的赫斯特(Hoechst)進(jìn)行染色后，用抗CD41 a抗體染色作為巨核細(xì)胞的標(biāo)記的CD41 a,利用流式細(xì)胞儀分析的結(jié)果。B是將A結(jié)果用圖表表示的圖。并且，C為核變?yōu)?N、4N、8N以及8N以上的細(xì)胞的顯微照。
[0072]圖8表示BCL-XL的表達(dá)細(xì)胞的增殖曲線。根據(jù)培養(yǎng)天數(shù)，對(duì)抑制巨核細(xì)胞中的MYC/BMI1的表達(dá)，在ROCK抑制劑(10 μ M)存在下，使BCL-XL表達(dá)的細(xì)胞(CD41a+) ()以及沒有使BCL-XL表達(dá)的細(xì)胞(⑶41a+) (A)的細(xì)胞數(shù)的變化，用圖表表示的結(jié)果。
[0073]圖9表示p53的敲除對(duì)多核化的影響。抑制巨核細(xì)胞中的MYC/BMI1的表達(dá)，在ROCK抑制劑(10 μ M)的存在下，使BCL-XL表達(dá)，進(jìn)一步地，敲除ρ53基因后，39°C下，培養(yǎng)7天，調(diào)查研究CD41a+細(xì)胞的多核化程度。A表示將沒有敲除p53的對(duì)照細(xì)胞(對(duì)照)和敲除了 P53的細(xì)胞(SiP53)，分別用染色核的赫斯特進(jìn)行染色后，用抗CD41a抗體染色作為巨核細(xì)胞的標(biāo)記的CD41a，利用流式細(xì)胞儀分析的結(jié)果。B是將A結(jié)果用圖表表示的圖。
[0074]圖10表示丙戊酸處理對(duì)多核化的影響。抑制巨核細(xì)胞中的MYC/BMII的表達(dá)，ROCK抑制劑存在(10 μ M)下，使BCL-XL表達(dá)，敲除ρ53基因，進(jìn)一步地，用丙戊酸(0.5mM)處理，在39°C下，培養(yǎng)7天，然后調(diào)查研究了 CD41a +細(xì)胞的多核化程度。A表示將沒有用丙戊酸處理過(guò)的細(xì)胞(Si P53)與用丙戊酸處理過(guò)的細(xì)胞(SiP53VLP)，分別用染色核的赫斯特進(jìn)行染色后，用抗CD41 a抗體染色作為巨核細(xì)胞的標(biāo)記的CD41 a,利用流式細(xì)胞儀分析的結(jié)果。B是將A結(jié)果用圖表表的圖。
[0075]圖11表示用肌球蛋白重鏈IIA/B ATPase抑制劑(肌動(dòng)球蛋白復(fù)合物功能抑制劑)對(duì)巨核細(xì)胞的多核化的影響。抑制巨核細(xì)胞中的MYC/BMI1的表達(dá)后(多西環(huán)素存在下，以及多西環(huán)素不存在下的培養(yǎng))，添加作為肌球蛋白重鏈IIA/B ATPase抑制劑的Blebbistatin (10 μ g/ml)，培養(yǎng)7天，然后調(diào)查研究了多核化程度。A表示將沒有添加Blebbistatin的細(xì)胞(一)和添加了 Blebbistatin (10 μ g/ml)的細(xì)胞(+),分別用染色核的赫斯特進(jìn)行染色后，用抗CD41a抗體染色作為巨核細(xì)胞的標(biāo)記的CD41a,利用流式細(xì)胞儀分析的結(jié)果。B是將A結(jié)果用圖表表示的圖。
[0076]圖12表示Blebbistatin處理與其他處理同時(shí)進(jìn)行時(shí)對(duì)巨核細(xì)胞的多核化的影響。抑制巨核細(xì)胞中的MYC/BMI1表達(dá)，Y27632 (ΙΟμΜ)以及丙戊酸(0.5mM)存在下，使BCL-XL表達(dá)，敲除p53基因，進(jìn)一步地，添加Blebbistatin，在39°C下，培養(yǎng)7天，然后調(diào)查研究了⑶41a +細(xì)胞的多核化程度。A表示將沒有用Blebbistatin處理的細(xì)胞(一)和用Blebbistatin處理的細(xì)胞(+),分別用染色核的赫斯特進(jìn)行染色后，用抗⑶41a抗體染色作為巨核細(xì)胞的標(biāo)記的CD41a，利用流式細(xì)胞儀分析的結(jié)果。B是將A結(jié)果用圖表表示的圖。
[0077]圖13表示Blebbistatin處理與其他處理同時(shí)進(jìn)行的細(xì)胞的增殖曲線。根據(jù)培養(yǎng)天數(shù)，對(duì)抑制巨核細(xì)胞中的MYC/BMI1表達(dá)，Y27632 (ΙΟμΜ)以及丙戊酸(0.5mM)存在下，使BCL-XL表達(dá)，敲除p53基因，用Blebbistatin處理的細(xì)胞(⑶41a+) (A)和沒有用Blebbistatin處理的細(xì)胞(⑶41a+) (`)的細(xì)胞數(shù)的變化，用圖表來(lái)表示(A)。并且，B表示對(duì)這些細(xì)胞的顯微鏡照。
[0078]圖14表示在血小板釋放期，抑制了 BCL-XL的表達(dá)時(shí)和沒有抑制時(shí)，巨核細(xì)胞和血小板的⑶41a和⑶42b的表達(dá)的調(diào)查研究結(jié)果。
[0079]圖15表示基于與圖14相同的結(jié)果，計(jì)數(shù)了 BCL-XL表達(dá)的0N/0FF時(shí)的細(xì)胞數(shù)的結(jié)果。A表示⑶42b陽(yáng)性血小板數(shù)，B表示⑶41a陽(yáng)性/⑶42b陽(yáng)性巨核細(xì)胞數(shù)，C表示⑶41a陽(yáng)性巨核細(xì)胞數(shù)。
[0080]圖16表示在血小板釋放期，抑制了 BCL-XL的表達(dá)時(shí)和沒有抑制時(shí)，培養(yǎng)溫度設(shè)定為35°C、37°C、39°C，對(duì)血小板的影響的調(diào)查研究結(jié)果。
[0081]圖17表示血清、`飼養(yǎng)細(xì)胞、Blebbistatin的有無(wú),對(duì)血小板數(shù)的影響的調(diào)查研究結(jié)果。
[0082]圖18表示血清、飼養(yǎng)細(xì)胞、Blebbistatin的有無(wú)，對(duì)⑶42b血小板的比率的影響
的調(diào)查研究結(jié)果。
[0083]圖19表示巨核細(xì)胞的多核化工序(MCB expansion)和血小板釋放期(Plateletproduction)的適宜的培養(yǎng)條件的一種示例。
[0084]圖20表示通過(guò)抑制BCL-XL的表達(dá)而提高⑶42b血小板的比率，通過(guò)從培養(yǎng)基去除血清以及飼養(yǎng)細(xì)胞，加入Blebbistatin而進(jìn)一步提高⑶42b血小板的比率。
[0085]圖21表示對(duì)于⑶42b的功能抑制性載體HIPl對(duì)末梢血血小板的瑞斯托菌素凝集效果的影響的調(diào)查研究結(jié)果。
[0086]圖22表示對(duì)于⑶42b的功能抑制性載體HIPl對(duì)體內(nèi)的血栓形成的影響的調(diào)查研
究結(jié)果。
[0087]圖23表示將通過(guò)加入ADAM17抑制劑KP-457 (S-45457)而產(chǎn)生的、提高了 GPIba(⑶42b)的表達(dá)量的iPS細(xì)胞來(lái)源血小板、以及沒有加入ADAM17抑制劑而產(chǎn)生的iPS細(xì)胞來(lái)源血小板，分別輸血于NOG小鼠，測(cè)定參與血栓形成的血小板的數(shù)的結(jié)果。
[0088]圖24表示將在KP-457存在下加入血小板損傷劑CCCP100 μ M而使人類末梢血血小板假劣化的血小板、在ΚΡ-457不存在下加入CCCP的血小板、新鮮血小板,分別進(jìn)行輸血，測(cè)定參與血栓形成的血小板的數(shù)的結(jié)果。【具體實(shí)施方式】
[0089](多核巨核細(xì)胞的制造方法)
[0090]本發(fā)明提供通過(guò)促進(jìn)巨核細(xì)胞的多核化，制備多核化的巨核細(xì)胞的方法。
[0091]本發(fā)明所涉及的多核巨核細(xì)胞(polynucleated megakaryocytic cell)的制造方法的一種方式，包括在多核化前的巨核細(xì)胞中使抗細(xì)胞凋亡基因強(qiáng)制表達(dá)，培養(yǎng)該細(xì)胞的工序。
[0092]在本發(fā)明中對(duì)于“多核化前的巨核細(xì)胞”沒有特別限制，可以是從臍帶血或骨髓細(xì)胞獲得的尚未進(jìn)行多核化的巨核細(xì)胞，并且，也可以是從來(lái)源于ES細(xì)胞、iPS細(xì)胞；臍帶血、骨髓血或外周血的、造血干細(xì)胞以及前體細(xì)胞等細(xì)胞分化誘導(dǎo)的尚未進(jìn)行多核化的巨核細(xì)胞。
[0093]并且，本發(fā)明的“多核化前的巨核細(xì)胞”還包括例如表征為⑶41a陽(yáng)性/⑶42a陽(yáng)性/⑶42b陽(yáng)性的細(xì)胞。
[0094]“多核巨核細(xì)胞”或“多核化的巨核細(xì)胞”，是指與“多核化前的巨核細(xì)胞”相比，核的數(shù)量相對(duì)增加的細(xì)胞或細(xì)胞組。例如，適用本發(fā)明的方法的巨核細(xì)胞的核為2N時(shí)，4N以上的細(xì)胞成為“多核巨核細(xì)胞”或“多核化的巨核細(xì)胞”。即使是多核化前的巨核細(xì)胞，核的數(shù)量也不限于一個(gè)。并且，細(xì)胞組中，經(jīng)過(guò)一定天數(shù)后，在整個(gè)該細(xì)胞組中的核的數(shù)量有意(significantly)增加時(shí),有時(shí)將經(jīng)過(guò)該天數(shù)之前的細(xì)胞組稱為多核化前的巨核細(xì)胞,有時(shí)還將經(jīng)過(guò)該天數(shù)后的細(xì)胞組稱為多核化的巨核細(xì)胞。
[0095]本發(fā)明也可以適用于從來(lái)源于多功能干細(xì)胞(ES細(xì)胞、iPS細(xì)胞等)；臍帶血、骨髓血或末梢血的造血干細(xì)胞以及前體細(xì)胞等細(xì)胞分化誘導(dǎo)的多核化前的巨核細(xì)胞。例如，優(yōu)選從ES細(xì)胞或iPS細(xì)胞制備的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)物(又稱為ES-sac或iPS_sac)獲得的巨核細(xì)胞。在此，從ES細(xì)胞或iPS細(xì)胞制備的“網(wǎng)`狀結(jié)構(gòu)物”，是指來(lái)源于ES細(xì)胞或iPS細(xì)胞的立體囊狀(伴隨內(nèi)部空間)結(jié)構(gòu)物，由內(nèi)皮細(xì)胞群等形成，內(nèi)部包含造血前體細(xì)胞(參照專利文獻(xiàn)1、專利文獻(xiàn)2以及非專利文獻(xiàn)2)。
[0096]對(duì)于本發(fā)明中所使用的ES細(xì)胞，沒有特別限制，一般可以使用將囊胚期的受精卵與飼養(yǎng)細(xì)胞一起培養(yǎng)，分開增殖的內(nèi)細(xì)胞團(tuán)來(lái)源的細(xì)胞，進(jìn)一步地反復(fù)進(jìn)行繼代培養(yǎng)操作，最終作為ES細(xì)胞株建立細(xì)胞。
[0097]并且，使用的iPS細(xì)胞時(shí)，只要是通過(guò)向體細(xì)胞(例如，纖維母細(xì)胞或血液細(xì)胞等)導(dǎo)入賦予分化多功能性的多種轉(zhuǎn)錄因子(以下，在此稱為“分化多功能因子”)基因而獲得了與ES細(xì)胞同樣的分化多功能性的細(xì)胞，則可以是任何來(lái)源的細(xì)胞。作為分化多功能因子，已經(jīng)報(bào)道有多種因子，在使用上沒有限制，但是例如可以舉出:0ct家族(例如，0ct3/4)、SOX 家族(例如，S0X2、SOXU S0X3、SOX15 以及 SOX17 等)、Klf 家族(例如，Klf4、Klf2 等)、MYC 家族(例如，c-MYC、N-MYC, L-MYC 等)、NANOG, LIN28 等。
[0098]本發(fā)明的
【發(fā)明者】們報(bào)道過(guò)關(guān)于在從多功能干細(xì)胞誘導(dǎo)的多核化前的巨核細(xì)胞(包括在專利文獻(xiàn)3中記載為“巨核前體細(xì)胞”的細(xì)胞)中使MYC等癌基因和BMIl等基因等強(qiáng)制表達(dá)，增加該巨核細(xì)胞的增殖能力(專利文獻(xiàn)3，JEM, 207:2817-28302010)。
[0099]根據(jù)該方法制備的多核化前的巨核細(xì)胞可以適用于本發(fā)明的方法。
[0100]因此，在本發(fā)明所涉及的多核巨核細(xì)胞的制造方法中，將通過(guò)以下工序獲得的細(xì)胞可以作為多核化前的巨核細(xì)胞使用:在從造血前體細(xì)胞到多核化前的巨核細(xì)胞的任意分化階段，在該細(xì)胞中使癌基因與以下(i)至(iii)中的任意基因強(qiáng)制表達(dá)，培養(yǎng)該細(xì)胞并使其增殖，
[0101](i)抑制pl6基因或者pl9基因表達(dá)的基因；
[0102](ii)抑制Ink4a/Arf基因表達(dá)的基因；以及
[0103](iii)多梳基因。
[0104]作為癌基因，例如可以舉出MYC家族基因、Src家族基因、Ras家族基因、Raf家族基因、C-Kit或H)GFR、Abl等蛋白激酶家族基因等。并且，作為(i)至(iii)基因，例如可以舉出 BMI1、Mell8、Ringla/b、Phcl/2/3、Cbx2/4/6/7/8、Ezh2、EecU Suzl2、HADC, Dnmtl/3a/3b等，但是特別優(yōu)選BMIl基因。癌基因以及細(xì)胞凋亡基因的表達(dá)調(diào)控可以根據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員的通常的方法而進(jìn)行，例如可以使用專利文獻(xiàn)3等中詳細(xì)記載的方法。癌基因以及(i)至
(iii)基因在從造血前體細(xì)胞向多核化前的巨核細(xì)胞分化的任意階段導(dǎo)入到細(xì)胞即可。無(wú)論使用哪一種方法，只要在本發(fā)明所使用的多核化前的巨核細(xì)胞中能夠使這些基因的表達(dá)被誘導(dǎo)即可。
[0105]本發(fā)明中所使用的癌基因以及(i)至(iii)基因(例如，BMIl基因)不言而喻包括其cDNA序列已經(jīng)被公開的基因，而且還包含基于這些公知的cDNA序列的同源性而根據(jù)現(xiàn)有技術(shù)鑒定的同源物(homolog)。
[0106]例如，在MYC家族基因中c-MYC基因是指例如由序列標(biāo)識(shí)符I表示的核酸序列構(gòu)成的基因。并且，c-MYC基因的同源物，是指其cDNA序列例如由與序列標(biāo)識(shí)符I表示的核酸序列實(shí)質(zhì)上相同的序列構(gòu)成的基因。由與序列標(biāo)識(shí)符I表示的核酸序列實(shí)質(zhì)上相同的序列構(gòu)成的cDNA，是指與由序列標(biāo)識(shí)符I表示的序列構(gòu)成的DNA具有約60%以上，優(yōu)選約70%以上，更優(yōu)選約 80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%，最為優(yōu)選約99%的一致性的序列構(gòu)成的DNA，或者是可以在嚴(yán)格條件下與由與序列標(biāo)識(shí)符I表示的核酸序列互補(bǔ)的序列構(gòu)成的DNA雜交的DNA，由這些DNA編碼的蛋白質(zhì)是對(duì)多核化前的巨核細(xì)胞等分化階段的細(xì)胞的擴(kuò)增起作用的物質(zhì)。
[0107]BMII基因是指例如由序列標(biāo)識(shí)符2表不的核酸序列構(gòu)成的基因。并且，BMIl基因的同源物，是指其cDNA序列例如由與序列標(biāo)識(shí)符2表示的核酸序列實(shí)質(zhì)上相同的序列構(gòu)成的基因。由與序列標(biāo)識(shí)符2表示的核酸序列實(shí)質(zhì)上相同的序列構(gòu)成的cDNA，是指與由序列標(biāo)識(shí)符2表示的序列構(gòu)成的DNA具有約60%以上，優(yōu)選約70%以上，更優(yōu)選約80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%，最為優(yōu)選約 99%的一致性的序列構(gòu)成的DNA，或者是可以在嚴(yán)格條件下與由與序列標(biāo)識(shí)符2表示的核酸序列互補(bǔ)的序列構(gòu)成的DNA雜交的DNA，由其DNA編碼的蛋白質(zhì)是抑制在表達(dá)MYC家族基因等癌基因的細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)的癌基因誘導(dǎo)性細(xì)胞衰老，促進(jìn)該細(xì)胞的擴(kuò)增的物質(zhì)。
[0108]雖然上述癌基因以及(i)至(iii)基因是在細(xì)胞增殖中所必需的，但是因?yàn)闀?huì)抑制多核化的促進(jìn)以及血小板的釋放等，所以也可以在進(jìn)入多核化工序之前將這些基因的表達(dá)進(jìn)行抑制。通過(guò)抑制細(xì)胞內(nèi)的這些基因的表達(dá)，使功能性血小板更加容易釋放(專利文獻(xiàn)3)。
[0109]在本說(shuō)明書中，“抗細(xì)胞凋亡基因”是指只要是抑制細(xì)胞凋亡的基因，沒有特別限制，例如可以舉出BCL2基因、BCL-XL基因、Survivin, MCLl等。
[0110]本發(fā)明的
【發(fā)明者】們發(fā)現(xiàn)如果抑制上述癌基因以及(i)至(iii)基因的強(qiáng)制表達(dá)，則會(huì)誘導(dǎo)被增殖的多核化前的巨核細(xì)胞的細(xì)胞死亡。如后述的實(shí)施例所示，對(duì)多核化前的巨核細(xì)胞中的癌基因以及(i)至(iii)基因的表達(dá)進(jìn)行抑制，同時(shí)使抗細(xì)胞凋亡基因在該細(xì)胞中強(qiáng)制表達(dá)，由此促進(jìn)該巨核細(xì)胞的多核化，其結(jié)果，能夠從多核化前的巨核細(xì)胞有效地生成血小板。
[0111]如后述的實(shí)施例所示，通過(guò)使抗細(xì)胞凋亡基因強(qiáng)制表達(dá)，從而巨核細(xì)胞長(zhǎng)期繼續(xù)增殖。
[0112]本發(fā)明中所使用的BCL-XL基因、BCL2基因等抑制細(xì)胞凋亡的基因不言而喻包括其cDNA序列已經(jīng)被公開的基因，而且還包含基于這些公知的cDNA序列的同源性而根據(jù)現(xiàn)有技術(shù)鑒定的同源物。例如，作為抑制細(xì)胞凋亡的一種基因的BCL-XL基因，是指由序列標(biāo)識(shí)符3表示的核酸序列構(gòu)成的基因。并且，BCL-XL基因的同源物，是指其cDNA序列例如由與序列標(biāo)識(shí)符3表示的核酸序列實(shí)質(zhì)上相同的序列構(gòu)成的基因。由與序列標(biāo)識(shí)符3表示的核酸序列實(shí)質(zhì)上相同的序列構(gòu)成的cDNA，是指與由序列標(biāo)識(shí)符3表示的序列構(gòu)成的DNA具有約 60% 以上，優(yōu)選約 70% 以上，更優(yōu)選約 80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%，最為優(yōu)選約99%的一致性的序列構(gòu)成的DNA，或者是可以在嚴(yán)格條件下與由與序列標(biāo)識(shí)符3表示的核酸序列互補(bǔ)的序列構(gòu)成的DNA雜交的DNA,由其DNA編碼的蛋白質(zhì)是具有抑制細(xì)胞凋亡效果的物質(zhì)。
[0113]在此，嚴(yán)格條件是指本領(lǐng)域技術(shù)人員容易決定的雜交條件，一般是基于探針長(zhǎng)度、洗脫溫度以及鹽濃度的經(jīng)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)條件。一般，如果探針長(zhǎng)，則適宜的退火溫度會(huì)上升；如果探針短，則溫度會(huì)降低。雜交物的形成一般依賴于互補(bǔ)鏈在略低于其熔點(diǎn)的環(huán)境中的再退火能力。
[0114]例如作為低嚴(yán)格條件，可以舉出在雜交后的過(guò)濾器的洗脫階段，在37°C~42°C的溫度條件下，于0.1XSSC、0.1%SDS溶液中洗脫等。并且，作為高嚴(yán)格條件，例如可以舉出在洗脫階段，在65°C溫度下，于5XSSC以及0.1%SDS中洗脫等。通過(guò)進(jìn)一步提高嚴(yán)格條件，能夠得到同源性高的多核苷酸。
`[0115]在使癌基因、(i)至(iii)基因、抗細(xì)胞凋亡基因等基因在細(xì)胞內(nèi)強(qiáng)制表達(dá)時(shí)，雖然可以根據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知的任何方法實(shí)施，但是例如可以利用介由慢病毒或逆轉(zhuǎn)錄病毒等的基因?qū)胂到y(tǒng)將基因?qū)氲郊?xì)胞內(nèi)，使其表達(dá)。當(dāng)介由病毒基因?qū)胼d體進(jìn)行基因表達(dá)時(shí)，可以在適宜的啟動(dòng)子的下游可發(fā)揮作用地連接該基因，將其插入到基因?qū)胼d體，然后導(dǎo)入到細(xì)胞內(nèi)，使目的基因表達(dá)。在此，“可發(fā)揮作用”地連接，是指將啟動(dòng)子和目的基因連接，以根據(jù)該啟動(dòng)子而順式調(diào)控目的基因而實(shí)現(xiàn)目的基因的期望的表達(dá)。在本發(fā)明的實(shí)施中，例如可以使用CMV啟動(dòng)子、EFl啟動(dòng)子等而組成性表達(dá)目的基因，或者還可以在由四環(huán)素等藥物響應(yīng)因素等反式因子而活性被調(diào)控的因素的作用下，設(shè)置適宜的啟動(dòng)子(誘導(dǎo)型啟動(dòng)子)，例如通過(guò)藥物添加等調(diào)控而誘導(dǎo)性表達(dá)目的基因。對(duì)于這種基于藥物的基因表達(dá)系統(tǒng)而言，為了實(shí)現(xiàn)癌基因或(i)至(iii)基因的期望的表達(dá)調(diào)控，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以容易地選擇合適的系統(tǒng)。為了進(jìn)行這種表達(dá)，還可以使用市場(chǎng)上銷售的試劑盒等。并且，可以將作為表達(dá)調(diào)控的目的基因的癌基因和(i)至(iii)基因分別插入到不同的載體,也可以插入到同一個(gè)的載體。
[0116]并且，巨核細(xì)胞內(nèi)的癌基因或(i)至(iii)基因的表達(dá)的抑制，例如，可以通過(guò)以下的方法實(shí)現(xiàn):通過(guò)去除藥物等而解除誘導(dǎo)，由此抑制由前述的誘導(dǎo)性表達(dá)系統(tǒng)誘導(dǎo)的表達(dá)?；蛘?，還可以通過(guò)使用Cre/Lox系統(tǒng)等而去除導(dǎo)入的癌基因或(i)至(iii)基因，抑制性調(diào)控這些基因的表達(dá)。為了抑制性調(diào)控癌基因或者(i)至(iii)基因的表達(dá)，也可以使用適宜的市場(chǎng)上銷售的試劑盒等。
[0117]本發(fā)明所涉及的多核巨核細(xì)胞的制造方法的一種方式，包括在使抗細(xì)胞凋亡基因強(qiáng)制表達(dá)的細(xì)胞中，同時(shí)進(jìn)行抑制P53基因產(chǎn)物的表達(dá)或功能的工序。在此，表達(dá)是指以包含轉(zhuǎn)錄以及翻譯的概念使用，稱為抑制表達(dá)時(shí)，可以包含轉(zhuǎn)錄水平上的抑制，也可以包含翻譯水平上的抑制。
[0118]p53基因產(chǎn)物作為癌抑制基因而被廣為人知，各種動(dòng)物種的基因序列等也已是公知的。
[0119]抑制巨核細(xì)胞內(nèi)的p53基因產(chǎn)物的功能的方法可以根據(jù)本領(lǐng)域的普通技術(shù)而實(shí)現(xiàn)。作為該方法，例如可以舉出:通過(guò)在P53基因中導(dǎo)入突變(取代、添加或缺失，或者改變或修飾)，抑制該基因產(chǎn)物的生成的方法；直接抑制該基因產(chǎn)物的功能的方法等。作為在基因中導(dǎo)入突變(取代、添加或缺失，或者改變或修飾)的方法，可以舉出:利用適宜的基因打靶載體而將整個(gè)P53基因通過(guò)同源重組進(jìn)行破壞的方法；利用Cre/lox等系統(tǒng)而向?qū)τ谠摶虍a(chǎn)物的活性重要的區(qū)域?qū)胪蛔兊姆椒ā?br> [0120]并且，作為抑制p53基因產(chǎn)物的功能的方法還可以使用顯性負(fù)性突變技術(shù)。顯性負(fù)性突變技術(shù)，是指導(dǎo)入突變而使降低或喪失了活性的P53蛋白在細(xì)胞內(nèi)大量表達(dá)，使細(xì)胞內(nèi)不活性的P53蛋白的比率壓倒性地高于正常的p53蛋白，其結(jié)果，獲得表現(xiàn)為不能得到P53蛋白的功能的行為的細(xì)胞的方法。
[0121]作為抑制p53基因產(chǎn)物的表達(dá)的方法，可以使用反義技術(shù)、核酶技術(shù)、RNAi技術(shù)
坐寸ο
[0122]反義技術(shù)，是利用具有與祀基因(基本上是轉(zhuǎn)錄廣物的mRNA)相互補(bǔ)的喊基序列，一般長(zhǎng)度為10個(gè)堿基~100個(gè)堿基、優(yōu)選為15個(gè)堿基~30個(gè)堿基的單鏈核酸，抑制基因表達(dá)的方法。通過(guò)將反義核酸導(dǎo)入到細(xì)胞內(nèi)，與靶標(biāo)基因雜交，由此使基因表達(dá)得到抑制。對(duì)于反義核酸而言，只要能獲得對(duì)靶基因的表達(dá)抑制效果，可以是不完全與靶基因互補(bǔ)的核酸。對(duì)于反義核酸而言，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以利用公知的軟件等而適宜設(shè)計(jì)。反義核酸可以是DNA、RNA、DNA-RNA嵌合體中的任意個(gè)，并且也可以被修飾。
[0123]核酶是將靶標(biāo)RNA進(jìn)行催化水解的核酸分子，由具有與靶標(biāo)RNA相互補(bǔ)的序列的反義區(qū)域以及承擔(dān)切割反應(yīng)的催化中心區(qū)域構(gòu)成。對(duì)于核酶而言，本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以根據(jù)公知的方法而適宜設(shè)計(jì)。核酶一般是RNA分子，但是也可以使用DNA-RNA嵌合分子。
[0124]RNAi技術(shù)，是由雙鏈核酸誘導(dǎo)的序列特異性基因表達(dá)抑制機(jī)制。因?yàn)槭悄繕?biāo)特異性非常高，且利用原本在機(jī)體內(nèi)存在的基因表達(dá)抑制機(jī)制的方法，因此安全性高。
[0125]作為具有RNAi效應(yīng)的雙鏈核酸，例如可以舉出siRNA。siRNA是當(dāng)用在哺乳動(dòng)物細(xì)胞時(shí)，通常為19~30個(gè)堿基左右、優(yōu)選為21~25個(gè)堿基左右的雙鏈RNA。具有RNAi效應(yīng)的雙鏈核酸一般在其一側(cè)具有與部分目標(biāo)核酸互補(bǔ)的堿基序列，另一側(cè)具有與其互補(bǔ)的序列。
[0126]具有RNAi效應(yīng)的雙鏈核酸可以基于靶基因的堿基序列，根據(jù)公知的方法而設(shè)計(jì)。并且，具有RNAi效應(yīng)的雙鏈核酸可以是雙鏈RNA，可以是DNA-RNA嵌合雙鏈核酸，也可以是人工核酸或者經(jīng)過(guò)各種修飾的核酸。[0127]siRNA、反義核酸、核酶可以通過(guò)將分別編碼這些核酸的載體(例如，慢病毒載體)導(dǎo)入到細(xì)胞內(nèi)，使其在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)。siRNA可以使用分別編碼雙鏈的DNA，也可以使用編碼通過(guò)環(huán)介導(dǎo)而連接形成雙鏈核酸的單鏈核酸的DNA。如果是后者，通過(guò)在細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄而獲得的單鏈RNA其互補(bǔ)的部分在分子內(nèi)雜交，呈發(fā)夾(Hairpin)結(jié)構(gòu)。該RNA稱為shRNA(shorthairpin RNA:短發(fā)夾RNA)。shRNA如果轉(zhuǎn)移到細(xì)胞質(zhì)，則環(huán)部分因酶(Dicer)而被切割，成為雙鏈RNAdIfe RNAi效應(yīng)。
[0128]除此以外，作為抑制巨核細(xì)胞內(nèi)的p53基因產(chǎn)物的功能的方法，還可以是直接或間接地抑制P53基因產(chǎn)物的功能的方法、通過(guò)抑制p53的磷酸化而間接地抑制p53的活化的方法等。
[0129]如后述的實(shí)施例所示，雖然對(duì)抗細(xì)胞凋亡基因的強(qiáng)制表達(dá)、以及P53基因產(chǎn)物的表達(dá)或功能進(jìn)行抑制之前的巨核細(xì)胞可以繼續(xù)增殖，但是細(xì)胞因子依賴性(cytokinedependency)為SCF，釋放出的血小板中還存在非⑶42b陽(yáng)性的血小板。如果對(duì)抗細(xì)胞凋亡基因的強(qiáng)制表達(dá)、以及P53基因產(chǎn)物的表達(dá)或功能進(jìn)行抑制，則巨核細(xì)胞此后會(huì)仍然增殖的同時(shí)一部分進(jìn)行多核化，會(huì)大量釋放出CD42b陽(yáng)性的血小板。在該階段，巨核細(xì)胞的細(xì)胞因子依賴性從SCF變?yōu)棣肠?，增殖與成熟并行。
[0130]本發(fā)明所涉及的多核巨核細(xì)胞的制造方法的一種方式，包括對(duì)使抗細(xì)胞凋亡基因強(qiáng)制表達(dá)而在培養(yǎng)的細(xì)胞，進(jìn)行處理的以下工序中的至少一個(gè)工序:(a)用肌動(dòng)球蛋白復(fù)合物功能抑制劑進(jìn)行處理；(b)用ROCK抑制劑進(jìn)行處理；(c)用HDAC抑制劑進(jìn)行處理。通過(guò)這些處理，會(huì)更加穩(wěn)定地進(jìn)行增殖以及多核化。
[0131]在此，肌動(dòng)球蛋白復(fù)合物是指肌動(dòng)蛋白與肌球蛋白II的復(fù)合物，例如構(gòu)成細(xì)胞質(zhì)分裂時(shí)出現(xiàn)的收縮環(huán)等。在肌動(dòng)球蛋白復(fù)合物中，肌球蛋白II與肌動(dòng)蛋白相作用的同時(shí)，還起馬達(dá)蛋白的作用，參與收 縮環(huán)的收縮運(yùn)動(dòng)等。本發(fā)明的“肌動(dòng)球蛋白復(fù)合物功能抑制劑”可以是通過(guò)任何機(jī)制抑制其功能的物質(zhì)，例如包括:通過(guò)抑制肌動(dòng)球蛋白復(fù)合物的形成而抑制肌動(dòng)球蛋白復(fù)合物的功能的物質(zhì)、伴隨肌球蛋白重鏈(Myosin heavy chain, MHC)IIA/B ATPase的抑制而抑制肌動(dòng)球蛋白復(fù)合物的功能的物質(zhì)、伴隨肌球蛋白輕鏈激酶抑制劑 (Myosin light chain kinase,MLCK)的抑制而抑制肌動(dòng)球蛋白復(fù)合物的功能的物質(zhì)等。肌球蛋白重鏈ΠΑ/Β ATPase是在細(xì)胞質(zhì)分裂時(shí)對(duì)收縮環(huán)的收縮運(yùn)動(dòng)起著重要的作用的分子，而肌球蛋白輕鏈激酶使肌球蛋白輕鏈中的L2磷酸化而誘導(dǎo)肌動(dòng)蛋白與肌球蛋白間的滑動(dòng)。
[0132]迄今為止，報(bào)道有ROCK抑制劑抑制巨核細(xì)胞的核內(nèi)分裂，促進(jìn)多核化，但是，對(duì)于調(diào)控肌動(dòng)球蛋白復(fù)合物的形成或功能的肌球蛋白重鏈IIA/B ATPase或肌球蛋白輕鏈激酶而言，在ROCK信號(hào)下游起作用，通過(guò)調(diào)節(jié)肌動(dòng)球蛋白復(fù)合物的形成或功能，更加直接地調(diào)控收縮環(huán)的收縮運(yùn)動(dòng)。因此，認(rèn)為肌動(dòng)球蛋白復(fù)合物功能抑制劑，是相比于ROCK抑制劑，更加有效地抑制巨核細(xì)胞的核內(nèi)分裂，更進(jìn)一步促進(jìn)多核化的物質(zhì)。
[0133]本發(fā)明中可使用的肌動(dòng)球蛋白復(fù)合物功能抑制劑，可以舉出作為肌球蛋白重鏈ΠΑ/Β ATPase抑制劑的、布雷他汀(Blebbistatin ;科學(xué)雜志(Science), 299:1743-17472003)。并且，可以舉出作為肌球蛋白輕鏈激酶抑制劑的、ML7等。另外，作為肌球蛋白重鏈IIA/B ATPase抑制劑或肌球蛋白輕鏈激酶抑制劑，還可以使用抑制肌球蛋白重鏈IIA/B ATPase或肌球蛋白輕鏈激酶的活性的核酸(例如，shRNA等)或抗體等。
[0134]另外，在本說(shuō)明書中，“處理”是指進(jìn)行操作以在對(duì)象細(xì)胞中使抑制劑等發(fā)揮效果，例如在細(xì)胞的培養(yǎng)液中添加適量的抑制劑等，放置在如吸收進(jìn)到細(xì)胞內(nèi)的狀態(tài)。根據(jù)情況，也可以同時(shí)進(jìn)行如促進(jìn)向細(xì)胞的吸收的操作。
[0135]本發(fā)明所涉及的巨核細(xì)胞的制造方法的一種方式，包括工序:對(duì)使抗細(xì)胞凋亡基因強(qiáng)制表達(dá)而在培養(yǎng)的細(xì)胞，用Rock抑制劑進(jìn)行處理。
[0136]作為ROCK (Rho相關(guān)的卷曲螺旋形成蛋白激酶(Rho-associated coiled-coilforming kinase) /Rho結(jié)合激酶)抑制劑，例如可以舉出反式_4_[(R)-1-氨基乙基]-N-(4-吡唳基)環(huán)己燒甲酰胺二鹽酸鹽((R) - (+) -trans-N- (4-pyridyl) ~4~ (1-aminoethyl)-cyclohexanecarboxamide *2HC1.Η20)(Υ27632)等。根據(jù)情況如抑制 Rho 激酶活性的抗體或者核酸(例如，shRNA等)也可以作為ROCK抑制劑使用。
[0137]本發(fā)明所涉及的巨核細(xì)胞的制造方法的一種方式，包括工序:對(duì)使抗細(xì)胞凋亡基因強(qiáng)制表達(dá)而在培養(yǎng)的細(xì)胞，用HDAC抑制劑進(jìn)行處理。
[0138]HDAC抑制劑具有抑制組蛋白去乙?；?histone deacetylase, HDAC)活性的作用。至今已經(jīng)得知有多種HDAC抑制劑，例如可以舉出丙戊酸、曲古抑菌素A(TrichostatinA)、SAHA (辛二酸苯胺異輕廂酸(SuberoylaniIide hydroxamic acid))、APHA (芳酸基吡咯基羥基酰胺(Aroyl pyrrolyl hydroxy amide))等,尤其可以適合使用丙戍酸、曲古抑菌素A。如果使用藥物具有鹽形式，也可以以鹽形式使用。
[0139]對(duì)于用肌動(dòng)球蛋白復(fù)合物功能抑制劑、ROCK抑制劑、HDAC抑制劑等處理細(xì)胞時(shí)的最適濃度等而言，只要是本領(lǐng)域技術(shù)人員，能夠通過(guò)預(yù)實(shí)驗(yàn)而事先決定。并且，對(duì)于處理的天數(shù)或方法等，本領(lǐng)域技術(shù)人員也能夠適宜選擇。例如，用肌球蛋白重鏈II ATPase抑制劑的、Blebbistatin進(jìn)行處理時(shí)，向培養(yǎng)液中添加2~15 μ g/ml、或者5~10 μ g/ml左右,作為培養(yǎng)天數(shù)例如為5~10天左右，尤其優(yōu)選為6~7天左右。并且，對(duì)于作為ROCK抑制劑的Y27632而言，可以使用5~15 μ M、或者8~12 μ Μ、優(yōu)選10 μ M左右；而作為HDAC抑制劑的丙戊酸而言，可以使用0.1~ImM、或者0.2~0.7mM、優(yōu)選0.5mM左右。作為Y27632、丙戊酸的處理時(shí)間，可以為10~21天，優(yōu)選為14天左右。
[0140]本發(fā)明所涉及的多核巨核細(xì)胞的制造方法的一種方式，包括將使抗細(xì)胞凋亡基因強(qiáng)制表達(dá)而在培養(yǎng)的細(xì)胞放置于37°C以上的溫度。
[0141]并且，確認(rèn)出通過(guò)在通常的37°C以上的溫度下培養(yǎng)巨核細(xì)胞，促進(jìn)多核化的巨核細(xì)胞的分化。在此，37°C以上的溫度，是指不損傷細(xì)胞的程度的溫度為適宜，因此例如約37°C~約42°C左右、優(yōu)選約37°C~約39°C左右。并且，對(duì)于37°C以上的溫度下的培養(yǎng)天數(shù)而言，實(shí)時(shí)觀察多核化的巨核細(xì)胞的數(shù)量等而適宜決定，例如10天~28天，優(yōu)選14天~21
天左右。
[0142]對(duì)于在多核化前的巨核細(xì)胞中使抗細(xì)胞凋亡基因強(qiáng)制表達(dá)而進(jìn)行培養(yǎng)的工序的其他培養(yǎng)條件等，只要適宜獲得本發(fā)明的效果，沒有特別限制，可以使用公知的培養(yǎng)條件或依照該條件的條件。例如，TPO、IL-1、IL-3、IL-4、IL5、IL-6、IL-9、IL-11、EPO、GM-CSF、SCF、G-CSF、Flt3配體、肝素(!feparin)等的任意個(gè)或者也可以從中組合兩個(gè)以上而添加到培養(yǎng)基。
[0143]并且，也可以使用適宜的飼養(yǎng)細(xì)胞而進(jìn)行培養(yǎng)。[0144]通過(guò)上述的方法獲得的多核化的巨核細(xì)胞有效地產(chǎn)生⑶42b陽(yáng)性的功能性血小板。如實(shí)施例所示，⑶42b陽(yáng)性的血小板在體內(nèi)(in vivo)以及體外(in vitro),具有高的血栓形成能力。并且，多核化的巨核細(xì)胞即使冷凍保存后解凍，也能產(chǎn)生功能性血小板。
[0145]本發(fā)明還提供多核巨核細(xì)胞的含有率高的血液細(xì)胞組合物。在此，“血液細(xì)胞組合物”中除了包括通過(guò)本發(fā)明的方法而被促進(jìn)了多核化的“多核巨核細(xì)胞”以外，還可以包括通過(guò)其他方法制備的巨核細(xì)胞、或者其他血液細(xì)胞。
[0146]根據(jù)本發(fā)明的方法而處理多核化前的巨核細(xì)胞，則能夠促進(jìn)向4N以上的多核巨核細(xì)胞的分化。為此，例如通過(guò)對(duì)從多功能干細(xì)胞等分化的巨核細(xì)胞群，適用本發(fā)明的方法，能夠獲得4N以上的多核巨核細(xì)胞的含有率高的血液細(xì)胞組合物。如果用本發(fā)明的方法處理巨核細(xì)胞群，則能夠?qū)?N以上的多核巨核細(xì)胞的含有率增加到至少20%以上、30%以上，優(yōu)選40%以上、50%以上，更為優(yōu)選80%以上(例如，參照?qǐng)D11B)。因此，根據(jù)本發(fā)明的方法，可以制備多核巨核細(xì)胞的存在比率高的巨核細(xì)胞群或者血液細(xì)胞群。
[0147]這種血液細(xì)胞組合物也能夠冷凍保存。因此，也可以以冷凍保存的狀態(tài)流通，由使用者進(jìn)行后述的血小板的制造方法。
[0148]對(duì)于采用本發(fā)明的方法處理而被促進(jìn)了多核化的巨核細(xì)胞等而言，通過(guò)適宜的方法移植到機(jī)體內(nèi)，在機(jī)體內(nèi)產(chǎn)生功能性血小板，也是有效的。
[0149]目前，作為造血干細(xì)胞的移植方法，采用骨髓移植、臍帶血移植等，尤其臍帶血移植而言，可以減輕骨髓移植中存在的捐贈(zèng)者的人數(shù)不足、捐贈(zèng)者的負(fù)擔(dān)大的問(wèn)題，因此近年來(lái)臍帶血移植的機(jī)會(huì)逐漸地增加。然而,通過(guò)臍帶血移植而機(jī)體內(nèi)產(chǎn)生的巨核細(xì)胞,多核化程度低，在機(jī)體內(nèi)產(chǎn)生充足的血小板為止需要時(shí)間，當(dāng)急需提高血小板的產(chǎn)生能力時(shí)，如果只采用臍帶血移植，則會(huì)處于難以充分地滿足所需的量的狀況。
[0150]根據(jù)本發(fā)明而獲得的多核巨核細(xì)胞等的移植能夠解決在骨髓移植中存在的捐贈(zèng)者的人數(shù)不足以及捐贈(zèng)者的負(fù)擔(dān)的問(wèn)題、在臍帶血移植中存在的機(jī)體內(nèi)的血小板產(chǎn)生能力的問(wèn)題，因此可以說(shuō)是與現(xiàn)有的移植方法比非常優(yōu)異的方法。
`[0151](血小板的制造方法)
[0152]另一方面，本發(fā)明所涉及的血小板的制造方法，是在機(jī)體外(in vitro)從通過(guò)本發(fā)明的方法獲得的多核巨核細(xì)胞等產(chǎn)生血小板的方法。
[0153]本發(fā)明所涉及的血小板的制造方法包括工序:培養(yǎng)通過(guò)上述的方法而獲得的多核化的巨核細(xì)胞,從培養(yǎng)物回收血小板。
[0154]對(duì)于培養(yǎng)條件不做限定,但是例如可以在TPO (10~200ng/mL、優(yōu)選50~IOOng/mL左右)的存在下；或者，TPO (10~200ng/mL、優(yōu)選50~100ng/mL左右)、SCF (10~200ng/mL、優(yōu)選 50ng/mL 左右)以及肝素(Heparin) (10 ~100U/mL、優(yōu)選 25U/ml 左右)的存在下，培養(yǎng)7~15天左右。
[0155]本發(fā)明所涉及的血小板的制造方法的一種方式，在多核巨核細(xì)胞的培養(yǎng)工序中，抑制上述細(xì)胞凋亡基因的強(qiáng)制表達(dá)，或者從多核巨核細(xì)胞去除上述抗細(xì)胞凋亡基因。
[0156]抗細(xì)胞凋亡基因的表達(dá)的抑制，例如，可以通過(guò)去除藥物等而解除由前述的誘導(dǎo)性表達(dá)系統(tǒng)誘導(dǎo)的表達(dá)，由此達(dá)到抑制表達(dá)的目的?；蛘?，還可以通過(guò)使用Cre/Lox系統(tǒng)等而去除導(dǎo)入的抗細(xì)胞凋亡基因，抑制性調(diào)控這些基因的表達(dá)。為了抑制性調(diào)節(jié)抗細(xì)胞凋亡基因的表達(dá)，也可以使用適宜的市場(chǎng)上銷售的試劑盒等。[0157]如后述的實(shí)施例所示，如果抑制為了促進(jìn)多核化而強(qiáng)制表達(dá)的抗細(xì)胞凋亡基因的表達(dá)，則⑶41a陽(yáng)性/⑶42b陽(yáng)性的功能性血小板的產(chǎn)生效率就會(huì)提高。
[0158]抗細(xì)胞凋亡基因的表達(dá)抑制或去除，從血小板回收前的15天前、優(yōu)選10天前、更優(yōu)選3天~7天前、進(jìn)一步優(yōu)選約3天前開始進(jìn)行。
[0159]更加具體而言，在該工序中，不僅抑制外源性的抗細(xì)胞凋亡基因，而且還可以抑制內(nèi)源性的抗細(xì)胞凋亡基因的表達(dá)。并且，在本工序中，還可以繼續(xù)進(jìn)行對(duì)P53基因產(chǎn)物的表達(dá)或功能的抑制。
[0160]對(duì)于培養(yǎng)溫度而言，只要獲得本發(fā)明的效果，則沒有特別限制，雖然可以在35°C~400C下進(jìn)行，但是如實(shí)施例所示，37°C~39°C為適宜。
[0161]本發(fā)明所涉及的制造方法中，也可以在無(wú)血清和/或無(wú)飼養(yǎng)細(xì)胞的條件下，進(jìn)行多核巨核細(xì)胞的培養(yǎng)工序。如實(shí)施例所示，本發(fā)明所涉及的方法中，將小牛血清添加到培養(yǎng)基時(shí)、以及采用無(wú)血清培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)時(shí)，雖然沒有觀察到血小板的產(chǎn)生量之間存在大的差異，但是采用無(wú)血清培養(yǎng)基或無(wú)飼養(yǎng)細(xì)胞培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)時(shí)，CD42b陽(yáng)性血小板的比率更高。如果能在無(wú)血清且無(wú)飼養(yǎng)細(xì)胞下進(jìn)行血小板產(chǎn)生工序，則當(dāng)獲得的血小板用于臨床時(shí)，不容易發(fā)生免疫原性問(wèn)題。
[0162]并且，如果不使用飼養(yǎng)細(xì)胞而能產(chǎn)生血小板，則沒有必要粘附飼養(yǎng)細(xì)胞，因此可以用燒瓶等進(jìn)行懸浮培養(yǎng)，從而能夠抑制制造成本，同時(shí)適合大規(guī)模生產(chǎn)。另外，不使用飼養(yǎng)細(xì)胞時(shí)，可以使用條件培養(yǎng)基(conditioned medium)。對(duì)于條件培養(yǎng)基(conditionedmedium)不做特別限定，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以根據(jù)公知的方法等而進(jìn)行制備，但是可以通過(guò)適宜培養(yǎng)飼養(yǎng)細(xì)胞， 采用過(guò)濾器從培養(yǎng)物去除飼養(yǎng)細(xì)胞而獲得。
[0163]本發(fā)明所涉及的血小板的制造方法的一種方式，向培養(yǎng)基加入ROCK抑制劑和/或肌動(dòng)球蛋白復(fù)合物功能抑制劑。作為ROCK抑制劑以及肌動(dòng)球蛋白復(fù)合物功能抑制劑，可以使用與上述的多核巨核細(xì)胞的制造方法中所使用的抑制劑相同的物質(zhì)。作為ROCK抑制劑，例如可以舉出Y27632。作為肌動(dòng)球蛋白復(fù)合物功能抑制劑，可以舉出作為肌球蛋白重鏈IIATPase抑制劑的、Blebbistatin?？梢詥为?dú)加入ROCK抑制劑，也可以單獨(dú)加入ROCK抑制劑以及肌動(dòng)球蛋白復(fù)合物功能抑制劑，還可以組合加入這些抑制劑。
[0164]ROCK抑制劑和/或肌動(dòng)球蛋白復(fù)合物功能抑制劑優(yōu)選加入0.1 μ M~30 μ M，例如也可以是0.5 μ M~25 μ Μ、5 μ M~20 μ M等。
[0165]從加入ROCK抑制劑和/或肌動(dòng)球蛋白復(fù)合物功能抑制劑后的培養(yǎng)天數(shù)可以是I天~15天,也可以是3天、5天、7天等。通過(guò)加入ROCK抑制劑和/或肌動(dòng)球蛋白復(fù)合物功能抑制劑，能夠進(jìn)一步增加⑶42b陽(yáng)性血小板的比率。
[0166]本發(fā)明的實(shí)施方式中，包括用于促進(jìn)巨核細(xì)胞的多核化，制造成熟巨核細(xì)胞和/或血小板的試劑盒。該試劑盒中除了包含癌基因、上述(i)~(iii)基因、BCL-XL基因等細(xì)胞內(nèi)表達(dá)所需的表達(dá)載體等以及試劑等以外，還包含用于細(xì)胞培養(yǎng)的培養(yǎng)基、血清、增殖因子等添加因子(supplement,例如，TP0、EP0、SCF、肝素、IL-6、IL-1I等)、抗菌劑等。另外，例如使用ES細(xì)胞或iPS細(xì)胞來(lái)源的細(xì)胞時(shí)，還包含用于鑒定從這些細(xì)胞制備的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)物的標(biāo)記確認(rèn)用的抗體(例如，針對(duì)Flkl、⑶31、⑶34、UEA-凝集素等的抗體)。試劑盒中所包含的試劑、抗體等可以裝在如使組成成分長(zhǎng)期有效地維持活性，不會(huì)根據(jù)容器的材料而吸附，不會(huì)發(fā)生變質(zhì)的、任意種類的容器中。[0167]進(jìn)一步地，本發(fā)明的試劑盒中也可以包含有使癌基因以及上述(i)~(iii)基因強(qiáng)制表達(dá)的多核化前的巨核細(xì)胞。
[0168]本說(shuō)明書中所記載的“細(xì)胞”的來(lái)源，是人類以及非人類動(dòng)物(例如，小鼠、大鼠、牛、馬、豬、綿羊、猴、狗、貓、雞等)，沒有特別限制。但是，尤其優(yōu)選人類來(lái)源的細(xì)胞。
[0169]以下，舉出實(shí)施例，進(jìn)行更加詳細(xì)的說(shuō)明，但是本發(fā)明不受實(shí)施例的任何限制。
[0170]實(shí)施例
[0171]1.多核化前的巨核細(xì)胞的制備
[0172]1-1.從ES細(xì)胞制備多核化前的巨核細(xì)胞
[0173]為了研究巨核細(xì)胞的多核化，從ES細(xì)胞制備了進(jìn)行多核化前的巨核細(xì)胞(詳細(xì)內(nèi)容參照專利文獻(xiàn)3。)。
[0174]將人類ES細(xì)胞株〔KhES-3〕在20ng/ml的VEGF存在下培養(yǎng)14天，制備網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)物，回收從該網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)物取出的造血前體細(xì)胞，在10T1/2細(xì)胞上種植以達(dá)到細(xì)胞數(shù)I X IO5/孔。
[0175]向如此制備的造血前體細(xì)胞以MOI = 10 (通過(guò)Jurkat細(xì)胞確認(rèn))每隔12小時(shí)感染三次整合了 C-MYC-2A-BMI1的pMx tet off c_MYC2A BMIl逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，進(jìn)行c_MYC和BMIl表達(dá)的誘導(dǎo)(專利文獻(xiàn)3)。pMx tet off c_MYC2A BMIl載體在雌二醇存在下，使c-MYC基因以及BMIl基因表達(dá)，而在多西環(huán)素(Dox)存在且雌二醇不存在下，則抑制c_MYC基因以及BMIl基因的表達(dá)。
[0176]與第一次感染同時(shí)添`加2mM雌二醇，并且，從最后一次感染12小時(shí)后去除病毒。在該時(shí)期，即使關(guān)閉(off) c-M`YC基因或BMII基因的表達(dá)，⑶42b陽(yáng)性血小板釋放得少，認(rèn)為是未成熟的巨核細(xì)胞。下面有時(shí)將該細(xì)胞稱為“iMKPC-型I”。
[0177]為了調(diào)查研究iMKPC-型I的細(xì)胞因子依賴性，在10T1/2飼養(yǎng)細(xì)胞上接種2xl05個(gè) iMKPC-型 I，在 2ιιΜβ-雌二醇(β-estradiol)存在下，在 37 °C，使用 SCF(50ng/ml)、TP0(50ng/ml)、EP0(6U/ml)的細(xì)胞因子，在圖1A示出的條件下培養(yǎng)14天。在第4天、第11天，對(duì)被確認(rèn)出增殖的組測(cè)定細(xì)胞數(shù)，以2X IO5個(gè)進(jìn)行再接種，除此以外更換培養(yǎng)基。在第8天、第14天，測(cè)定細(xì)胞數(shù)，以2X IO5個(gè)進(jìn)行再接種，同時(shí)在第8天，將部分細(xì)胞使用CD41抗體、CD42b抗體以及GPA抗體進(jìn)行染色，利用流式細(xì)胞儀進(jìn)行分析。
[0178]結(jié)果示出在圖1B以及C。如圖1B所示，iMKPC-型I的增殖高度依賴于SCF。并且，如圖1C所示，雖然所有的組幾乎為⑶41陽(yáng)性，但去除了 SCF的組中，⑶41+/⑶42b-組的增殖極其低下。⑶41+/⑶42b-組在iMKPC-型I中也是增殖良好的群體。
[0179]iMKPC-型I為SCF依賴性，從這一點(diǎn)也暗示著iMKPC-型I是未成熟的巨核細(xì)胞。
[0180]1-2.從臍帶血 來(lái)源CD34陽(yáng)性細(xì)胞制備多核前的巨核細(xì)胞
[0181]確認(rèn)出也能從臍帶血來(lái)源⑶34陽(yáng)性細(xì)胞通過(guò)與ES細(xì)胞或iPS細(xì)胞同樣的方法制備多核化前的巨核細(xì)胞。
[0182]具體而言，向臍帶血來(lái)源⑶34陽(yáng)性細(xì)胞以M0I10感染三次pMx-c-MYC和DNsamBMIl病毒(均為逆轉(zhuǎn)錄病毒載體)，然后對(duì)第14天以及第21天的細(xì)胞利用FACS計(jì)數(shù)了⑶41a (巨核細(xì)胞標(biāo)記)陽(yáng)性細(xì)胞。作為對(duì)照，使用了 Mock (空白載體(Empty vector))。
[0183]結(jié)果示出在圖1D。與Mock對(duì)比，使c-MYC以及BMIl強(qiáng)制表達(dá)的組中，觀察到⑶41陽(yáng)性巨核細(xì)胞的增殖，確認(rèn)出也能從臍帶血來(lái)源細(xì)胞通過(guò)與1-1.同樣的方法獲得多核化前的巨核細(xì)胞。
[0184]2.從多核化前的巨核細(xì)胞制備多核巨核細(xì)胞
[0185]2-1.BCL-XL表汰對(duì)多核化的影響
[0186]在1-1.中，整合了 C-MYC-2A-BMI1 的 pMx tet off C-MYC2A BMIl 逆轉(zhuǎn)錄病毒載體感染后第23天，以M0I10感染一次多西環(huán)素誘導(dǎo)性的Lv-BCL-XL-GFP (慢病毒載體)。該載體是如下制備的:向用EcoR1、BamHI處理過(guò)的A1-Lv tet on載體(clontech公司),利用In-Fusion advance PCR cloning kit (clontech 公司)，導(dǎo)入通過(guò) PCR 擴(kuò)增的 BCL-XL 的cDNA，由此進(jìn)行制備。從感染24小時(shí)后，去除病毒。去除雌二醇，加入多西環(huán)素，抑制c-MYC和BMIl的表達(dá)，同時(shí)開始BCL-XL的表達(dá)。
_7] 2-2.p53基因的敲除對(duì)多核化的影響
[0188]使多西環(huán)素誘導(dǎo)性的Lv-BCL-XL-GFP慢病毒載體感染外，又使FG12_shp53慢病毒載體感染，敲除P52基因。下面有時(shí)將該細(xì)胞稱為“iMKPC-型II”。
[0189]2-3.1MKPC-型II的細(xì)朐閔子依賴件
[0190]在10T1/2飼養(yǎng)細(xì)胞接種 2X IO5個(gè) iMKPC-型 II，在Dox0.5 μ g/ml 存在下，在 39°C，SCF(50ng/ml)、TP0(50ng/ml)、EP0(6U/ml)的細(xì)胞因子條件下，培養(yǎng)21天。結(jié)果示出在圖2A。確認(rèn)出iMKPC-型II株雖然在細(xì)胞因子不存在下也進(jìn)行增殖，但因TPO的添加而增殖被進(jìn)一步促進(jìn)。iMKPC-型I是SCF依賴性，TPO與增殖無(wú)關(guān)，但是型II在TPO存在下增殖被促進(jìn)，SCF與增殖無(wú)關(guān)。
[0191]2-4.1MKPC-型II的表面標(biāo)記的分析
[0192]添加細(xì)胞因子后第21天，將細(xì)胞使用CD41抗體、CD42b抗體以及GPA抗體進(jìn)行染色，用流式細(xì)胞儀進(jìn)行分析。結(jié)果示出`在圖2B。添加了 TPO的組與其他組相比，⑶41a以及⑶42b的表達(dá)更高。被認(rèn)為是更加定向(commit)于巨核細(xì)胞的群體。
[0193]2-5.形杰學(xué)變仆,以及Blebbistatin的影口向
[0194]將通過(guò)顯微鏡觀察iMKPC-型I以及型II的結(jié)果示出在圖3。通過(guò)關(guān)閉(off) c_MYC和BMII的表達(dá)，使BCL-XL強(qiáng)制表達(dá)的同時(shí)敲除p53，由此能夠觀察到向多核化發(fā)展。并且，確認(rèn)出如果添加Blebbistatin (5 μ g/ml),則會(huì)進(jìn)一步向多核化發(fā)展。
[0195]如2-3.~2-5.所示，在iMKPC-型II階段，巨核細(xì)胞增殖的同時(shí)，釋放的血小板中CD42b陽(yáng)性的比率變高，一部分向多核化發(fā)展而細(xì)胞因子依賴性變?yōu)棣肠?，因此被認(rèn)為增殖與成熟在并行。
[0196]2-6.BCL-XL表汰抑制的影響
[0197]在1011/2飼養(yǎng)細(xì)胞接種2\105個(gè)丨]\0^(:-型11，在0(?0.5 4 8/1111存在下(8(^-父1^0N)或不存在下(BCL-XL 0FF)，在39°C下，長(zhǎng)期培養(yǎng)。2天~5天一次測(cè)定細(xì)胞數(shù)，再接種2X105 個(gè)。
[0198]結(jié)果示出在圖4。如果通過(guò)Dox OFF抑制BCL-XL的表達(dá)，則iMKPC-型II的增殖速度變得低下，經(jīng)過(guò)長(zhǎng)時(shí)間后(100天以后，)失去了增殖能力。得知BCL-XL對(duì)iMKPC-型II的長(zhǎng)期增殖是必需的。
_9] 2-7.其他處理對(duì)多核化的影響的研究
[0200]2-7-1.ROCK抑制劑的影響
[0201 ] 導(dǎo)入MYC以及BMII基因后，在多西環(huán)素不存在以及雌二醇存在下，培養(yǎng)條件37°C、5% CO2存在下，將巨核細(xì)胞(IO5左右)培養(yǎng)30天左右，增殖達(dá)到IO11個(gè)左右。為了抑制增殖的巨核細(xì)胞株中的MYC基因以及BMIl基因的表達(dá)，將條件改為多西環(huán)素存在，而雌二醇不存在，為了觀察ROCK抑制劑(Y27632 ;和光純藥)對(duì)多核化的影響，向培養(yǎng)液添加Y27632達(dá)到10 μ Μ，進(jìn)一步繼續(xù)培養(yǎng)。從添加Υ27632而培養(yǎng)第7天時(shí)，利用FACS調(diào)查研究了多核化程度(圖5)。添加了 ROCK抑制劑的細(xì)胞(圖5的上圖(Rocki)、下圖中白色)與沒有添加的細(xì)胞(圖5的上圖(載體對(duì)照，vehicle)、下圖中黑色)比較，增加了 4N以上的細(xì)胞數(shù)。從這一點(diǎn)明確了 ROCK抑制劑對(duì)從ES細(xì)胞誘導(dǎo)、且通過(guò)c-MYC基因以及BMIl基因的表達(dá)而獲得了增殖能力的多核化前的巨核細(xì)胞，促進(jìn)多核化。
[0202]2-7-2.ROCK抑制劑+高溫條件下的培養(yǎng)的影響
[0203]迄今為止，報(bào)道有如果將未成熟巨核細(xì)胞在比通常的培養(yǎng)溫度高的溫度如39°C下培養(yǎng)，則多核化、前血小板(proplatelet)形成等巨核細(xì)胞的成熟會(huì)得到促進(jìn)(非專利文獻(xiàn)5)。為了在從ES細(xì)胞誘導(dǎo)的多核化前的巨核細(xì)胞中確認(rèn)這一點(diǎn)，通過(guò)定量PCT，研究了被認(rèn)為是隨巨核細(xì)胞的成熟而表達(dá)量上升的基因(GATA1、PF4、NFE2以及β-微管蛋白)的表達(dá)量。
[0204]促進(jìn)了多核化前的巨核細(xì)胞的增殖。為了抑制獲得的多核化前的巨核細(xì)胞中的MYC基因以及BMIl基因的表達(dá)，將條件改為多西環(huán)素存在，而雌二醇不存在，培養(yǎng)溫度為39°C，培養(yǎng)5天后，通過(guò)定量PCR法，測(cè)定各種基因的表達(dá)量(圖6)。其結(jié)果得知，與在37°C下培養(yǎng)時(shí)相比，在39°C下培養(yǎng)時(shí)成為巨核細(xì)胞的成熟的指標(biāo)的基因的表達(dá)更加上升。
[0205]2-7-3.ROCK抑制劑+BCL-XL某閔強(qiáng)制表汰的影響
[0206]抑制多核化前的 巨核細(xì)胞中的MYC/BMI1的表達(dá)的同時(shí)在多西環(huán)素存在下向細(xì)胞內(nèi)導(dǎo)入了與2-1.相同地使BCL-XL表達(dá)的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體。
[0207]調(diào)查研究了 BCL-XL基因的表達(dá)與否對(duì)由ROCK抑制劑誘導(dǎo)的巨核前體細(xì)胞的多核化引起什么樣的影響(圖7)。
[0208]在10 μ M的Υ27632存在下，抑制MYC / BMIl的表達(dá)，且使BCL-XL表達(dá)，培養(yǎng)7天后，研究了多核化的程度(倍體檢測(cè)，ploidy assay)。能夠確認(rèn)BCL-XL表達(dá)細(xì)胞株(圖7B，斜線柱)與未表達(dá)BCL-XL的細(xì)胞株(圖7B，白色柱)相比，8N以上的多核化細(xì)胞優(yōu)勢(shì)地增長(zhǎng)。并且，觀察到未表達(dá)BCL-XL的細(xì)胞的細(xì)胞數(shù)逐漸減少(圖8中▲)，與此相比，表達(dá)BCL-XL的細(xì)胞的細(xì)胞數(shù)平穩(wěn)地逐漸增殖(圖8中_)。
[0209]以上的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，揭示因癌基因的強(qiáng)制表達(dá)而獲得高增殖能力的多核化前的巨核細(xì)胞中，為了避免癌基因依賴性，BCL-XL基因等抑制細(xì)胞凋亡的基因是有效的。
[0210]2-7-4.ROCK抑制劑+BCL-XL某閔強(qiáng)制表汰+p53某閔抑制的影響
[0211]研究了在多核化前的巨核細(xì)胞中，p53的表達(dá)抑制是否促進(jìn)多核化。
[0212]p53基因的表達(dá)抑制，與2-2.同樣地，通過(guò)利用導(dǎo)入了 Hl啟動(dòng)子、shp53的慢病毒FG12載體以M0I10進(jìn)行了慢病毒感染。
[0213]抑制MYC/BMI1的表達(dá)，使BCL-XL強(qiáng)制表達(dá)，在Y27632的存在下，進(jìn)行了 p53的表達(dá)抑制，在39°C下，培養(yǎng)了 7天。培養(yǎng)后，調(diào)查研究了多核化的程度，其結(jié)果，與沒有敲除p53的對(duì)照細(xì)胞(圖9B，黑色柱)相比，敲除了 p53的細(xì)胞(圖9B，白色柱)中，8N以上的細(xì)胞數(shù)增加，多核化得到了促進(jìn)。
[0214]2-7-5.ROCK抑制劑+BCL-XL基因強(qiáng)制表達(dá)+p53基因抑制+丙戊酸的影響[0215]進(jìn)行上述2-7-4.的處理，再進(jìn)一步地對(duì)細(xì)胞進(jìn)行丙戊酸處理，研究了對(duì)多核化的影響。抑制MYC/BMI1的表達(dá)，進(jìn)行BCL-XL的強(qiáng)制表達(dá)、ROCK抑制劑處理(10 μ Μ)、ρ53表達(dá)抑制，進(jìn)一步地向培養(yǎng)基中添加丙戊酸(終濃度0.5mM)，在39°C下，培養(yǎng)了 7天，其結(jié)果，與沒有用丙戊酸處理過(guò)的對(duì)照細(xì)胞(圖10B，黑色柱)相比，用丙戊酸處理過(guò)的細(xì)胞(圖10B，白色柱)，多核化得到了促進(jìn)。
[0216]2-7-6.BCL-XL某閔強(qiáng)制表汰+肌球蛋白重鏈IIA/B ATPase抑制劑的影響以及ROCK抑制劑+BCL-XL某閔強(qiáng)制表汰+P53某閔抑制+丙戊酸+肌球蛋白重鏈IIA/B ATPase抑制劑的影響
[0217]研究了對(duì)沒有進(jìn)行多核化的巨核細(xì)胞，用肌球蛋白重鏈IIA/B ATPase抑制劑的Blebbistatin進(jìn)行處理時(shí)，是否對(duì)多核化程度產(chǎn)生影響。抑制MYC/BMI1的表達(dá)、進(jìn)行BCL-XL強(qiáng)制表達(dá)、Blebbistatin (10 μ g/ml)處理，在39°C下，培養(yǎng)了 7天。與沒有用Blebbistatin處理的對(duì)照細(xì)胞(圖11B,黑色柱)比較,用Blebbistatin處理的細(xì)胞(圖11,白色柱)中，8N以上的細(xì)胞數(shù)增加，多核化得到了促進(jìn)。
[0218]接著，研究了其他處理與Blebbistatin處理組合進(jìn)行時(shí)的多核化程度。在上述
2-7-5.處理上,再進(jìn)一步對(duì)細(xì)胞進(jìn)行了 Blebbistatin處理,研究了對(duì)多核化的影響。進(jìn)行抑制MYC/BMI1的表達(dá)、BCL-XL強(qiáng)制表達(dá)、ROCK抑制劑(10 μ M)處理、ρ53表達(dá)抑制、丙戊酸(0.5mM)處理的基礎(chǔ)上，還進(jìn)行了 Blebbistatin (10 μ g/ml)處理，在39°C下，培養(yǎng)了 7天。與沒有用Blebbistatin處理的對(duì)照細(xì)胞(圖12B,黑色柱)比較,用Blebbistatin處理的細(xì)胞(圖12，白色柱沖，SN以上的細(xì)胞數(shù)增加，多核化得到了促進(jìn)。并且，培養(yǎng)7天后，用Blebbistatin處理的細(xì)胞，增殖能力逐漸低下(圖13，上部圖)，而觀察到細(xì)胞質(zhì)增生，確認(rèn)了向成熟巨核細(xì)胞的誘導(dǎo)(圖13，下部圖)。
[0219]3.從多核巨核細(xì)胞的血小板的產(chǎn)生
[0220]3-1.BCL-XL表汰抑制對(duì)血小板產(chǎn)牛的影響(I)`[0221]在10T1/2飼養(yǎng)細(xì)胞上，接種從2-2.獲得的2X IO5個(gè)iMKPC-型II，在Dox0.5 μ g/ml存在下(BCL-XL 0N)，或者從培養(yǎng)液中去除Dox (BCL-XL 0FF)，在39°C下培養(yǎng)。第3_4天，用CD41抗體以及CD42b抗體染色巨核細(xì)胞以及培養(yǎng)液中的血小板，通過(guò)流式細(xì)胞儀進(jìn)行分析。
[0222]將結(jié)果示出在圖14。與在Dox ON下表達(dá)BCL-XL的巨核細(xì)胞(A)比較，由于DoxOFF而BCL-XL表達(dá)被抑制的組中，表達(dá)⑶42b的成熟的巨核細(xì)胞成為主體(B)。并且，從該巨核細(xì)胞釋放的血小板與從BCL-XL ON的巨核細(xì)胞釋放的血小板(C)比較，表達(dá)功能表達(dá)所需的⑶42b的血小板的比例也增加了(D)。
[0223]3-2.BCL-XL表汰抑制對(duì)血小板產(chǎn)牛的影響(2)
[0224]基于與3-1.相同的結(jié)果，將計(jì)數(shù)了在BCL-XL表達(dá)0N/0FF時(shí)的細(xì)胞數(shù)的結(jié)果示出在圖15。抑制了 BCL-XL表達(dá)的組中，血小板數(shù)顯著地增加。
[0225]A表示⑶42b陽(yáng)性血小板數(shù)，B表示⑶41a陽(yáng)性/⑶42b陽(yáng)性巨核細(xì)胞數(shù)，C表示⑶41a陽(yáng)性巨核細(xì)胞數(shù)。
[0226]對(duì)于表達(dá)⑶41的巨核細(xì)胞的數(shù)而言，雖然沒有觀察到因Bcl-xL的表達(dá)的影響(C)，但是⑶41+中的⑶42b的表達(dá)比率因Bcl-xL表達(dá)抑制而增加，可以說(shuō)更加成熟的巨核細(xì)胞增加了。[0227]3-3.培養(yǎng)溫度對(duì)血小板產(chǎn)生的影響
[0228]在10T1/2飼養(yǎng)細(xì)胞上，接種2~3X105個(gè)iMKPC-型II，在添加或不添加Dox0.5 μ g/ml的條件下，在35、37、39°C的培養(yǎng)溫度下，培養(yǎng)3天。用CD41抗體以及CD42b抗體染色包含于上清中的血小板，通過(guò)流式細(xì)胞儀進(jìn)行分析。將以37°C Dox+作為1，各組的⑶41+⑶42b+血小板數(shù)的平均值以及標(biāo)準(zhǔn)偏差示出在圖16。
[0229]了解到培養(yǎng)溫度為37°C或39°C，是適宜的。以后的實(shí)驗(yàn)中，培養(yǎng)溫度設(shè)定為37°C。
[0230]3-4.飼養(yǎng)細(xì)朐、培養(yǎng)某中的血清以及Blebbistatin的有無(wú)對(duì)血小板產(chǎn)牛的影響
[0231]如圖17所示，將使用/不使用飼養(yǎng)細(xì)胞、使用/不使用條件培養(yǎng)基(ConditionedMedium)、使用血清培養(yǎng)基/使用無(wú)血清培養(yǎng)基、加入/不加入Blebbistatin的條件進(jìn)行組合，測(cè)定了血小板產(chǎn)生效率。
[0232]對(duì)于條件培養(yǎng)基(Conditioned Medium)而言，明膠涂層(Gelatin coating)的IOcm的培養(yǎng)皿(dish)中接種用MMC處理的10T1/2細(xì)胞8X 105，第二天(細(xì)胞粘附后)，更換為含SCF(50ng/ml)、TP0 (50ng/ml)的含15%血清的分化培養(yǎng)基(EBM)或者沒有血清的分化培養(yǎng)基10ml，24小時(shí)后回收培養(yǎng)基，添加IOml的新培養(yǎng)基(含SCF、ΤΡ0)，將3日份的條件培養(yǎng)基(Conditioned Medium)合并(pool),使用0.22 μ m的過(guò)濾器去除10T1/2,由此進(jìn)行配制。用于試驗(yàn)時(shí)，重新添加SCF、TP0。
[0233]對(duì)于飼養(yǎng)細(xì)胞使用組而言，在10T1/2飼養(yǎng)細(xì)胞上接種2~3 X IO5個(gè)iMKPC-型II，而對(duì)于非使用組而言，涂覆明膠的培養(yǎng)皿(dish)中同樣地接種細(xì)胞。對(duì)于血清培養(yǎng)基使用組而言，使用含15%血清的分化培養(yǎng)基或條件培養(yǎng)基(Conditioned Medium),對(duì)于Blebbistatin添加組而言，在培養(yǎng)基中添加5 μ M的Blebbistatin。在37°C下，培養(yǎng)3天。
[0234]用⑶41抗體以及⑶42b抗體染色包含于培養(yǎng)上清中的血小板，通過(guò)流式細(xì)胞儀進(jìn)行分析。將在飼養(yǎng)細(xì)胞上未添加Blebbistatin、添加15%血清而培養(yǎng)的組作為標(biāo)準(zhǔn)狀態(tài)(normal condition),將各組的⑶41+⑶42b+血小板數(shù)相對(duì)于標(biāo)準(zhǔn)狀態(tài)的比率的平均值以及標(biāo)準(zhǔn)偏差以柱狀圖示出在圖17。血小板產(chǎn)生量在所有的組中均沒有出現(xiàn)較大的差異。
[0235]并且，將各組的⑶41陽(yáng)性血小板中的⑶42b表達(dá)量(各組的平均熒光強(qiáng)度相對(duì)于標(biāo)準(zhǔn)狀態(tài)的平均熒光強(qiáng)度的比率)的比較示出在圖18。沒有血清、沒有飼養(yǎng)細(xì)胞的條件下，產(chǎn)生了⑶42b的表達(dá)最高的血小板。沒有觀察到Blebbistatin的影響。
[0236]將最適宜的條件的一種例示出在圖19。并且，將該條件下培養(yǎng)時(shí)的⑶41陽(yáng)性、⑶42b (還稱為GPIba)陽(yáng)性血小板的比率示出在圖20。
[0237]如圖20所示，從根據(jù)本發(fā)明獲得的多核巨核細(xì)胞得到的血小板約20%呈⑶41陽(yáng)性⑶42b陽(yáng)性，通過(guò)抑制BCL-XL的表達(dá)，其比率上升到55%，進(jìn)一步地，通過(guò)去除飼養(yǎng)細(xì)胞和血清而進(jìn)行培養(yǎng)，能夠上升到81%。
[0238]4.⑶42b表汰對(duì)血小板功能的重要件(參考)
[0239]利用人類末梢血血小板，測(cè)定對(duì)于瑞斯托菌素(ristocetin)凝集反應(yīng)(介由vWF和血小板上的受體(由GPIba、GPIX等構(gòu)成的異源五聚體)的凝集反應(yīng))的HIPl抗體的抑制效果。HIPl抗體是GPIba的功能抑制性抗體。
[0240]將IX IO8個(gè)血小板懸浮于50%血漿中，添加HIPl抗體，在37°C下前培養(yǎng)3分鐘，抑制GPIba效果，然后添加瑞斯托菌素(終濃度為2mg/ml)，引起凝集反應(yīng)，實(shí)時(shí)觀察7分鐘光透射率。將表示各組的最大光透射率(表示凝集的強(qiáng)度)的柱狀圖示出在圖21。HPIl抗體在10 μ g/ml以上的濃度下完全抑制由GPIb/alpha-von Willebrand factor (vWF,血衆(zhòng)血管性血友病因子)締合的凝集。
[0241]接著，向NOG小鼠體內(nèi)給予IOOug的HIPl抗體或?qū)φ誌gG，輸血用TAMRA (紅色色素)染色的血小板。用激光照射血管內(nèi)皮使其損傷，引起血栓的形成，計(jì)數(shù)參與血栓形成的人類血小板(紅色)數(shù)。
[0242]用單位血管長(zhǎng)度校正血栓中的人類血小板數(shù)，將校正值的平均值以及標(biāo)準(zhǔn)誤差以柱狀圖表示(圖22)。給予HIPl抗體的組中，抑制了人類血小板參與血栓形成。
[0243]從以上試驗(yàn),得知GPIba (Q)42b)是在體內(nèi)(in vivo)以及體外(in vitro)對(duì)血栓形成起重要的作用的分子。
[0244]產(chǎn)業(yè)上的可利用性
[0245]本發(fā)明提供促進(jìn)巨核前體細(xì)胞的多核化，進(jìn)一步地，有效地使血小板釋放的方法。尤其，本發(fā)明的方法在從各種干細(xì)胞在體外制備巨核細(xì)胞或血小板時(shí)非常有效，會(huì)對(duì)醫(yī)療領(lǐng)域中的治療方法或血液制劑的研發(fā)做出較大貢獻(xiàn)。
【權(quán)利要求】
1.一種方法，是制造多核巨核細(xì)胞的方法，包括工序:在多核化前的巨核細(xì)胞中使抗細(xì)胞凋亡基因強(qiáng)制表達(dá)，培養(yǎng)該細(xì)胞。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，所述抗細(xì)胞凋亡基因?yàn)锽CL-XL基因。
3.如權(quán)利要求1或2所述的方法，在所述的培養(yǎng)工序中，抑制p53基因產(chǎn)物的表達(dá)或功倉(cāng)泛。
4.如權(quán)利要求1至3中任意一項(xiàng)所述的方法，在所述的培養(yǎng)工序中，對(duì)多核化前的巨核細(xì)胞進(jìn)行以下(a)至(C)中的至少一個(gè)處理: (a)由肌動(dòng)球蛋白復(fù)合物功能抑制劑的處理； (b)由ROCK抑制劑的處理；以及 (c)由HDAC抑制劑的處理。
5.如權(quán)利要求4所述的方法，所述ROCK抑制劑為Y27632，所述HDAC抑制劑為丙戊酸，所述肌動(dòng)球蛋白復(fù)合物功能抑制劑是Blebbistatin。
6.如權(quán)利要求1至5中任意一項(xiàng)所述的方法，在高于37°C的溫度下進(jìn)行所述的培養(yǎng)工序。
7.如權(quán)利要求1至 6中任意一項(xiàng)所述的方法，所述多核化前的巨核細(xì)胞是通過(guò)以下工序而獲得的:在從造血前體細(xì)胞到多核化前的巨核細(xì)胞的分化階段的任意階段，在該細(xì)胞中使癌基因與以下(i )至(iii )中的任意基因強(qiáng)制表達(dá)，培養(yǎng)該細(xì)胞并使其增殖， (i)抑制pl6基因或者pl9基因表達(dá)的基因、 (ii)抑制Ink4a/Arf基因表達(dá)的基因、以及 (iii)多梳基因。
8.如權(quán)利要求7所述的方法，作為所述癌基因而使用c-MYC基因，作為所述(i)至(iii)的基因而使用BMII。
9.如權(quán)利要求7或8所述的方法,所述造血前體細(xì)胞來(lái)源于iPS細(xì)胞、ES細(xì)胞，以及來(lái)源于從由臍帶血、骨髓血或末梢血來(lái)源的造血干細(xì)胞和造血干細(xì)胞構(gòu)成的組中選擇的細(xì)胞。
10.包含根據(jù)權(quán)利要求1至9中任意一項(xiàng)所述的方法而制造的多核巨核細(xì)胞的血液細(xì)胞組合物。
11.一種方法，是血小板的制造方法，包括工序: 通過(guò)權(quán)利要求1至9中任意一項(xiàng)所述的方法而獲得多核巨核細(xì)胞，培養(yǎng)該細(xì)胞； 從所述多核巨核細(xì)胞的培養(yǎng)物回收血小板。
12.如權(quán)利要求11所述的方法，所述的培養(yǎng)多核巨核細(xì)胞的工序是通過(guò)抑制抗細(xì)胞凋亡基因的強(qiáng)制表達(dá)或者從細(xì)胞去除所述抗細(xì)胞凋亡基因而進(jìn)行的。
13.如權(quán)利要求11或12所述的方法，所述的培養(yǎng)多核巨核細(xì)胞的工序是在沒有血清和/或沒有飼養(yǎng)細(xì)胞的條件下進(jìn)行的。
14.如權(quán)利要求11至13中任意一項(xiàng)所述的方法，所述的培養(yǎng)多核巨核細(xì)胞的工序進(jìn)行I到15天。
15.如權(quán)利要求11至14中任意一項(xiàng)所述的方法，所述的培養(yǎng)多核巨核細(xì)胞的工序在37 °C下進(jìn)行。
16.如權(quán)利要求11至15中任意一項(xiàng)所述的方法,在所述的培養(yǎng)多核巨核細(xì)胞的工序中，在培養(yǎng)基中添加ROCK抑制劑和/或肌動(dòng)球蛋白復(fù)合物功能抑制劑。
17.如權(quán)利要求16所述的方法，所述ROCK抑制劑為Y27632，所述肌動(dòng)球蛋白復(fù)合物功能抑制劑是Blebbistatin。
18.根據(jù)權(quán)利要求11至17中任意一項(xiàng)所述的方法制造的血小板。
19.包含權(quán)利要求18所述的血小板的血液制劑。
【文檔編號(hào)】A61K35/14GK103814126SQ201280023379
【公開日】2014年5月21日 申請(qǐng)日期:2012年5月11日 優(yōu)先權(quán)日:2011年5月13日
【發(fā)明者】江藤浩之, 中內(nèi)啟光, 高山直也, 中村壯 申請(qǐng)人:國(guó)立大學(xué)法人東京大學(xué)