與氧化應(yīng)激有關(guān)的疾病的治療和預(yù)防的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及治療和預(yù)防與氧化應(yīng)激和激素抵抗有關(guān)的病況的領(lǐng)域。優(yōu)選地，胰島素抵抗、紅細(xì)胞生成素抵抗和乙酰膽堿抵抗是焦點(diǎn)。本發(fā)明還涉及氨基酸、特別是對(duì)-L-酪氨酸和其前體作為預(yù)防或治療所述病況的藥劑或組合物或調(diào)配物的用途的領(lǐng)域。
【專利說(shuō)明】與氧化應(yīng)激有關(guān)的疾病的治療和預(yù)防
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及治療和預(yù)防由于氧化應(yīng)激和激素抵抗所致的病況的領(lǐng)域。優(yōu)選地，胰島素抵抗、紅細(xì)胞生成素抵抗和乙酰膽堿抵抗是焦點(diǎn)。本發(fā)明還涉及氨基酸、特別是對(duì)-L-酪氨酸和其前體作為預(yù)防或治療所述病況的藥劑或組合物或調(diào)配物的用途的領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002]脂肪組織是活躍的內(nèi)分泌和旁分泌器官，不僅影響體重穩(wěn)態(tài)而且還在炎癥中起重要作用，所述炎癥誘導(dǎo)氧化應(yīng)激(OS)，從而導(dǎo)致例如胰島素抵抗和糖尿病(艾奧佐(1zzo)2009,豪斯替斯(Houstis) 2006)。OS導(dǎo)致活性氧物質(zhì)(ROS)與抗氧化防御能力之間的失衡。ROS尤其涉及超氧陰離子自由基(.02_)、過(guò)氧化氫(H2O2)和羥基自由基(.0Η)。.0H可例如在過(guò)渡金屬存在下在芬頓(Fenton)反應(yīng)中形成。已知氧化應(yīng)激(OS)對(duì)大分子具有負(fù)面效應(yīng)；例如OH能夠?qū)-苯丙氨酸(Phe)轉(zhuǎn)化成天然氨基酸對(duì)-酪氨酸(對(duì)-Tyr)的異構(gòu)體間-酪氨酸(間-Tyr)和鄰-酪氨酸(鄰-Tyr)(哈金斯(Huggins) 1993)。此反應(yīng)不僅可以發(fā)生在蛋白多肽鏈內(nèi)的Phe殘基上，而且還可以發(fā)生于非蛋白結(jié)合氨基酸上(加拉諾(Galano)2008)。因?yàn)殚g-Tyr和鄰-Tyr是穩(wěn)定分子且認(rèn)為不存在于常態(tài)蛋白中，因此它們已充當(dāng).0H自由基應(yīng)激的有用標(biāo)記物(吉熱(Gurer)-奧爾罕(Orhan) 2006)。
[0003]OS相關(guān)疾病一般建議用如抗壞血酸、生育酚、類胡蘿卜素和多酚等直接抗氧化劑治療和/或預(yù)防(波柯米(Pokomy)2001)。通過(guò)給藥抗氧化物質(zhì)白藜蘆醇進(jìn)行治療性干預(yù)可降低胰島素抵抗(HOMAie)(伯拉斯楊(Brasnyo )2011)?；蛘呓o藥增加如谷胱甘肽等細(xì)胞內(nèi)抗氧化劑的水平的藥劑(US2009/0017002A1)。通常，這些努力基本上無(wú)效且多數(shù)臨床研究并未確認(rèn)先前假設(shè)。然而，我們工作組的先前數(shù)據(jù)顯示，白藜蘆醇能夠通過(guò)減少鄰-Tyr的尿排泄來(lái)改進(jìn)胰島素抵抗(伯拉斯楊2011)。
[0004]本發(fā)明人并不知道關(guān)于使用對(duì)-L-酪氨酸(在本文中還簡(jiǎn)化用作對(duì)-酪氨酸、對(duì)-Tyr或Tyr)、其衍生物、前體或相關(guān)化合物治療由OS所致或由OS誘導(dǎo)的疾病的任何現(xiàn)
有信息。
[0005]US2010/0172916A1提供關(guān)于間-或?qū)?酪氨酸和間或?qū)?酪胺的醫(yī)學(xué)用途的綜述。作為神經(jīng)遞質(zhì)前體的酪氨酸廣泛地用作飲食補(bǔ)充劑。
[0006]US7977319也教導(dǎo)了可尤其包含對(duì)-Tyr氨基酸的高纖維含量飲料。沒(méi)有對(duì)-Tyr本身作為活性劑會(huì)適合預(yù)防激素抵抗疾病的事實(shí)的跡象。
[0007]在W001/13935中，瘦素抵抗的治療建議通過(guò)尤其使用對(duì)_Tyr，通過(guò)增加跨血-腦屏障的瘦素轉(zhuǎn)運(yùn)并且由此治療肥胖來(lái)進(jìn)行。
[0008]US2008/0090832教導(dǎo)了通過(guò)向受試者給藥四氫生物喋呤來(lái)治療高苯丙氨酸血癥。提到對(duì)-Tyr僅作為氨基酸飲食補(bǔ)充劑且不作為活性劑。
[0009]萊茵斯坦(Reinstein)等(萊茵斯坦1985)提出在應(yīng)激激素水平降低的病況中使用飲食性酪氨酸。
[0010] 郝(Hao)等提出，酪氨酸可能為與在肥胖治療中和神經(jīng)性厭食的極端情形下體重減輕的維持相關(guān)的認(rèn)知和情緒問(wèn)題的潛在療法(郝2001)。就此而言，有人報(bào)道，酪氨酸可例
如通過(guò)影響參與食欲調(diào)節(jié)的腦區(qū)-下丘腦(弗斯特倫(Fernstrom)2001)來(lái)降低易感受試
者的食欲(莫勒(Mtoller) 1995)。
[0011]本發(fā)明人已意外地發(fā)現(xiàn)，雖然在氧化應(yīng)激條件下形成的間-Tyr和鄰-Tyr抑制PI3-K/Akt (磷脂酰-肌醇-3激酶/蛋白激酶B)途徑中的蛋白磷酸化，但對(duì)-Tyr可逆轉(zhuǎn)此過(guò)程。
[0012]本發(fā)明人也已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，對(duì)-Tyr可用于逆轉(zhuǎn)因以下原因所產(chǎn)生的激素抵抗:細(xì)胞中因OS而形成鄰-Tyr和/或間-Tyr并且這些氨基酸并入到所述激素的受體蛋白或各自的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的信號(hào)傳導(dǎo)蛋白中。在優(yōu)選實(shí)施例中，對(duì)-Tyr可用于逆轉(zhuǎn)胰島素抵抗和/或紅細(xì)胞生成素(EPO)抵抗和/或乙酰膽堿抵抗。
[0013]此外，本發(fā)明人已經(jīng)認(rèn)識(shí)到，對(duì)-Tyr可用于治療由氧化應(yīng)激介導(dǎo)或誘導(dǎo)的激素抵抗疾病，所述激素抵抗疾病選自以下疾病、病況或綜合征的組:肥胖、IGT (葡萄糖耐受不良)、代謝綜合征、2型糖尿病、高血壓、胰島素抵抗；脂肪組織/脂肪細(xì)胞中的氧化應(yīng)激、貧血、慢性貧血、缺血、血管疾病、慢性腎病(CKD)、慢性心臟衰竭(CHF)、腎的氧化應(yīng)激、阻塞性睡眠呼吸暫停(OSAS)(或與胰島素或紅細(xì)胞生成素或乙酰膽堿(信號(hào)傳導(dǎo))途徑有關(guān)的其它疾病)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0014]本發(fā)明涉及選自對(duì)-L-酪氨酸(對(duì)-Tyr)、對(duì)-Tyr前體、或其醫(yī)藥上可接受的鹽的化合物，所述化合物在受試者中供使用于預(yù)防、改善或治療由于氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的激素抵抗所致的病況(或激素抵抗疾病)，其中所述對(duì)-Tyr前體在所述受試者中代謝為對(duì)-Tyr。
[0015]在優(yōu)選實(shí)施例中，所述受試者顯示了或特征在于:氧化應(yīng)激狀態(tài)、優(yōu)選慢性氧化應(yīng)激狀態(tài)、優(yōu)選對(duì)苯丙氨酸(Phe)的羥基自由基損害。優(yōu)選地，至少一種氧化應(yīng)激標(biāo)記物在所述患者中增加、優(yōu)選在取自所述患者的生物樣品中增加。任選地，間-Tyr和鄰-Tyr的尿液水平可視為對(duì)Phe的羥基自由基損害的特定標(biāo)記物。此外，所述患者體液(其中所述體液為血清或血漿)中高的正常水平或增加水平的高敏感性C反應(yīng)蛋白(hsCRP)可視為氧化應(yīng)激的間接標(biāo)記物。
[0016]在優(yōu)選實(shí)施例中，所述激素抵抗是胰島素抵抗。
[0017]在優(yōu)選實(shí)施例中，所述激素抵抗是紅細(xì)胞生成素抵抗。
[0018]在又一優(yōu)選實(shí)施例中，所述激素抵抗是乙酰膽堿抵抗。
[0019]優(yōu)選地，所述病況選自肥胖、IGT (葡萄糖耐受不良)、代謝綜合征、2型糖尿病、高血壓、胰島素抵抗、紅細(xì)胞生成素抵抗、乙酰膽堿抵抗、脂肪組織/脂肪細(xì)胞中的氧化應(yīng)激、貧血、慢性貧血、缺血、血管疾病、慢性腎病(CKD)、慢性心臟衰竭(CHF)、腎的氧化應(yīng)激、阻塞性睡眠呼吸暫停(OSAS)或(由于胰島素或紅細(xì)胞生成素或乙酰膽堿(信號(hào)傳導(dǎo))途徑所致的)其它疾病)。
[0020]非常優(yōu)選地，所述病況選自高血壓、貧血、例如慢性貧血、血管疾病、慢性心臟衰竭(CHF)，甚至更優(yōu)選地，所述病況是高血壓或貧血，非常優(yōu)選地，所述病況是腎病，例如慢性腎病(CKD)或腎的氧化應(yīng)激。
[0021 ] 在優(yōu)選實(shí)施例中，通過(guò)鄰-Tyro和/或間-Tyr的形成且任選地通過(guò)將所述鄰-Tyr和/或間-Tyr并入到細(xì)胞蛋白中、優(yōu)選并入到抵抗與所述病況有關(guān)的激素的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)途徑的至少一種細(xì)胞蛋白中，激素抵抗由氧化應(yīng)激來(lái)誘導(dǎo)。
[0022]優(yōu)選地，激素抵抗不同于瘦素抵抗。在又一優(yōu)選實(shí)施例中，本發(fā)明范圍不包括由于跨血-腦屏障的瘦素轉(zhuǎn)運(yùn)受到抑制或阻斷所致的胰島素抵抗性病理。具體來(lái)說(shuō)，在優(yōu)選實(shí)施例中，不包括由于瘦素抵抗所致的、誘導(dǎo)的或介導(dǎo)的胰島素抵抗和/或2型糖尿病和/或肥胖。解決方案的范圍可通過(guò)測(cè)量所述患者血清中的瘦素水平來(lái)評(píng)估或限定。通常，瘦素抵抗患者具有升高的血清瘦素水平。
[0023]在又一優(yōu)選實(shí)施例中，本發(fā)明范圍不包括將對(duì)-Tyr用作氨基酸飲食補(bǔ)充劑且不用作活性劑的組合物和飲食方案。
[0024]優(yōu)選地，通過(guò)修飾抵抗與所述病況有關(guān)的激素的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)途徑的至少一種細(xì)胞蛋白的酪氨酸殘基由此抑制所述蛋白的酪氨酸磷酸化，激素抵抗由氧化應(yīng)激來(lái)誘導(dǎo)。
[0025]更優(yōu)選地，所述至少一種蛋白選自胰島素信號(hào)傳導(dǎo)途徑的葡萄糖攝取和/或血管舒張途徑的蛋白；和/或紅細(xì)胞生成素信號(hào)傳導(dǎo)途徑的神經(jīng)保護(hù)、磷脂酰肌醇神經(jīng)保護(hù)和/或紅細(xì)胞生成途徑的蛋白；和/或磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)/AKT途徑的蛋白。更優(yōu)選地，所述至少一種蛋白選自所述激素的受體的細(xì)胞內(nèi)部分、胰島素受體、IRS1、IRS2、H)3K、PDKUAKT 和 GLUT4。 [0026]在優(yōu)選實(shí)施例中，所述激素通過(guò)磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K) /AKT途徑起作用。
[0027]在又一實(shí)施例中，所述病況的預(yù)防、改善或治療包含根據(jù)所述受試者定制的(個(gè)性化)方案或給藥計(jì)劃的一部分，或由所述部分組成或?yàn)樗霾糠帧?br> [0028]在優(yōu)選實(shí)施例中，即將根據(jù)本發(fā)明進(jìn)行治療的患者是遭受氧化應(yīng)激的患者或處于氧化應(yīng)激狀態(tài)的患者。優(yōu)選地，氧化應(yīng)激是慢性氧化應(yīng)激。遭受氧化應(yīng)激、優(yōu)選慢性氧化應(yīng)激、優(yōu)選由于氧化應(yīng)激性疾病所致的患者已經(jīng)產(chǎn)生由于氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的激素抵抗所致的病況或病癥，或具有產(chǎn)生所述病況或病癥的風(fēng)險(xiǎn)。
[0029]因此，本發(fā)明優(yōu)選在要預(yù)防或改善、優(yōu)選預(yù)防由于氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的激素抵抗所致的病況或病癥時(shí)適用。
[0030]氧化應(yīng)激狀態(tài)可通過(guò)氧化應(yīng)激標(biāo)記物來(lái)顯示或診斷。
[0031 ] 在優(yōu)選實(shí)施例中，氧化應(yīng)激標(biāo)記物是患者尿液中升高水平或排泄(例如每日排泄)的間-Tyr或鄰-Tyr。又一氧化應(yīng)激標(biāo)記物是高的正常水平或升高水平的高敏感性C反應(yīng)蛋白(hsCRP)ο
[0032]因此，在又一實(shí)施例中，本發(fā)明涉及選自對(duì)-L-酪氨酸(對(duì)-Tyr)、對(duì)-Tyr前體、或其醫(yī)藥上可接受的鹽的化合物，其中所述對(duì)-Tyr前體在所述受試者中代謝為對(duì)-Tyr，所述化合物在受試者中用于預(yù)防或改善或優(yōu)選預(yù)防由于激素抵抗所致的病況，其中所述受試者遭受氧化應(yīng)激和/或由于羥基自由基(.0H)形成所致的氧化應(yīng)激或所述受試者罹患氧化應(yīng)激性疾病。優(yōu)選地，氧化應(yīng)激是慢性氧化應(yīng)激和/或氧化應(yīng)激性疾病是慢性氧化應(yīng)激性疾病。
[0033]在優(yōu)選實(shí)施例中，受試者患有亞臨床炎癥病況。具體來(lái)說(shuō)，所述受試者的特征在于高的正常水平或升高水平的高敏感性C反應(yīng)蛋白(hsCRP)。
[0034]在又一優(yōu)選實(shí)施例中，所述患者顯示尿液中升高水平或排泄(例如每日排泄)的間-Tyr或鄰-Tyr。[0035]優(yōu)選地,所述受試者是哺乳動(dòng)物，優(yōu)選人類。
[0036]在優(yōu)選實(shí)施例中，所述化合物選自
[0037]-對(duì)-L-酪氨酸和對(duì)-酪氨酸前體，優(yōu)選對(duì)-OH-苯基-丙酮酸鹽。
[0038]在某些實(shí)施例中，所述化合物選自
[0039]-酪氨酸酮基類似物
[0040]-和其乙酰基衍生物。
[0041]在優(yōu)選實(shí)施例中，所述化合物調(diào)配成醫(yī)藥組合物或藥劑，或所述化合物調(diào)配成具有健康聲明的飲食補(bǔ)充劑、營(yíng)養(yǎng)制品、功能性食物、食物或組合物。
[0042]本發(fā)明還涉及所述調(diào)配物，該調(diào)配物優(yōu)選選自具有健康聲明的醫(yī)藥組合物、飲食補(bǔ)充劑、營(yíng)養(yǎng)制品、功能性食物、食物或組合物。優(yōu)選地，所述調(diào)配物用于治療如上文所定義的病況。優(yōu)選地，所述調(diào)配物伴有本發(fā)明化合物的生物效應(yīng)和/或治療適應(yīng)癥和/或所提出治療(如本文所公開(kāi)的它們中的每一個(gè))的說(shuō)明。
[0043]所述調(diào)配物可經(jīng)調(diào)配用于口服用途或非經(jīng)腸用途。在一實(shí)施例中，所述調(diào)配物調(diào)配成醫(yī)藥組合物或藥劑且進(jìn)一步包含醫(yī)藥上可接受的載體或賦形劑。 [0044]在又一實(shí)施例中，所述調(diào)配物調(diào)配成具有健康聲明的飲食補(bǔ)充劑、食物補(bǔ)充劑、營(yíng)養(yǎng)制品、功能性食物、食物或組合物或它們中的一或多個(gè)。
[0045]在優(yōu)選實(shí)施例中，本發(fā)明的調(diào)配物包含適于提供至少一天的日攝入的至少一劑量或多劑量的化合物。
[0046]在實(shí)施例中，所述化合物的單劑量是至少100mg、200mg、300mg、400mg、500mg、600mg、700mg、800mg、900mg、Ig 和 / 或至多 10g、7.5g、5mg、3g、2.5g、2g、l.8g、l.6g、l.5g、1.4g、l.3g、l.2g、l.lg、lg、900mg、800mg、700mg、600mg、500mg,分別取決于最大或最小劑量。
[0047]本發(fā)明進(jìn)一步涉及預(yù)防、改善或治療與由氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的激素抵抗有關(guān)的病況的方法，包含給藥選自對(duì)-Tyr、對(duì)-Tyr前體、或其醫(yī)藥上可接受的鹽的化合物或醫(yī)藥有效劑量的所述化合物，其中所述對(duì)-Tyr前體在所述受試者中代謝為對(duì)-Tyr。
[0048]優(yōu)選地，所述病況是如上文所定義的病況。
[0049]優(yōu)選地，在本發(fā)明的方法中，所給藥的化合物是如上文所定義的化合物。
[0050]優(yōu)選地，患有要被預(yù)防、改善或治療的所述病況的受試者是哺乳動(dòng)物，優(yōu)選人類。
[0051]優(yōu)選地，所述病況的預(yù)防、改善或治療包含根據(jù)所述受試者定制的(個(gè)性化)方案或給藥計(jì)劃的一部分，或由所述部分組成或?yàn)樗霾糠帧?br> [0052]在優(yōu)選實(shí)施例中，向遭受氧化應(yīng)激和/或由于羥基自由基(.0H)形成所致的氧化應(yīng)激的受試者或患有氧化應(yīng)激性疾病的受試者給藥所述化合物。優(yōu)選地，氧化應(yīng)激是慢性氧化應(yīng)激和/或氧化應(yīng)激性疾病是慢性氧化應(yīng)激性疾病。在優(yōu)選實(shí)施例中，受試者患有亞臨床炎癥病況。具體來(lái)說(shuō)，所述受試者的特征在于高的正常水平或升高水平的高敏感性C反應(yīng)蛋白(hsCRP)。在又一優(yōu)選實(shí)施例中，所述患者顯示尿液中升高水平或排泄(例如每日排泄)的間-Tyr或鄰-Tyr。
[0053]在優(yōu)選實(shí)施例中，所述化合物的日攝入是每天一次、兩次或三次如下劑量:至少100mg、200mg、300mg、400mg、500mg、600mg、700mg、800mg、900mg、Ig 和 / 或至多 10g、7.5g、5mg、3g、2.5g、2g、l.8g、l.6g、l.5g、l.4g、l.3g、l.2g、l.lg、lg、900mg、800mg、700mg、600mg、500mgo如果適當(dāng),對(duì)于至多30000mg的單日攝入,可施加更大單劑量,條件為其可以調(diào)配為仍可經(jīng)口給藥(例如吞咽)或給藥進(jìn)入的單劑量單位。優(yōu)選地，本發(fā)明的調(diào)配物以適于給藥提供日攝入的劑量的形式進(jìn)行調(diào)配。
[0054]在又一優(yōu)選實(shí)施例中，在設(shè)定對(duì)-Tyr劑量方案的期間或在治療期間監(jiān)測(cè)對(duì)-Tyr和鄰-Tyr和間-Tyr的血清水平。
[0055]在優(yōu)選實(shí)施例中，監(jiān)測(cè)包括測(cè)量血清和尿液對(duì)-Tyr和鄰-Tyr和/或間-Tyr水平以及優(yōu)選血清葡萄糖和胰島素水平。在某一實(shí)施例中，還監(jiān)測(cè)脂肪細(xì)胞和/或脂肪組織對(duì)對(duì)-Tyr和/或激素的攝取。
[0056]在由于氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的激素抵抗所致的病況或疾病的治療的優(yōu)選實(shí)施例中
[0057]-向特征在于或易患由于氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的激素抵抗所致的病況或病癥的受試者給藥對(duì)-Tyr或?qū)?Tyr前體，
[0058]-評(píng)估所述患者中的氧化應(yīng)激水平，
[0059]-其中如果氧化應(yīng)激水平高于預(yù)定值,則增加患者所被給藥的對(duì)-Tyr或?qū)?Tyr前體的日劑量。
[0060]優(yōu)選地,給藥是在連續(xù)治療中實(shí)施的或持續(xù)至少7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天或15天，更優(yōu)選持續(xù)至少一個(gè)月、至少2個(gè)月、至少3個(gè)月、至少4個(gè)月或至少持續(xù)半年或至少I(mǎi)年或至少2年或至少3年或至少5年或至少10年或終生。
[0061]所述化合物優(yōu)選如上文所定義的進(jìn)行調(diào)配。
[0062]本發(fā)明還涉及根據(jù)本發(fā)明的化合物用于制備用于預(yù)防、改善或治療如本文所定義的病況的如本文所定義的調(diào)配物的用途。
[0063]定義
[0064]對(duì)-酪氨酸前體是在包括人類在內(nèi)的動(dòng)物活體內(nèi)轉(zhuǎn)化成對(duì)-L-酪氨酸的分子。優(yōu)選地，對(duì)-L-酪氨酸前體在所述動(dòng)物的活體內(nèi)合成。非常優(yōu)選地，根據(jù)本發(fā)明，對(duì)-酪氨酸前體是對(duì)-Tyr的酮基類似物一對(duì)-OH-苯基-丙酮酸鹽。
[0065]細(xì)胞蛋白是當(dāng)由細(xì)胞表達(dá)時(shí)位于所述細(xì)胞內(nèi)或所述細(xì)胞的膜的細(xì)胞側(cè)、優(yōu)選在所述細(xì)胞內(nèi)的蛋白。
[0066]信號(hào)傳導(dǎo)途徑或信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑或簡(jiǎn)稱為途徑，如果上下文允許，則在本文中可互換使用且涉及一系列的生物化學(xué)變化和或事件，包括細(xì)胞內(nèi)的生物化學(xué)變化和/或事件，其中生物化學(xué)物質(zhì)(例如生物分子)影響、催化或?qū)崿F(xiàn)所述變化或事件且其中細(xì)胞膜受體接收信號(hào)(優(yōu)選激素)并將此信息傳遞到所述細(xì)胞中且優(yōu)選實(shí)現(xiàn)細(xì)胞反應(yīng)，或涉及此過(guò)程的一部分，優(yōu)選包含至少兩個(gè)優(yōu)選涉及至少兩種酶的生物化學(xué)變化事件或反應(yīng)。
[0067]開(kāi)啟生物化學(xué)變化的受體可直接通過(guò)受體內(nèi)的固有的酶促活性或通過(guò)活化細(xì)胞內(nèi)信使分子來(lái)達(dá)成此目的。
[0068]激素是身體內(nèi)產(chǎn)生的控制和調(diào)節(jié)某些細(xì)胞或器官的活性的化學(xué)物質(zhì)。因此，此術(shù)語(yǔ)在本文中被寬泛地理解，包括身體內(nèi)例如從器官到細(xì)胞攜帶信息的小化學(xué)分子，因此包括例如乙酰膽堿。在又一優(yōu)選實(shí)施例中，激素是肽激素，例如胰島素或紅細(xì)胞生成素。優(yōu)選地，激素不同于瘦素。
[0069]由于激素抵抗所致的病況或疾病(或激素抵抗疾病)在本文中應(yīng)理解為患者的狀態(tài)，其中所述患者內(nèi)的激素抵抗促成所述狀態(tài)。所述狀態(tài)不同于健康狀態(tài)，例如其特征在于超出作為健康受試者的正常或典型的接受范圍的可測(cè)量參數(shù)。任選地，所述狀態(tài)是疾病，例如由于所述患者內(nèi)形成的激素抵抗所致的疾病。
[0070]術(shù)語(yǔ)由氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的激素抵抗(或由氧化應(yīng)激介導(dǎo)的激素抵抗疾病)涉及氧化應(yīng)激可檢測(cè)地存在于患者體內(nèi)這一病況。如果氧化應(yīng)激通過(guò)升高水平的如本文所定義的氧化應(yīng)激標(biāo)記物來(lái)顯示，則其呈現(xiàn)增加風(fēng)險(xiǎn)的激素抵抗，優(yōu)選胰島素抵抗和/或紅細(xì)胞生成素抵抗和/或乙酰膽堿抵抗。因此，氧化應(yīng)激的狀態(tài)、優(yōu)選慢性氧化應(yīng)激的狀態(tài)界定一組將根據(jù)本發(fā)明來(lái)治療的受試者。由此，可預(yù)防或改善由于氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的激素抵抗所致的病況或疾病或氧化應(yīng)激性疾病。實(shí)際上，術(shù)語(yǔ)由氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的激素抵抗或氧化應(yīng)激性疾病應(yīng)理解為，在給定受試者或患者內(nèi)存在激素抵抗與氧化應(yīng)激之間的共存或相關(guān)。
[0071]氧化應(yīng)激(OS)是受試者的一種狀態(tài)，該狀態(tài)特征在于活性氧物質(zhì)(ROS)與抗氧化防御能力之間的失衡或在于即增加水平的R0S、特別是超氧陰離子自由基(.02_)、過(guò)氧化氫(H2O2)和羥基自由基(.0H)，在非常優(yōu)選的實(shí)施例中為.0H。氧化應(yīng)激如果持續(xù)存在，則為慢性氧化應(yīng)激。慢性氧化應(yīng)激在本文中應(yīng)理解為受試者內(nèi)存在時(shí)間長(zhǎng)于急性氧化應(yīng)激的氧化應(yīng)激，即持續(xù)通常至少5天或至少10天或至少15天或持續(xù)I周或持續(xù)至少2周或持續(xù)至少3周或優(yōu)選地，持續(xù)至少4周或持續(xù)至少I(mǎi)個(gè)月或至少2個(gè)月或至少3個(gè)月或持續(xù)至少半年或至少I(mǎi)年。
[0072]氧化應(yīng)激性疾病或慢性氧化應(yīng)激性疾病是受試者的一種病況，該病況的特征在于慢性氧化應(yīng)激，其中在所述受試者中，可顯示、評(píng)估、測(cè)量或診斷慢性氧化應(yīng)激的任何有害效應(yīng)或病狀，例如激素抵抗、優(yōu)選胰島素抵抗和/或EPO抵抗和/或乙酰膽堿抵抗的發(fā)生。評(píng)估氧化應(yīng)激的方法在本文中被公開(kāi)并且也被所屬領(lǐng)域內(nèi)已知。
[0073]受試者是人類或動(dòng)物?；颊呤墙邮茚t(yī)療護(hù)理、照顧或治療的受試者。
[0074]如本文所理解，預(yù)防涉及治療受試者，包含給藥本發(fā)明化合物，目的在于預(yù)防所述受試者中激素抵抗的發(fā)展或預(yù)防激素抵抗疾病的發(fā)作或預(yù)防激素抵抗疾病癥狀的惡化。優(yōu)選地，預(yù)防是治療遭受、特征在于、或具有氧化應(yīng)激狀態(tài)、優(yōu)選慢性氧化應(yīng)激狀態(tài)的受試者，從而預(yù)防所述受試者中激素抵抗的發(fā)展或預(yù)防激素抵抗疾病的發(fā)作。部分預(yù)防優(yōu)選包括在此術(shù)語(yǔ)的含義內(nèi)。
[0075]生物化學(xué)過(guò)程包含在活有機(jī)體內(nèi)的一或多個(gè)功能相關(guān)的生物變化和/或事件，所述生物變化和/或事件在所述有機(jī)體內(nèi)具有效應(yīng)，所述效應(yīng)優(yōu)選為可檢測(cè)的，其中生物化學(xué)物質(zhì)(例如生物分子)影響、催化或?qū)崿F(xiàn)所述變化或事件。
[0076]生物化學(xué)過(guò)程的抑制意指導(dǎo)致所述生物過(guò)程的生物效應(yīng)與無(wú)抑制的同一過(guò)程相比降低的過(guò)程。所述生物效應(yīng)的降低可導(dǎo)致所述效應(yīng)的消除，可導(dǎo)致所述效應(yīng)降低到不可檢測(cè)的水平或所述效應(yīng)降低到低于無(wú)抑制時(shí)測(cè)量的水平。
[0077]抑制劑是與所述生物化學(xué)物質(zhì)(例如生物分子)接觸時(shí)導(dǎo)致抑制的物質(zhì)、優(yōu)選化合物。
[0078]非標(biāo)準(zhǔn)縮寫(xiě)和首字母縮寫(xiě)
[0079]ACh乙酰膽堿
[0080]ERK細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶
[0081]HPLC高效液相色譜
[0082] 間-Tyr間-L-酪氨酸[0083]NO一氧化氮
[0084]鄰-Tyr鄰-L-酪氨酸
[0085].0H羥基自由基
[0086]對(duì)-Tyr對(duì)-L-酪氨酸
[0087]PheL-苯丙氨酸
[0088]PI3K/Akt磷脂酰肌醇3-激酶/Akt
[0089]Px過(guò)氧化物酶
[0090]ROS活性氧物質(zhì)
【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0091]圖1.氧化應(yīng)激、間-和鄰-酪氨酸產(chǎn)生、亞臨床炎癥與隨之發(fā)生的激素抵抗之間的關(guān)系的示意性圖示。通過(guò)前饋(或正反饋)機(jī)制的持久且未治療的氧化應(yīng)激開(kāi)啟惡性循環(huán)，從而導(dǎo)致激素抵抗和氧化應(yīng)激性疾病。
[0092]圖2.3T3-L1脂肪細(xì)胞對(duì)脫氧_D_葡萄糖2_[12_3H(N)]的胰島素依賴性攝取。在含有以下物質(zhì)的培養(yǎng)基中測(cè)量葡萄糖的攝取:i)對(duì)-酪氨酸與5mM葡萄糖含量、ii)間-酪氨酸與5 mM葡萄糖，iii)鄰-酪氨酸與5 mM葡萄糖和iv)對(duì)-酪氨酸與25mM葡萄糖含量。如所示用2nM、 20nM、200nM和400nM胰島素處理細(xì)胞。將對(duì)-酪氨酸和5mM葡萄糖的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的未處理細(xì)胞的葡萄糖攝取設(shè)定為100%。結(jié)果為n=5的個(gè)體測(cè)量，結(jié)果為平均值土SEM。在所有胰島素濃度下(獨(dú)立樣品t-檢驗(yàn))，*，p〈0.05，對(duì)-Tyr+5mM葡萄糖相對(duì)于(vs.)間-Tyr+5mM葡萄糖、鄰_Tyr+5mM葡萄糖和對(duì)_Tyr+25mM葡萄糖，。
[0093]圖3.在補(bǔ)充有不同濃度(7211^/1、3611^/1、1811^/1、911^/1、4.511^/1、2.2511^/1)的對(duì)酪氨酸(72mg/l)或間(子圖(panel) A)或鄰(子圖B)酪氨酸的培養(yǎng)基中，3T3-L1脂肪細(xì)胞對(duì)脫氧-D-葡萄糖2-[12-3H (N)]的胰島素依賴性(400nmol/l)攝取(實(shí)心圖)?？招臈l指示在對(duì)-酪氨酸培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的未經(jīng)胰島素處理的(對(duì)照組)細(xì)胞的攝取。結(jié)果是n=2的個(gè)體測(cè)量的代表。
[0094]圖4.在不同時(shí)間段，在補(bǔ)充有對(duì)酪氨酸(72mg/l)或間(72mg/l)(子圖A)或鄰(72mg/l)(子圖B)酪氨酸的培養(yǎng)基中，3T3-L1脂肪細(xì)胞對(duì)脫氧-D-葡萄糖2-[12-3H (N)]的胰島素依賴性(400nM)攝取(實(shí)心條?？招臈l指示未經(jīng)胰島素處理的(對(duì)照組)細(xì)胞的攝取，將其設(shè)定為100%。結(jié)果是n=2的個(gè)體測(cè)量的代表。
[0095]圖5.在200nmol/l和400nmol/l胰島素處理下，在含有對(duì)_、鄰-或間-酪氨酸的培養(yǎng)基中，在含有5mM或25mM葡萄糖的培養(yǎng)物中生長(zhǎng)的3T3-L1脂肪細(xì)胞中胰島素誘導(dǎo)的Akt [蛋白激酶B]的磷酸化。結(jié)果是n=5的個(gè)體測(cè)量的平均值土 SEM。*, p<0.05，對(duì)-Tyr和5mM葡萄糖相對(duì)于所有其它處理組(獨(dú)立樣品t-檢驗(yàn))。
[0096]圖6.3T3-L1脂肪細(xì)胞在與上述酪氨酸一起時(shí)間依賴性孵育后，對(duì)對(duì)_、鄰-和間-酪氨酸的急性攝取的HPLC測(cè)量，所述細(xì)胞用或不用胰島素(400nM)處理。注意，對(duì)-Tyr是以μ M測(cè)量(子圖A)，而鄰-Tyr (子圖B)和間-Tyr (子圖C)是以ηΜ測(cè)量。
[0097]圖7.含有對(duì)-酪氨酸(子圖Α)、鄰-酪氨酸(子圖B)或間-酪氨酸(子圖C)的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的細(xì)胞裂解物中的蛋白結(jié)合酪氨酸異構(gòu)體的HPLC測(cè)量。*:ρ〈0.05 (獨(dú)立樣品t-檢驗(yàn))。結(jié)果是n=10的個(gè)體測(cè)量的平均值土SEM。將氨基酸的量校正為蛋白總酪氨酸含量。
[0098]圖8.A)斯普拉格-杜勒大鼠(Sprague-Dawley rat)中的酪氨酸異構(gòu)體補(bǔ)充的實(shí)驗(yàn)研究方案。開(kāi)始時(shí)，向禁食雄性大鼠(5-6周齡)經(jīng)口供應(yīng)溶解于鹽水的對(duì)-酪氨酸(對(duì)-Tyr)或鄰-酪氨酸(鄰-Tyr)或媒劑(僅鹽水)，持續(xù)4周(也參見(jiàn)方法部分)。在4周補(bǔ)充結(jié)束時(shí)，處死大鼠以供HPLC和血管舒縮研究，或通過(guò)停止酪氨酸異構(gòu)體補(bǔ)充使大鼠經(jīng)受4周長(zhǎng)的‘清除期’且在第8周結(jié)束時(shí)處死以供HPLC和血管舒縮研究。B)大鼠酪氨酸異構(gòu)體補(bǔ)充對(duì)經(jīng)分離的連續(xù)動(dòng)脈區(qū)段的血管鄰-Tyr水平的效應(yīng)(第4周)。與媒劑治療的大鼠(對(duì)照組)相比，大鼠的持續(xù)經(jīng)口鄰-Tyr補(bǔ)充(鄰-Tyr)顯著增加所有三個(gè)動(dòng)脈區(qū)段(即胸部和腹部主動(dòng)脈和股部動(dòng)脈)中的鄰-Tyr含量,而對(duì)-Tyr補(bǔ)充(對(duì)-Tyr)不改變鄰-Tyr水平。[對(duì)照組:胸部:n=4 ;腹部:n=4 ;股部:n=4 Jf-Tyr:胸部:n=4 ;腹部:n=4 ;股部:n=4 ;鄰-Tyr:胸部:n=4 ;腹部:n=4 ;股部:n=4]。血管鄰-Tyr水平與苯丙氨酸(Phe)水平相關(guān)。C)大鼠酪氨酸異構(gòu)體補(bǔ)充對(duì)經(jīng)分離的連續(xù)動(dòng)脈區(qū)段的胰島素誘導(dǎo)舒張的效應(yīng)(第4周)。與對(duì)-Tyr-治療組(對(duì)-Tyr)相比，向大鼠補(bǔ)充鄰-Tyr (鄰-Tyr)顯著地減弱所有三個(gè)經(jīng)分離的區(qū)段的胰島素誘導(dǎo)舒張，并且與媒劑治療的大鼠(對(duì)照組)相比，也顯著地減弱腹部主動(dòng)脈和股部動(dòng)脈中的胰島素誘導(dǎo)的舒張，這由更接近于O的降低的胰島素logEC50值所指示。[對(duì)照組:胸部:n=4 ;腹部:n=4 ;股部:n=4 ;對(duì)-Tyr:胸部:n=4 ;腹部:n=4 ;股部:n=4 ;鄰-Tyr:胸部:n=4 ;腹部:n=4 ;股部:n=4]。數(shù)據(jù)是平均值 +SEM0 *Ρ〈0.05 ；NS Ρ>0.05 ;子圖 B: (ANOVA)；子圖C:#Ρ<0.05相對(duì)于對(duì)(額外平方和F檢驗(yàn)) [0099]圖9.在各自的氨基酸的急性(30分鐘)并入下，不同酪氨酸亞型很少并入到小鼠內(nèi)皮瘤細(xì)胞的細(xì)胞蛋白中，對(duì)于所有比較，Ρ>0.05 (ANOVA)0數(shù)據(jù)以平均值土SEM表示
[0100]圖10.在與各自的氨基酸一起7天后，不同酪氨酸亞型并入到小鼠內(nèi)皮瘤細(xì)胞的細(xì)胞蛋白中。*:p〈0.05 (ANOVA)0數(shù)據(jù)以平均值土SEM表示
[0101]圖11.第4周(子圖Α)、第8周(4周清除后，子圖B)和急性實(shí)驗(yàn)中(子圖C)，以對(duì)-Tyr/間-Tyr/鄰-Tyr喂養(yǎng)的斯普拉格-杜勒大鼠的胸部主動(dòng)脈中的胰島素依賴性血管舒張。*:ρ〈0.05
[0102]圖12.第4周(子圖Α)、第8周(4周清除后，子圖B)和急性實(shí)驗(yàn)中(子圖C)，以對(duì)-Tyr/間-Tyr/鄰-Tyr喂養(yǎng)的斯普拉格-杜勒大鼠的腹主動(dòng)脈中的胰島素依賴性血管舒張。*:ρ<0.05
[0103]圖13.第4周(子圖Α)、第8周(4周清除后，子圖B)和急性實(shí)驗(yàn)中(子圖C)，以對(duì)-Tyr/間-Tyr/鄰-Tyr的喂養(yǎng)斯普拉格-杜勒大鼠的腎動(dòng)脈中的胰島素依賴性血管舒張。*:ρ<0.05
[0104]圖14.第4周(子圖Α)、第8周(4周清除后，子圖B)和急性實(shí)驗(yàn)中(子圖C)，以對(duì)-Tyr/間-Tyr/鄰-Tyr的喂養(yǎng)斯普拉格-杜勒大鼠的股部動(dòng)脈中的胰島素依賴性血管舒張。*:ρ<0.05
[0105]圖15.第4周喂養(yǎng)時(shí)，以對(duì)-Tyr/間-Tyr/鄰-Tyr喂養(yǎng)的斯普拉格-杜勒大鼠的不同血管區(qū)段中表示為胰島素劑量的-log EC50的胰島素依賴性血管舒張。與媒劑-治療的大鼠(對(duì)照組)相比，向大鼠補(bǔ)充對(duì)-Tyr (對(duì)-Tyr)僅在胸部主動(dòng)脈中，而不在任何其它經(jīng)分離的動(dòng)脈區(qū)段(即腹部主動(dòng)脈和股部動(dòng)脈)中增加胰島素誘導(dǎo)的舒張。*:P<0.05
[0106]圖16.表示為斯普拉格-杜勒大鼠的不同血管區(qū)段中的胰島素劑量的logEC50的乙酰膽堿(Ach)誘導(dǎo)的血管舒張。在所述實(shí)驗(yàn)中，僅給與Ach (黑色條)或給與Ach +超氧化物歧化酶(SOD)和過(guò)氧化氫酶(CAT)。*:p<0.05
[0107]圖17.3T3-L1脂肪細(xì)胞對(duì)脫氧_D_葡萄糖2_[12_3H (N)]的紅細(xì)胞生成素依賴性攝取。在含有以下物質(zhì)的培養(yǎng)基中測(cè)量葡萄糖攝取:i )對(duì)-酪氨酸與5mM葡萄糖含量或ii )鄰-酪氨酸與5mM。用不同濃度的紅細(xì)胞生成素處理細(xì)胞(如所指示的)。將對(duì)-酪氨酸和5mM葡萄糖的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的未處理細(xì)胞的葡萄糖攝取設(shè)定為100%。結(jié)果是n=3的個(gè)體測(cè)量的平均值。
[0108]圖18.3T3-L1脂肪細(xì)胞中Akt (PKB)的紅細(xì)胞生成素依賴性磷酸化。在含有以下物質(zhì)的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的細(xì)胞中實(shí)施實(shí)驗(yàn):i)對(duì)-酪氨酸與25mM葡萄糖含量，ii)間-酪氨酸與25mM葡萄糖，iii)鄰-酪氨酸與25mM葡萄糖。用不同濃度的紅細(xì)胞生成素處理細(xì)胞(如所指示的)。將對(duì)-酪氨酸和25mM葡萄糖的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的未處理細(xì)胞的磷酸化率設(shè)定為100%。結(jié)果為n=3的個(gè)體測(cè)量的平均值土SEM。*，p〈0.05 (獨(dú)立樣品t_檢驗(yàn))。
[0109]圖19.實(shí)驗(yàn)中使用的斯普拉格-杜勒大鼠的連續(xù)動(dòng)脈區(qū)段的示意圖。使用胸部(a)和腹部主動(dòng)脈(c)和股部動(dòng)脈(e)的近端區(qū)段利用HPLC分析來(lái)測(cè)定鄰-Tyr含量。使用相同胸部主動(dòng)脈(b)、腹部主動(dòng)脈(d)和股部動(dòng)脈(f)區(qū)段的遠(yuǎn)端部分來(lái)評(píng)估血管舒縮功能。
【具體實(shí)施方式】
[0110]活性氧物質(zhì)(ROS)源性損害可通過(guò)檢測(cè)脂肪酸、核酸或氨基酸的穩(wěn)定衍生物來(lái)研究。由于羥基自由基的攻擊，因此可形成酪氨酸的兩種特定亞型，即間-Tyr和鄰-Tyr。這些氨基酸并非產(chǎn)生自Phe的酶促羥基化；在后一反應(yīng)中，僅形成對(duì)-Tyr。因此，間-Tyr和鄰-Tyr可視為對(duì)Phe的羥基自由基損害的特定標(biāo)記物。
[0111]這些氧化的氨基酸可在適當(dāng)位置在翻譯后通過(guò)蛋白鏈的Phe殘基的氧化產(chǎn)生，然而，也有證明表明，游離間-和鄰-Tyr可被攝入并且并入到中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞(吉熱-奧爾罕2006)、小鼠巨噬細(xì)胞(羅杰斯(Rodgers) 2002)的蛋白中并且可改變蛋白轉(zhuǎn)換和細(xì)胞功倉(cāng)泛。
[0112]本發(fā)明人已執(zhí)行模型實(shí)驗(yàn)來(lái)獲得富集間-Tyr和鄰-Tyr的蛋白以模擬高氧化應(yīng)激狀態(tài)的效應(yīng)，其中或者Phe側(cè)鏈可在適當(dāng)位置被氧化而生成蛋白間-和鄰-Tyr側(cè)鏈，或者ROS源性游離間-和鄰-Tyr可并入到蛋白中。當(dāng)細(xì)胞在含有間-或鄰-Tyr的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)10天時(shí)，兩種非生理性氨基酸異構(gòu)體被并入到所述蛋白中。蛋白Phe含量沒(méi)有顯著變化(數(shù)據(jù)未顯示)。
[0113]3T3-L1細(xì)胞可分化成脂肪細(xì)胞，并且用作對(duì)脂肪組織的活體外效應(yīng)的模型(湯姆森(Thomson) 1997)。由于脂肪組織是胰島素抵抗的主要部位，因此本發(fā)明人研究了胰島素對(duì)3T3-L1細(xì)胞的效應(yīng)。本發(fā)明人在實(shí)驗(yàn)中使用了不同濃度的氨基酸異構(gòu)體，即，對(duì)-Tyr:間-Tyr的比率或?qū)?Tyr:鄰-Tyr的比率在1:32到1:1間變化。本發(fā)明人已發(fā)現(xiàn),在等摩爾濃度(72:72mg/l)下，間-Tyr和鄰-Tyr 二者均完全抑制胰島素誘導(dǎo)的葡萄糖攝取。對(duì)-Tyr需要以比間-Tyr或鄰-Tyr高約8_32倍的濃度存于培養(yǎng)基中，以便能夠與間_或鄰-Tyr的效應(yīng)競(jìng)爭(zhēng)。這些數(shù)據(jù)表明氨基酸之間的競(jìng)爭(zhēng)。
[0114]間-或鄰-Tyr并入到所述蛋白中誘導(dǎo)患者氧化應(yīng)激的持久效應(yīng)。因此，這意味著，如果患者的細(xì)胞遭受慢性氧化應(yīng)激，則所述細(xì)胞“記住”氧化狀態(tài)。這主要發(fā)生于導(dǎo)致激素抵抗的慢性氧化應(yīng)激中，如本文所公開(kāi)。
[0115]因此，即將根據(jù)本發(fā)明治療的典型患者是遭受氧化應(yīng)激的患者，所述氧化應(yīng)激遭受時(shí)間足以形成此“氧化應(yīng)激記憶”且因此形成激素抵抗。因此，這些遭受氧化應(yīng)激的患者即使不存在激素抵抗疾病的癥狀，激素抵抗的風(fēng)險(xiǎn)增加。在這些患者中，根據(jù)本發(fā)明的治療可用作由于氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的激素抵抗所致的病況或病癥的預(yù)防。
[0116]在激素抵抗的早期癥狀的情況下，可改善由于氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的激素抵抗所致的病況或病癥。然而，應(yīng)理解，即使患者中已產(chǎn)生根據(jù)本發(fā)明的激素抵抗，給藥根據(jù)本發(fā)明使用的化合物仍可提供對(duì)疾病惡化的預(yù)防，即可預(yù)防或減輕所述激素抵抗疾病的下游結(jié)果。
[0117]因此，根據(jù)本發(fā)明，通過(guò)給藥根據(jù)本發(fā)明的化合物來(lái)預(yù)防、改善或治療、優(yōu)選預(yù)防慢性氧化應(yīng)激性疾病或由此誘導(dǎo)的病況、癥狀、綜合征或疾病。優(yōu)選地，慢性氧化應(yīng)激(疾病)是由升高水平的OH自由基誘導(dǎo)。
[0118]氧化應(yīng)激的狀態(tài)可通過(guò)氧化應(yīng)激標(biāo)記物來(lái)顯示或診斷。所述方法為所屬領(lǐng)域內(nèi)已知。例如，間-Tyr和鄰-Tyr可視為對(duì)Phe的羥基自由基損害的特定標(biāo)記物。已發(fā)現(xiàn)，在患有2型糖尿病且伴有或不伴有慢性腎病的患者中，鄰-Tyr的腎排泄增加(莫爾納(Molndr)2005a)。此外，間-Tyr和鄰-Tyr在糖尿病患者的白內(nèi)障晶狀體的不溶性蛋白內(nèi)積累(莫爾納2005b)。因此，間-Tyr和鄰-Tyr可用作羥基自由基誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激的標(biāo)記物且可能用作胰島素抵抗的標(biāo)記物。
[0119]氧化應(yīng)激的又一優(yōu)選間接標(biāo)記物是高的正常水平或升高水平的高敏感性C反應(yīng)蛋白(hsCRP)。氧化應(yīng)激的其它標(biāo)記物于下文中提到。
[0120]下文將通過(guò)這些實(shí)例并且通過(guò)描述潛在的科學(xué)背景和結(jié)果來(lái)更詳細(xì)地解釋本發(fā)明。
[0121]不同細(xì)胞組分的氧化損害在不同疾病的發(fā)病機(jī)理中起核心作用。
[0122]因此，根據(jù)本發(fā)明，在受試者中使用對(duì)-L-酪氨酸(對(duì)-Tyr)、對(duì)-Tyr前體、或其醫(yī)藥上可接受的鹽來(lái)預(yù)防、改善或治療由于由氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的或特征在于氧化應(yīng)激的激素抵抗所致的病況或激素抵抗疾病。
[0123]優(yōu)選地，在受試者中使用對(duì)-L-酪氨酸(對(duì)-Tyr)、對(duì)-Tyr前體、或其醫(yī)藥上可接受的鹽來(lái)預(yù)防、改善或治療紅細(xì)胞生成素抵抗或紅細(xì)胞生成素抵抗疾病。
[0124]優(yōu)選地，根據(jù)本發(fā)明，在受試者中使用對(duì)-L-酪氨酸(對(duì)-Tyr)、對(duì)-Tyr前體、或其醫(yī)藥上可接受的鹽來(lái)預(yù)防、改善或治療胰島素抵抗或胰島素抵抗疾病。
[0125]優(yōu)選地，根據(jù)本發(fā)明，在受試者中使用對(duì)-L-酪氨酸(對(duì)-Tyr)、對(duì)-Tyr前體、或其醫(yī)藥上可接受的鹽來(lái)預(yù)防、改善或治療乙酰膽堿抵抗或乙酰膽堿抵抗疾病。
[0126]在很多情況下，氧化應(yīng)激是胰島素抵抗的潛在原因之一。在糖尿病相關(guān)代謝改變、炎癥和氧化應(yīng)激之間存在復(fù)雜的相互關(guān)系。高血糖癥本身可通過(guò)多種途徑導(dǎo)致氧化應(yīng)激增加。在其內(nèi)部發(fā)生ROS、AGE形成、炎癥、RAGE等之間的此復(fù)雜相互作用的一種組織是脂肪組織。用于研究胰島素途徑和肥胖的脂肪細(xì)胞的活體外模型是3T3-L1細(xì)胞系，即小鼠胚胎成纖維細(xì)胞向脂肪轉(zhuǎn)化的細(xì)胞系(湯姆森1997)。
[0127]胰島素是在正常條件下增加脂肪中的葡萄糖攝取并因此充當(dāng)血糖濃度主要調(diào)節(jié)劑的激素。
[0128]胰島素抵抗是胰島素不能確保葡萄糖被周圍組織、尤其是脂肪細(xì)胞中有效利用的病況。前人已對(duì)發(fā)病機(jī)理進(jìn)行深入研究，但尚未完全理解。有人提出若干途徑起決定性作用(德弗羅佐(DeFronzo) 2010)。在胰島素抵抗的發(fā)病機(jī)理中實(shí)現(xiàn)的一個(gè)可能因素是肥胖和積累內(nèi)臟脂肪組織。
[0129]伴有胰島素抵抗的綜合征是2型糖尿病。此外，以下事實(shí)強(qiáng)調(diào)了胰島素抵抗的重要性:可將它視為代謝綜合征的可能的潛在原因(萊伊文(Reaven) 1988，巴爾考(Balkau)1999，阿爾貝蒂(Alberti) 1998)。
[0130]已有人提出，在所謂的突破(break-through)期間血糖正常的時(shí)期可能具有長(zhǎng)期(約6-12個(gè)月)效應(yīng)，并且這些患者中的一些人可以維持良好的血糖控制而無(wú)需口服抗糖尿病劑，或其可延遲對(duì)胰島素的需要。一些數(shù)據(jù)也表明，此方法在胰島素抵抗較小的患者中更有效(瑞恩(Ryan) 2004，吉R町(Yoshioka) 2004)。此現(xiàn)象的背景還沒(méi)有被闡明，一些數(shù)據(jù)表明β -細(xì)胞功能的長(zhǎng)期改進(jìn)，而一些數(shù)據(jù)表明改進(jìn)的胰島素抵抗，一些數(shù)據(jù)表明短暫血糖正常后二者都存在。
[0131]已知胰島素結(jié)合到胰島素受體觸發(fā)受體的自磷酸化，從而開(kāi)啟具有許多酪氨酸磷酸化關(guān)鍵點(diǎn)的復(fù)雜信號(hào)傳導(dǎo)級(jí)聯(lián)(常(Chang)2010)。通過(guò)磷脂酰肌醇3-激酶(PI3_K)/Akt(蛋白激酶B)途徑，胰島素誘導(dǎo)代謝效應(yīng)(葡萄糖載體4-GLUT4-輸送到細(xì)胞膜)和血管舒張(NO產(chǎn)生)，且具有固有的抗炎效應(yīng)(阿沃加羅(Avogaro) 2008)。
[0132]然而，胰島素可通過(guò)又一途徑施加其作用:涉及能夠促進(jìn)細(xì)胞增殖的MAP激酶級(jí)聯(lián)。第一途徑的選擇性損害導(dǎo)致胰島素的代謝和血管舒張效應(yīng)降低。同時(shí)，胰島素效應(yīng)轉(zhuǎn)向第二途徑(即轉(zhuǎn)向細(xì)胞增殖)，這部分地解釋了糖尿病和胰島素抵抗中觀察到的較高惡性腫瘤率(阿沃加羅2008)。因此，改善經(jīng)由PI3激酶-Akt (PKB)途徑的胰島素效應(yīng)的干預(yù)會(huì)產(chǎn)生逆轉(zhuǎn)效應(yīng)，即胰島素效應(yīng)會(huì)從細(xì)胞增殖轉(zhuǎn)向代謝和血管舒張活性。因此，所述干預(yù)不僅能夠改進(jìn)代謝狀況和血管反應(yīng)性，而且應(yīng)當(dāng)會(huì)產(chǎn)生較低的細(xì)胞增殖速率(在本發(fā)明背景下為與激素抵抗有關(guān)的病況)。
[0133]已將胰島素抵抗與胰島素信號(hào)傳導(dǎo)分子的磷酸化(活性)的降低關(guān)聯(lián)起來(lái)(卡尼替(Kanety) 1995)。胰島素受體與Akt之間的信號(hào)傳導(dǎo)系統(tǒng)可能受到影響。在胰島素抵抗存在下，沿著PI3K/Akt途徑的胰島素信號(hào)傳導(dǎo)選擇性地受到損害。
[0134]Akt可通過(guò)不同的信號(hào)傳導(dǎo)方式活化，胰島素對(duì)葡萄糖攝取的效應(yīng)涉及IRS-1、PI3K并導(dǎo)致Akt的Ser (473)磷酸化。氧化劑可以若干方式影響胰島素信號(hào)傳導(dǎo)。
[0135]氧化應(yīng)激可影響胰島素敏感性,然而，區(qū)分氧化應(yīng)激的急性效應(yīng)與慢性效應(yīng)非常重要。例如吳(Wu)等展示了急性H2O2爆發(fā)(burst)可改進(jìn)胰島素敏感性和信號(hào)傳導(dǎo)，而慢性升高的H2O2水平導(dǎo)致對(duì)相同信號(hào)傳導(dǎo)途徑的損害(吳2005)。
[0136]細(xì)胞長(zhǎng)期暴露于ROS引起PI3K的區(qū)室特異性活化降低，從而導(dǎo)致GLUT-4易位減少(魯?shù)倨?Rudich) 1998)。此外，F(xiàn)FA誘導(dǎo)的Akt磷酸化降低可由抗N0X2的siRNA恢復(fù)，這表明ROS在抑制Akt途徑中的作用(袁(Yuan) 2010)。由慢性氧化應(yīng)激活化的另一途徑經(jīng)由JNK磷酸化，JNK磷酸化可導(dǎo)致IRS-1的抑制性Ser-磷酸化和隨后的降解，所述IRS-1誘導(dǎo)對(duì)Akt-介導(dǎo)信號(hào)傳導(dǎo)的抑制(博迪切夫斯基(Berdichevsky) 2010)。
[0137] 催化Phe —對(duì)-Tyr轉(zhuǎn)化的酶——Phe-羥化酶在腎臟中非常豐富。此組科學(xué)工作者先前已展示，在慢性腎病CKD患者中，血漿和尿液的對(duì)-酪氨酸水平降低(摩拿(Molnar)等2005a)。此外，患有CKD或腎衰竭的患者優(yōu)選具有激素抵抗。CKD可為具有較低水平的對(duì)-Tyr和較高水平的異常氨基酸——間-和/或鄰-Tyr的病況。因此，異常氨基酸與生理氨基酸的比率，即間-Tyr/對(duì)-Tyr或鄰-Tyr/對(duì)-Tyr比率高度異常。具有CKD和所述異常氨基酸比例的患者可能尤其受益于所述干預(yù)，這是可行的。
[0138]最近，塞科新(Zecchin)等已顯示，乙酰膽堿(ACh)誘導(dǎo)大鼠主動(dòng)脈中詹納斯(Janus)激酶2 (JAK2)的快速酪氨酸磷酸化和活化，且反過(guò)來(lái)，在JAK2活化時(shí)，檢測(cè)到胰島素受體底物(IRS) -1的酪氨酸磷酸化。另外，ACh誘導(dǎo)JAK2/IRS-1和IRS-1/磷脂酰肌醇(PI) 3-激酶的締合，Akt/蛋白激酶B、內(nèi)皮細(xì)胞-一氧化氮合成酶(eNOS)和細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(ERK)-l/2的下游活化。所述結(jié)果支持，Ach還借助血管中的JAK2酪氨酸磷酸化來(lái)刺激IRS-1/PI3-激酶/Akt/eNOS活化和ERK1/2的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。該作者提出，在肥胖大鼠的主動(dòng)脈中，不僅存在胰島素抵抗，而且也存在ACh抵抗，它們可能由常見(jiàn)信號(hào)傳導(dǎo)途徑介導(dǎo)。
[0139]我們的模型的目的在于模仿慢性高氧化應(yīng)激狀態(tài)，其中蛋白會(huì)展現(xiàn)氧化的氨基酸一間-和鄰-Tyr的高含量。所得結(jié)果證實(shí)，與葡萄糖攝取降低的發(fā)現(xiàn)一致，添加間-Tyr和鄰-Tyr抑制胰島素誘導(dǎo)的Akt-磷酸化，這類似于高葡萄糖環(huán)境。因此，間-和鄰-Tyr對(duì)Akt途徑的抑制提供對(duì)脂肪細(xì)胞的較低葡萄糖攝取(即胰島素抵抗?fàn)顟B(tài))的解釋。因此，間-和鄰-Tyr的并入由于擾亂蛋白Tyr磷酸化而干擾胰島素信號(hào)傳導(dǎo)。由此得出，對(duì)-Tyr和其非生理類似物間-和鄰-Tyr處于競(jìng)爭(zhēng)之中，因此后面氨基酸的形成的負(fù)面效應(yīng)可通過(guò)給藥對(duì)-Tyr來(lái)逆轉(zhuǎn)，并且使用對(duì)-Tyr進(jìn)行干預(yù)可改善通過(guò)PI3激酶-Akt (PKB)途徑的胰島素效應(yīng)。在此情況下，胰島素效應(yīng)會(huì)從細(xì)胞增殖轉(zhuǎn)向代謝和血管舒張活性。因此，所述干預(yù)不僅能夠改進(jìn)代謝狀況 和血管反應(yīng)性，而且很可能產(chǎn)生較低的細(xì)胞增殖速率和因此較低的惡性腫瘤發(fā)生率。
[0140]此外，本發(fā)明人已示出，ROS還在ACh抵抗中具有作用。因此，預(yù)期對(duì)-Tyr具有有益效應(yīng)，其中ACh低反應(yīng)性實(shí)現(xiàn)IRS-1/PI3-激酶/Akt途徑。
[0141]效應(yīng)受氧化應(yīng)激和ROS損害的激素的另一實(shí)例是紅細(xì)胞生成素(ΕΡ0)。已對(duì)紅細(xì)胞生成素受體(EPO-R)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)進(jìn)行充分描述。所述受體在JAK2/STAT1-5途徑的下游信號(hào)中持續(xù)的8個(gè)細(xì)胞質(zhì)酪氨酸結(jié)構(gòu)域上活化。JAK2活性還受酪氨酸-磷酸化調(diào)節(jié)。不受此理論約束，似乎間-或鄰-酪氨酸錯(cuò)誤整合到信號(hào)傳導(dǎo)途徑的酶中改變?cè)贓PO響應(yīng)能力中起主要作用的受體活化的細(xì)胞內(nèi)結(jié)果。
[0142]本發(fā)明人已應(yīng)用激素抵抗模型且在3T3-L1脂肪細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)Akt的增加和隨之發(fā)生的在EPO效應(yīng)上葡萄糖攝取的增加。已確認(rèn)慢性間-或鄰-酪氨酸處理對(duì)EPO對(duì)葡萄糖攝取的效應(yīng)和對(duì)脂肪細(xì)胞的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的影響。根據(jù)慢性腎病(CKD)患者尿液中的較高鄰-酪氨酸水平，我們假設(shè)尿液鄰-酪氨酸水平顯示與EPO-響應(yīng)能力的負(fù)相關(guān)。為此目的，實(shí)施利用動(dòng)物模型的一組活體內(nèi)實(shí)驗(yàn)。
[0143]如下文所詳述，發(fā)現(xiàn)EPO抵抗背后的潛在機(jī)制類似于涉及氧化應(yīng)激的胰島素抵抗，且涵蓋由對(duì)-Tyr進(jìn)行的治療。至于在將被治療的受試者或有機(jī)體中產(chǎn)生對(duì)-Tyr的對(duì)-Tyr前體，同樣適用。
[0144]關(guān)于實(shí)例性病況和疾病，貧血是罹患慢性腎病(CKD)患者的常見(jiàn)并發(fā)癥。自1989年以來(lái)在CRD中一直使用重組人類紅細(xì)胞生成素(r-hu-EPO)，使得改進(jìn)了生活質(zhì)量。接受約10%的r-hu-EPO的受試者具有低響應(yīng)性，與死亡風(fēng)險(xiǎn)增加相關(guān)[范德普滕(van derPutten)等2008]。EPO抵抗的原因尚未研究清楚。范德普滕等強(qiáng)調(diào)由炎癥細(xì)胞因子上調(diào)的、細(xì)胞因子誘導(dǎo)的含SH2的蛋白(CIS)的作用，所述蛋白結(jié)合到EPO-受體(EPO-R)并抑制EPO依賴性細(xì)胞增殖；或強(qiáng)調(diào)造血細(xì)胞磷酸酶(HCP)在抑制EPO-R的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中的影響。
[0145]現(xiàn)在本發(fā)明提供對(duì)EPO抵抗患者的治療和預(yù)防。
[0146]當(dāng)研究主動(dòng)脈的胸部和腹部區(qū)段以及腎動(dòng)脈和股部動(dòng)脈中胰島素誘發(fā)的血管舒張時(shí)，我們注意到與對(duì)照組或?qū)?Tyr組相比，間-和鄰-Tyr治療動(dòng)物的胸部主動(dòng)脈、股部動(dòng)脈和腎動(dòng)脈中顯著降低的胰島素反應(yīng)。實(shí)驗(yàn)表明，盡管間-和鄰-Tyr導(dǎo)致胰島素抵抗，但此可通過(guò)給藥對(duì)-Tyr來(lái)逆轉(zhuǎn)。
[0147]如上文所表明，對(duì)-Tyr不僅適宜用作根據(jù)本發(fā)明的競(jìng)爭(zhēng)劑。對(duì)-Tyr在生理環(huán)境下也通過(guò)兩種途徑以酶促方式形成。一方面，它可以通過(guò)酪氨酸轉(zhuǎn)氨酶將L-谷氨酸鹽同時(shí)轉(zhuǎn)化成2-酮基-戊二酸鹽，由對(duì)-OH-苯基-丙酮酸鹽合成。反過(guò)來(lái)，通過(guò)預(yù)苯酸脫氫酶由預(yù)苯酸鹽形成對(duì)-OH-苯基-丙酮酸鹽。另一方面，苯丙氨酸通過(guò)苯丙氨酸-4-羥化酶轉(zhuǎn)化成對(duì)-Tyr，因此此途徑的上游前體(即苯基-丙酮酸鹽和預(yù)苯酸鹽)也是對(duì)-Tyr的前體。
[0148]指示了氧化應(yīng)激參與異常氨基酸的產(chǎn)生，羥基自由基將L-苯丙氨酸轉(zhuǎn)化成間-酪氨酸和鄰-酪氨酸。因此，預(yù)苯酸鹽、苯基-丙酮酸鹽和L-Phe—般并不是本發(fā)明中有用的的適當(dāng)?shù)膶?duì)-Tyr前體。然而，作為對(duì)-Tyr直接前體的對(duì)-OH-苯基-丙酮酸鹽可為其有用替代物。優(yōu)選地，將它與酪氨酸轉(zhuǎn)氨酶常見(jiàn)底物L(fēng)-谷氨酸鹽一起給藥和供應(yīng)。
[0149]因此，根據(jù)本發(fā)明，由于氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的激素抵抗所致的病況可通過(guò)給藥選自對(duì)-Tyrjf -Tyr衍生物、或其醫(yī)藥上可接受的鹽的化合物或醫(yī)藥有效劑量的所述化合物來(lái)預(yù)防、改善或治療，其中所述對(duì)-Tyr衍生物在所述受試者中代謝為對(duì)-Tyr。優(yōu)選地，所述病況是如
【發(fā)明內(nèi)容】
中所定義的病況。優(yōu)選地，所述病況通過(guò)給藥對(duì)-Tyr或?qū)?OH-苯基-丙酮酸鹽來(lái)預(yù)防或改善、優(yōu)選預(yù)防。
[0150]患者中的氧化應(yīng)激狀態(tài)可通過(guò)測(cè)量或檢測(cè)從所述患者獲得的生物樣品中的氧化應(yīng)激標(biāo)記物的水平來(lái)評(píng)估或診斷。
[0151]氧化應(yīng)激性疾病[如糖尿病(DM)、慢性腎病(DM)、肥胖(OB)、高血壓(DM)、阻塞性睡眠呼吸暫停綜合征(OSAS)]導(dǎo)致形成若干活性氧物質(zhì)(ROS)和自由基源性大分子(如鄰-Tyr)。具體來(lái)說(shuō)，在本發(fā)明背景下，形成羥基自由基(.0H)。這些物質(zhì)能夠活化諸多細(xì)胞內(nèi)過(guò)程，它們尤其可導(dǎo)致核因子K B (NFk B)的活化。NF κ B的活化反過(guò)來(lái)導(dǎo)致促炎性細(xì)胞因子的表達(dá)增加。所述過(guò)程導(dǎo)致可通過(guò)高的正常水平或增加水平的高敏感性C反應(yīng)性蛋白(hsCRP)指示的亞臨床炎癥。作為非約束性解釋，促炎性細(xì)胞因子能夠通過(guò)其細(xì)胞因子受體來(lái)促進(jìn)NADPH-氧化酶的活化。數(shù)據(jù)也表明，CRP本身可活化NADPH-氧化酶。NADPH-氧化酶的活化造成ROS的產(chǎn)生增加，即氧化應(yīng)激。因此，可能開(kāi)始惡性循環(huán)(前饋或正反饋)(圖1)。由此得出，在發(fā)生激素抵抗后給藥本發(fā)明化合物盡管可能不足以逆轉(zhuǎn)所述疾病，但很可能完全或部分地預(yù)防其進(jìn)一步惡化或可完全或部分地預(yù)防激素抵抗疾病后期階段癥狀的出現(xiàn)。
[0152]氧化應(yīng)激的標(biāo)記物例如為鄰-Tyr的水平，優(yōu)選如在患者尿液中所測(cè)量的，如由莫爾納等(莫爾納等2005a)所述的。通常，在遭受氧化應(yīng)激的患者的尿液中，鄰-Tyr水平與正常水平或范圍相比升高至少1.5倍或至少2倍或至少2.5倍或至少3倍或至少4倍或至少5倍或至少6倍或至少8倍或2倍到10倍或5倍到10倍或8倍到20倍。通常，遭受氧化應(yīng)激的患者的鄰-Tyr尿排泄物中，鄰-Tyr水平為至少0.5umol/天或至少I(mǎi)umol/天或至少
1.5umol/ 天或至少 2umol/ 天或至少 2.5umol/ 天或 0.4umol/ 天到 IOumol/ 天或 0.5umol/天到IOumol/天或Iumol/天到8umol/天或2umol/天到IOumol/天。鄰Tyr的水平或每日排泄可通過(guò)所屬領(lǐng)域內(nèi)已知的方法測(cè)量。一種替代可能性是測(cè)量患者尿液中的間_Tyr。
[0153]適用于本發(fā)明的另一氧化應(yīng)激標(biāo)記物是炎癥性標(biāo)記物C反應(yīng)蛋白(CRP)、特別是高敏感性CRP (hsCRP)的增加[艾布拉姆森*J*L (Abramson JL)等(2005)]。作者已發(fā)現(xiàn)，氧化應(yīng)激可為CRP水平的決定因素并在CHD發(fā)生的最早階段促進(jìn)促動(dòng)脈粥樣硬化性炎癥過(guò)程。也已發(fā)現(xiàn)，CRP水平與氧化應(yīng)激相關(guān)，而在炎癥、氧化應(yīng)激與傳統(tǒng)心血管風(fēng)險(xiǎn)因素之間存在顯著的相互關(guān)系[土肥.J (Dohi J)等(2007) ]。CRP或hsCRP水平可通過(guò)所屬領(lǐng)域內(nèi)已知的任何方法測(cè)量，例如通過(guò)如以下論文中任一者中所公開(kāi)的方法測(cè)量:[艾布拉姆森.J.L 等(2005);康成.K (Yasunari K)等(2002) ;土肥.J 等(2007)]。通常，即將用本發(fā)明的化合物治療的患者的hsCRP水平或其中將施加預(yù)防的患者的hsCRP水平顯示健康患者正常范圍上限的至少50%或至少60%或至少70%或至少75%或至少90%的hsCRP水平，所述hsCRP水平顯示氧化應(yīng)激狀態(tài)增加和由此產(chǎn)生激素抵抗的發(fā)展。優(yōu)選地，遭受氧化應(yīng)激的患者的hsCRP水平與正常水平或范圍相比升高至少1.2倍或至少1.5倍或至少2倍或至少2.5倍或至少3倍或至少4倍。
[0154]氧化應(yīng)激的又一適用標(biāo)記物是氧自由基測(cè)試(F0RT)，其反映了有機(jī)氫過(guò)氧化物的水平且顯示與hsCRP水平的良好相關(guān)[艾布拉姆森.J.L等(2005)]。 [0155]用于其評(píng)估的其它氧化標(biāo)記物和方法在以下綜述論文中公開(kāi):[內(nèi)藤.Y (NaitoY)等(2010);斯蒂芬斯.J.W (Stephens J W)等(2009);荻野.K (Ogino K)和王.D.H(WangD-H) (2007)]。
[0156]任選地具有醫(yī)藥上可接受的載體或賦形劑的作為醫(yī)藥組合物或作為藥劑的對(duì)-Tyr調(diào)配物為所屬領(lǐng)域內(nèi)已知。優(yōu)選地，產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)、患者冊(cè)子(leaflet)或給醫(yī)生的信息包含即將用含有如本文定義的本發(fā)明化合物的調(diào)配物治療、預(yù)防或改善的病況的信息。此外，作為飲食補(bǔ)充劑、食物補(bǔ)充劑、營(yíng)養(yǎng)制品、功能性食物、食物或組合物的調(diào)配物也為所屬領(lǐng)域內(nèi)已知。本發(fā)明還涉及這些產(chǎn)品用于預(yù)防、改善或治療如本文所規(guī)定的病況。在此實(shí)施例中，所述產(chǎn)品的用途指示于標(biāo)簽上、與所述產(chǎn)品相關(guān)的冊(cè)子或廣告中。具體來(lái)說(shuō)，這些產(chǎn)品中的任一種都可以伴有健康聲明。例如，如歐洲議會(huì)和委員會(huì)于2006年12月20日關(guān)于對(duì)食物作出的營(yíng)養(yǎng)和健康聲明的條例(Regulation) (EC)第1924/2006號(hào)所規(guī)定的，“健康聲明”意指陳述、表明或暗示食物分類、食物或其組分之一與健康之間存在關(guān)系的任何聲明；且特定“疾病風(fēng)險(xiǎn)降低聲明”意指陳述、表明或暗示食物分類、食物或其組分之一的消耗顯著降低產(chǎn)生人類疾病的風(fēng)險(xiǎn)因素的任何健康聲明。關(guān)于類似范圍和受試者的條例可在其它國(guó)家或地理區(qū)域內(nèi)有效，且健康聲明或類似適應(yīng)癥可表明，根據(jù)本發(fā)明使用的化合物在如本文所公開(kāi)的病況中有益。這些供使用的產(chǎn)品在本發(fā)明范圍內(nèi)。
[0157]優(yōu)選地，所述病況的預(yù)防、改善或治療包含根據(jù)所述受試者定制的(個(gè)性化)方案或給藥計(jì)劃的一部分，或由所述部分組成或?yàn)樗霾糠帧?br> [0158]例如，所述化合物可用于具有激素抵抗風(fēng)險(xiǎn)(即在氧化應(yīng)激增加狀態(tài)下)的患者。
[0159]例如，所述化合物可在糖尿病癥狀出現(xiàn)之前用于例如預(yù)防IGT和DM (單一療法)。
[0160]在糖尿病中，所述化合物或調(diào)配物可與口服和非經(jīng)腸抗糖尿病劑(例如磺脲、雙胍、格列酮(glitazone)、DPP-4抑制劑、腸降血糖素模擬物、α -葡糖苷酶抑制劑、格列奈(glinide)(美各里替尼，meglitinide)、SGLT-2抑制劑)且與胰島素組合用于胰島素抵抗患者。
[0161]在高血壓患者中，所述化合物或調(diào)配物可與抗高血壓劑(例如血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑、血管緊張素受體阻斷劑、直接腎素抑制劑、利藥劑、鈣通道阻斷劑、α-l受體阻斷劑、β -受體阻斷劑、直接血管擴(kuò)張劑、影響中樞神經(jīng)系統(tǒng)的抗高血壓藥)組合使用。
[0162]高血壓患者可優(yōu)選為胰島素抵抗患者和/或紅細(xì)胞生成素抵抗患者和/或乙酰膽堿抵抗患者。
[0163]在優(yōu)選實(shí)施例中，通過(guò)給藥對(duì)-Tyr的一倍、兩倍或三倍一般劑量或如
【發(fā)明內(nèi)容】
部分中所給定的劑量或包含等效于至多30000mg日攝入的劑量的調(diào)配物來(lái)提供所述化合物的日攝入，條件為制備所述單劑量適于給藥且可以合理方式進(jìn)行處置。
[0164]此處應(yīng)注意，對(duì)-Tyr可干擾其它藥物，例如，可降低L-多巴的有效性，且分開(kāi)給藥劑量可能適當(dāng)。此外，對(duì)-Tyr可增加影響多巴胺代謝的藥物的效應(yīng)。
[0165]總之，我們發(fā)現(xiàn)，例如在胰島素和紅細(xì)胞生成素和乙酰膽堿的情況下，鄰-和間-Tyr引起Akt途徑激素的激素抵抗，所述激素抵抗可通過(guò)給藥對(duì)-Tyr和給藥在機(jī)體內(nèi)代謝為對(duì)-Tyr的衍生物、類似物和前體來(lái)逆轉(zhuǎn)。
[0166]實(shí)例
[0167]材料和方法
[0168]基本材料
[0169]胰島素、腎上腺素、對(duì)_、間_、鄰-酪氨酸和Mg2S04，購(gòu)自西格瑪-奧德里奇(Sigma-Aldrich)(西格瑪-奧德里奇公司，圣路易斯，MO (密蘇里州)63178，美國(guó))。NaCl,KC1、KH2P04、NaHC03、葡萄糖和 CaC12*2H20，購(gòu)自默克(Merck)(默克集團(tuán)(Merck KGaA),64271達(dá)姆施塔特，德國(guó))。
[0170]細(xì)胞培養(yǎng)物
[0171]小鼠胚胎成纖維細(xì)胞(3T3-L1)的原代培養(yǎng)物購(gòu)自ATCC(馬納薩斯，美國(guó))。在補(bǔ)充有10%胎牛血清(吉布可(Gibco)，CAT編號(hào):16170-078)、100U/ml青霉素和0.lmg/ml鏈霉素(吉布可，CAT編號(hào):15070-063)和398nM對(duì)-、間-或鄰-Tyr的達(dá)爾伯克改良伊格爾培養(yǎng)基(Dulbecco’ s modified Eagle medium, DMEM,英杰(Invitrogen), CAT 編號(hào):41966-029 ;西格瑪奧德里奇CAT編號(hào):D6046)中培養(yǎng)3T3-L1成纖維細(xì)胞的早期傳代物。DMEM含有25mM或5mM葡萄糖(取決于實(shí)驗(yàn))、L-谷氨酰胺和丙酮酸鹽。使細(xì)胞在37°C和5%C02的濕化孵育器中生長(zhǎng)。分化培養(yǎng)基由補(bǔ)充有10%胎牛血清(FBS，吉布可，色特斯(Csertex)，布達(dá)佩斯，匈牙利，CAT編號(hào):10106-169) (FBS)的DMEM組成，向所述培養(yǎng)基中添加包含以下物質(zhì)的混合物:0.5nM異丁基甲基黃嘌呤(西格瑪奧德里奇，CAT編號(hào):I5879)、0.17nM胰島素(西格瑪奧德里奇，CAT編號(hào):19278)和250nM地塞米松(西格瑪奧德里奇，CAT編號(hào):861871)。從第4天開(kāi)始，將細(xì)胞維持在含有1.5μ g/ml胰島素的DMEM/10%FBS中，每隔一天更換培養(yǎng)基，直到開(kāi)啟實(shí)驗(yàn)處理。對(duì)于所有處理來(lái)說(shuō)，在90%的細(xì)胞群達(dá)到脂肪細(xì)胞表型后，將細(xì)胞在無(wú)血清培養(yǎng)基中孵育過(guò)夜。
[0172] 在含有200nmol/l或400nmol/l胰島素的無(wú)血清培養(yǎng)基中經(jīng)5分鐘完成實(shí)驗(yàn)處理。在用鹽水(4°C)將處理細(xì)胞洗滌兩次以去除任何痕量培養(yǎng)基后，然后遭受含有1.15%曲拉通 X (TritonX)UM 曲貝斯(Trisbase) (ρΗ7.4)、0.5M EDTA (ρΗ8)、0.2Μ EGTA (ρΗ7)、
0.1M 二硫蘇糖醇(DTT)、5mg/ml苯甲磺?；?PMSF)、0.1M Na3V04、5mg/ml亮抑酶肽、5mg/ml抑肽酶、磷酸酶抑制劑混合物I和2 (西格瑪奧德里奇，CAT編號(hào):P2850和P5726)的80 μ L裂解緩沖液/板。以機(jī)械方式刮掉脂肪細(xì)胞且然后冷凍在_70°C。
[0173]來(lái)自內(nèi)皮瘤的小鼠內(nèi)皮細(xì)胞(EC)的原代培養(yǎng)物購(gòu)自LGC普莫科(Promochem)(特丁頓(Taddington)，英國(guó))。在補(bǔ)充有10%胎牛血清(吉布可，CAT編號(hào):16170_078)、2%的青霉素-鏈霉素(吉布可，CAT編號(hào):15070-063)和400 μ mol/1對(duì)-Tyr(對(duì)照組)、或800 μ mol/I 對(duì)-Tyr (對(duì)-Tyr)、或 400 μ mol/1 間-和 400 μ mol/1 對(duì)-Tyr (間-Tyr)、或 400 μ mol/1鄰-和400 μ mol/1對(duì)-Tyr (鄰-Tyr)的混合物的達(dá)爾伯克改良伊格爾培養(yǎng)基(DMEM ;吉布可，色特斯，布達(dá)佩斯，匈牙利)中培養(yǎng)EC。每2天更換培養(yǎng)基。使細(xì)胞在37°C和5%C02的濕化孵育器中生長(zhǎng)。7天后，以機(jī)械方式刮掉EC然后用于HPLC分析。
[0174]同位素?cái)z取
[0175]將細(xì)胞在無(wú)葡萄糖DMEM (吉布可，色特斯，匈牙利)中孵育30分鐘，然后用2nmol/
1、20nmol/l、200nmol/l或400nmol/l胰島素處理100分鐘。同時(shí)將Iμ Ci/ml脫氧-D-葡萄糖 2-[12_3H (N)] (3.7X 104Bq/ml)(同位素研究所(Ιζο--ρ Int6zet)，匈牙利)添加到板并保持100分鐘。將細(xì)胞刮到培養(yǎng)基中并以1000rpm離心5分鐘。將沉積物溶解于70 μ I裂解緩沖液中并通過(guò)貝克曼(Beckman) LS5000TD計(jì)數(shù)器以每分鐘計(jì)數(shù)(CPM)閃爍計(jì)數(shù)測(cè)量30 μ I樣品來(lái)評(píng)估葡萄糖攝取，每次為5分鐘，使用平均活性作為結(jié)果。將樣品在_70°C冷凍過(guò)夜并使用日立(Hitachi)分光光度計(jì)測(cè)量蛋白濃度。將蛋白含量結(jié)果歸一化(卡代(Kaddai)2009)。
[0176]對(duì)酪氨酸-異構(gòu)體并入的分析；HPLC分析
[0177]樣品的制備根據(jù)所欲測(cè)定的酪氨酸的類型而不同。方法基于帶有修改的較早出版物(莫爾納2005a，莫爾納2005b)。為了測(cè)量結(jié)合蛋白的細(xì)胞酪氨酸的總含量，在添加200 μ I蒸餾水后，將樣品在_70°C冷凍過(guò)夜以完成細(xì)胞裂解。在熔化完并以4000rpm離心10分鐘后，將200 μ 160%三氯乙酸添加到200 μ I上清液中并在冰上孵育30分鐘，以使蛋白沉淀。在以4000rpm第二次離心10分鐘后，將沉積物再懸浮于1%三氯乙酸中并將4 μ 1400mmol/l脫鐵氨和40 μ 1500mmol/l 丁基化羥基甲苯添加到樣品中以避免在水解期間形成可能的自由基。然后添加200μ I或400μ 16N鹽酸，且在120°C執(zhí)行蛋白的過(guò)夜酸水解。然后通過(guò)0.2 μ m過(guò)濾器(密理博(Millipore)公司，比勒瑞卡(Billerica), MA (馬薩諸塞州)，美國(guó))過(guò)濾水解產(chǎn)物并使用羅丹尼(Rheodyne)手動(dòng)注射器將20 μ I濾液注射到島津(Shimadzu)C-1OADVP類HPLC系統(tǒng)(島津美國(guó)制造公司，坎比(Canby )，OR (俄勒岡州)，美國(guó))的HPLC柱上。
[0178]通過(guò)具有以下差異的類似方法測(cè)量EC的結(jié)合蛋白的細(xì)胞酪氨酸總含量:在添加200 μ I蒸餾水后，用超聲波均質(zhì)器對(duì)樣品實(shí)施2分鐘長(zhǎng)的聲波處理以完成細(xì)胞裂解。添加100 μ 160%三氯乙酸之后進(jìn)行離心和再懸浮，如上文所述。再懸浮后，添加100 μ 160%三氯乙酸。在如上文所述進(jìn)行第二次離心后，再次重復(fù)前一過(guò)程。最后，將沉積物4μ 1400mmol/I脫鐵氨和40 μ 1500mmol/l 丁基化羥基甲苯添加到沉積物以避免水解期間形成可能的自由基。然后將400 μ 16Ν鹽酸添加到樣品。
[0179]為了測(cè)量細(xì)胞內(nèi)非蛋白結(jié)合的酪氨酸總含量，將200μ I蒸餾水添加到樣品，然后將它們?cè)赺70°C冷凍過(guò)夜以完成細(xì)胞裂解。將樣品熔化完并以15000rpm離心15分鐘。將200 μ 160%三氯乙酸添加到200 μ I上清液。在冰上孵育30分鐘后，再次以15，OOOrpm將樣品離心15分鐘。以上述方式將上清液過(guò)濾，稀釋5次，并將160 μ I蒸餾水添加到40 μ I濾液中，將所述濾液注射到HPLC柱上。
[0180]對(duì)于血管壁的酪氨酸含量的測(cè)定來(lái)說(shuō)，使用莫爾納等(莫爾納2005b)的修改方法。在充分閉合的O形環(huán)保護(hù)的聚丙烯管中水解近端部分。將4μ 1400mmol/l脫鐵氨(最終濃度:3.6mmol/l)和40 μ 1500mmol/l 丁基化羥基甲苯(最終濃度:45mmol/l)添加到樣品。然后將200 μ 16Ν鹽酸添加到樣品。
[0181]我們?cè)?20°C對(duì)取自EC和動(dòng)脈的蛋白進(jìn)行過(guò)夜酸水解。然后通過(guò)0.2 μ m過(guò)濾器(密理博公司，比勒瑞卡，MA，美國(guó))過(guò)濾水解產(chǎn)物并將20 μ I濾液注射到HPLC柱上。
[0182]使用對(duì)_、間-和鄰-Tyr和Phe的自身熒光來(lái)測(cè)量它們?cè)跇悠分械牧?。因此，不需要染色或衍生化。任選地使用羅丹尼手動(dòng)注射器在配備有RF-10AXL熒光檢測(cè)器(島津美國(guó)制造公司，坎比，俄勒R州，美國(guó))的島津IOaDVP類HPLC系統(tǒng)上運(yùn)行樣品。流動(dòng)相由溶解于水中的1%乙酸和1%乙酸鈉組成，在等度運(yùn)行(isocratic run)中，分離發(fā)生于LiChroCHART250-4柱(默克集團(tuán)(Merck KGaA), 64271達(dá)姆施塔特，德國(guó))上。使用275nm激發(fā)波長(zhǎng)和305nm發(fā)射波長(zhǎng)來(lái)測(cè)量對(duì)_、間-和鄰_Tyr，而在258nm激發(fā)波長(zhǎng)和288nm發(fā)射波長(zhǎng)下檢測(cè)Phe。使用曲線下面積(AUC)的測(cè)定和外部標(biāo)準(zhǔn)校準(zhǔn)來(lái)計(jì)算氨基酸的確切濃度。在一些情況下，還通過(guò)峰加和法(peak-addition method)來(lái)證實(shí)物質(zhì)的洗脫時(shí)間。經(jīng)總酪氨酸或苯丙氨酸濃度校正氨基酸濃度。 [0183]蛋白印跡(Westernblot)分析
[0184]對(duì)EC裂解物的樣品進(jìn)行聲波處理(2分鐘)和離心(10分鐘，13，OOOrpm, 4°C )。通過(guò)布拉德福德法(Bradford method)使用牛血清白蛋白作為標(biāo)準(zhǔn)的伯樂(lè)本奇馬克普納斯(Bio-Rad Benchmark Plus)來(lái)測(cè)定樣品的蛋白含量。樣品溶解于IOOmM Tris (三輕甲基氨基甲烷)-HCl (pH6.8),4.0%十二烷基硫酸鈉(SDS)、20%甘油、200mM DTT和0.2%溴酚藍(lán)的緩沖液中。在10%聚丙烯酰胺凝膠上以電泳方式對(duì)樣品(80 μ g到120 μ g的蛋白)實(shí)施解析并將其在含有38mM甘氨酸、48mMTris堿(Tris_base)和20%甲醇的緩沖液(pH8.3)中轉(zhuǎn)移到PVDF膜(安瑪西亞生物技術(shù)(Amersham-Biotech), AP匈牙利,布達(dá)佩斯,匈牙利)且在250mA下保持90分鐘。
[0185]將膜與在含有5%牛血清(BS)的TBS-T (0.1%)中稀釋到1:1000的免疫球蛋白G(IgG)單克隆抗體一起孵育過(guò)夜。首先使用抗-磷酸_(Ser473)_Akt的抗體(pAkt, Ser473,#9271,1:1000,細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)技術(shù)(Cell Signalling Technology),比佛利(Beverly),美國(guó))。用TBS-T0.1%洗滌該膜且該膜在過(guò)氧化物酶偶聯(lián)IgG 二級(jí)抗體(其在5%無(wú)脂乳中稀釋到1:2000)中與抗兔多克隆(細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)技術(shù)，編號(hào)7074) —起孵育以檢測(cè)抗-磷酸-(Ser473)-Akt。為了利用總PKB/Akt的替代性一級(jí)抗體(編號(hào)9272，細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)技術(shù)，比佛利，美國(guó))再次探測(cè)蛋白印跡，如下剝離膜:在TBS-T0.1%中將膜洗滌10分鐘，然后置于含有1.5%甘氨酸、0.1%SDS、1%吐溫-20 (Tween-20) (ph:2.2)的剝離緩沖液中保持2X10分鐘，然后在蒸餾水中洗滌。使用增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光(ECL ;皮爾斯生物技術(shù)(PierceBiotech),伯樂(lè),布達(dá)佩斯,匈牙利)檢測(cè)印跡。利用用于視窗軟件(Windows Software)的賽恩圖像(Scion Image)來(lái)分析特定條帶的計(jì)算機(jī)化的密度測(cè)定(積分光密度)。經(jīng)總Akt蛋白水平校正蛋白表達(dá)且經(jīng)對(duì)照組進(jìn)行調(diào)節(jié)。
[0186]由佩奇大學(xué)醫(yī)學(xué)院(University of P6cs Medical School)的實(shí)驗(yàn)室醫(yī)學(xué)系(Department of Laboratory Medicine)根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)臨床實(shí)驗(yàn)室程序?qū)嵤┏Ｒ?guī)的血液和尿液測(cè)試。
[0187]動(dòng)物和組織準(zhǔn)備
[0188]在匈牙利地方動(dòng)物實(shí)驗(yàn)委員會(huì)(HungarianLocal Animal Experiment Committee)的許可下實(shí)施實(shí)驗(yàn)。斷奶后不久將雄性CFY大鼠(斯普拉格-杜勒大鼠品系)置于單個(gè)籠中且保持規(guī)律飲食。在禁食兩小時(shí)后，一周的6天通過(guò)填喂法(經(jīng)口)向動(dòng)物(4-5周齡，80-140g)加載1.76mg/天的溶解于鹽水的對(duì)_、間_或鄰_酪氨酸(對(duì)_、間_、鄰-Tyr ;西格瑪-奧德里奇公司，圣路易斯，M063178，美國(guó))或媒劑(僅鹽水)。在一個(gè)月的處理后，用乙醚麻醉動(dòng)物并用斷頭臺(tái)(guillotine)斷頭,或終止對(duì)-、間-、鄰-Tyr和媒劑的補(bǔ)充(“清除”期)并在兩周后將它們處死(圖8.A)。下行的胸部和腹部主動(dòng)脈、腎動(dòng)脈和股部動(dòng)脈被移除并清除掉結(jié)締組織(圖19)。將切段立即水解用于HPLC分析或用于血管反應(yīng)性研究。
[0189]在進(jìn)一步的酪氨酸異構(gòu)體并入研究中，當(dāng)研究大鼠慢性經(jīng)口補(bǔ)充對(duì)-Tyr和鄰-Tyr對(duì)鄰-Tyr水平和胰島素誘導(dǎo)的經(jīng)分離的動(dòng)脈區(qū)段舒張的效應(yīng)時(shí)，使用18只雄性斯普拉格-杜勒大鼠(5-6周齡)。在每周的6天期間向大鼠經(jīng)口供應(yīng)1.76mg/天對(duì)-Tyr或鄰-Tyr或媒劑，持續(xù)4周。用幾乎它們體重三倍的對(duì)-Tyr、鄰-Tyr或媒劑治療大鼠，但各組間不存在差異。在4周治療結(jié)束時(shí)，執(zhí)行HPLC和血管舒縮研究。在另一組大鼠中，終止對(duì)-Tyr/鄰-Tyr的補(bǔ)充，持續(xù)4周(“清除”期)，此后，將它們處死用于HPLC和血管舒縮研究。
[0190]連續(xù)動(dòng)脈血管的準(zhǔn)備示于圖19中。
[0191]血管反應(yīng)性研究
[0192]使用菲素斯(F6sils)等(菲素斯2007)的修改方法。在冰冷克雷布斯緩沖液(Krebsbuffer)中將血管的遠(yuǎn)端部分切割成2mm長(zhǎng)區(qū)段并將環(huán)狀物安裝在610M型丹麥多功能肌動(dòng)描記器(Danish Multimyograph Model610M) (DMT-美國(guó)公司，亞特蘭大，GA (佐治亞州)，美國(guó))內(nèi)的兩根不銹鋼絲(直徑為40 μ m)上。在37°C并供應(yīng)5%C02和95%02氣體下，將血管浸濕在克雷布斯緩沖液(含有 119mM NaCl, 4.7mM KCl，1.2mM KH2PO4, 25mMNaHC03,1.2mM Mg2SO4,
11.1mM葡萄糖，1.6mM CaCl2*2H20，pH7.4)。測(cè)定每一血管的靜息張力/內(nèi)周長(zhǎng)關(guān)系然后將內(nèi)部周長(zhǎng)設(shè)定為0.9XL100，其中L100是血管在IOOmmHg的跨壁壓力下舒張時(shí)活體內(nèi)原本具有的內(nèi)部周長(zhǎng)。在此歸一化程序后，使血管穩(wěn)定30分鐘，然后連續(xù)地記錄等長(zhǎng)張力。用IOOnM腎上腺素使環(huán)狀物預(yù)收縮。在達(dá)到穩(wěn)定的收縮平穩(wěn)期后，評(píng)估對(duì)增加劑量的胰島素的舒張反應(yīng)。舒張率被表示為腎上腺素(100%)誘發(fā)的收縮百分比。在添加腎上腺素前10分鐘和添加胰島素前30分鐘，將對(duì)_、間_、鄰-酪氨酸或媒劑添加到血管腔。
[0193]在所述方法的變化形式中，對(duì)_、間-和鄰-Tyr在實(shí)驗(yàn)中單獨(dú)使用。在所述方法的又一變化形式中，對(duì)-和鄰-Tyr或間-和鄰-Tyr —起使用且將結(jié)果與當(dāng)單獨(dú)使用化合物獲得的數(shù)據(jù)比較以評(píng)估競(jìng)爭(zhēng)效應(yīng)。
[0194]統(tǒng)計(jì)學(xué)
[0195]視情況使用司徒登氏(Student’ s) t_檢驗(yàn)或ANOVA來(lái)計(jì)算統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性。所有分布均為正態(tài)，數(shù)據(jù)表示為平均值土SEM。使用SPSS程序包5.0版(SPSS公司，芝加哥，IL(伊利諾伊州)，美國(guó))和格拉夫帕得棱鏡(GraphPad Prism)5 (格拉夫帕得軟件公司，拉荷亞(La Jolla), CA (加利福尼亞州)，美國(guó))，視情況通常利用AN0VA、額外平方和F檢驗(yàn)、非參數(shù)檢驗(yàn)執(zhí)行測(cè)試，將0.05或更小的P值視為顯著。
[0196]結(jié)果
[0197]3T3-L1細(xì)胞對(duì)同位素標(biāo)記的2_脫氧-D-葡萄糖的攝取
[0198]我們測(cè)量3T3-L1細(xì)胞對(duì)同位素標(biāo)記的2_脫氧-D-葡萄糖的攝取。在含有對(duì)-Tyr+5mM葡萄糖的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的細(xì)胞中，胰島素濃度的增加導(dǎo)致脫氧-D-葡萄糖攝取增加。在含有對(duì)-Tyr+高的葡萄糖(25mM)的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的細(xì)胞中，胰島素未能增加葡萄糖攝取。與這種情形類似，在具有正常的葡萄糖(5mM)但具有間-Tyr或鄰-Tyr補(bǔ)充的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的細(xì)胞中不能證實(shí)胰島素效應(yīng)(圖2)。在每一實(shí)驗(yàn)中，細(xì)胞生長(zhǎng)11天。
[0199]發(fā)現(xiàn)間-Tyr和鄰-Tyr抑制胰島素誘導(dǎo)的葡萄糖攝取的能力具有濃度依賴性。在對(duì)-Tyr和正常葡萄糖上生長(zhǎng)的細(xì)胞中，胰島素(400nM)導(dǎo)致葡萄糖攝取增加約2倍(白色條和第一個(gè)黑色條)，而隨著間-Tyr (圖3A)和鄰-Tyr (圖3B)濃度的增加，胰島素誘導(dǎo)的葡萄糖攝取降低。在等摩爾濃度的間-Tyr和對(duì)-Tyr或鄰-Tyr和對(duì)-Tyr (72_72mg/l)下，胰島素對(duì)葡萄糖攝取根本沒(méi)有效應(yīng)(最后的條)，表明所述三種氨基酸的強(qiáng)競(jìng)爭(zhēng)。
[0200]從圖中可以看出，對(duì)-Tyr應(yīng)當(dāng)以比間-Tyr或鄰-Tyr高8_32倍的濃度存于培養(yǎng)基中，以便能夠與間-Tyr或鄰-Tyr有效地競(jìng)爭(zhēng)。
[0201]我們還對(duì)間-Tyr和鄰-Tyr的效應(yīng)是否具有時(shí)間依賴性進(jìn)行了測(cè)試。我們發(fā)現(xiàn)，含有間-Tyr-或鄰-Tyr的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的3T3-L1細(xì)胞中的基線葡萄糖攝取未顯示顯著變化。然而，間-Tyr和鄰-Tyr以時(shí)間依賴性方式阻斷胰島素誘導(dǎo)的葡萄糖攝取(圖4A和4B)。
[0202]間-Tyr和鄰-Tyr對(duì)胰島素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的效應(yīng)
[0203]我們研究了向細(xì)胞的培養(yǎng)基中添加間-Tyr和鄰-Tyr對(duì)不同信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的效應(yīng)。我們發(fā)現(xiàn)，在對(duì)-Tyr和低葡萄糖上生長(zhǎng)的細(xì)胞中，與對(duì)照組相比，增加胰島素的劑量導(dǎo)致Akt (蛋白激酶B)磷酸化增加3倍。在僅具有對(duì)-Tyr的高葡萄糖培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的細(xì)胞中，胰島素誘導(dǎo)顯著更低的Akt-磷酸化。在間-Tyr或鄰-Tyr上生長(zhǎng)的細(xì)胞中，胰島素并不能顯著增強(qiáng)Akt磷酸化(圖5)。
[0204]對(duì)-Tyr、間-Tyr和鄰-Tyr的急性攝取
[0205]在上述發(fā)現(xiàn)的背景下，我們假定，所供應(yīng)的氨基酸可進(jìn)入細(xì)胞中。也對(duì)此假定進(jìn)行了測(cè)試:在不同的孵育時(shí)間后，使用HPLC測(cè)量細(xì)胞內(nèi)總對(duì)-Tyr、間-Tyr和鄰-Tyr含量。我們發(fā)現(xiàn)，在正常和高葡萄糖培養(yǎng)基中以及具有和不具有胰島素處理的情況下，補(bǔ)充對(duì)-Tyr(圖6A)、間-Tyr (圖6B)或鄰-Tyr (圖6C)均可有效地升高3T3細(xì)胞中各自氨基酸的水平。
[0206]間-Tyr和鄰-Tyr向細(xì)胞蛋白中的并入
[0207]也對(duì)以下情況進(jìn)行了測(cè)試:更長(zhǎng)期給與(11天)間-Tyr或鄰-Tyr供給是否導(dǎo)致蛋白并入的間-Tyr和鄰-Tyr增加。對(duì)-Tyr含量表示為總蛋白酪氨酸含量的百分比，即計(jì)算對(duì)-Tyr/[(對(duì)-Tyr)+ (間-Tyr)+ (鄰-Tyr)]比率。還經(jīng)總Tyr含量將間-和鄰-Tyr歸一化。在正常(5mM)和高葡萄糖(25mM)實(shí)驗(yàn)設(shè)定中實(shí)施測(cè)試。在正常和高葡萄糖條件下，細(xì)胞在間-Tyr或鄰-Tyr補(bǔ)充的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)均導(dǎo)致蛋白對(duì)-Tyr水平降低。與正常葡萄糖培養(yǎng)基相比，在高葡萄糖培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的間-Tyr供應(yīng)的細(xì)胞的對(duì)-Tyr含量顯著更高(圖7A)。在5mM和25mM葡萄糖培養(yǎng)基中，間-Tyr供應(yīng)的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的細(xì)胞的間-Tyr含量均顯著高于對(duì)-或鄰-Tyr上生長(zhǎng)的細(xì)胞。在間-Tyr培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的細(xì)胞中，與正常葡萄糖培養(yǎng)基相比，蛋白間-Tyr含量顯著低于高葡萄糖環(huán)境(圖7B)。當(dāng)研究蛋白鄰-Tyr含量時(shí)，我們發(fā)現(xiàn)，其在高葡萄糖培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的對(duì)-Tyr供應(yīng)的細(xì)胞中顯著高于在5mM葡萄糖培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的細(xì)胞中。在鄰-Tyr供應(yīng)的細(xì)胞中，在正常和高葡萄糖培養(yǎng)基中，蛋白鄰-Tyr顯著高于對(duì)-Tyr或間-Tyr供應(yīng)細(xì)胞(圖7C)。
[0208]鄰-Tyr的動(dòng)脈存在和其對(duì)血管活性的效應(yīng)
[0209]在又一實(shí)驗(yàn)中，移除未處理大鼠的下行的胸部和腹部主動(dòng)脈和股部動(dòng)脈，進(jìn)行清洗并用于評(píng)估，如材料和方法章節(jié)中所述。將切段立即水解用于HPLC分析或用于血管反應(yīng)性研究。不同血管的禁食動(dòng)物的基線鄰-Tyr含量(作為氧化應(yīng)激的量度)顯示胸部主動(dòng)脈>腹部主動(dòng)脈 > 股部動(dòng)脈的等級(jí)次序(圖8，子圖B，黑色條)，對(duì)胰島素的反應(yīng)顯示胸部主動(dòng)脈〈腹部主動(dòng)脈〈股部動(dòng)脈的相反等級(jí)次序(圖8，子圖C，黑色條；差異顯著)。
[0210]補(bǔ)充對(duì)血管壁中間-和鄰-酪氨酸水平的影響
[0211]在此實(shí)驗(yàn)中，向大鼠加載對(duì)_、間-或鄰-酪氨酸。在一個(gè)月處理后，處死動(dòng)物，或終止補(bǔ)充(“清除”期)并在4周后將它們處死(圖8，子圖A)。在用對(duì)_、間_、鄰-Tyr和媒劑處理一個(gè)月后，我們測(cè)量了主動(dòng)脈的胸部和腹部部分和腎動(dòng)脈和股部動(dòng)脈的酪氨酸含量。在每一次檢查的動(dòng)脈中，我們?cè)卩?Tyr處理組中觀察到顯著高于對(duì)照組的鄰-Tyr水平(圖8，子圖B，白色條)。然而，在此實(shí)驗(yàn)中，在不同組的間-Tyr含量之間沒(méi)有發(fā)現(xiàn)顯著差異(數(shù)據(jù)未顯示)。 [0212]我們測(cè)定了，向大鼠持續(xù)活體內(nèi)補(bǔ)充鄰-Tyr是否對(duì)離體(ex vivo)胰島素誘導(dǎo)的舒張具有任何影響。與媒劑_(黑色條)或?qū)?Tyr-治療組(灰色條)相比，我們?cè)卩?Tyr-處理的大鼠的腹部主動(dòng)脈和股部動(dòng)脈中獲得了顯著降低的對(duì)胰島素的反應(yīng)(圖8，子圖C，白色條)。在胸部主動(dòng)脈中，在對(duì)照組與鄰-Tyr-處理組之間沒(méi)有顯著差異。相比之下，我們發(fā)現(xiàn)與其它組相比，在從對(duì)-Tyr-處理的大鼠分離的胸部主動(dòng)脈中，響應(yīng)于胰島素的舒張?jiān)庋?圖8C)。終止酪氨酸補(bǔ)充后4周(第8周)，評(píng)估相同血管的鄰-和間-Tyr含量。在不同組的鄰-Tyr與間-Tyr含量之間沒(méi)有顯著差異(數(shù)據(jù)未顯示)。
[0213]對(duì)_、間-和鄰-酪氨酸向內(nèi)皮細(xì)胞的細(xì)胞蛋白中的并入
[0214]激素誘發(fā)血管活性效應(yīng)，血管活性效應(yīng)誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞的響應(yīng)能力。因此，這些細(xì)胞的氨基酸組成的變化可能具有關(guān)鍵作用。在急性實(shí)驗(yàn)中，與各自氨基酸一起孵育30分鐘并不導(dǎo)致細(xì)胞蛋白對(duì)_、間-和鄰-Tyr含量的顯著變化(圖9A、B和C)。
[0215]在間-Tyr上生長(zhǎng)7天的EC的細(xì)胞蛋白中，間-Tyr的相對(duì)含量高于對(duì)-Tyr補(bǔ)充的細(xì)胞或?qū)φ战M細(xì)胞(圖10B)。類似地，在鄰-Tyr處理的細(xì)胞的蛋白中，所測(cè)量的鄰-Tyr含量高于對(duì)-Tyr或?qū)φ战MEC (圖10C)。相對(duì)的對(duì)-Tyr量幾乎不反映間-和鄰-Tyr含量的變化(圖10A)。
[0216]對(duì)_、間-和鄰-酪氨酸補(bǔ)充對(duì)胰島素誘導(dǎo)的血管舒張的影響
[0217]在一個(gè)月處理后(圖11到14，子圖A)和之后一個(gè)月清除(子圖B)和在急性實(shí)驗(yàn)中即在30分鐘孵育后(子圖C)，我們?cè)u(píng)估了主動(dòng)脈的胸部和腹部區(qū)段和腎動(dòng)脈和股部動(dòng)脈中胰島素誘發(fā)的血管舒張(圖11到14)。顯示在所研究的4個(gè)血管中反映最高血管內(nèi)-壁內(nèi)的氧化應(yīng)激最高水平的鄰-Tyr的胸部主動(dòng)脈中(圖8，子圖B，黑色條)，我們?cè)诘?周并未觀察到對(duì)補(bǔ)充有間-或鄰-Tyr的胰島素的響應(yīng)的任何顯著的進(jìn)一步下降(圖11A)。相比之下，對(duì)-Tyr補(bǔ)充組的胸部主動(dòng)脈中響應(yīng)于胰島素的血管舒張與其它組相比更高，表明氨基酸確實(shí)競(jìng)爭(zhēng)(圖11A)。我們注意到，與對(duì)照組動(dòng)物相比，補(bǔ)充有間-和鄰-Tyr的動(dòng)物的較低氧化狀態(tài)區(qū)段(腹部主動(dòng)脈和股部動(dòng)脈，參見(jiàn)圖8子圖B)中對(duì)胰島素的響應(yīng)顯著降低(圖12,13和14的子圖A)。此外，在這些動(dòng)脈中，我們?cè)趯?duì)照組與對(duì)-Tyr之間和間-Tyr組與鄰-Tyr組之間不能檢測(cè)到顯著差異(圖12A、13A和14A)。在所有區(qū)段中，通過(guò)4周清除完全消除慢性效應(yīng)(圖11、12、13和14的子圖B)。
[0218]在急性實(shí)驗(yàn)中，在與各自氨基酸一起孵育30分鐘后，血管舒張保持不變(圖11、
12、13和14的子圖C)。
[0219]在第4周這些實(shí)驗(yàn)的計(jì)算logEC50值(慢性對(duì)-、間-和鄰-Tyr補(bǔ)充)繪示于圖15中。
[0220]在胸部主動(dòng)脈的胰島素誘導(dǎo)的血管舒張實(shí)驗(yàn)中，對(duì)-酪氨酸補(bǔ)充引起的內(nèi)源性間-和鄰-酪氨酸的效應(yīng)的逆轉(zhuǎn)
[0221]從圖15上可以看出，慢性對(duì)-Tyr補(bǔ)充已導(dǎo)致與對(duì)照組動(dòng)物的相同血管相比胸部主動(dòng)脈中的血管舒張較大(注意在圖15上胸部主動(dòng)脈的黑色柱與第一個(gè)灰色柱之間有顯著差異)。此數(shù)據(jù)表明，即使在對(duì)照組動(dòng)物中，仍然存在慢性基線氧化應(yīng)激，從而導(dǎo)致可通過(guò)給藥對(duì)-Tyr而部分恢復(fù)的較低胰島素敏感性。
[0222]鄰-Tyr的 水平似乎在胸部主動(dòng)脈中最高，這與激素抵抗相關(guān)。因此，此實(shí)驗(yàn)表明，向胸部主動(dòng)脈中加載對(duì)-Tyr導(dǎo)致鄰-Tyr的部分替換和血管舒張的改進(jìn)。這是作為由主動(dòng)脈中氧化應(yīng)激引起的激素抵抗相關(guān)效應(yīng)的逆轉(zhuǎn)模型來(lái)起作用的。
[0223]在類似的進(jìn)一步提出的實(shí)驗(yàn)中，向大鼠持續(xù)活體內(nèi)補(bǔ)充鄰-Tyr和對(duì)-Tyr且在同一經(jīng)分離動(dòng)脈區(qū)段中檢查對(duì)胰島素的響應(yīng)。預(yù)期對(duì)胰島素的降低的響應(yīng)被逆轉(zhuǎn)。間-和鄰-Tyr補(bǔ)充的代謝效應(yīng)還可通過(guò)使用功能性成像來(lái)研究。此外，可在自發(fā)高血壓大鼠、朱克(Zucker)脂肪性糖尿病大鼠、具有血管緊張素-1I微型泵(minipump)的大鼠或遭受5/6腎切除的大鼠中研究對(duì)-Tyr補(bǔ)充的潛在有益效應(yīng)。
[0224]短期抗氧化劑處理對(duì)乙酰膽堿誘導(dǎo)的血管舒張的效應(yīng)
[0225]執(zhí)行利用乙酰膽堿的血管舒張實(shí)驗(yàn)。在Ach誘導(dǎo)的血管舒張的情況下，我們發(fā)現(xiàn)不同血管區(qū)段之間的顯著差異，即由Ach誘導(dǎo)的血管舒張最易在股部動(dòng)脈中完成，對(duì)Ach的敏感性在腹部中顯著更低且在胸部主動(dòng)脈中甚至更低。在胸部主動(dòng)脈和股部動(dòng)脈的情況下，用SOD和過(guò)氧化氫酶處理導(dǎo)致小而顯著的變化，然而不同區(qū)段的EC50值的差異保持顯著(圖16)。這些數(shù)據(jù)表明，Ach誘導(dǎo)的血管舒張的實(shí)質(zhì)性差異在S0D+CAT處理后保持相同，因此它并非調(diào)節(jié)血管舒張的急性氧化應(yīng)激。
[0226]此實(shí)驗(yàn)將通過(guò)Tyr補(bǔ)充以與上文“對(duì)_、間-和鄰-酪氨酸補(bǔ)充對(duì)胰島素誘導(dǎo)的血管舒張的影響”部分中所述設(shè)定類似的方式來(lái)繼續(xù)并且預(yù)計(jì)有類似效應(yīng)。
[0227]3T3-L1細(xì)胞通過(guò)紅細(xì)胞生成素(EPO)對(duì)同位素標(biāo)記的2_脫氧-D-葡萄糖的攝取
[0228]在前一實(shí)驗(yàn)中，我們?cè)?T3-L1脂肪細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)Akt磷酸化的增加和隨之發(fā)生的葡萄糖攝取的增加。在本實(shí)驗(yàn)中，我們測(cè)量了在不同濃度的EPO下在對(duì)-和鄰-Tyr存在下，3T3-L1細(xì)胞中同位素標(biāo)記的2-脫氧-D-葡萄糖的攝取(圖17)。我們發(fā)現(xiàn)，與對(duì)-Tyr對(duì)照組相比，在鄰-酪氨酸存在下EPO誘導(dǎo)的葡萄糖攝取被抑制。[0229]紅細(xì)胞生成素信號(hào)傳導(dǎo)中的Akt磷酸化
[0230]在3T3-L1脂肪細(xì)胞中通過(guò)蛋白印跡在對(duì)_、鄰和間-酪氨酸存在下研究了由于EPO的下游效應(yīng)所致的Akt磷酸化改變(圖18)。培養(yǎng)基中存在鄰-和間-Tyr抑制Akt磷酸化的正常增加。
[0231]設(shè)定對(duì)-Tyr治療方案
[0232]作為一實(shí)例，體重指數(shù)為例如29的具有代謝綜合征風(fēng)險(xiǎn)的血脂異常患者參與規(guī)律性醫(yī)療控制。以600mg的日攝入分三次劑量每次200mg開(kāi)始對(duì)-L-酪氨酸療法。每?jī)芍軠y(cè)量對(duì)-Tyr、鄰-Tyr和間-Tyr的血清和尿液水平與一般血液參數(shù)，包括血清胰島素和葡萄糖。提出低脂低葡萄糖飲食并由患者保持。在對(duì)結(jié)果有所了解的情況下將對(duì)-Tyr劑量增加到有效水平。
[0233]作為又一實(shí)例，患有高血壓疾病且在最近一個(gè)月的規(guī)律性日常工作下壓力增加的男性患者參與醫(yī)療控制。在這種情況下，他將咖啡因攝入的增加與糖聯(lián)系在一起。測(cè)量他的高敏感性C反應(yīng)蛋白(hsCRP)水平以及他的血清胰島素和血漿葡萄糖水平。發(fā)現(xiàn)每一測(cè)量值均接近于正常范圍的上限，而血漿葡萄糖稍微超過(guò)它。以3g的日攝入(三次Ig劑量)開(kāi)始對(duì)-Tyr療法，在一個(gè)月內(nèi)再次測(cè)量所有參數(shù)并發(fā)現(xiàn)略有降低，繼續(xù)對(duì)-Tyr療法且在又一個(gè)月內(nèi)，值返回到培養(yǎng)基正常范圍。以1.5g的日攝入分三次劑量繼續(xù)對(duì)-Tyr療法。
[0234]工業(yè)適用性
[0235]本發(fā)明提供用于治療激素抵抗病癥和慢性氧化應(yīng)激病癥的化合物、調(diào)配物和方法。 [0236]參考文獻(xiàn)
[0237]Abramson J L et al.(2005)Association between novel oxidative stressmarkers and C-reactive protein among adults without clinical coronary heartdisease.Atherosclerosis178(2005) 115 - 121
[0238]Alberti KGj Zimmet PZ.Definition, diagnosis and classification of diabetesmellitus and its complications.Partl!Diagnosis and classification of diabetesmellitus provisional report of a WHO consultation.Diabet Med.1998; 15:539-553.[0239]Avogaro A，de Kreutzenberg SVj Fadini GP Oxidative stress and vasculardisease in diabetes:1s the dichotomization of insulin signaling still valid?FreeRadic Biol Med2008;44:1209-15.[0240]Balkau B，Charles MA: Comment on the provisional report from the WHOconsultation.European Group for the Study of Insulin Resistance (EGIR)DiabetMed.1999May;16(5):442-3.[0241]Berdichevsky A，Guarente Lj Bose A: Acute oxidative stress canreverse insulin resistance by inactivation of cytoplasmic JNK.J BiolChem.2010Jul9 ;285(28):21581-9.[0242]Brasnyo P，Molnar GA，Mohas M，Marko Lj Laczy B，Cseh J，Mikolas E，SzijartoIAj Merei A, , Halmai Rj Meszaros LGj Siimegi Bj Wittmann 1: Resveratrol improvesinsulin sensitivity, reduces oxidative stress and activates the Akt pathway intype2diabetic patients.Br J Nutr.2011Mar9:1-7.[Epub ahead of print]
【權(quán)利要求】
1.一種選自對(duì)-L-酪氨酸(對(duì)-Tyr)和對(duì)-Tyr前體、優(yōu)選對(duì)-OH-苯基-丙酮酸鹽、或其醫(yī)藥上可接受的鹽的化合物，所述化合物在受試者中用于預(yù)防、改善或治療由于氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的激素抵抗所致的病況或病癥，其中，所述對(duì)-Tyr前體在所述受試者中代謝為對(duì)-Tyr0
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的供使用的化合物，其中，所述受試者是患有氧化應(yīng)激性疾病、優(yōu)選患有慢性氧化應(yīng)激性疾病的受試者。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的供使用的化合物，其中，所述氧化應(yīng)激的特征在于 -所述受試者的體液中或所述受試者的組織中增加水平的間-酪氨酸(間-Tyr)和/或鄰-酪氨酸(鄰-Tyr )，其中，所述體液選自血清、血漿、尿液、唾液、液體、眼淚，其中，所述受試者的組織選自脂肪組織、肌肉、來(lái)自腎或肝的活檢樣本，和/或 -所述患者的體液中高的正常水平或增加水平的高敏感性C反應(yīng)蛋白(hsCRP)，其中，所述體液是血清或血漿。
4.根據(jù)權(quán)利要求1到3中任一項(xiàng)所述的供使用的化合物，其中，所述化合物用于預(yù)防由于氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的激素抵抗所致的病況或病癥且將在所述病況或病癥發(fā)作前給藥，其中，優(yōu)選地，所述受試者遭受氧化應(yīng)激或易患所述病況或病癥。
5.根據(jù)權(quán)利要求1到4中任一項(xiàng)所述的供使用的化合物，其中，所述激素抵抗是胰島素抵抗。
6.根據(jù)權(quán)利要求1到4中任一項(xiàng)所述的供使用的化合物，其中，所述激素抵抗是紅細(xì)胞生成素抵抗。
7.根據(jù)權(quán)利要求1到4中任一項(xiàng)所述的供使用的化合物，其中，所述激素抵抗是乙酰膽堿抵抗。
8.根據(jù)權(quán)利要求1到7中任一項(xiàng)所述的供使用的化合物，其中，所述病況選自高血壓、脂肪組織或脂肪細(xì)胞中的氧化應(yīng)激、貧血、慢性貧血、缺血、血管疾病、慢性腎病(CRF)、慢性心臟衰竭(CHF)、腎的氧化應(yīng)激、阻塞性睡眠呼吸暫停綜合征、與激素抵抗有關(guān)的惡性腫瘤或作為其結(jié)果的任何病況。
9.根據(jù)權(quán)利要求1到8中任一項(xiàng)所述的供使用的化合物，其中，通過(guò)鄰-Tyr和/或間-Tyr的形成并通過(guò)將所述鄰-Tyr和/或間-Tyr并入到細(xì)胞蛋白中、優(yōu)選并入到抵抗與所述病況有關(guān)的激素的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)途徑的至少一種細(xì)胞蛋白中，所述激素抵抗由氧化應(yīng)激來(lái)誘導(dǎo)。
10.根據(jù)權(quán)利要求1到8中任一項(xiàng)所述的供使用的化合物，其中，所述激素通過(guò)磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K) /AKT途徑起作用。
11.根據(jù)權(quán)利要求9所述的供使用的化合物，其中，所述至少一種蛋白選自所述激素的受體的細(xì)胞內(nèi)部分、胰島素受體IRS1、IRS2.PD3K, PDKU Akt和GLUT4。
12.根據(jù)權(quán)利要求1到11中任一項(xiàng)所述的供使用的化合物，其中，所述病況的所述預(yù)防、改善或治療包含根據(jù)所述受試者定制的個(gè)性化方案，其中，向所述受試者給藥所述化合物持續(xù)至少7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天或15天，更優(yōu)選持續(xù)至少一個(gè)月、至少2個(gè)月、至少3個(gè)月、至少4個(gè)月或至少持續(xù)半年或至少I(mǎi)年或至少2年或至少3年或至少5年或至少10年或終生。
13.—種調(diào)配物，包含根據(jù)權(quán)利要求1到12中任一項(xiàng)中所定義的化合物，用于在受試者中預(yù)防、改善或治療與由氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的激素抵抗有關(guān)的病況， 所述調(diào)配物選自醫(yī)藥組合物和藥劑。
14.一種調(diào)配物，包含根據(jù)權(quán)利要求1到12中任一項(xiàng)中所定義的化合物，用于在受試者中預(yù)防、改善或治療與氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的激素抵抗有關(guān)的病況， 所述調(diào)配物選自具有健康聲明的飲食補(bǔ)充劑、營(yíng)養(yǎng)制品、功能性食物、食物和組合物。
15.根據(jù)權(quán)利要求13或14中任一項(xiàng)所述的供使用的調(diào)配物，所述調(diào)配物包含以下劑量的所述化合物:至少 100mg、200mg、300mg、400mg、500mg、600mg、700mg、800mg、900mg、Ig和 / 或至多 10g、7.5g、5g、3g、2.5g、2g、l.8g、l.6g、l.5g、l.4g、l.31300mg、1200mg、llOOmg、1000mg、900mg、800mg、700mg、600mg、500mg,且所述調(diào)配物每天給藥一次、兩次或三次或調(diào)配為提供等效日攝入量。
16.一種根據(jù)權(quán)利要求1到12中任一項(xiàng)中所定義的化合物在用于制備用以預(yù)防、改善或治療根據(jù)權(quán)利要求1到11中任一項(xiàng)中所定義的病況的調(diào)配物中的用途，其中，優(yōu)選地，所述調(diào)配物是根據(jù)權(quán)利 要求13到15中任一項(xiàng)中所定義的調(diào)配物。
【文檔編號(hào)】A61K31/198GK103998033SQ201280030850
【公開(kāi)日】2014年8月20日 申請(qǐng)日期:2012年6月25日 優(yōu)先權(quán)日:2011年6月23日
【發(fā)明者】伊什特萬(wàn)·維特曼, 蓋爾格·阿提拉·莫爾納, 朱迪特·莫哈斯切赫, 伊什特萬(wàn)·安德拉什·茲雅托 申請(qǐng)人:佩奇大學(xué)