用于治療缺血性損傷的化合物的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及用于在急性缺血/再灌注影響治療中使用的微小RNA(miRNA)化合物，用于通過使用生物樣品的缺血-再灌注試驗、預(yù)處理試驗和后處理試驗制備miRNA化合物的方法，miRNA化合物在制備在缺血性心臟疾病中具有細胞保護作用和/或抗缺血作用的藥物組合物中的用途。
【專利說明】用于治療缺血性損傷的化合物

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種通過檢測缺血再灌注、檢測生物樣品預(yù)處理和檢測生物樣品后處 理制備特定的微小RNA(miRNA)化合物的方法，用于細胞或組織的預(yù)防和/或治療以保護它 們免于在易感染于缺血或缺血發(fā)作的患者體內(nèi)急性缺血再灌注損傷的影響的miRNA化合 物及包括它們的藥物組合物，還涉及miRNA化合物及編碼它們的核苷酸在診斷和在制備藥 物組合物中的用途，及用于治療需要保護細胞或組織免于急性缺血再灌注損傷的影響的患 者的方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 微小 RNA
[0003] 微小RNA (miRNA)是小的（長度約18至約25個核苷酸，優(yōu)選地長度19-23個核苷 酸）非蛋白質(zhì)編碼RNA分子，它們在當(dāng)前被認為是基因表達的內(nèi)源性生理調(diào)節(jié)劑[Bartel DP2004]。最近，miRNA通過抑制或激活翻譯/轉(zhuǎn)錄（"RNA干擾"）在基因表達的轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié) 中起到的重要作用已被公認[Lim LP等，2005 ;Buchan JR等，2007]。雖然不同的人體miRNA 的總數(shù)估計高達1000個，體現(xiàn)了整個基因組的大概1-2%，但迄今為止只研究了約300-500 個[Small EM等，2010]。然而在很多情況下，靶向基因和因此相關(guān)的生物功能還尚未被識 另IJ，據(jù)估計miRNA調(diào)節(jié)整個基因組高達30%的基因。大量的miRNA和更大量的靶向基因顯 示了在大范圍疾病的開始和發(fā)展中miRNA的重要作用。miRNA活性可以以各種方式被對抗， 例如通過反義miRNA、所謂的反義寡核苷酸（antagomir)或miRNA抑制劑，因此，與疾病相 關(guān)的特定的miRNA的上調(diào)可通過依據(jù)miRNA的表達在體內(nèi)或體外給藥miRNA抑制劑的治療 被正?；?。miRNA的效果可與miRNA激動劑化合物一起取得，miRNA激動劑例如為miRNA模 擬物，因此，在這種情況下，與疾病相關(guān)的特定的miRNA的下調(diào)可在體內(nèi)或體外通過外源給 藥miRNA激動劑（例如miRNA模擬物）被正?；３酥?，使與疾病相關(guān)的miRNA正常 化表達的藥物可被開發(fā)。
[0004] 已知miRNA在一些器官和/或組織的細胞水平的許多生理和病態(tài)過程中起到重要 作用。例如，在心臟中，這些過程包括缺血再灌注損傷、心肌纖維化、肥厚性反應(yīng)、肌細胞收 縮、心臟發(fā)育、和心律失常[van Rooij E等，2007]。最近，若干小組報道了 miRNA在心肌梗 塞的病理學(xué)中的參與[Ren XP等，2009 ;Dong S等，2009]。miRNA在心臟病理學(xué)中的重要性 暗示了它們的治療前景和/或診斷潛力[Frost RJ等，2010 ;Fasanaro P等，2010]。然而， miRNA在心肌缺血中的作用，特別是在心肌缺血再灌注損傷和內(nèi)源性心肌保護機制如缺血 預(yù)處理和缺血后處理的早期階段中的作用是未知的。
[0005] 缺血件心腫病和心肌保護
[0006] 缺血性心臟病在工業(yè)化國家是死亡的首要原因。缺血性心臟病包括急性心肌梗塞 (MI (其中心肌組織死亡從而出現(xiàn)急性心力衰竭和心律失常）以及慢性心肌梗塞引發(fā)的心 臟組織重塑和心臟衰竭。當(dāng)冠狀動脈變得閉塞、并且不能再將血液供應(yīng)到心肌組織時發(fā)生 MI。這通常主要歸因于脆弱的動脈粥樣硬化斑塊破裂后的冠狀動脈閉塞（堵塞），它是動脈 壁上的脂質(zhì)（脂肪酸）和白血細胞（特別是巨噬細胞）的不穩(wěn)定聚集。冠狀動脈閉塞也可 通過其他機制發(fā)生，例如通過動脈的機械性閉塞，如在心臟手術(shù)期間，或通過動脈的突然收 縮，如由于交感緊張的病理性增加。
[0007] 當(dāng)急性心肌梗塞發(fā)生時，該組織不再接收充足的血液流動并在幾小時內(nèi)死亡。在 心肌梗塞的冠狀閉塞之后的幾秒內(nèi)，灌注下的心肌細胞不再收縮，導(dǎo)致壁運動異常，梗塞內(nèi) 部和周圍的高壁壓力、抑制的心室功能、及出現(xiàn)心律失常。在受影響的心肌組織內(nèi)的細胞死 亡后的幾周內(nèi)，心肌細胞被替換為疤痕組織。因此，我們可明確區(qū)別急性心肌梗塞（特征為 快速細胞死亡）和慢性梗塞（特征為疤痕組織的形成及心肌組織的重塑）。
[0008] 在急性心肌梗塞之前通常有警示信號和警示癥狀。與急性心肌梗塞有關(guān)的疼痛可 感覺像嚴(yán)重的胃灼熱?；加屑毙怨Ｈ幕颊呖赡軙杏X到胸腔內(nèi)的壓迫或擠壓疼痛，有時 伴有出汗、暈眩、惡心或嘔吐。他們可能也會經(jīng)受從胸部延伸到下巴、左手臂或左肩膀的疼 痛。感覺胸悶，伴有呼吸氣短超過幾秒以上、或伴有突發(fā)的壓倒性的疲勞發(fā)作都是非常常見 的警示信號。
[0009] 急性心肌梗塞的治療已進入新的時代，其中，死亡率可通過允許血流快速回流到 梗塞的缺血區(qū)域的程序（例如再灌注治療）大約被減半。但是，再灌注可能導(dǎo)致進一步的 并發(fā)癥，如減弱的心肌收縮功能（暈眩）和心律失常。此外，有實驗證據(jù)表明，不可逆的細 胞損傷導(dǎo)致的細胞壞死和細胞凋亡通過再灌注可能被提高。因此，開發(fā)抗缺血劑以在缺血 再灌注期間延遲細胞壞死的開始并限制梗塞的總程度從而改善心肌功能以及減少心律失 常的發(fā)病率是重大的臨床重要性，[參見綜述：Ferdinandy P等，2007]。
[0010] 早期的用于減弱缺血再灌注損傷影響的藥理方法具有有限的實驗效果或未能轉(zhuǎn) 化成實用的臨床療法。但是最近，心臟已顯示出具有顯著的適應(yīng)缺血再灌注壓力的能力，并 且在缺血再灌注中，心臟的這種分子可塑性已成為努力研究的焦點，以期望潛在的機制可 被運用于治療開發(fā)。
[0011] 最近，一些研究已表明，miRNA通過改變關(guān)鍵信號元素來有助于缺血再灌注損 傷，從而使他們成為潛在的治療靶點。使用各種體內(nèi)、間接體內(nèi)和體外模型的研究已表明 miR-1、miR-21、miR-29、miR-92a、miR-133、miR-199a 和 miR-320 參與到缺血再灌注和 / 或心肌梗塞后的重塑的可能性[參見例如Ye Y.等，2011，Ren XP等，2009]。Sepramaniam S.等（2010)已表明反義miR-320a可引起伴隨水通道蛋白1及4mRNA及蛋白表達增加的 腦內(nèi)缺血梗塞體積的減少，這與Ren XP等（2009)的結(jié)果不同，并表明miRNA在腦內(nèi)的調(diào)節(jié) 不同于在心臟中的調(diào)節(jié)。現(xiàn)已表明，肌肉和/或心臟特定的miRNA miR-1、miR-133a/b和 miR-208相對于它們在胎心中的調(diào)節(jié)，參與人體MI后的重塑[Bost jancic E.等，2010, He B， 等，（2011)]。
[0012] Godwin JG，等（2010)提供了在腎缺血再灌注模型中腎缺血再灌注損傷的miRNA信 號。他們發(fā)現(xiàn)了 miR-192顯著地下調(diào)?，F(xiàn)已識別miRNA信號在整個外圍血液中作為新的生 物標(biāo)記用于急性心肌梗塞，并報道了血漿miR-30C水平的顯著提高[Meder B等，2010]。
[0013] Dong S等（2009)研究了 miRNA-21的作用，并表明miRNA-21顯示了對抗缺血誘發(fā) 的心肌細胞損傷的保護作用。然而，作者沒有研究在沒有再灌注及預(yù)處理和后處理的情況 下實施的冠狀動脈的永久性閉塞。Cheng Y(2010)也表明缺血預(yù)處理調(diào)節(jié)的miRNA-21保護 心臟免于缺血/再灌注損傷。兩個作者審查了只有在缺血狀態(tài)開始6小時后miRNA才表達， 在這個時間點梗塞在小鼠心臟中充分形成。本發(fā)明的發(fā)明人基于用于獲得樣品的預(yù)處理、 后處理及更為狹窄的、臨床上更為重要的時間窗口的特定研究得出不同的結(jié)果。
[0014] YinKJ等（2010)已發(fā)現(xiàn)miR-497在腦缺血后顯著地上調(diào)，并表明這一 miRNA通過 負向調(diào)控抗凋亡蛋白、bcl-2和bcl-w促進缺血性神經(jīng)元死亡，并且這一方式可有助于中風(fēng) 的缺血性腦損傷的發(fā)病機理。
[0015] Xu，Ch 等（2009)已表明 mmu_miR-23a、mmu-miR-326、mmu-mi R-346_MM1 和 mmu-miR-370在IPC對抗肝臟中肝臟I/R損傷的保護機制中的潛在作用。然而，miRNA在肝 臟中的表達模式似乎明顯地不同于其在心臟中的表達模式。在這一研究中，沒有測量梗塞 尺寸。
[0016] Lusardi TA等（2010)表明缺血預(yù)處理調(diào)控了 miRNA的表達和它們在老鼠大腦皮 層中的預(yù)測靶向目標(biāo)。沒有暗含表明用于急性心肌梗塞的治療。
[0017] He B，等（2011)研究了承受缺血/再灌注的心臟中的miRNA的表達，并發(fā)現(xiàn)了任 意選取的miRNA-Ι和miRNA-133在后處理中是上調(diào)的。作者試圖發(fā)現(xiàn)這些miRNA的靶向目 標(biāo)。沒有給出使用這些或其他的miRNA用于治療的建議。
[0018] 一些miRNA在本領(lǐng)域中因為在心臟疾病或缺血性病癥中具有作用已被提到。例 如，在 US2010/0010073[Thum T.，Bauersachs J. 2010]中大量的 miRNA 序列在心臟疾病的 預(yù)防或治療中作為潛在的活性物質(zhì)被提出，其中包括miR-134、miR-212、miR-214、miR-21、 miR-129、miR-182 和 miR-290。
[0019] Wang X.等（2010)已發(fā)現(xiàn)革巴向促凋亡蛋白和抗凋亡蛋白的MiRNA-494保護對抗缺 血-再灌注引發(fā)的心臟損傷。
[0020] 在 W02009/062169(2009)和 US2010/0317713(2010)中 Olson E.和 Van Rooij， Ε·表明 miR-15 家族（miR-15a、miR-15b、miR-16、miR-195、miR-424 和 miR-497)的抑制作 用在心臟肥大、心臟衰竭或心肌梗塞的治療中及用于這些疾病的診斷中將是有用的。實驗 數(shù)據(jù)主要涉及心臟的形態(tài)學(xué)研究，但沒有得出這些分子在急性缺血再灌注損傷中的細胞保 護作用的結(jié)論。
[0021] W02010/103015[Engelhardt S.和 Jentzsch C. (2010)]報道了在心肌細胞用 471 個人體前體的miRNA庫進行轉(zhuǎn)染的實驗，并研究了它們對心肌細胞的尺寸及形態(tài)的影響。 雖然可以得出這些miRNA對心肌細胞的影響的間接提示，但沒有得出它們的心肌保護作用 的明確結(jié)論。
[0022] 在恥2010/135570[01801^.和￥3111?000_3.2010]中試圖識別在隨后的心肌梗塞 (MI)中參與的miRNA，MI在小鼠心臟中被實驗性地誘導(dǎo)，并且對比了在MI后在第3天和14 天的小鼠心臟中的miRNA表達譜。沒有公開在MI或急性缺血再灌注后很快的miRNA調(diào)控 的指示。
[0023] 在 W〇2〇10/〇9l2〇4[01son E.和 Van Rooij，E. 2010]中提出共同給藥 miR_2〇8a 或 miR-208b的抑制劑及miR-499的抑制劑用于治療心臟肥大、心臟衰竭或MI，正如已發(fā)現(xiàn)這 些miRNA的擊倒效應(yīng)（knockdown)抑制心臟應(yīng)激反應(yīng)。沒有提供直接證據(jù)。
[0024] 在EP2275545Al[Thum T.和Fiedler, J. 2011]中在心肌梗塞后的第14天在內(nèi)皮 細胞中檢測到了 miR-24上調(diào)，然而miR-24水平在心肌梗塞后的心肌細胞中并未改變（圖 Id)。接著，心臟內(nèi)皮細胞被抑制的反義寡核苷酸和miR-24表達靶向。在小鼠中，在心肌 梗塞后使用反義寡核苷酸對抗miR-24的及時治療導(dǎo)致心臟功能的改善和左心室擴張的衰 減。
[0025] 在W02010/120969[01son E.等2010]中公開了 miR-30家族成員在心肌梗塞后的 第3天和14天的心臟組織中是下調(diào)的。在MI后的即刻或不久之后沒有提供有關(guān)miR30家 族調(diào)控的數(shù)據(jù)。
[0026] 在CN101643791A[WangN.等2010]中提議在診斷、預(yù)防和治療包括心肌梗塞的心 臟疾病中使用miRNA-328的反義核苷酸。
[0027] 在 W02011/084460[Qlson Eric N. ;Rooi j Eva Van ;Quiat Daniel2011]中研究了 在心肌梗塞后的6、24、48小時和/或在再灌注之后miRNA的上調(diào)或下調(diào)。已發(fā)現(xiàn)在MI 后，一些miRNA是上調(diào)的，一些miRNA是下調(diào)的，然而調(diào)控水平在不同的時間點是不同的。 作者提供了關(guān)于哪些miRNA應(yīng)當(dāng)被對抗（miR-15家族、miR-30家族、miR-92a、miR-320、 miR-20、miR-199a、miR-499a)，或者在研究條件下是否應(yīng)當(dāng)在它們中給予激動劑（miR-126、 miR-143、miR-210和miR-29a-c)的建議。沒有在預(yù)處理或后處理中有關(guān)miRNA調(diào)控數(shù)據(jù) 的報道，然而，也沒有缺血再灌注期間或缺血再灌注后即刻的信息。
[0028] 這些出版物在梗塞之后通?？紤]miRNA的后期上調(diào)，通常是缺血發(fā)作或它們的實 驗?zāi)M后的數(shù)天，并且不涉及miRNA在急性缺血再灌注損傷中的細胞保護作用，并且作者 沒有檢查細胞保護作用中miRNA的潛在作用。此外，在大量的miRNA的情況下，本發(fā)明的發(fā) 明人已發(fā)現(xiàn)在實驗設(shè)定中miRNA種類（species)的不同調(diào)控，其中，在預(yù)處理和后處理中研 究了特定的細胞保護作用。
[0029] 在現(xiàn)有的實驗中，其中，僅以非常少的實例公開了所分析的miRNA或它們的激動 劑或拮抗劑；通常情況，僅僅描述了在疾病條件下或在它們的實驗?zāi)Ｐ椭杏嘘P(guān)該miRNA調(diào) 控的觀察。
[0030] 本領(lǐng)域似乎沒有提到用于得到在組織或器官的缺血再灌注中并且特別是急性缺 血和/或再灌注中特定參與細胞保護性miRNA以及相關(guān)化合物（miRNA化合物，例如miRNA 模擬物和/或miRNA抑制劑）的方法。本發(fā)明的發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，如果考慮miRNA種類在預(yù)處 理和/或后處理中的調(diào)控，可獲得細胞保護性miRNA化合物。所述化合物在急性缺血和/ 或再灌注損傷期間、之前或之后的細胞保護作用中是特別有用的。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0031] 本發(fā)明渉及一種用于獲得微小RNA(miRNA)化合物的方法，該化合物用于在治療 中保護細胞或組織免于在易感染于缺血的或缺血發(fā)作的患者心臟內(nèi)急性缺血性損傷和/ 或急性再灌注損傷的影響，
[0032] i)提供包含表達的miRNA種類的生物樣品組，所述樣品組包括
[0033] 對照樣品，
[0034] 第一樣品和
[0035] 第二樣品和/或
[0036] 第三樣品
[0037] 其中，所述樣品能夠經(jīng)受缺血，
[0038] ii )使每個樣品承受需氧灌注一段時間，并在這段時間內(nèi)
[0039] 使所述對照樣品既不承受缺血也不承受預(yù)處理或后處理，從而獲得非缺血對照樣 品，和
[0040] 使所述第一樣品承受缺血，從而承受缺血樣品，和
[0041] 通過使第二樣品承受預(yù)處理治療方案并隨后承受缺血來預(yù)處理第二樣品，從而獲 得預(yù)處理的樣品，和/或
[0042] 通過使第三樣品承受缺血并隨后承受后處理治療方案來后處理第三樣品，從而獲 得后處理的樣品，
[0043] iii)評價miRNA種類的表達水平
[0044] -在非缺血對照樣品中，
[0045] -相對于所述非缺血對照樣品，在缺血樣品中，和
[0046] -相對于所述非缺血對照樣品，在預(yù)處理的樣品中，和/或
[0047] -相對于所述非缺血對照樣品，在后處理的樣品中，和
[0048] iv)計算所述miRNA種類的表達水平的比率
[0049] -相對于缺血樣品，在預(yù)處理的樣品中，和/或
[0050] -相對于缺血樣品，在后處理的樣品中，
[0051] v)相對于所述缺血/再灌注樣品，在所述預(yù)處理的樣品和/或后處理的樣品中， 識別miRNA種類的表達水平被上調(diào)至少1. 3倍，優(yōu)選至少1. 5倍，或至少1. 8倍或至少2. 0 倍，或下調(diào)至少1. 3倍，優(yōu)選1. 5倍或至少1. 8倍或至少2. 0倍，
[0052] vi )獲得所述miRNA種類的核苷酸序列，
[0053] vii)合成 miRNA 化合物，
[0054] -所述miRNA化合物是所述miRNA種類的miRNA激動劑，稱為預(yù)缺血細胞保護性 miRNA種類，條件是該miRNA種類相對于缺血樣品在預(yù)處理的樣品中是上調(diào)的，和/或
[0055] -所述miRNA化合物是所述miRNA種類的miRNA激動劑，稱為后缺血細胞保護性 miRNA種類，條件是該miRNA種類相對于缺血樣品在后處理的樣品中是上調(diào)的，
[0056] 和 / 或
[0057] -所述miRNA化合物為所述miRNA種類的miRNA拮抗劑，稱為預(yù)缺血細胞病變 miRNA種類，條件是該miRNA種類相對于缺血樣品在預(yù)處理的樣品中是下調(diào)的，和/或
[0058] -所述miRNA化合物為所述miRNA種類的miRNA拮抗劑，稱為后缺血性細胞病變 miRNA種類，條件是該miRNA種類相對于缺血樣品在后處理的樣品中是下調(diào)的。
[0059] 在本發(fā)明中，用于表達水平評估的樣品優(yōu)選地在缺血結(jié)束后最多l(xiāng)h、l. 5h、2h、 2. 5h或3h后被收集。優(yōu)選地，在缺血結(jié)束后最多l(xiāng)h、l. 5h、2h、2. 5h或3h后進行再灌注。 優(yōu)選地，在缺血結(jié)束后最少0. 5h或lh或1. 5h進行再灌注。
[0060] 在優(yōu)選實施例中，缺血包括缺血及再灌注。
[0061] 在另一優(yōu)選實施例中，缺血可被視為缺氧。在優(yōu)選實施例中，缺氧包括缺氧和復(fù) 氧。
[0062] miRNA種類的顯著上調(diào)或下調(diào)在本文中被稱為是miRNA種類的改變或變化水平， 其至少1. 3倍或優(yōu)選至少1. 5倍或至少1. 8倍或至少2. 0倍或可能的高于可接受的p值， 優(yōu)選地以在統(tǒng)計學(xué)顯著性測試中不大于0. 05的p值（或以p〈0. 05)。應(yīng)當(dāng)理解的是，顯著 性問題可取決于測量方法以及測量精度或正確性。因此，重要的是上調(diào)或下調(diào)的水平顯著 低于使用條件下的水平，然而以數(shù)字給定的水平可以是變化的，因為對于本領(lǐng)域技術(shù)人員 是清楚理解地。優(yōu)選地，在本發(fā)明的任一實施例中，miRNA種類的表達水平是
[0063] 上調(diào)至少1. 5倍，高度優(yōu)選地至少1. 8倍，或至少2倍，和/或
[0064] 下調(diào)至少1. 5倍，高度優(yōu)選地至少1. 8倍，或至少2倍。
[0065] 在優(yōu)選實施例中，下調(diào)通過對數(shù)比例來評估，優(yōu)選通過log2比例或通過線性比例 評估。
[0066] 在本發(fā)明實施例中，治療或預(yù)防急性心肌梗塞。
[0067] 在優(yōu)選實施例中，所述miRNA化合物選擇由下述任一的miRNA種類的miRNA激動 劑組成的組：miR-333、miR-188、miR-125b*、miR-139-3P、miR-320、miR-532-3P、miR-451、 miR-212、miR-192、miR-139_5P、miR-503、miR-33、miR-328、miR_181a、miR_7b、let7e、 let7i、miR-1 和下述任 一 miRNA 種類的 miRNA 拮抗劑：miR_487b、miR-208、miR_19b、 miR-19a 和 miR-352、miR-93、miR-494、miR-106b 以及它們的任何組合。
[0068] 在更優(yōu)選實施例中，所述miRNA化合物選自由下述任一的miRNA種類的miRNA 激動劑組成的組：miR-125b*、miR-139-3p、miR-532-3p、miR-212、miR-139-5p、miR-33、 miR_let7b和下述任一 miRNA種類的miRNA拮抗劑：miR_494、miR_487b以及它們的任意組 合。
[0069] 在優(yōu)選實施例中，識別的miRNA種類是預(yù)缺血細朐保護件miRNA種類,其中，
[0070] 該預(yù)缺血細胞保護性miRNA種類選自由以下組成的組：miR-320、miR-139-3p、 11^1?-139-5?、11^1?-188、11^1?-192、11^1?-532-3?、11^1?-12513*、11^1-451、11^1?-212、它們的前體、與 它們具有相同的種源區(qū)的miRNA種類、為它們的家族成員的miRNA種類，
[0071] 其中，該miRNA化合物用于在治療中保護細胞或組織免于在易感染于缺血患者內(nèi) 的缺血性損傷和/或再灌注損傷的影響。
[0072] 在優(yōu)詵實施例中，該預(yù)缺血細朐保護件miRNA種類相對于非缺血對照樣品在預(yù)處 理的樣品中是顯著上調(diào)的，和/或
[0073] 該miRNA種類相對于非缺血對照樣品在缺血樣品中是顯著下調(diào)的。
[0074] 為了提供解釋，相對于非局部缺血對照樣品，在預(yù)處理的樣品中是顯著上調(diào)的預(yù) 缺血細胞保護性miRNA種類，在使組織適應(yīng)缺血和/或再灌注中具有潛在的作用。在優(yōu)選 實施例中，識別的miRNA種類是后缺血細朐保護件miRNA種類,其中，
[0075] 所述后缺血細胞保護性miRNA種類選自由以下組成的組：miR-125b*、miR-33、 miR-139_3p、miR-320、miR-532_3p、miR-188、miR_let7e、miR_let7i、miR-1、miR-503、 miR-335、miR-328、miR-181a、miR-let7b、它們的前體、與它們具有相同的種源區(qū)的miRNA 種類，為它們的家族成員的miRNA種類，
[0076] 其中，所述miRNA化合物用于在治療中保護細胞或組織免于在缺血發(fā)作的患者中 急性缺血性損傷的影響。
[0077] 在優(yōu)詵實施例中，該后缺血細朐保護件miRNA種類相對于非缺血對照樣品在后處 理的樣品中是顯著上調(diào)的，和/或
[0078] 所述miRNA種類相對于非缺血對照樣品在缺血樣品中是顯著下調(diào)的。
[0079] 為了提供解釋，相對于非缺血對照樣品，在后處理的樣品中也是顯著上調(diào)的后缺 血細胞保護性miRNA種類，在使組織適應(yīng)缺血和/或再灌注中可能具有作用。
[0080] 如果預(yù)缺血或后缺血細胞保護性miRNA種類的水平相對于非缺血樣品在缺血樣 品中沒有顯著地變化，這表明所述miRNA沒有參與缺血性損傷。
[0081] 如果預(yù)缺血或后缺血細胞保護性miRNA種類在缺血樣品中顯著地下調(diào)，即在缺血 和預(yù)處理或后處理中分別觀察到相反調(diào)控，這表明所述miRNA具有特別強的保護作用。
[0082] 在優(yōu)選實施例中，識別的miRNA種類是預(yù)缺血細朐病奪miRNA種類,其中
[0083] 該預(yù)缺血細胞病變miRNA種類選自由以下組成的組：mir_487b、miR-494、 miR-352、miR-93、miR-106b、它們的前體、與它們具有相同的種源區(qū)的miRNA種類，為它們 的家族成員的miRNA種類，
[0084] 其中，所述miRNA化合物用于在治療中保護細胞或組織免于在易感染于缺血的患 者中缺血性損傷和/或再灌注損傷的影響。
[0085] 在優(yōu)選實施例中，該預(yù)缺血細朐病奪miRNA種類相對于非缺血對照樣品在預(yù)處理 的樣品中是顯著下調(diào)的。
[0086] 相對于缺血樣品，在預(yù)處理的樣品中下調(diào)的所述預(yù)缺血細胞病變miRNA種類被稱 為是預(yù)缺血性細胞毒性miRNA種類，條件是所述miRNA種類相對于非缺血對照樣品在缺血 樣品中也上調(diào)至少1. 3倍，優(yōu)選至少1. 5倍。
[0087] 在優(yōu)選實施例中，識別的miRNA種類是后缺血件細朐病奪miRNA種類,其中， 所述后缺血性細胞病變miRNA種類選自由以下組成的組：miR-208、miR-19b、miR-19a、 miR-130a、miR-16、miR-21、miR-22*、miR-26b、miR-30b-5p、miR-30c、miR-30c-l*、miR-30e、 1^尺-339-3口、1^1?-45(^、1^1?-499、1^1?-760-5。、1^1?-993、1^1?-993*、它們的前體、與它們具有 相同的種源區(qū)的miRNA種類、為它們的家族成員的miRNA種類，
[0088] 其中，所述miRNA化合物用于在治療中保護細胞或組織免于在缺血發(fā)作的患者中 缺血性損傷和/或再灌注損傷的影響。
[0089] 在優(yōu)詵實施例中，該后缺血件細朐病奪miRNA種類相對于缺血樣品在后處理的樣 品中是顯著下調(diào)的。
[0090] 相對于缺血樣品，在后處理的樣品中下調(diào)的所述后缺血性細胞病變miRNA種類被 稱為后缺血性細胞毒性miRNA種類，條件是所述miRNA物種相對于非缺血對照樣品在缺血 樣品中也上調(diào)至少1. 3倍，優(yōu)選至少1. 5倍。
[0091] 本發(fā)明還涉及用于在治療中保護細胞、組織和/或器官免于在易感染于缺血或缺 血發(fā)作的患者中缺血性損傷和/或再灌注損傷的影響的miRNA化合物,其中所述miRNA化 合物選自
[0092] i )通過如本文所公開的本發(fā)明的方法獲得的miRNA化合物，
[0093] ii) miRNA 激動劑
[0094] -在所述細胞或組織的預(yù)處理期間，在哺乳動物的細胞或組織中預(yù)缺血性細胞保 護性miRNA種類的miRNA激動劑上調(diào)至少1. 5倍或至少1. 8倍，或至少2倍，和/或
[0095] -在所述細胞或組織的預(yù)處理期間，在哺乳動物的細胞或組織中后缺血性細胞保 護性miRNA種類的miRNA激動劑上調(diào)至少1. 5倍或至少1. 8倍，或至少2倍，
[0096] iii) miRNA 詰抗劑
[0097] -由于所述細胞或組織的預(yù)處理，在哺乳動物的細胞或組織中預(yù)缺血性細胞病變 miRNA種類的miRNA拮抗劑下調(diào)至少1. 5倍或至少1. 8倍，或至少2倍，和/或
[0098] -由于所述細胞或組織的后處理，在哺乳動物的細胞或組織中后缺血性細胞病變 miRNA種類的miRNA拮抗劑下調(diào)至少1. 5倍或至少1. 8倍，或至少2倍。
[0099] 本發(fā)明還涉及用于在治療中保護細胞、組織和/或器官免于在易感染于缺血或缺 血發(fā)作的患者中（在所述患者的心臟中）急性缺血和再灌注損傷的短期和/或直接影響的 miRNA化合物。
[0100] 其中，所述miRNA化合物在缺血發(fā)作后的5、4、3、2或1. 5小時內(nèi)或與再灌注同時 給藥患者和/或在與缺血風(fēng)險有關(guān)的手術(shù)或介入前少于一天或少于12、8、6、5、4、3、2或1 小時內(nèi)給藥患者。
[0101] 其中，所述miRNA化合物選自
[0102] ii) miRNA 激動劑
[0103] - - miRNA種類的miRNA激動劑，相對于承受缺血和再灌注的對照心臟組織樣品， 在承受缺血和再灌注的所述細胞或組織的預(yù)處理期間，哺乳動物心臟組織樣品中的所述 miRNA種類被上調(diào)至少1. 5倍，且所述miRNA種類是預(yù)缺血性細胞保護性miRNA種類，和/ 或
[0104] - - miRNA種類的miRNA激動劑，相對于承受缺血和再灌注的對照心臟組織樣品， 在承受缺血和再灌注的所述細胞或組織的后處理期間，哺乳動物心臟組織樣品中的所述 miRNA種類被上調(diào)至少1. 5倍，且所述miRNA種類是后缺血性細胞保護性miRNA種類，
[0105] iii ) miRNA 詰抗劑
[0106] - - miRNA種類的miRNA拮抗劑，由于承受缺血和再灌注的所述細胞或組織的預(yù) 處理，相對于承受缺血和再灌注的對照心臟組織樣品，在哺乳動物心臟組織樣品中的所述 miRNA種類被下調(diào)至少1. 5倍，且所述miRNA種類是預(yù)缺血性細胞病變miRNA種類，和/或
[0107] -miRNA種類的miRNA拮抗劑，由于承受缺血和再灌注的所述細胞或組織的預(yù)處 理，所述miRNA種類在哺乳動物心臟組織樣品中相對于承受缺血和再灌注的對照心臟組織 樣品中下調(diào)至少1. 5倍，且所述miRNA種類是后缺血性細胞病變miRNA種類，
[0108] 其中，所述miRNA激動劑或拮抗劑為核酸部分，所述核酸部分包含等同于或互補 于相應(yīng)miRNA種類的種源區(qū)的核苷酸序列，和/或所述核酸部分包括17到27個核苷酸長度 的核酸片段，所述核酸片段的序列等同于成熟miRNA種類的序列或等同于所述成熟miRNA 種類的互補序列、或者分別與所述成熟miRNA種類的序列或所述成熟miRNA種類的互補序 列中最多1、2、3、4、5或6個核苷酸不同。
[0109] 優(yōu)選地，所述 miRNA 化合物是選自 miR-333、miR-188、miR-125b*、miR-139-3p、 miR-320、miR-532-3p、miR-451、miR-212、miR-192、miR-139-5p、miR-503、miR-33、miR-328、 miR-181a、miR-7b、let7e、let7i、miR-l及它們的任何組合的組的miRNA種類的miRNA激動 齊U，和 / 或選自 miR-487b、miR-208、miR-19b、miR-19a、miR-352、miR-93、miR-494、miR-106b 或它們的任意組合的組的miRNA種類的miRNA拮抗劑。
[0110] 更優(yōu)選地，所述miRNA化合物為
[0111] 選自 miR_125b*、miR-139_3p、miR-532_3p、miR-212、miR-139_5p、miR-33、 miR-let7b的組的miRNA種類的miRNA激動劑，和/或
[0112] 選自miR-494、miR-487b和它們的任意組合的組的miRNA種類的miRNA拮抗劑。
[0113] 更優(yōu)選地，所述miRNA化合物選自它本身或選為來自以下組的組合，所述組由 miRNA 種類 miR-139-5p、miR-33、miR-125b*、let-7b 的激動劑，miRNA 種類 miR-494 和 miR-487b的拮抗劑組成，并且所述miRNA激動劑或拮抗劑包括核苷酸序列，所述核苷酸序 列與所述miRNA種類的種源區(qū)等同或互補，和/或所述核苷酸序列包括17到27個核苷酸 長度的核酸片段，所述核酸片段的序列與所述miRNA種類的序列等同或互補，或者分別與 所述成熟miRNA種類的序列或所述成熟miRNA種類的互補序列中最多1、2、3、4、5或6個核 苷酸不同，其中所述miRNA化合物在心肌細胞存活性測試中顯示了細胞保護作用。
[0114] 優(yōu)選地，
[0115] 所述預(yù)缺血性細胞保護性miRNA種類選自由以下組成的組：miR-320、 miR-139_3p、miR-139_5p、miR-188、miR-192、miR-532_3p、miR_125b*、miR-451、miR-212、 它們的前體、與它們具有相同的種源區(qū)的miRNA種類、為它們的家族成員的miRNA種類，和 /或
[0116] 所述后缺血性細胞保護性miRNA種類選自由以下組成的組：miR-125b*、miR-33、 miR-139_3p、miR-320、miR-532_3p、miR_let7e、miR_let7i、miR-1、miR-503、miR-328、 miR-181a、miR-7b、它們的前體、與它們具有相同的種源區(qū)的miRNA種類、為它們的家族成 員的miRNA種類，和/或
[0117] 所述預(yù)缺血性細胞病變miRNA種類選自由以下組成的組：mir-487b、miR-352、 miR-93、它們的前體、與它們具有相同的種源區(qū)的miRNA種類、為它們的家族成員的miRNA 種類，和/或
[0118] 所述后缺血性細胞病變miRNA種類選自由miR-208、miR-19b、miR-19a、和 miR-130a、miR-16、miR-21、miR-22*、miR-26b、miR-30b-5p、miR-30c、miR-30c-l*、miR-30e、 miR-339_3p、miR_450a、miR-499、miR-760_5p、miR_99a、miR_99a* 組成的組。
[0119] 在高度優(yōu)選實施例中，所述miRNA化合物在缺血發(fā)作后的4或3小時內(nèi)或與再灌 注同時給藥于患者，和/或在手術(shù)或介入之前少于6小時內(nèi)給藥于患者。
[0120] 在優(yōu)選實施例中，在預(yù)處理或后處理期間，所述miRNA激動劑或miRNA拮抗劑分別 在所述哺乳動物心臟組織樣品中的上調(diào)或下調(diào)通過以下方法進行評價：
[0121] i)提供一組包含表達的miRNA種類的生物樣品，所述樣品組包括：
[0122] 對照樣品，
[0123] 第一樣品，和
[0124] 第二樣品，和/或
[0125] 第三樣品
[0126] 其中，所述樣品能夠經(jīng)受缺血，
[0127] ii )使每個樣品于需氧灌注一段時間，并且在這段時間內(nèi)
[0128] 使所述對照樣品既不承受缺血也不承受預(yù)處理或后處理，從而獲得非缺血對照樣 品，和
[0129] 使所述第一樣品承受缺血，優(yōu)選承受缺血和再灌注，從而獲得缺血樣品，和
[0130] 通過使第二樣品承受預(yù)處理治療方案并隨后承受缺血來預(yù)處理第二樣品，從而獲 得預(yù)處理的樣品，和/或
[0131] 通過使第三樣品承受缺血并隨后承受后處理治療方案來后處理第三樣品，從而獲 得后處理的樣品，
[0132] 優(yōu)選地在缺血后不超過5小時后分離miRNA
[0133] iii)評價所述miRNA種類的表達水平
[0134] -在非缺血對照樣品中
[0135] -相對于所述非缺血對照樣品，在缺血樣品中，和
[0136] -相對于所述非缺血對照樣品，在預(yù)處理的樣品中，和/或
[0137] -相對于所述非缺血對照樣品，在后處理的樣品中，
[0138] iv)計算所述miRNA種類的表達水平的比率
[0139] -相對于缺血樣品，在預(yù)處理的樣品中，和/或
[0140] -相對于缺血樣品，在后處理的樣品中
[0141] V)相對于所述缺血/再灌注樣品，在所述預(yù)處理的樣品和/或后處理的樣品中，識 別所述miRNA種類的表達水平被上調(diào)至少1. 5倍或下調(diào)至少1. 5倍，
[0142] vi )獲得所述miRNA種類的核苷酸序列。
[0143] 在優(yōu)選實施例中，所述miRNA種類在承受于缺血和再灌注的對照心臟組織樣品中 是
[0144] -相對于非缺血對照樣品顯著上調(diào)，
[0145] -相對于非缺血對照樣品顯著下調(diào)，
[0146] -相對于非缺血對照樣品既不顯著上調(diào)也不顯著下調(diào)。
[0147] 本發(fā)明還涉及用于預(yù)防或治療在易感染于缺血或缺血發(fā)作的患者體內(nèi)（優(yōu)選 地在所述患者的心臟組織中）缺血和/或再灌注損傷影響的miRNA化合物，其中，所述 miRNA化合物選自由以下任一 miRNA種類的miRNA激動劑組成的組：miR-333、miR-188、 miR_125b*、miR-139_3p、miR-532_3p、miR-451、miR-139_5p、miR-503、miR-33、miR-328、 miR-181a ;以及以下任一 miRNA 種類的 miRNA 拮抗劑：miR-487b、miR-208、miR-19b、 miR_19a、miR-352、miR-93、miR_106b，和包括等同于或互補于所述miRNA種類的種源區(qū)的 核苷酸序列的miRNA激動劑或拮抗劑，和/或所述miRNA激動劑或拮抗劑包含17到27個 核苷酸長度的核酸片段，所述核酸片段的序列等同于成熟miRNA的序列、或等同于所述成 熟miRNA的互補序列，或分別與所述成熟miRNA種類的序列或所述成熟miRNA種類的互補 序列中最多1、2、3、4、5或6個核苷酸不同和它們的任一組合。
[0148] 在本發(fā)明中，用于表達水平評估的樣品優(yōu)選地在缺血后最多l(xiāng)h、l. 5h、2h、2. 5h或 3h之后被收集。優(yōu)選地，在缺血后的最多l(xiāng)h、1.5h、2h、2. 5h或3h后進行再灌注。優(yōu)選地， 在缺血后最少0. 5h或lh或1. 5h進行再灌注。
[0149] 在優(yōu)選實施例中，本發(fā)明還涉及至少兩個根據(jù)權(quán)利要求1至10任一所述的miRNA 化合物的組合，其中，優(yōu)選地所述組合包括至少miRNA拮抗劑和miRNA激動劑，
[0150] 所述激動劑和拮抗劑包括等同于或互補于所述miRNA種類的種源區(qū)的核苷酸序 列，和/或所述激動劑和拮抗劑包括17到27個核苷酸長度的核酸片段，所述核酸片段的序 列等同于成熟miRNA種類的序列或等同于所述成熟miRNA種類的互補序列、或與所述所述 成熟miRNA種類或所述互補序列中最多1、2、3、4、5或6個核苷酸不同，其中，所述miRNA化 合物在心肌細胞的存活性測試中顯示了細胞保護作用。
[0151] 優(yōu)選地，所述 miRNA 種類的 miRNA 激動劑選自 miR-139-5p、miR-33、miR-125b*、 let-7b的組，并且所述miRNA種類的miRNA拮抗劑選自miR-494和miR-487b的組。
[0152] 在優(yōu)選實施例中，所述miRNA化合物用于在易感染于缺血的患者體內(nèi)細胞保護受 缺血損傷的組織，所述miRNA化合物在手術(shù)之前或期間或與缺血風(fēng)險相關(guān)的介入期間給藥 所述患者，其中
[0153] 該miRNA化合物是
[0154] -預(yù)缺血性細胞保護性miRNA種類的miRNA激動劑，或
[0155] -預(yù)缺血性細胞病變miRNA種類的miRNA拮抗劑，優(yōu)選為預(yù)缺血性細胞毒性miRNA 種類。
[0156] 例如由于手術(shù)或治療介入或由于患者疾病的缺血可能會損傷細胞、組織或器官。 所述手術(shù)或治療介入優(yōu)選是所述缺血情況可被提前預(yù)測的一種，例如在其血管中，例如動 脈或動脈線是或可能是被堵塞或血液流動減緩或存在閉塞風(fēng)險或突然灌注不足的風(fēng)險。
[0157] 所述手術(shù)或介入可能是緊急介入或選擇性介入、心臟手術(shù)，例如經(jīng)皮冠狀動脈介 入治療（PCI)或血管成形術(shù)、支架安置、去除不良運作的血管，例如靜脈曲張、肺部手術(shù)、心 臟移植、肺移植、腎移植、肝移植、皮膚移植、肌肉移植等，腦或神經(jīng)系統(tǒng)手術(shù)，從心臟、大腦、 肺、腎、肝、腸、末梢血管疾病中的腫瘤的移除。優(yōu)選地，通常應(yīng)用所述miRNA化合物用于預(yù) 防的目的。
[0158] 優(yōu)選地，所述miRNA化合物用于易感染于缺血的患者，其中所述患者處于缺血的 持續(xù)風(fēng)險中，且所述miRNA化合物在給定的時間周期內(nèi)定期給藥于患者，優(yōu)選至少一周，更 優(yōu)選為至少兩周、三周、一個月、兩個月或更長，用于細胞保護受缺血損傷的組織。
[0159] 在本發(fā)明的任何實施例中，優(yōu)選地，所述易感染于缺血的患者為易感染于急性缺 血和/或急性再灌注損傷的患者。優(yōu)選地，該患者是患有心血管疾病或缺血性心臟疾病的 高風(fēng)險或至少中等風(fēng)險的患者，優(yōu)選為急性缺血和/或急性再灌注損傷，或優(yōu)選為缺血性 心臟發(fā)作。優(yōu)選地，該患者在隨后的15、12、10、8、5、3或1年中處于這些疾病的一個或多個 的死亡的風(fēng)險中。
[0160] 優(yōu)選地，所述miRNA化合物在手術(shù)或介入前少于一周、少于一天或少于12、8、6、5、 4、3、2或1小時內(nèi)給藥。
[0161] 在另一優(yōu)選實施例中，所述miRNA化合物用于細胞保護患有急性缺血性損傷和/ 或急性再灌注損傷的患者和/或接受再灌注治療的患者的組織，并給藥于
[0162] -缺血發(fā)作與再灌注之間，或就在再灌注之前，
[0163] -在缺血發(fā)作之后，優(yōu)選地在缺血發(fā)作之后的三天、一天或半天之內(nèi)，更優(yōu)選6、5、 4、3、2或1. 5小時之內(nèi)，更優(yōu)選在60、50、40或30分鐘之內(nèi)，
[0164] -在再灌注期間，或
[0165] -在再灌注之后，優(yōu)選在再灌注之后的三天、60小時、2天、1天、24小時或12小時 之內(nèi)，更優(yōu)選在6、5、4、3、2或1. 5小時之內(nèi)，更優(yōu)選在60、50、40、30、20或10分鐘之內(nèi)，或 在再灌注的同時，其中
[0166] 該miRNA化合物是
[0167] -后缺血性細胞保護性miRNA種類的miRNA激動劑，或
[0168] -后缺血性細胞病變miRNA種類的miRNA拮抗劑，優(yōu)選為后缺血性細胞毒性miRNA 種類。
[0169] 在優(yōu)選實施例中
[0170] -所述miRNA化合物包含至少16、17、18或19個核苷酸單元，優(yōu)選地約18至約25 個具有或?qū)?yīng)于所述miRNA種類的序列、或不同于其中1，2或3個核苷酸單元的序列的核 苷酸單元，或
[0171] -所述miRNA化合物是miRNA種類的互補序列、抑制劑或拮抗劑，所述miRNA化合 物包含至少或至少14、15、16、17、18或19個核苷酸單元，或約18至約25個核苷酸單元，具 有或?qū)?yīng)于所述miRNA種類的序列或至少它們的種源區(qū)的互補序列，或不同于其中1、2或 3個核苷酸單元的序列，或所述miRNA化合物包含至少7、8、9個核苷酸單元，具有或?qū)?yīng)于 至少是所述miRNA種類的種源區(qū)序列的互補序列。
[0172] 優(yōu)選地，所述miRNA激動劑是所述miRNA種類的miRNA模擬物。
[0173] 優(yōu)選地，所述miRNA拮抗劑是miRNA抑制劑，優(yōu)選為miRNA種類的反義寡核苷酸 (antagomir)〇
[0174] 在優(yōu)選的實施例中，通過RNA陣列或miRNA陣列或"芯片（chip)"技術(shù)或通過定量 RT-PCR技術(shù)評估m(xù)iRNA種類的表達水平。
[0175] 本發(fā)明還涉及一種蓋並1組僉並[，所述藥物組合物用于在治療時，在易感染于缺血 或缺血發(fā)作的患者體內(nèi)、在易感染于急性缺血或急性缺血發(fā)作的患者的心臟中，保護細胞、 組織和/或器官免于急性缺血和再灌注損傷影響，所述組合物包括一個或多個如權(quán)利要求 1至13任一項所限定的miRNA化合物及藥學(xué)上可接受的賦形劑，其中優(yōu)選地
[0176] 所述組合物包括選自下列的一種或多種miRNA化合物
[0177] --種或多種預(yù)缺血性細胞保護性miRNA種類的一種或多種miRNA激動劑，
[0178] --種或多種預(yù)缺血性細胞病變miRNA種類的一種或多種miRNA拮抗劑，
[0179] --種或多種后缺血性細胞保護性miRNA種類的一種或多種miRNA激動劑，和/或
[0180] -一種或多種后缺血性細胞病變miRNA種類的一種或多種miRNA的拮抗劑。
[0181] 優(yōu)選地，所述藥物組合物用于在治療中保護易感染于缺血或缺血發(fā)作的患者、易 感染于急性缺血或急性缺血發(fā)作的患者的心臟中的細胞、組織和/或器官免于急性缺血和 再灌注損傷的短期影響和/或直接影響，
[0182] 所述組合物包括一種或多種如本文所限定的miRNA化合物及藥學(xué)上可接受的賦 形劑。
[0183] 根據(jù)本發(fā)明，優(yōu)選地，
[0184] 所述miRNA激動劑是所述miRNA種類的激動劑，該miRNA種類同時為預(yù)缺血性細 胞保護性miRNA種類和后缺血性細胞保護性miRNA種類，和/或
[0185] 所述miRNA拮抗劑是所述miRNA種類的拮抗劑，該miRNA種類同時為預(yù)缺血性細 胞病變miRNA種類和后缺血性細胞病變miRNA種類，
[0186] 所述miRNA激動劑或拮抗劑對于保護所述患者體內(nèi)的細胞和/或組織免于急性缺 血性損傷并對抗缺血的再次發(fā)作均是有用的。
[0187] 根據(jù)本發(fā)明，所述缺血-再灌注損傷包括心血管缺血-再灌注損傷。
[0188] 根據(jù)本發(fā)明，例如在本發(fā)明的藥物組合物或治療方法中，將至少一種miRNA激動 劑和至少一種miRNA拮抗劑一起應(yīng)用。
[0189] 在另一優(yōu)選的實施例中，將一種或多種miRNA化合物與一種或多種另一化合物共 同給藥用于保護或治療如本文所公開的疾病。優(yōu)選地，所述一種或多種另一化合物選自用 于缺血性心臟疾病的化合物（有機硝酸酯、β-受體阻斷劑、鈣拮抗劑、血管緊張素轉(zhuǎn)化酶 抑制劑、代謝調(diào)節(jié)劑如曲美他嗪）、血管擴張劑、纖維蛋白溶解劑、抗血小板劑、抗炎劑、降低 心臟速率的藥物如伊伐布雷定（ivabradin)、以及用于緩解缺血性心臟疾病的風(fēng)險因素的 化合物（抗高血脂藥物如他汀類藥物、抗糖尿病化合物、抗高血壓藥、抗肥胖藥等等）。
[0190] 可依次或同時應(yīng)用或給藥多種化合物。
[0191] 在優(yōu)選的實施例中，所述藥物組合物包括多種化合物。在另一實施例中，本發(fā)明涉 及包括多種化合物的藥物試劑盒。
[0192] 本發(fā)明還渉及用于識別微小RNA(miRNA)種作為靶向目標(biāo)用于治療的方法，以保 護易感染于缺血或缺血發(fā)作的患者內(nèi)的細胞或組織免于急性缺血性損傷的影響，
[0193] i)提供一組包括表達的miRNA種類的生物樣品，所述樣品組包括
[0194] 對照樣品，
[0195] 第一樣品，和
[0196] 第二樣品，和/或
[0197] 第三樣品
[0198] 其中，所述樣品能夠經(jīng)受缺血，
[0199] ii )使每個樣品承受需氧灌注一段時間，并在這段時間內(nèi)
[0200] 使對照樣品既不承受缺血也不承受預(yù)處理或后處理，從而獲得非缺血對照樣品， 和
[0201 ] 使第一樣品承受缺血，從而犾得缺血樣品，和
[0202] 通過使第二樣品承受預(yù)處理治療方案并隨后承受缺血來預(yù)處理第二樣品，從而獲 得預(yù)處理的樣品，和/或
[0203] 通過使第三樣品承受缺血并隨后承受后處理治療方案來后處理第三樣品，從而獲 得后處理的樣品
[0204] iii)評價miRNA種類的表達水平
[0205] -在非缺血對照樣品中，
[0206] -相對于該非缺血對照樣品，在缺血樣品中，和
[0207] -相對于該非缺血對照樣品，在在預(yù)處理的樣品中，和/或
[0208] -相對于該非缺血對照樣品，在后處理的樣品中，和
[0209] iv)計算所述miRNA種類的表達水平的比率
[0210] -相對于該缺血樣品，在預(yù)處理的樣品中，和/或
[0211] -相對于該缺血樣品，在后處理的樣品中
[0212] v)相對于缺血樣品，在預(yù)處理樣品和/或后處理的樣品中，識別miRNA種類的表達 水平被上調(diào)至少1. 3倍，優(yōu)選至少1. 5倍或下調(diào)至少1. 3倍，優(yōu)選至少1. 5倍。
[0213] 優(yōu)選地，如上述所定義的術(shù)語miRNA種類取決于它們在樣品中的上調(diào)或下調(diào)。
[0214] 在本發(fā)明步驟的優(yōu)選方法中，所述表達水平的計算比率通過以下步驟獲得：
[0215] a)評價miRNA種類的表達水平
[0216] -在非缺血對照樣品中，
[0217] -在缺血/再灌注樣品中，和
[0218] -在預(yù)處理的樣品中，和
[0219] -在后處理的樣品中
[0220] b)計算所述miRNA種類的表達水平的比率
[0221] -相對于非缺血對照樣品，在缺血/再灌注樣品中
[0222] -相對于非缺血對照樣品，在預(yù)處理的樣品中
[0223] -相對于非缺血對照樣品，在后處理的樣品中
[0224] -相對于缺血/再灌注樣品，在預(yù)處理的樣品中，和/或
[0225] -相對于缺血/再灌注樣品，在后處理的樣品中。
[0226] 根據(jù)本發(fā)明，本f中還提供了一種用于治療缺血-再灌灃損傷（包括血管疾病和 缺血性心臟疾病)的方法，該方法包括給藥于需要根據(jù)本發(fā)明的miRNA化合物治療的受試 者。
[0227] 本發(fā)明進一步涉及用于治療易感染于缺血或缺血發(fā)作的患者以保護所述患者體 內(nèi)的細胞或組織免于缺血性損傷和/或再灌注損傷影響的方法，所述方法包括給藥所述患 者根據(jù)本發(fā)明的miRNA化合物。
[0228] 優(yōu)選地，所述缺血性損傷為急性缺血性損傷，所述再灌注損傷為急性再灌注損傷。
[0229] 在優(yōu)選的實施例中，所述miRNA化合物在與缺血風(fēng)險相關(guān)的手術(shù)或介入之前或期 間給藥于所述患者，用于細胞保護受缺血損傷的組織，其中
[0230] 所述miRNA化合物是
[0231] 如本文所限定的預(yù)缺血性細胞保護性miRNA種類的miRNA激動劑，或
[0232] 如本文所限定的預(yù)缺血性細胞病變miRNA種類的miRNA拮抗劑。
[0233] 優(yōu)選地，所述miRNA化合物在手術(shù)或介入之前少于一周、少于一天或少于12、8、6、 5、4、3、2或1小時前給藥。
[0234] 在另一優(yōu)選的實施例中，所述miRNA化合物給藥于患有急性缺血性損傷和/或急 性再灌注損傷或接受再灌注治療的患者，
[0235] -在缺血發(fā)作與再灌注之間，或就在再灌注之前
[0236] -在再灌注期間，或
[0237] -在再灌注之后，優(yōu)選地在再灌注后的一天之內(nèi)，更優(yōu)選地在5、4、3、2或1. 5小時 之內(nèi)，更優(yōu)選地在60、50、40或30分鐘之內(nèi)，其中
[0238] 所述miRNA化合物是
[0239] 如本文所限定的后缺血性細胞保護性miRNA種類的miRNA激動劑，或
[0240] 如本文所限定的后缺血性細胞毒性miRNA種類的miRNA拮抗劑。
[0241] 除非特別注明，否則在本發(fā)明中，本發(fā)明所公開的一個或多個實施例、或關(guān)于本發(fā) 明的給定方面或?qū)嵤├枋龅奶卣骺梢耘c本文所公開的任何其他方面或?qū)嵤├Y(jié)合，條 件是對于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言在技術(shù)上是合理的，并且根據(jù)本發(fā)明對現(xiàn)有技術(shù)做出貢獻。
[0242] 免責(zé)聲明
[0243] 可選地，本發(fā)明沒有涉及一種或多種下述的miRNA種類和/或相應(yīng)的miRNA化合 物，或它們的用途，或所述miRNA種類和/或未被考慮的化合物：
[0244] i)在一個或多個實施例中，可選地：miR-134、miR-212、miR-214、miR-21、 miR-129、miR-182和miR-290或它們的激動劑，
[0245] ii)在一個或多個實施例中，可選地：11^1?-192、1^1?-30(3、1^1?-494、1^1?-497 或激動 劑或它們的拮抗劑，
[0246] iii)在一個或多個實施例中，可選地:miR-15家族的拮抗劑或抑制劑（miR_15a、 mir-15b、miR-16、miR-195、miR-424 和 miR-497)
[0247] iv)在一個或多個實施例中，可選地：let_7家族成員、miR_15b、miR-21、 miR_199a、miR_199b、miR-214、miR-10a、miR-10b、miR-16、miR_146a、miR_146b、miR-221、 miR-222、miR-30 家族成員、miR-497、miR-20a 的拮抗劑，和 / 或 miR-20b、miR-93、miR-101、 miR-126、miR-143、miR-145、miR-150 及 miR-29a-c 的激動劑，
[0248] v)在一個或多個實施例中，可選地：miR-208a或miR-208b的拮抗劑或抑制劑，或 miR-499的抑制劑，或它們的組合，
[0249] vi)在一個或多個實施例中，可選地：miR-24和/或miR-328的拮抗劑或抑制劑，
[0250] vii)在一個或多個實施例中，可選地：miR-15家族（例如miR_15a、miR_15b、 miR-16-1、miR-16-2、miR-195、miR-424 和 miR-497)，miR-30 家族（miR-30a、miR-30b、 miR-30c、miR-30d、miR-30e)，miR-92a，miR-320, miR-20, miR-199a，miR-499a 的拮抗劑，和 / 或 miR-126、miR-143、miR-210 和 miR-29a-c 的激動劑，
[0251] viii)在一個或多個實施例中，可選地：W02010103015A1所公開的一種或多種 miRNA寡核苷酸。
[0252] ix)在一個或多個實施例中，可選地：miR-1和/或miR-133和/或miR-320的激 動劑。
[0253] 可選地，本發(fā)明不涉及現(xiàn)有技術(shù)所公開的以及通過本發(fā)明的方法可獲得的一種或 多種miRNA種類和/或相應(yīng)的miRNA化合物，或它們的用途，其中與所述miRNA種類或化合 物相關(guān)的本發(fā)明的方法未被現(xiàn)有技術(shù)所公開。
[0254] 可選地，本發(fā)明不涉及一種或多種用于在任一如本文所公開的任一治療中所使用 的上述miRNA種類和/或miRNA化合物。
[0255] 定義
[0256] "miRNA(微小RNA)種"是天然存在的核糖核酸（RNA)分子，該分子是一種小的， 約18至約25個核苷酸長的非編碼RNA分子，是基因表達的內(nèi)源性生理調(diào)節(jié)劑。[Bartel DP2004]。MiRNA在通過翻譯/轉(zhuǎn)錄（"RNA干擾"）的抑制或激活的基因表達的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控 中起到至關(guān)重要的作用。
[0257] "miRNA化合物"是合成的或人工的核酸化合物，所述核酸化合物是miRNA種類的 激動劑或拮抗劑。
[0258] "核酸化合物"是包含核酸的有機分子，所述核酸由具有特定序列的核苷酸單元構(gòu) 成，所述特定序列可通過化學(xué)或生化方法測定，并且可選地包含一個或多個另一基團，如用 于改善生物功能、穩(wěn)定性、靶向性、報告性或檢測性的基團。
[0259] miRNA種類的"miRNA激動劑"是核酸化合物，其一旦引入生物材料（如細胞或組 織）中，由于它的核苷酸序列會產(chǎn)生相同類型的生物作用或相同模式的作用，例如誘導(dǎo)調(diào) 節(jié)同一生物材料中的相同基因或相應(yīng)的miRNA種類的基因。
[0260] "miRNA模擬物"是為人工的（人造的）雙鏈RNA或RNA衍生物的miRNA激動劑， 所述雙鏈RNA或RNA衍生物在轉(zhuǎn)染進入細胞后模擬成熟的內(nèi)源性miRNA。所述miRNA模擬 物可以是化學(xué)合成的或重組產(chǎn)生的并由前體處理得到?？蛇x地，miRNA模擬物可以包括一 個或多個修飾的或人工的堿基、糖單元或核苷酸連接鍵。
[0261] miRNA種類的"miRNA拮抗劑"廣義上是能夠減緩、抑制或阻斷miRNA調(diào)控作用的任 何化合物。優(yōu)選地，是核酸化合物，其一旦引入生物材料（如細胞或組織）中，由于它的核 苷酸序列會拮抗在同一生物材料中相應(yīng)的miRNA種類的作用，例如抑制或沉默所述miRNA 種類有關(guān)一個或多個基因的調(diào)控。
[0262] "miRNA抑制劑"是減緩miRNA表達水平（下調(diào)）與或抑制其結(jié)合它的靶序列或 RISC復(fù)合物的任何核酸。
[0263] 優(yōu)選的miRNA抑制劑是"反義寡核苷酸"，即有用于沉默的內(nèi)源性微小RNA的化學(xué) 合成的寡核苷酸。優(yōu)選地，反義寡核苷酸具有序列，該序列為miRNA序列、或它的部分序列、 或它的變體反義的序列，該變體與miRNA有1、2或3個核苷酸不同。
[0264] 在優(yōu)選的實施例中，所述miRNA化合物具有核酸部分，所述核酸部分包含等同于 或互補于相應(yīng)的miRNA種類的種源區(qū)的核酸序列。
[0265] 在優(yōu)選的實施例中，miRNA化合物是核酸化合物，所述核酸化合物包括17到27個 核苷酸長度，優(yōu)選為18至24個，或19至24個，或19至23個核苷酸長度的核酸片段，（"核 心序列"）的序列等同于或互補于成熟miRNA種類的序列，或分別與所述成熟miRNA種類的 序列或所述成熟miRNA種類的互補序列中最多1、2、3、4、5或6個核苷酸不同，但保持所述 激動或拮抗作用。miRNA化合物還可以包含修飾的堿基（在這種情況下，序列中修飾的堿基 被認為是所修飾的起始堿基），或者人工堿基；如果四個天然RNA堿基明顯不對應(yīng)于人工堿 基,那么該人工堿基被考慮為序列中的差異或突變。miRNA化合物還可以包括任何修飾的一 個或多個核苷酸連接鍵。這種修飾的連接鍵是本領(lǐng)域所公知和合適的，例如用于穩(wěn)定寡核 苷酸。此外，所述miRNA化合物可包括在核心序列側(cè)翼的側(cè)翼區(qū)域。
[0266] "缺血"是限制，即供應(yīng)絕對不足或相對不足的血液到組織或組織細胞或有綜合損 害的整個器官或功能紊亂的組織，由此導(dǎo)致輸送到組織的氧氣減少（缺氧）。供血不足導(dǎo)致 組織缺氧（在根本沒有氧氣供應(yīng)情況下的缺氧），由此導(dǎo)致所有決定細胞死亡的壞死、凋亡 和自噬。
[0267] 如果缺血是由于缺血發(fā)作，優(yōu)選由于例如栓塞、血栓形成、血栓（血凝塊）導(dǎo)致的 突然供血不足，例如通過手術(shù)、在流通或血管損傷中出現(xiàn)異物導(dǎo)致的突然血管障礙，那么缺 血是"急性缺血"。"急性缺血"需在癥狀開始的3天或2天之內(nèi)治療，優(yōu)選地在24或12小 時之內(nèi)，更優(yōu)選在6、5、4、3、2或1. 5小時之內(nèi)治療。急性缺血的短期后果是直接地細胞死 亡。在心肌缺血細胞死亡導(dǎo)致心臟泵血衰竭的情況下會引起其它器官（腦、腎、腸等）的低 血壓/低灌注,這被稱為心源性休克。細胞死亡也導(dǎo)致心肌細胞的電活動改變，往往導(dǎo)致危 及生命的心律失常（心動過速、房顫、束支傳導(dǎo)阻滯），導(dǎo)致心源性猝死。乳頭肌的死亡通常 導(dǎo)致心臟瓣膜功能障礙，從而導(dǎo)致血液回流和泵血功能無效。心肌細胞的死亡可能導(dǎo)致動 脈瘤的形成和心肌壁的破裂。
[0268] 腦部的急性缺血是"中風(fēng)"。
[0269] 在"慢性缺血"中，由于例如動脈粥樣硬化（脂質(zhì)斑塊阻塞動脈管腔）、低血壓（如 敗血癥或心臟衰竭）等，血液供應(yīng)不足正逐步發(fā)展和局部發(fā)展。
[0270] 缺血可以是心臟缺血，例如心肌缺血。
[0271] 在"短暫性腦缺血發(fā)作"（TIA)中，缺血癥狀在幾分鐘內(nèi)消失。TIA通常是由血塊 阻塞通向給定組織（例如腦、心臟、肝臟或腎臟）的血管中的一個引起的。
[0272] "易感染于缺血患者"是傾向于缺血發(fā)作、易受缺血發(fā)作影響、通過缺血發(fā)作有生 命危險的患者，例如該患者
[0273] -經(jīng)歷過缺血發(fā)作[例如患者處于術(shù)后心肌梗塞（PMI)的風(fēng)險中]，
[0274] -顯示出任一的代謝綜合癥、糖尿病、肥胖、高血壓、動脈粥樣硬化、低密度脂蛋白 膽固醇水平高、升高的血清高半胱氨酸、增加的血小板功能或惡化的血小板功能、吸煙、日 常身體鍛煉尤其是有氧運動水平低的遺傳或代謝風(fēng)險因素，或多種風(fēng)險因素，
[0275] -是或?qū)⒁?jīng)受的治療介入而增加的缺血風(fēng)險，例如介入導(dǎo)致的缺氧狀態(tài)，如手術(shù) 介入，尤其是涉及心血管系統(tǒng)的手術(shù)等。例如，所述介入可以是選擇性心臟介入，如選擇性 PCI、心臟手術(shù)、冠狀動脈旁路移植手術(shù)（CABG)或（早期）外科血管再生如在急性心肌梗塞 (AMI)之后。
[0276] "再灌注"是血液供應(yīng)到組織中的修復(fù)，該組織由于正常血液供應(yīng)減少而缺血。該 減少可能由于包括動脈粥樣硬化阻塞、動脈狹窄或外科夾緊的任何來源。再灌注可自發(fā)地 發(fā)生，或者可受部分治療的影響。它通過促進局部缺血組織恢復(fù)以用于治療心肌梗塞或其 它局部缺血的主要步驟，從而進一步限制壞死和因此的梗塞尺寸。然而，再灌注本身可進一 步損傷缺血性組織，引起再灌注損傷。
[0277] "缺血和再灌注損傷"或"再灌注損傷"或"缺血-再灌注損傷"（I/R損傷）在這里 被理解為任何功能、代謝和/或結(jié)構(gòu)的變化，包括受再灌注、或缺血和再灌注共同影響的缺 血組織到受缺血影響的組織的任何區(qū)域中的壞死、凋亡和自噬。
[0278] "急性缺血-再灌注損傷"或"急性再灌注損傷"是指缺血性再灌注損傷，即任何后 果，優(yōu)選地再灌注或缺血和再灌注共同的短期后果和/或直接后果。從某種意義上說急性 再灌注損傷是細胞死亡出現(xiàn)的后果，至少在很大程度上通過壞死和/或凋亡的機制和/或 通過自噬。從某種意義上說急性再灌注損傷對抗炎治療不敏感。在某種意義上的任何后 果，可選地細胞死亡出現(xiàn)在再灌注期間或不久之后或立即出現(xiàn)，優(yōu)選地在再灌注之后一天 之內(nèi)，更優(yōu)選在5、4、3、2或1. 5小時之內(nèi)，更優(yōu)選在60、50、40或30分鐘之內(nèi)。
[0279] 在急性缺血再灌注損傷之后出現(xiàn)的大多數(shù)后果和損傷是由在再灌注期間、血液流 動至受影響的器官的修復(fù)中的急性抗炎反應(yīng)引起的。
[0280] "急性心肌梗塞"（AMI)是在心臟區(qū)域的循環(huán)受阻并由于壞死、凋亡或細胞自噬的 心肌細胞死亡出現(xiàn)的期間出現(xiàn)的心肌梗塞。AMI需要在癥狀發(fā)作的3或2天之內(nèi)，優(yōu)選在 12小時或6小時之內(nèi)，更優(yōu)選在5、4、3、2或1. 5小時之內(nèi)治療。AMI的特點是急性缺血和 急性再灌注損傷。
[0281] "缺血性心臟疾病"（IHD)或心肌缺血是一種以心肌缺血為特點的疾病。IHD包括 引起心肌組織死亡從而急性心臟衰竭和心律失常的急性心肌梗塞、以及引起心臟組織重塑 和心臟衰竭的慢性心肌梗塞。
[0282] "缺血預(yù)處理"是使缺血性損傷的組織（例如：心肌，腎臟或神經(jīng)組織）承受簡短 的、重復(fù)周期的缺氧，優(yōu)選缺血（例如，通過血管閉塞）。在實施例中，缺血預(yù)處理包括通過 具有產(chǎn)生與組織中所述缺氧的重復(fù)周期相同效果的外部效應(yīng)來使組織承受；這可例如用藥 學(xué)、物理和化學(xué)試劑模擬預(yù)處理效果處理得以實現(xiàn)。預(yù)處理具有心臟保護作用，使該組織免 于缺血或再灌注損傷的有害影響，并減小了缺血后的心肌梗塞尺寸、功能障礙和心律失常。
[0283] "預(yù)處理治療方案"是一系列若干給定的缺氧周期，優(yōu)選為正常供氧的給定的時間 周期，例如在它們之間再灌注。例如，預(yù)承受的時間周期可能是例如1-10分鐘，2至8、7或 6分鐘，更優(yōu)選約3至6或5分鐘，組織承受缺血和再灌注的時間可能有所不同。
[0284] "缺血后處理"是使受缺血性損傷的組織（例如：心肌、腎臟或神經(jīng)組織）承受簡短 的、重復(fù)周期的缺氧，優(yōu)選缺血之后的短暫缺血（例如，通過血管閉塞）。在實施例中，缺血 預(yù)處理包括通過具有產(chǎn)生與組織中所述缺氧的重復(fù)周期相同效果的外部效應(yīng)使體內(nèi)的相 同組織或任何遠端組織承受；這可例如用藥學(xué)、物理和化學(xué)試劑模擬預(yù)處理效果的處理得 以實現(xiàn)。后處理具有心肌保護作用，使該組織免于缺血或再灌注損傷的有害影響，并減小了 缺血后的心肌梗塞尺寸、功能障礙和心律失常。
[0285] "后處理治療方案"是一系列若干給定的缺氧周期，優(yōu)選為正常供氧的給定的時間 周期，例如在缺血發(fā)作之后在它們之間再灌注。例如，預(yù)承受的時間周期可以是例如半分鐘 到10分鐘，更優(yōu)選約1-2分鐘，組織承受缺血和再灌注的時間可從1到10不等，或優(yōu)選從 1到6。
[0286] "細胞病變"作用在這里被理解為有關(guān)、涉及或特征為至少在細胞水平上可檢測到 或檢測不到的任何不利變化或影響的作用。細胞病變作用可以是細胞內(nèi)或細胞外作用的結(jié) 果，例如通過細胞病變劑或缺氧、缺血例如急性心肌梗塞或中風(fēng)、或缺血再灌注損傷例如急 性缺血再灌注損傷接觸細胞，
[0287] "細胞毒性"作用在這里被理解為有關(guān)、涉及或特征為在細胞水平可檢測到的損 害、退行性或病理改變，或具有細胞水平影響的疾病或紊亂的效果的作用。
[0288] "細胞保護"作用在這里被理解為miRNA種類或miRNA化合物的作用，其減少或抑 制由外部或內(nèi)部例如生物作用引起的細胞損傷，例如細胞毒性作用。
[0289] "生物樣品"在這里被理解為任何生物材料，其包括由于外部作用miRNA可被上調(diào) 或下調(diào)的生物材料，并且所述生物樣品可被用于實驗（即用于選自測試缺血再灌注、缺氧、 預(yù)處理、后處理任一條件的測試中）。
[0290] 生物樣品可以是細胞、細胞群組或集合、細胞培養(yǎng)、組織樣品、器官或模型動物體。
[0291] "組織樣品"是生物樣品，其為組織培養(yǎng)、活體取樣的樣品、或分離的器官。在本發(fā) 明的優(yōu)選實施例中使用分離的器官。
[0292] 對哺乳動物"給藥"有效量的miRNA化合物在這里被理解為包括任何方式的給藥 化合物，雖然不是miRNA化合物本身被引入所述哺乳動物中，但該方式導(dǎo)致所述哺乳動物 中所述miRNA化合物的存在。特別是，該術(shù)語涵蓋前體miRNA的給藥，或從其釋放出所述 miRNA化合物的組合物的給藥，或載體的給藥，例如導(dǎo)致在所述miRNA的存在下在一定水平 提供有效量的表達載體。給藥途徑包括口服、靜脈內(nèi)、皮內(nèi)、皮下、肌內(nèi)、局部、吸入。
[0293] "經(jīng)皮冠狀動脈介入"（PCI)，也被稱為血管成形術(shù)，涉及將氣球型器件插入到患者 動脈內(nèi)以擴覽和打開阻塞動脈。
[0294] 附圖簡要說明
[0295] 圖1實驗治療方案
[0296] 從雄性維斯塔（Wistar)鼠中分離得到的心臟經(jīng)受時間匹配的需氧灌注（S卩，非缺 血對照，C)，或30分鐘的局部缺血和120分鐘再灌注（IR)或用3X5分鐘缺血-再灌注預(yù) 處理后進行30min的局部缺血和120分鐘的再灌注（PRE)，或進行后處理（POST)治療方案 (在30分鐘的局部缺血之后立即施加6X 10秒的總體缺血-再灌注、并隨后進行120分鐘 再灌注）。在規(guī)定的時間點測量冠脈血流量以便核實冠狀動脈閉塞的成功。在局部缺血后 的再灌注之后的最初5分鐘立即收集冠狀動脈流出物用于LDH釋放檢測。梗塞尺寸在再灌 注的第120分鐘進行測量。對于獨立實驗中分離出來的miRNA，左心室在灌注治療方案結(jié)束 后冷凍于液氮中。
[0297] 圖2與缺血-再灌注損傷相關(guān)聯(lián)的心臟MiRNA
[0298] 該圖顯示出相對于非缺血對照，miRNA顯著地被缺血-再灌注改變，但是由于缺 血-再灌注，預(yù)處理和后處理并沒有顯著地影響它們的改變。這些結(jié)果表明，這些miRNA可 能不受心肌保護機制的影響。條形顯示出在缺血-再灌注對比非缺血對照（IR/C，黑色條）、 預(yù)處理對比非缺血對照（PRE/C，白色條）、后處理對比非缺血對照（P0ST/C，灰色條）、或預(yù) 處理對比缺血-再灌注（PRE/IR，白色陰影條）、后處理對比缺血-再灌注（P0ST/IR，灰色陰 影條）中的miRNA表達的改變。值為倍性表達變化土標(biāo)準(zhǔn)偏差。*表示p〈0. 05和彡±1. 5 的倍性變化。
[0299] 圖3涉及在缺血-再灌注損傷的反向調(diào)控的基礎(chǔ)上通過預(yù)處理（板塊A)或后處 理（板塊B和C)進行心臟保護的MiRNA
[0300] 該圖顯示出相對于非缺血對照，miRNA顯著地被缺血-再灌注改變，然而由于缺 血-再灌注，預(yù)處理（A)或后處理（B和C)顯著地逆轉(zhuǎn)了它們的表達變化。這顯示出這些 miRNA通過預(yù)處理和后處理經(jīng)由缺血-再灌注的有害機制的逆轉(zhuǎn)參與了心肌保護，盡管所 述miRNA自身可能具有心臟保護（miR-33、miR-320)作用或心臟毒性（miR-497、miR-19a、 miR-19b、miR-208 和 miR-106)作用。
[0301] 條形顯示出在缺血-再灌注對比非缺血對照（IR/C，黑色條）、預(yù)處理對比非缺血 對照（PRE/C，白色條）、后處理對比非缺血對照（P0ST/C，灰色條）或預(yù)處理對比缺血-再灌 注（PRE/IR，白色陰影條）、后處理對比缺血再灌注（P0ST/IR，灰色陰影條）中的miRNA表達 的改變。值為倍性表達變化土標(biāo)準(zhǔn)偏差。*表示P〈〇. 05和> ±1. 5的倍性變化。
[0302] 圖4涉及在缺血-再灌注損傷的反向調(diào)控的基礎(chǔ)上（板塊A和B)或在正常心肌 保護誘導(dǎo)機制的基礎(chǔ)上（板塊C)通過預(yù)處理和后處理兩者進行心肌保護的MiRNA
[0303] 該圖顯示出相對于非缺血對照，miRNA顯著地被缺血-再灌注改變（板塊A和 B)，然而由于缺血-再灌注，預(yù)處理和后處理均顯著地逆轉(zhuǎn)了它們的表達變化。這表明這 些miRNA通過預(yù)處理和后處理可能地（特別是在板塊A和B中示出的miRNA的情況下） 經(jīng)由缺血-再灌注的有害機制的逆轉(zhuǎn)參與了心肌保護。假設(shè)相對于非缺血對照，板塊C中 miRNA的上調(diào)或下調(diào)不顯著，但在預(yù)處理和后處理中分別有顯著的下調(diào)（miR-352、miR-93) 或上調(diào)（miR-532-3P)出現(xiàn)表明該機制可能是相同的。條形顯示出在缺血再灌注對比非缺 血對照（IR/C，黑色條）、預(yù)處理對比非缺血對照（PRE/C，白色條）、后處理對比非缺血對照 (P0ST/C，灰色條）或預(yù)處理對比缺血-再灌注（PRE/IR，白色陰影條）、后處理對比缺血-再 灌注（P0ST/IR，灰色陰影條）的miRNA表達的改變。值為倍性表達變化土標(biāo)準(zhǔn)偏差。*表 示p〈0. 05和彡± 1. 5的倍性變化。
[0304] 圖5在預(yù)處理誘導(dǎo)機制的基礎(chǔ)上涉及心肌保護的MiRNA
[0305] 該圖顯示出相對于缺血-再灌注和非缺血對照，miRNA顯著地受預(yù)處理誘導(dǎo)，這表 明這些miRNA受到預(yù)處理的特異性誘導(dǎo)，并在心肌保護適應(yīng)中起作用（可以稱之為保護性 mir (Protectomir))。因此，這些miRNA通過在預(yù)處理中被激活的機制具有心肌保護作用。 條形顯示出在缺血再灌注對比非缺血對照（IR/C，黑色條）、預(yù)處理對比非缺血對照（PRE/ C，白色條）、后處理對比非缺血對照（P0ST/C，灰色條）或預(yù)處理對比缺血-再灌注（PRE/ IR，白色陰影條）、后處理對比缺血再灌注（P0ST/IR，灰色陰影條）中的miRNA表達的改變。 值為倍性表達變化土標(biāo)準(zhǔn)偏差。*表示P〈〇. 05和> ± 1. 5的倍性變化。
[0306] 圖6在后處理誘導(dǎo)機制的基礎(chǔ)上涉及心肌保護的MiRNA
[0307] 該圖顯示出相對于缺血-再灌注，miRNA顯著地被后處理改變，表明這些miRNA被 后處理特異性改變。這些miRNA必定是下調(diào)的以便后處理誘導(dǎo)的心肌保護可以發(fā)生，因此 所述微小RNA自身可以稱為毒性mir(Path 〇mirs)。條形顯示出在缺血-再灌注中對比于 非缺血對照（IR/C，黑色條）、預(yù)處理對比非缺血對照（PRE/C，白色條）、后處理對比非缺血 對照（P0ST/C，灰色條）或預(yù)處理對比缺血-再灌注（PRE/IR，白色陰影條）、后處理對比缺 血-再灌注（P0ST/IR，灰色陰影條）中的miRNA表達的改變。值為倍性表達變化土標(biāo)準(zhǔn)偏 差。*表示p〈〇. 05和> ± 1. 5的倍性變化。因此，心肌保護通過抑制劑對抗這些miRNA是 可行的。
[0308] 圖7與缺血-再灌注損傷相關(guān)聯(lián)的心肌MiRNA
[0309] 該圖顯示出相對于非缺血對照，miRNA顯著地被缺血-再灌注改變，但由于缺 血-再灌注，預(yù)處理和后處理均沒有顯著地影響它們的改變。這些結(jié)果表明這些miRNA可能 不受心肌保護機制的影響。條形顯示出在缺血-再灌注對比非缺血對照（IR/C，黑色條）、 預(yù)處理對比非缺血對照（PRE/C，白色條）、后處理對比非缺血對照（P0ST/C，灰色條）或預(yù) 處理對比缺血-再灌注（PRE/IR，白色陰影條）、后處理對比缺血-再灌注（P0ST/IR，灰色 陰影條）中miRNA表達的改變。值為倍性表達變化的log2值土標(biāo)準(zhǔn)偏差。*表示p〈0. 05 和〈-0. 585或> 0. 585的log2值的倍性變化。
[0310] 圖8涉及通過預(yù)處理誘導(dǎo)機制和后處理誘導(dǎo)機制兩者進行心肌保護的MiRNA
[0311] 板塊A示出相對于非缺血對照，miRNA-188表達在預(yù)處理和后處理中顯著地增加， 如果相對于缺血-再灌注中的變化，這一改變保持不變。
[0312] 板塊 B 示出相對于非缺血對照，miRNA(miR-125b*、miR-139-3p、miR-320 和 miR-532-3p)顯著地被缺血-再灌注改變，然而，由于缺血-再灌注，預(yù)處理和后處理均顯著 地逆轉(zhuǎn)了它們的表達變化。
[0313] 這些結(jié)果表明這些miRNA在預(yù)處理和后處理中均參與心肌保護。在板塊B示出的 miRNA的情況中，心肌保護經(jīng)由缺血-再灌注的有害機制的逆轉(zhuǎn)發(fā)生。反之，在板塊A示出 的miRNA-188的情況中，該miRNA的誘導(dǎo)導(dǎo)致心肌保護。
[0314] 條形顯示出在缺血-再灌注對比非缺血對照（IR/C，黑色條）、預(yù)處理對比非缺血 對照（PRE/C，白色條）、后處理對比非缺血對照（P0ST/C，灰色條）或預(yù)處理對比缺血-再 灌注（PRE/IR，白色陰影條）、后處理對比缺血-再灌注（P0ST/IR，灰色陰影條）中的miRNA 表達的變化。值為倍性表達變化的l〇g2值土標(biāo)準(zhǔn)偏差。*表示p〈0. 05和〈-0. 585或> 0. 585的log2值的倍性變化。
[0315] 圖9在預(yù)處理誘導(dǎo)機制的基礎(chǔ)上涉及心肌保護的MiRNA
[0316] 該圖顯示出相對于缺血-再灌注和非缺血對照，miRNA顯著地被預(yù)處理改變，表明 這些miRNA被預(yù)處理特異性誘導(dǎo)，并在心肌保護適應(yīng)中具有一定作用（可以被稱為保護性 mir)。因此，這些miRNA通過在預(yù)處理中被激活的機制具有心肌保護作用。板塊A示出了 相對于對照，miRNA表達在缺血再灌注中沒有顯著地改變，然而，通常相對于對照和缺血樣 品，預(yù)處理顯著提高了它們的水平。板塊B示出了 miRNA-487b在缺血再灌注中經(jīng)歷了顯著 提高的水平，然而，在預(yù)處理中它的表達被逆轉(zhuǎn)表明它的細胞毒性特征。
[0317] 條形顯示出在缺血-再灌注對比非缺血對照（IR/C，黑色條）、預(yù)處理對比非缺血 對照（PRE/C，白色條）、后處理對比非缺血對照（P0ST/C，灰色條）或預(yù)處理對比缺血-再 灌注（PRE/IR，白色陰影條）、后處理對比缺血-再灌注（P0ST/IR，灰色陰影條）中的miRNA 表達的改變。值為倍性表達變化的l〇g2值土標(biāo)準(zhǔn)偏差。*表示p〈0. 05和〈-0. 585或> 0. 585的log2值的倍性變化。
[0318] 圖10在后處理誘導(dǎo)機制的基礎(chǔ)上涉及心肌保護的MiRNA (板塊A和B)
[0319] 該圖顯示出相對于缺血-再灌注，miRNA顯著地被后處理改變，表明這些miRNA被 后處理特異性改變。某些miRNA，如miR-208、miR-19b和miR-19a必定是下調(diào)的以便后處理 誘導(dǎo)的心肌保護可以發(fā)生，因此所述微小RNA自身可被稱為毒性mir，即細胞毒性miRNA(它 們在缺血/再灌注中也是顯著上調(diào)的）。因此，心肌保護經(jīng)由抑制劑對抗這些miRNA是可行 的。
[0320] Let-7e、let-7i、miR-l、let-7b、miR-181a、miR-328、miR-33、miR-503 都是"保護 性mir"，因為由于缺血后處理，它們都是顯著上調(diào)的。
[0321] 條形顯示出在缺血-再灌注對比非缺血對照（IR/C，黑色條）、預(yù)處理對比非缺血 對照（PRE/C，白色條）、后處理對比非缺血對照（P0ST/C，灰色條）或預(yù)處理對比缺血-再灌 注（PRE/IR，白色陰影條）、后處理對比缺血再灌注（P0ST/IR，灰色陰影條）中miRNA表達 的改變。值為倍性表達變化的l〇g2值土標(biāo)準(zhǔn)偏差。*表示p〈0. 05和〈-0. 585或> 0. 585 的l〇g2值的倍性變化。
[0322] 圖11該圖顯示出細胞保護通過隨機選擇的細胞存活性檢測中隨機選擇的心肌保 護的微小RNA和/或細胞毒性的微小RNA的抑制劑（見表3b)的組合對抗模擬的缺血。所 采用的組合對抵抗模擬的缺血/再灌注損傷都是有效的。
[0323] 本發(fā)明的詳細說明具體實施例
[0324] 最近，心臟已經(jīng)被證明具有非凡的適應(yīng)缺血-再灌注壓力的能力，并且在缺血再 灌注中，心臟的這種分子可塑性已成為激烈研究的焦點，以期望潛在的機制可被應(yīng)用于治 療性開發(fā)中。缺血預(yù)處理是良好描述的適應(yīng)性響應(yīng)，其中，短暫地承受缺血顯著地提高了心 臟承受隨后的缺血性損傷的能力。此外，在長期缺血之后應(yīng)用短期的缺血-再灌注還賦予 心臟保護作用免于心肌缺血-再灌注的影響，這種現(xiàn)象稱為缺血后處理。
[0325] 內(nèi)源性抗缺血、心肌保護機制的這兩種主要形式的發(fā)現(xiàn)已促進了保護缺血和/或 再灌注的心肌的新方式的開發(fā)，并且詳述了在缺血和/或隨后的再灌注期間，我們對損傷 和存活的分子基礎(chǔ)的理解[Ferdinandy P等，2007]。值得注意的是，預(yù)處理和后處理兩者均 可在一些可逆的壓力刺激下被誘導(dǎo)，例如缺氧、特定藥品模擬預(yù)處理或者后處理的保護作 用，也可通過遠端調(diào)節(jié)被誘導(dǎo)，也就是除了祀向器官的壓力刺激[Ferdinandy P等，2007]。
[0326] 心肌保護介入、模擬這些先天適應(yīng)性保護機制，特別是缺血后處理已作為人體內(nèi) 用于限制心肌損傷的理論上可能的、臨床上適用的方法出現(xiàn)[Qvize Μ等，2010]。然而，盡 管近十年來的激烈研究，由于細胞性活動、其他復(fù)發(fā)病變的介入及缺血性心臟疾病的風(fēng)險 等因素的復(fù)雜性，在預(yù)處理和后處理的心肌保護作用下潛在的確切的生物機制依舊不明確 [Ferdinandy P等，2007]。因此，生物方法的體系的用途似乎有必要揭露復(fù)雜的分子活動。
[0327] 缺血和因此的急性缺血和/或再灌注損傷不限于心臟，類似的適應(yīng)性機制和保護 性機制應(yīng)當(dāng)在腎、肝及其他器官的中風(fēng)、缺血中起作用。
[0328] 然而，如何在預(yù)防或治療缺血-再灌注損傷中使用或模擬這些內(nèi)源性機制作為明 確地外科介入用于在多數(shù)情況下不被期望的目的和對于處于臨界狀態(tài)的患者可能存在其 他風(fēng)險的目的并不明顯。通過外科介入給藥具有同樣效果的特定治療性劑代替預(yù)處理或 后處理將是所期望的，然而，不僅這類化合物，就連潛在的調(diào)控機制在很大程度上都是未知 的。
[0329] 在本文所公開的一系列說明本發(fā)明的研究中，本發(fā)明的發(fā)明人旨在識別有關(guān)缺血 和/或再灌注損傷、以及有關(guān)使用miRNA表達模型的系統(tǒng)性對比進行預(yù)處理或后處理的 miRNA〇
[0330] 在現(xiàn)有技術(shù)中，雖然研究了缺血中的miRNA調(diào)控，但通常將表達水平與非缺血對 照相對比。
[0331] 作為一種新方法，本發(fā)明人在檢測缺血（和再灌注）樣品及經(jīng)受組織或細胞保護 性處理（預(yù)處理和/或后處理）的樣品中使用miRNA表達模式，并通過將這些表達模式不 僅與非缺血對照相比較、而且與缺血-再灌注處理下預(yù)處理和/或后處理的樣品中的表達 水平相比較的方式獲得數(shù)據(jù)。
[0332] 在它們的實驗設(shè)計中，為了研究不同樣品中的表達模式，本發(fā)明的發(fā)明人使用了 miRNA微陣列和RT-PCR，以便通過后者的方法可以計算微陣列數(shù)據(jù)。在圖中示出了相關(guān)的 微陣列數(shù)據(jù)，并在下列實施例的表格中示出了 RT-PCR數(shù)據(jù)。本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以理解的 是，由于本領(lǐng)域的新的miRNA被連續(xù)地識別，通過在較大的miRNA組上不斷地重復(fù)發(fā)明人的 實驗或使用相同的原則，調(diào)控類似于本發(fā)明的發(fā)明人發(fā)現(xiàn)的那些miRNA的進一步的miRNA 種類隨后將被發(fā)現(xiàn)。
[0333] 對于miRNA有標(biāo)準(zhǔn)的命名體系[Griffiths-Jones S，2006]，其也被用于本說明書 中?；趍iRNA的這些所命名的序列與其它數(shù)據(jù)一起可在miRBase數(shù)據(jù)庫（早期Sanger 數(shù)據(jù)庫）中被明確地找到。在它們的發(fā)現(xiàn)公開之前，由實驗證實的miRNA被給予命名。命 名包括前綴"mir"或"miR"，其中"mir"是指未成熟的miRNA前體，而大寫的"miR"是指 成熟的形態(tài)。命名中的數(shù)字通常表明命名的順序，即通常為發(fā)現(xiàn)的順序。僅相差一個或兩 個核苷酸的相關(guān)miRNA序列用附加的小寫字母進行詮釋。例如，miR-19a與miR-19b密切 相關(guān)。產(chǎn)生100%相同的成熟miRNA但位于基因組中不同部位的miRNA前體用附加的短 線-數(shù)字后綴進行說明。例如，miRNA前體hsa-mir-194-l和hsa-mir-194-2產(chǎn)生相同的 成熟miRNA(hsa-miR-194)但位于基因組的不同區(qū)域。原始種用三個字母前綴指定，例如， hasa代表人類（智人），rno代表大白鼠。當(dāng)兩個成熟的miRNA來源于同一 miRNA前體的 異側(cè)臂（opposite arms)時，它們將用-3p或-5p后綴被指示。當(dāng)相關(guān)表達水平是已知時， 命名后的星號表明相對于發(fā)夾彎（hairpin)異側(cè)臂的miRNA, miRNA為低水平表達。例如， miR-123和miR-123*將共享miRNA前體發(fā)夾彎，但更多的miR-123將在細胞中被發(fā)現(xiàn)。
[0334] 相當(dāng)出人意料地，本發(fā)明的發(fā)明人已意識到承受缺血和隨后的再灌注、前處理和 隨后的缺血-再灌注以及缺血-再灌注和隨后的后處理治療方案的樣品中的所述miRNA 表達模式的適當(dāng)比較會導(dǎo)致在這些情況中不同調(diào)控的miRNA種類的識別，并對于制備所述 miRNA種類的激動劑或拮抗劑的心肌保護的miRNA化合物是有用的，所述miRNA種類的激動 劑或拮抗劑在易感染于心臟缺血或心臟缺血發(fā)作如急性心肌梗塞的患者的治療中是有用 的，其中，細胞、組織和/或器官被保護以對抗所述患者的心臟中的急性缺血和再灌注的短 期和/或直接的影響。優(yōu)選地，已發(fā)現(xiàn)所述miRNA化合物在缺血發(fā)作之后5、4、3、2或1. 5 小時之內(nèi)或與再灌注同時和/或在與缺血風(fēng)險相關(guān)的手術(shù)或介入之前少于1天或少于12、 8、6、5、4、3、2或1小時之內(nèi)給藥于患者。
[0335] 更如此的是，已經(jīng)驚人地發(fā)現(xiàn)，相對于承受缺血-再灌注、沒有這些保護機制的組 織，在預(yù)處理和/或后處理中顯著上調(diào)的miRNA具有細胞保護作用。類似地，在預(yù)處理和/ 或后處理中miRNA種類的下調(diào)允許細胞保護機制在這些條件下發(fā)生；因此，這些miRNA將適 度地被對抗以便誘導(dǎo)細胞保護。已發(fā)現(xiàn)這些miRNA的拮抗劑也有細胞保護作用。
[0336] 特別地，通過使用350個已知小鼠 miRNA基因的miRNA微陣列，通過缺血預(yù)處理和 后處理在心肌缺血-再灌注損傷和心肌保護的早期階段中參與的一些miRNA已被識別，并 且心肌保護的 miRNA 化合物即 miRNA 模擬物（rn〇-miR-139、rn〇-miR_125b*、rn〇-miR-33) 和 miRNA 抑制劑（rn〇-miR-494、rn〇-miR_487b)已被制備。
[0337] 更密切地，根據(jù)本發(fā)明，提供了一系列樣品，包括對照樣品、第一樣品和第二樣品 和/或第三樣品，使每個樣品承受需氧灌注一段時間，且在這一時間內(nèi)
[0338] 使對照樣品既不承受缺血-再灌注也不承受預(yù)處理或后處理從而獲得非缺血對 照樣品，和
[0339] 使第一樣品承受至少于缺血，從而獲得缺血樣品，和
[0340] 通過使第二樣品承受預(yù)處理治療方案、并隨后至少承受缺血來預(yù)處理第二樣品， 從而獲得預(yù)處理的樣品，和/或
[0341] 通過使第三樣品至少承受缺血、并隨后承受后處理治療方案來后處理第三樣品， 從而獲得后處理的樣品。
[0342] 承受缺血的樣品通常隨后承受再灌注，以便獲得缺血-再灌注樣品。這尤其是在 后處理的情況中。
[0343] 隨后，進行測量以實驗地確定miRNA種類的表達水平，優(yōu)選地，它們是多樣性的。
[0344] 優(yōu)選地，至少獲得下列數(shù)據(jù)集中的一個：
[0345] i)miRNA種類的表達水平
[0346] -相對于所述非缺血對照樣品，在缺血/再灌注樣品中，
[0347] -相對于所述非缺血對照樣品，在預(yù)處理的樣品中，和
[0348] -相對于所述缺血/再灌注樣品，在預(yù)處理的樣品中，和/或
[0349] ii)miRNA種類的表達水平
[0350] -相對于所述非缺血對照樣品，在缺血/再灌注樣品中，
[0351] -相對于所述非缺血對照樣品，在后處理的樣品中，
[0352] -相對于所述缺血/再灌注樣品，在后處理的樣品中。
[0353] 在優(yōu)選的實施例中，獲得下列數(shù)據(jù)集:miRNA種類的表達水平
[0354] -相對于所述非缺血對照樣品，在缺血/再灌注樣品中
[0355] -相對于所述非缺血對照樣品，在預(yù)處理的樣品中，和
[0356] -相對于所述非缺血對照樣品，在后處理的樣品中，和
[0357] -相對于所述缺血/再灌注樣品，在預(yù)處理的樣品中，
[0358] -相對于所述缺血/再灌注樣品，在后處理的樣品中。
[0359] 至少，miRNA種類的表達水平
[0360] -相對于所述缺血/再灌注樣品，在預(yù)處理的樣品中，和/或
[0361] -相對于所述缺血/再灌注樣品，在后處理的樣品中的表達水平由通過直接測量 評估的其他各個數(shù)據(jù)集進行計算。
[0362] 在優(yōu)選的實施例中，獲得所述miRNA種類的表達水平的原始數(shù)據(jù)
[0363] -在非缺血對照樣品中，
[0364] -在缺血/再灌注樣品中，和
[0365] -在預(yù)處理的樣品中，和/或
[0366] -在后處理的樣品中。
[0367] 計算所述miRNA種類的表達水平的比率
[0368] -相對于非缺血樣品在缺血樣品中，
[0369] -相對于非缺血樣品，在預(yù)處理的樣品中
[0370] -相對于非缺血樣品，在后處理的樣品中
[0371] -相對于缺血/再灌注樣品，在預(yù)處理的樣品中，和/或
[0372] -相對于缺血/再灌注樣品，在后處理的樣品中。
[0373] 基于這些評估和計算，可以識別下述兩種基本類型的miRNA種類：
[0374] 保護性 mir :
[0375] -miRNA種類，稱為預(yù)缺血細胞保護性miRNA種類，條件是該miRNA種類相對于缺血 /再灌注樣品在預(yù)處理的樣品中是顯著上調(diào)的
[0376] -miRNA種類，稱為后缺血細胞保護性miRNA種類，條件是該miRNA種類相對于缺血 /再灌注樣品在后處理的樣品中是顯著上調(diào)的
[0377] 病變 mir:
[0378] -miRNA種類，稱為預(yù)缺血細胞病變miRNA種類，條件是該miRNA種類相對于缺血/ 再灌注樣品在預(yù)處理的樣品中是顯著下調(diào)的
[0379] -miRNA種類，稱為后缺血細胞病變miRNA種類，條件是該miRNA種類相對于缺血/ 再灌注樣品在后處理的樣品中是顯著下調(diào)的
[0380] 毒性 mir :
[0381] -如果相對于非缺血對照，在缺血樣品中細胞病變的miRNA是顯著上調(diào)的以及如 果通過預(yù)處理和/或后處理，細胞病變的miRNA是下調(diào)的，則表明被稱為細胞毒性的細胞病 變的miRNA在缺血中具有有害作用。這些miRNA可以稱為毒性mir。
[0382] 在本文中可以理解的是，miRNA種類在同一時間可屬于多樣類別，但有些類別是相 互排斥的。
[0383] 例如，設(shè)計為對抗miRNA種類的激動劑為優(yōu)選的，該miRNA種類同時為預(yù)缺血細胞 保護性miRNA種類和后缺血細胞保護性miRNA，反之亦然。
[0384] 例如，設(shè)計為對抗miRNA種類的拮抗劑為優(yōu)選的，該miRNA種類同時為預(yù)缺血細胞 毒性miRNA種類和后缺血細胞毒性miRNA種類，反之亦然。
[0385] 預(yù)缺血細胞毒性miRNA種類同時為預(yù)缺血細胞保護性miRNA種類的情況顯然是不 可能的和被排除的，對于后缺血性miRNA種類同樣如此。
[0386] 在罕見的事件中發(fā)現(xiàn)預(yù)缺血細胞毒性miRNA種類同時是后缺血細胞保護性miRNA 種類以及預(yù)缺血細胞保護性miRNA種類同時是后缺血細胞毒性miRNA種類，這反映了一個 事實，即在預(yù)處理和后處理中適應(yīng)的保護基因調(diào)控機制可能會有所不同。因此，在易于感染 缺血之前和在缺血發(fā)作之后情況中的患者需要謹(jǐn)慎的被評估及處理、或不同地和特別地被 治療。
[0387] 將哪種類型的miRNA化合物給藥于患者的難題取決于患者的狀態(tài)或病情。因此， 患者狀態(tài)的評估可提供有關(guān)所給予治療的重要信息，以便提高保護患者組織免于急性缺 血-再灌注損傷。
[0388] 特別地，如果患者狀態(tài)的評估表明所述患者易受預(yù)期的缺血發(fā)作或在患者體內(nèi)缺 少任何內(nèi)在保護免于這類發(fā)作的跡象，這為醫(yī)療人員提供了介入是可取的重要信息。
[0389] 典型地，預(yù)缺血細胞病變miRNA的拮抗劑（即病變mir的拮抗劑）或預(yù)缺血細胞 保護性miRNA的拮抗劑（即保護性mir的拮抗劑）被添加給易受缺血的患者。在這種情況 下，患者的一個或多個組織或器官受缺血影響有危險。這種缺血活動可能或不可能是可預(yù) 測的。如果安排了涉及包括某些組織缺氧引發(fā)缺血步驟的治療性介入，那么可預(yù)期的缺血 作用的時間可以提前確定，并在可能的缺血時間之前的適宜時間內(nèi)給予適合的保護性mir。
[0390] 然而，當(dāng)包括組織缺氧的缺血的發(fā)生是由于所述患者的疾病狀態(tài)時的情況下，所 述發(fā)生的時間是無法預(yù)測的。在這種情況下，評估或監(jiān)測所述患者的狀態(tài)是重要的。在這 個方面，心肌梗塞（優(yōu)選是它的急性變體）的風(fēng)險因素應(yīng)該被考慮。若患者處于顯著的缺 血風(fēng)險，應(yīng)該給予他/她適當(dāng)?shù)谋Ｗo性mir或混合物或保護性mir的組合物。通過這樣來 做，由于通過提供了安全的、藥理學(xué)的和患者適宜的可選治療方案的預(yù)處理，在受損組織中 可取得相似的情況。預(yù)期地更好的患者依從性突出了這一類型治療的重要性。
[0391] 風(fēng)險因素評估的方法學(xué)在最近幾年已得到顯著改進。
[0392] 動脈硬化的風(fēng)險因素通常是心肌梗塞和其他器官（腦、腎、上肢和下肢、視網(wǎng)膜 等）梗塞的風(fēng)險因素。這類風(fēng)險因素例如：
[0393] -糖尿?。ㄓ?無胰島素耐受性）_缺血性心臟疾?。↖HD)的單一最重要的風(fēng)險因 素；
[0394] -吸煙；
[0395] -高膽固醇或升高的血液膽固醇水平（更準(zhǔn)確地說高脂蛋白血癥，特別是高低密 度脂蛋白和低高密度脂蛋白水平）；
[0396] -高甘油三酯水平；
[0397] -高血壓；
[0398] -缺血性心臟疾?。↖HD)的家族史；
[0399] -肥胖（定義為超過30kg/m2的身體質(zhì)量指數(shù)，或者可選地通過腰圍或腰臀比定 義）；
[0400] -年齡-男性在45歲將有獨立危險因素，女性在55歲將有獨立危險因素；此外， 如果個人有在55歲或在55之前患有冠狀血管病情的直系男性親屬（兄弟、父親），則他還 有其它獨立危險因素；如果個人有在65歲或小于65歲患有冠狀血管病情的直系女性親屬 (母親、姐妹），則他還有其它獨立風(fēng)險因素；
[0401]-高同型半胱氨酸血癥（血液中高半胱氨酸水平，當(dāng)例如服用維生素 B2、維生素 B6、B12和葉酸不足時，有毒的血氨基酸將升高）；
[0402]-壓力-高壓力指數(shù)的職業(yè)對于動脈粥樣硬化和由此導(dǎo)致的缺血性疾病的敏感性 是共知的；
[0403] -酒精-研究表明，長期接觸高量的酒精可增加心臟發(fā)作的風(fēng)險；
[0404] -男性比女性處于更高風(fēng)險。
[0405] 許多這些危險因素是可修飾的，所以很多心臟病發(fā)作可以通過保持健康的生活方 式來預(yù)防。個體形成心肌梗塞的易感性例如可通過使用由歐洲心臟病學(xué)會編寫的SCORE表 [Conroy RM 等，2003 ;www. heartscore. org]進行預(yù)測。
[0406] 患有高風(fēng)險或可能在中等風(fēng)險的心血管疾病或缺血性心臟疾病的患者應(yīng)適當(dāng)?shù)?尋求醫(yī)療建議，并且應(yīng)考慮用保護性mir進行治療（保護性mir治療）。優(yōu)選地，具有缺血 發(fā)作或急性心肌梗死導(dǎo)致的高死亡風(fēng)險的患者應(yīng)予以考慮?？赡艿嫩E象是CVD(心血管疾 病）得分高于3%，更優(yōu)選高于5%、7%、10%、15%或20% [Conroy RM等人，2003]。其他 風(fēng)險評估方法也是適用的。
[0407] 在本發(fā)明另一實施例中，后缺血細胞病變miRNA的拮抗劑（即病變mir的拮抗劑） 或后缺血細胞保護性miRNA的激動劑（即保護性mir的激動劑）將被給予經(jīng)受缺血、優(yōu)選 為急性缺血、并可能隨后再灌注的患者。
[0408] 在這種情況下，患者在缺血情況之后盡快、或者在再灌注（如果發(fā)生的話）期間或 之后不久可以得到適當(dāng)?shù)闹委熆赡苁侵陵P(guān)重要，可能包括給藥患者細胞保護性miRNA化合 物（包括保護性mir)。
[0409] 在住院后對患者狀況的快速評估也很重要。如果需要，外科介入（例如，PCI)可 能是必要的，以便實現(xiàn)再灌注或應(yīng)用再灌注治療。
[0410] 根據(jù)最近出版的ESC/EACTS指南[WijnsW等人，2010]，基本上會給出關(guān)于在血管 再生中的再灌注策略的下列建議。
[0411] 盡一切努力減少所有的時間延遲是有必要的，特別是癥狀出現(xiàn)后的第一個2小時 之內(nèi)。許可進入沒有PCI設(shè)備的醫(yī)院的患者應(yīng)當(dāng)轉(zhuǎn)移至PCI功能中心，并且如果預(yù)期的首次 醫(yī)療接觸（FMC)與球囊擴張之間的時間延遲小于2小時，則不應(yīng)當(dāng)給藥纖維蛋白溶解。如 果預(yù)期的延遲超過2小時（或者在某些超過75歲患者中超過90分鐘），許可進入非PCI中 心的患者應(yīng)立即接受纖維蛋白溶解，并隨后被轉(zhuǎn)移到PCI功能中心，其中，應(yīng)在3-24小時的 時間窗口內(nèi)執(zhí)行血管造影和PCI。
[0412] 延遲的PCI可在癥狀發(fā)作長達60小時或3天執(zhí)行。例如，這在不成功的纖維蛋白 溶解之后、或者如果首次醫(yī)療接觸發(fā)生不久、例如癥狀出現(xiàn)之后不遲于12或24小時可能是 必要的。然而，作者發(fā)現(xiàn)，在3至28天之間患者持續(xù)表現(xiàn)出冠狀動脈閉塞，則并沒有從PCI 中獲益。
[0413] 值得注意的是，在心源性休克的患者中，在癥狀發(fā)生與侵入性診斷以及再血管化 之間不應(yīng)該出現(xiàn)時間限制。
[0414] 已發(fā)現(xiàn)在癥狀出現(xiàn)后的6_12h之內(nèi)用高體積治療的主要PCI (即無纖維蛋白酶溶 解的PCI治療），有經(jīng)驗的中心顯示更有效的血管通暢的恢復(fù)，更少的再閉塞，可改善殘余 的LV(左室）功能，以及比在可比條件下的醫(yī)院纖維蛋白溶解療法更好的臨床結(jié)果。
[0415] PCI之前，預(yù)缺血性細胞病變miRNA化合物的拮抗劑和/或預(yù)缺血性細胞保護性 miRNA的化合物的激動劑的給藥應(yīng)在手術(shù)過程中及可能的缺血發(fā)作、或在自發(fā)的（進一步 的）缺血-再灌注損傷過程中提供保護作用。
[0416] 后缺血性細胞病變miRNA的拮抗劑和/或后缺血性細胞保護性miRNA的激動劑應(yīng) 該在治療性介入之前、期間和隨后即刻應(yīng)用。理由是，當(dāng)再灌注發(fā)生或發(fā)生不久之后，應(yīng)優(yōu) 選給予所述化合物，以鞏固或提供后處理的效果。
[0417] 以上列出了這些miRNA的給藥期限，其取決于所施加的介入。
[0418] 然而，以后給藥這些miRNA化合物也是可取的，以預(yù)防或減少缺血的長期效果。
[0419] 所述miRNA種類是否具有所尋求的效果，檢測了它們相對于非缺血對照或相對于 其他樣品，所述miRNA種類在樣品組織中是否顯著上調(diào)或下調(diào)。顯著上調(diào)或下調(diào)在本文被 理解為相對于其他在參考中使用的樣品中的表達水平分別地上調(diào)或下調(diào)，至少1.3倍，優(yōu) 選至少1. 5倍，更優(yōu)選至少1. 8倍，其以統(tǒng)計學(xué)顯著設(shè)置，其中p值小于顯著性水平的0. 1， 優(yōu)選為0.05或0.01。
[0420] 應(yīng)當(dāng)指出的是，這一顯著性水平，特別是1.5倍的水平，涉及測定的當(dāng)前靈敏度， 特別是miRNA微陣列方法。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，如果應(yīng)用了更靈敏的方法這可能會 改變。此外，用于評估表達水平的方法的靈敏度可能和很可能在未來會增加，正如過去發(fā)生 的那樣。因此，在不脫離本發(fā)明構(gòu)思的情況下，可發(fā)現(xiàn)其它miRNA顯著上調(diào)或下調(diào)。即使在 更靈敏的方法的情況下，表達水平的1. 3倍變化是實際閾值。
[0421] 已發(fā)現(xiàn)，在本領(lǐng)域中的實驗性方法和生物信息學(xué)方法中，在mRNA上的miRNA靶向 位點主要由所述miRNA的5'末端的"種源"區(qū)域的6或7個核苷酸確定，即成熟miRNA的 2至7、3至9、3至8或2至8的核苷酸位置。確定靶向位點（"3'_補償性位點"）的附加 區(qū)域在miRNA的3'部分發(fā)現(xiàn)，通常在位置13至18上或之內(nèi)[Robertson B.，2010 ;Small EM2010]。這兩個位點限定了相同或相關(guān)靶向位點及相同靶基因的miRNA家族。基于相同 的種源區(qū)域和靶向位點，miRNA被分入可能是靶向相同或靶基因位點相似的家族。此外，現(xiàn) 可以通過若干種方法預(yù)測miRNA祀基因 [Griffiths S.等，2006]。
[0422] 若干作者也發(fā)現(xiàn)，miRNA家族成員在心臟疾病中的調(diào)控近似[Olson E.和 Van Rooji, E. W02009/0621692009 ；01son Eric N. ；Rooij Eva Van ；Quiat Daniel W02011/0844602011]。本發(fā)明人的結(jié)果在若干例子中證實了這一發(fā)現(xiàn)。
[0423] 通過用長達8個核苷酸的微小鎖定核酸來特定沉默整個miRNA家族的這一發(fā)現(xiàn)進 一步支持這一想法[0bas S等，2011]。
[0424] 一旦miRNA種類被識別具有缺血-再灌注和預(yù)處理和/或后處理中給定的表達 模式，則它將根據(jù)上述解釋的本發(fā)明進行分類。因此，同一家族的其他成員將結(jié)合同樣的 靶向位點并且將調(diào)控同樣的或近似的基因模式將是合理的推測。事實上，本發(fā)明發(fā)明人已 發(fā)現(xiàn)，根據(jù)本發(fā)明，屬于同一家族的miRNA在樣品（即條件）中顯示出近似的表達調(diào)控模 式（關(guān)于這一點，參見 let-7 家族、miR-19a 和 19b、miR-139-3p 和 139-5p、miR-10a-5p 和 miR-10b)?？紤]到miRBase數(shù)據(jù)庫中miRNA數(shù)目漸增的事實，根據(jù)本發(fā)明的方法發(fā)現(xiàn)另外 的分類的miRNA的家族成員用于通過本發(fā)明的方法識別和制備miRNA在本領(lǐng)域技術(shù)人員的 技術(shù)范圍內(nèi)。一個或多個家族成員沒有確切相同的功能和效果可能是會發(fā)生的；然而，這可 以容易地通過本文公開的功能檢測進行確定，通過實施例3的細胞活力檢測、或通過使用 缺血/再灌注的、預(yù)處理的和后處理的樣品用于識別相關(guān)miRNA的方法。
[0425] miRNA測序和特征的數(shù)量在過去5至10年已成倍增加，miRNA序列目前儲存在 miRBase數(shù)據(jù)庫中，該數(shù)據(jù)庫為用于所有miRNA測序的主要數(shù)據(jù)庫。本發(fā)明人在相對較小的 一組miRNA中發(fā)現(xiàn)的細胞保護性和細胞毒性miRNA的數(shù)量清晰地表明通過重復(fù)本發(fā)明的方 法進一步有用的miRNA將被識別。一旦這樣的miRNA種類被識別，在本領(lǐng)域技術(shù)人員的技 術(shù)范圍內(nèi)能夠很好地制備miRNA激動劑（例如，miRNA模擬物）或miRNA拮抗劑（例如拮 抗mir)。因此，基于本發(fā)明可以清楚地預(yù)見，一旦數(shù)據(jù)庫增加，在技術(shù)人員的技術(shù)范圍內(nèi)可 以制備其它miRNA化合物，并且在本文中制備該類化合物是充分可行的。
[0426] 制備miRNA模擬物和miRNA抑制劑是在本領(lǐng)域技術(shù)人員的技術(shù)范圍內(nèi)的。基于該 序列，技術(shù)人員可從商業(yè)來源訂購模仿物和抑制劑。例如，可從賽默飛世爾（Thermo Fisher Scientific)有限公司的子公司Dharmacon訂購miRIDIAN miRNA模擬物和發(fā)夾抑制劑。 Quiagen的miScript miRNA模擬物是合成的、雙鏈RNA，其在轉(zhuǎn)染進入細胞后模仿自然出現(xiàn) 的miRNA。Quiagen還銷售miScript miRNA抑制劑，它們是合成的、單鏈的、經(jīng)化學(xué)修飾的 RNA，其在轉(zhuǎn)染進入細胞后特異性抑制miRNA的功能。模擬物和抑制劑可被轉(zhuǎn)染進入細胞 中，隨后通過下游進行的基因表達分析或表型分析闡明特定miRNA的靶向和作用。
[0427] Sigma-Aldrich提供MISSIONS.:人類miRNA模擬物，其為小的、雙鏈RNA分子， 當(dāng)被轉(zhuǎn)染進入細胞后模擬內(nèi)源性成熟miRNA分子。Sidma-Aldrich從貨架上提供了至少985 個人類miRNA模擬物，通常購買miRNA的1天內(nèi)發(fā)貨。作為一種服務(wù)，定購靶序列設(shè)計是可 行的。
[0428] Ambion的Anti-miR?miRNA的抑制劑是設(shè)計成特異性結(jié)合并抑制內(nèi)源性 miRNA (miRNA)分子的經(jīng)化學(xué)修飾的、單鏈核酸。即時可用和定制設(shè)計形式都是可行的。 Pre-miRTMmiRNA的前體分子設(shè)計成模擬內(nèi)源性成熟miRNA的、小的、經(jīng)化學(xué)修飾的雙鏈RNA 分子，其也可購于Ambion公司。
[0429] Exi qon提供miRCURY LNA?miRNA的抑制劑庫，并聲稱擁有目前市場上最全面的 miRNA抑制劑庫。該鎖核酸（LNA)抑制劑技術(shù)的科學(xué)背景例如由Kauppinen S公開（2007)。
[0430] 已經(jīng)表明的是，具有互補于成熟miRNA序列的抑制劑可以與所述miRNA-RISC核蛋 白復(fù)合物交互作用具有抑制效果。Vermeulen等（2007)教導(dǎo)了，高度結(jié)構(gòu)化的、圍繞在反 向互補核心的雙鏈側(cè)翼區(qū)的合并顯著增加抑制劑功能，并允許在次納摩爾（subnanomolar) 濃度的多重miRNA抑制。
[0431] 制備這些miRNA化合物背后的原則在現(xiàn)有技術(shù)中是已知的。
[0432] miRNA模擬物或抑制劑通常是穩(wěn)定化的，例如：通過硫代磷酸酯骨架修飾對抗生 物體中的降解。此外，各樣的核苷酸修飾，包括2' -0-甲基（2' -Ο-Me)和2' -0-甲氧基乙基 (2'-Μ0Ε)衍生物已被用于增強miRNA化合物的結(jié)合親和力和穩(wěn)定性。鎖核酸具有特別強的 結(jié)合力；因此，即使類似于種源序列的較短的序列也足以有效阻止miRNA種類的結(jié)合[Obad S.，2011]?；瘜W(xué)修飾和設(shè)計的方法由倫諾克斯KA (Lennox KA)提出（2011)。
[0433] 因此，基于根據(jù)本發(fā)明miRNA化合物所識別的miRNA種類，它的激動劑或拮抗劑是 現(xiàn)成可得的。
[0434] 用于靶向本發(fā)明的miRNA化合物的方法在現(xiàn)有技術(shù)中也是可得的。在 W02010129672A1中公開了親脂性多核苷酸軛合物，其中親脂性基團通過磷酸酯或者乙醚連 接軛合。在W02006137941A2中作者公開了引入合成的miRNA模擬物或抑制劑進入細胞的 方法，并公開了功能基團的連接方式。合成的RNA分子具有17-125個殘基長度，并包括具 有與部分成熟的miRNA序列等同的序列區(qū)域。
[0435] 將miRNA給藥于患者的靶組織可受若干方式影響。
[0436] 傳統(tǒng)上，注射miRNA化合物是最容易被接受的方法；然而，這是優(yōu)選地適用于靶向 肝、腎或脾的方法。
[0437] 封裝miRNA化合物于基于脂質(zhì)的制劑中，例如脂質(zhì)體或心導(dǎo)管可能更適于引入 miRNA進入心血管系統(tǒng)[Small EM2010]。
[0438] 該miRNA化合物可通過置于受損或損害組織或器官中的藥物洗脫裝置引入到血 液中。該類裝置為例如藥物-洗脫裝置。
[0439] 在某些實施例中，局部給藥是可能的，并且該藥物組合物可被配制為油膏、滴劑、 溶液、滴眼劑、軟膏或洗劑等。這類給藥可例如優(yōu)選在外圍血管疾病中。
[0440] 抑制劑或激動劑可以被引入到適當(dāng)?shù)慕M織中并在其中通過包括雙鏈DNA的表達 載體進行表達，該雙鏈DNA包括反義miRNA的兩個重復(fù)的DNA互補序列（W02009132351A2， CA2609142A1)。
[0441] 用于從表達的拮抗劑（例如反義miRNA)、或拮抗其他的影響的miRNA、以及是其他 激動劑的miRNA(如保護性mir)中引入序列的適合載體在本領(lǐng)域是公知的。該類載體包括 但不限于病毒載體，例如逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒、慢病毒、腺伴隨病毒載體、質(zhì)粒等。同樣地，用 于引入DNA或載體的方法是本領(lǐng)域已知的，并且包括但不限于電穿孔、脂質(zhì)轉(zhuǎn)染或其它的 已知轉(zhuǎn)染方法。在優(yōu)選實施例中，靶向的給定組織細胞被用來作為載體以攜帶所述可表達 的基因材料進入需被處理的組織。這些細胞可靶向所述組織，例如通過歸巢機制。該類細 胞可以是例如所述組織的干細胞、或者多潛能細胞或多能細胞。
[0442] 下面通過非限制性實驗實施例進一步說明本發(fā)明。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，基 于本文提供的本發(fā)明的多個一般性教導(dǎo)方法，存在有等同的方案并且是隨手可得的。
[0443] 識別組織保護性miRNA的實驗性治療方案
[0444] 雄性Wistar大鼠（250_300g)被麻醉并靜脈注射給予500U/Kg肝素。心臟隨后被 分離，并根據(jù)Langendorff使用所描述的充氧的、常溫的Krebs-Henseleit緩沖劑進行再灌 注[CSonkaC等，1999]。應(yīng)用了四種不同的再灌注治療方案（圖1)。對時間匹配的對照 組進行需氧灌注190min。在第二組中，通過30min左前降支冠脈閉塞誘導(dǎo)局部缺血后進行 120分鐘再灌注。在第三組中，心臟經(jīng)受預(yù)處理治療方案后再通過缺血-再灌注檢測。在 lOmin平衡之后，預(yù)處理通過3次5min局部缺血（被5min有氧灌注分隔）的間歇周期被誘 導(dǎo)。在第四組中，后處理通過在再灌注開始時立即施加的六次10秒心肌梗塞和10秒再灌 注的連續(xù)循環(huán)被誘導(dǎo)。在所有組中，貫穿整個灌注治療方案監(jiān)控心率和冠脈血流量（圖1)。 為了評估組織損傷的嚴(yán)重程度，通過在再灌注結(jié)束時用氯化三苯基四氮唑染色確定梗塞尺 寸（η = 8-10)，并通過面積法進行計算（梗塞尺寸2. 4 ;Pharmahungary，Szeged，Hungary)。 梗塞尺寸表示為處于風(fēng)險的面積的百分比[CsonkaC等，2010]。為進一步評估組織損傷， 使用取自缺血檢測后在再灌注5分鐘收集的冠脈流出物的LDH-P試劑盒（Diagnosticum, Budapest, Hungary)測量心臟釋放的乳酸脫氫酶（LDH) (η = 12)。LDH釋放被表示為毫單 位每分鐘每克濕心臟重量。
[0445] 為了證實預(yù)處理和后處理的心肌保護作用，在30分鐘局部缺血后進行120分鐘的 再灌注之后測量梗塞尺寸。相對于缺血-再灌注組的心臟，缺血預(yù)處理和缺血后處理組的 梗塞尺寸均顯著減?。ū?)。在冠狀動脈流出物中測量LDH釋放以進一步證實缺血性損 傷的發(fā)展。30分鐘缺血檢測后接受5min再灌注導(dǎo)致缺血再灌注組中顯著的LDH釋放（表 1)，這在缺血預(yù)處理和缺血后處理組中均是顯著降低的（表1)。心率或冠脈流量都不受灌 注結(jié)束時的任何介入的顯著影響（表1)。
[0446] 在獨立實驗中，取自所有組（每組中n = 6)的前壁心肌樣品在120min再灌注結(jié) 束時迅速被冷凍在液氣中用于miRNA分尚。在液氣中，在破壞各組中的6個心臟樣品后，將 樣品溶解于20%的由80 μ 1結(jié)合緩沖液和320 μ 1不含水的核酸酶制備的結(jié)合緩沖液中。 所有的其他步驟均根據(jù)從試劑盒的組織方案中分離miRNA操作（Roche，德國）。通過加入 100 μ 1的洗脫緩沖液將RNA從第二柱中洗脫。使用分光光度計（NanoDrop，美國）和2100 生化分析儀（安捷倫（Agilent)，加利福尼亞州（CA)，美國）進行定性和定量評估。將從各 組中的6個不同的樣品中提取的RNA的任意一對合并，并在微陣列中分析獲得的3個樣品 /組。
[0447] miRNA表達的微陣列分析和它通過QRT-PCR檢測的校驗
[0448] 使用安捷倫的miRNA完整標(biāo)記和Hyb試劑盒體系（安捷倫科技帕洛阿爾托 (Agilent Technologies Palo Alto)，加利福尼亞州，美國，p/n5190-0456)標(biāo)記總共 50ng 的 純的miRNA。該方案簡要如下：25-25ng的兩個平行樣品被合并于2μ 1的終體積、并在4μ 1 的終體積中使用牛小腸堿性磷酸酶（CIP)在37°C經(jīng)脫磷酸作用反應(yīng)30分鐘。在第二步中， 添加2. 8 μ 1的DMS0到每一樣品中用于在100°C變性5分鐘，并立即置于冰上。在這一步驟 之后，在11. 3 μ 1的總體積中使用T4RNA連接酶和Cyanine3-pCp在16°C進行連接反應(yīng)2小 時以標(biāo)記該RNA樣品。標(biāo)記的樣品在中高（45°C)熱定型中完全真空干燥，并雜交到安捷倫 8x15k大鼠 miRNA微陣列（安捷倫科技，帕洛阿爾托，加利福尼亞州，美國p/n G4473A)的表 面上。包含探針的微陣列用于以下350個來自Sanger數(shù)據(jù)庫vlO. 1的miRNA(miRBase最近 由BBSRC資助在曼徹斯特大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院維持，并通過韋爾科姆基金會桑格（Wellcome Trust Sanger)學(xué)院預(yù)先主辦和支持）：
[0449]
[0450]

【權(quán)利要求】
1. 一種miRNA化合物，所述miRNA化合物用于在治療時，在易感染于缺血或缺血發(fā)作的 患者中、在所述患者的心臟中，保護細胞、組織和/或器官免于急性缺血和再灌注損傷的短 期和/或直接影響， 其中，所述miRNA化合物在所述缺血發(fā)作之后5、4、3、2或1.5小時內(nèi)、或與再灌注同時 給藥于患者，和/或，在與缺血風(fēng)險相關(guān)的手術(shù)或介入之前少于1天或少于12、8、6、5、4、3、 2或1小時給藥于患者， 其中，所述miRNA化合物選自 ii ) miRNA激動劑 -一 miRNA種類的miRNA激動劑，相對于承受缺血和再灌注的對照心臟組織樣品，在承 受缺血和再灌注的所述細胞或組織的預(yù)處理期間，哺乳動物心臟組織樣品中的所述miRNA 種類被上調(diào)至少1. 5倍，且所述miRNA種類是預(yù)缺血性細胞保護性miRNA種類，和/或 -一 miRNA種類的miRNA激動劑，相對于承受缺血和再灌注的對照心臟組織樣品，在承 受缺血和再灌注的所述細胞或組織的后處理期間，哺乳動物心臟組織樣品中的所述miRNA 種類被上調(diào)至少1. 5倍，且所述miRNA種類是后缺血性細胞保護性miRNA種類， iii) miRNA拮抗劑 -一 miRNA種類的miRNA拮抗劑，由于承受缺血和再灌注的所述細胞或組織的預(yù)處理， 相對于承受缺血和再灌注的對照心臟組織樣品，在哺乳動物心臟組織樣品中的所述miRNA 種類被下調(diào)至少1. 5倍，且所述miRNA種類是預(yù)缺血性細胞病變miRNA種類，和/或 -miRNA種類的miRNA拮抗劑，由于承受缺血和再灌注的所述細胞或組織的預(yù)處理，所 述miRNA種類在哺乳動物心臟組織樣品中相對于承受缺血和再灌注的對照心臟組織樣品 中被下調(diào)至少1. 5倍，且所述miRNA種類是后缺血性細胞病變miRNA種類， 其中，所述miRNA激動劑或拮抗劑為核酸部分，所述核酸部分包含等同于或互補于相 應(yīng)miRNA種類的種源區(qū)的核苷酸序列，和/或所述核酸部分包括17到27個核苷酸長度的 核酸片段，所述核酸片段的序列等同于成熟miRNA種類的序列或等同于所述成熟miRNA種 類的互補序列、或者分別與所述成熟miRNA種類的序列或所述成熟miRNA種類的互補序列 中最多1、2、3、4、5或6個核苷酸不同。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的供使用的miRNA化合物，其中，所述miRNA激動劑為一 miRNA 種類的激動劑，所述miRNA種類同時是預(yù)缺血性細胞保護性miRNA種類及后缺血性細胞 保護性miRNA種類，其中優(yōu)選地所述miRNA種類選自miR-118、miR-125b*、miR-139-3p、 miR-320 和 miR-532-3p 的組， 和/或 所述miRNA拮抗劑是一 miRNA種類的拮抗劑，所述miRNA種類同時是預(yù)缺血性細胞病 變miRNA種類和后缺血性細胞病變miRNA種類，其中優(yōu)選地所述miRNA種類選自miR-352 和miR-93的組。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的供使用的miRNA化合物，其中，所述miRNA化合物是 選自 miR-333、miR-188、miR-125b*、miR-139-3p、miR-320、miR-532-3p、miR-451、 miR-212、miR-192、miR-139-5p、miR-503、miR-33、miR-328、miR-181a、miR-7b 及它們的任 何組合的組的miRNA種類的miRNA激動劑，和/或 選自 miR-487b、miR-208、miR-19b、miR-19a、miR-352、miR-93、miR-494、miR-106b 或 它們的任意組合的組的miRNA種類的miRNA拮抗劑。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的供使用的miRNA化合物，其中，所述miRNA化合物是 選自 miR-125b*、miR-139-3p、miR-532-3p、miR-212、miR-139-5p、miR-33、miR-let7b 的組的miRNA種類的miRNA激動劑，和/或 選自miR-494、miR-487b和它們的任意組合的組的miRNA種類的miRNA拮抗劑。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的供使用的miRNA化合物，其中，所述miRNA化合物選自它本 身或選為來自以下組的組合，所述組由miRNA種類miR-139-5p、miR-33、miR-125b*、let-7b 的激動劑，miRNA種類miR-494和miR-487b的拮抗劑組成，并且所述miRNA激動劑或拮抗 劑包括核苷酸序列，所述核苷酸序列與所述miRNA種類的種源區(qū)等同或互補，和/或所述核 苷酸序列包括17到27個核苷酸長度的核酸片段，所述核酸片段的序列與所述miRNA種類 的序列等同或互補，或者與所述所述miRNA種類或所述互補序列中最多1、2、3、4、5或6個 核苷酸不同，其中所述miRNA化合物在心肌細胞存活性測試中顯示了細胞保護作用。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的miRNA化合物，其中， 所述預(yù)缺血性細胞保護性miRNA種類選自由以下組成的組：miR-320、miR-139-3p、 11^1?-139-5?、11^1?-188、11^1?-192、11^1?-532-3?、11^1?-12513*、11^1?-451、11^1?-212、它們的前體、與 它們具有相同的種源區(qū)的miRNA種類、為它們的家族成員的miRNA種類，和/或 所述后缺血性細胞保護性miRNA種類選自由以下組成的組：miR-125b*、miR-33、 miR-139_3p、miR-320、miR-532_3p、miR_let7e、miR_let7i、miR-1、miR-503、miR-328、 miR-181a、miR-7b、它們的前體、與它們具有相同的種源區(qū)的miRNA種類、為它們的家族成 員的miRNA種類，和/或 所述預(yù)缺血性細胞病變miRNA種類選自由以下組成的組：mir-487b、miR-352、miR-93、 它們的前體、與它們具有相同的種源區(qū)的miRNA種類、為它們的家族成員的miRNA種類，和 /或 所述后缺血性細胞病變miRNA種類選自由miR-208、miR-19b、miR-19a、和miR-130a、 miR-16、miR-21、miR-22*、miR_26b、miR-30b_5p、miR_30c、miR-30c_l*、miR_30e、 miR-339_3p、miR_450a、miR-499、miR-760_5p、miR_99a、miR_99a* 組成的組。
7. 根據(jù)權(quán)利要求1至6任一項所述的miRNA化合物，其中，所述miRNA化合物在缺血發(fā) 作之后4或3小時內(nèi)、或與再灌注同時給藥于患者，和/或在手術(shù)或介入之前少于6小時給 藥于患者。
8. 根據(jù)權(quán)利要求1至7任一項所述的miRNA化合物，其中，在預(yù)處理或后處理期間，在 所述哺乳動物心臟組織樣品中分別地對所述mi RNA激動劑或mi RNA拮抗劑的上調(diào)或下調(diào)通 過以下方法進行評價： i)提供一組包含表達的miRNA種類的生物樣品，所述樣品組包括： 對照樣品， 第一樣品，和 第二樣品，和/或 第三樣品 其中，所述樣品能夠經(jīng)受缺血， ? )使每個樣品承受需氧灌注一段時間，并且在這段時間內(nèi) 使所述對照樣品既不承受缺血也不承受預(yù)處理或后處理，從而獲得非缺血對照樣品， 和 使所述第一樣品承受缺血，優(yōu)選承受缺血和再灌注，從而獲得缺血樣品，和 通過使所述第二樣品承受預(yù)處理治療方案并隨后承受缺血來預(yù)處理所述第二樣品，從 而獲得預(yù)處理的樣品，和/或 通過使所述第三樣品承受缺血并承受后處理治療方案來后處理所述第三樣品，從而獲 得后處理的樣品， 優(yōu)選地，在缺血后不超過5小時后分離miRNA ; iii) 評價所述miRNA種類的表達水平 -在非缺血對照樣品中 -相對于所述非缺血對照樣品，在所述缺血樣品中，和 -相對于所述非缺血對照樣品，在所述預(yù)處理的樣品中，和/或 -相對于所述非缺血對照樣品，在所述后處理的樣品中， iv) 計算所述miRNA種類的表達水平的比率 -相對于所述缺血樣品，在所述預(yù)處理的樣品中，和/或 -相對于所述缺血樣品，在所述后處理的樣品中 v) 相對于所述缺血/再灌注樣品，在所述預(yù)處理的樣品和/或所述后處理的樣品中，識 別所述miRNA種類的表達水平被上調(diào)至少1. 5倍或下調(diào)至少1. 5倍， vi) 獲得所述miRNA種類的核苷酸序列。
9. 根據(jù)權(quán)利要求1至8任一項所述的miRNA化合物，其中，所述miRNA種類在承受缺血 和再灌注的對照心臟組織樣品中是 -相對于非缺血對照樣品顯著上調(diào)， -相對于非缺血對照樣品顯著下調(diào)， -相對于非缺血對照樣品既不顯著上調(diào)也不顯著下調(diào)。
10. -種用于預(yù)防或治療易感染于缺血或缺血發(fā)作的患者體內(nèi)缺血和/或再灌注損傷 影響的miRNA化合物， 其中，所述miRNA化合物選自由以下任一 miRNA種類的miRNA激動劑組成的組： miR-333、miR-188、miR_125b*、miR-139_3p、miR-532_3p、miR-451、miR-139_5p、miR-503、 miR-33、miR-328、miR-18la ;以及以下任一 miRNA 種類的 miRNA 拮抗劑：miR-487b、 miR-208、miR-19b、miR-19a、miR-352、miR-93、miR-106b，和包括等同于或互補于所述 miRNA 種類的種源區(qū)的核苷酸序列的miRNA激動劑或拮抗劑，和/或所述miRNA激動劑或拮抗劑 包含17到27個核苷酸長度的核酸片段，所述核酸片段的序列等同于成熟miRNA的序列、或 等同于所述成熟miRNA的互補序列，或與所述成熟miRNA或所述互補序列中最多1、2、3、4、 5或6個核苷酸不同和它們的任一組合。
11. 至少兩個根據(jù)權(quán)利要求1至10任一項所述的miRNA化合物的組合，其中，所述組合 包括至少miRNA拮抗劑和miRNA激動劑， 所述激動劑和拮抗劑包括等同于或互補于所述miRNA種類的種源區(qū)的核苷酸序列，和 /或所述激動劑和拮抗劑包括17到27個核苷酸長度的核酸片段，所述核酸片段的序列等 同于成熟miRNA種類的序列或等同于所述成熟miRNA種類的互補序列、或與所述所述成熟 miRNA種類或所述互補序列中最多1、2、3、4、5或6個核苷酸不同，其中，所述miRNA化合物 在心肌細胞的存活性測試中顯示了細胞保護作用。
12. 根據(jù)權(quán)利要求11所述的miRNA化合物的所述組合，其中，miRNA種類的所述miRNA 激動劑選自miR-139-5p、miR-33、miR-125b*、let-7b的組，并且miRNA種類的所述miRNA拮 抗劑選自miR-494和miR-487b的組。
13. -種藥物組合物，所述藥物組合物用于在治療時，在易感染于缺血或缺血發(fā)作的患 者體內(nèi)、在易感染于急性缺血或急性缺血發(fā)作的患者的心臟中，保護細胞、組織和/或器官 免于急性缺血和再灌注損傷的短期和/或直接影響， 所述組合物包括一個或多個權(quán)利要求1至12中任一項所限定的miRNA化合物及藥學(xué) 上可接受的賦形劑。
14. 一種用于獲取用于在治療時，在易感染于急性缺血或急性缺血發(fā)作的患者心臟 中，保護細胞、組織和/或器官免于急性缺血和再灌注損傷的短期和/或直接影響的微小 RNA (miRNA)化合物的方法，所述方法包括 i)提供一組包括表達的miRNA種類的生物樣品，所述樣品組包括 對照樣品， 第一樣品，和 第二樣品，和/或 第三樣品 其中，所述樣品能夠經(jīng)受缺血， ? )使每個樣品承受需氧灌注一段時間，并在這段時間內(nèi) 使對照樣品既不承受缺血也不承受預(yù)處理或后處理，從而獲得非缺血對照樣品，和 使第一樣品承受缺血，從而獲得缺血樣品，和 通過使所述第二樣品承受預(yù)處理治療方案并隨后承受缺血來預(yù)處理所述第二樣品，從 而獲得預(yù)處理的樣品，和/或 通過使所述第三樣品承受缺血并承受后處理治療方案來后處理所述第三樣品，從而獲 得后處理的樣品 iii) 評價miRNA種類的表達水平 -在所述非缺血性對照樣品中 -相對于所述非缺血對照樣品，在所述缺血樣品中，和 -相對于所述非缺血對照樣品，在所述預(yù)處理的樣品中，和/或 -相對于所述非缺血對照樣品，在所述后處理的樣品中，和 iv) 計算所述miRNA種類的表達水平的比率 -相對于所述缺血樣品，在所述預(yù)處理的樣品中，和/或 -相對于所述缺血樣品，在所述后處理的樣品中， v) 相對于所述缺血/再灌注樣品，在所述預(yù)處理的樣品和/或所述后處理的樣品中，識 別miRNA種類的表達水平被上調(diào)至少1. 5倍或下調(diào)至少1. 5倍， vi) 獲得所述miRNA種類的所述核苷酸序列 vii) 合成miRNA化合物，其中，所述miRNA化合物為所述miRNA種類的激動劑或拮抗 劑，并且所述miRNA化合物為核酸部分，所述核酸部分包括等同于或互補于相應(yīng)miRNA種類 的種源區(qū)的核苷酸序列，和/或所述miRNA化合物包括17到27個核苷酸長度的核酸片段， 所述核酸片段的序列等同于成熟miRNA的序列或等同于所述成熟miRNA的互補序列、或分 別與所述成熟miRNA或所述互補序列中最多1、2、3、4、5或6個核苷酸不同。
15. 根據(jù)權(quán)利要求14所述的方法，其中，所述miRNA化合物選自由以下任一 miRNA 種類的 miRNA 激動劑組成的組：miR-333、miR-188、miR-125b*、miR-139-3p、miR-320、 miR-532_3p、miR-451、miR-212、miR-192、miR-139_5p、miR-503、miR-33、miR-328、 miR-181a、miR-7b ;以及以下任一 miRNA 種類的拮抗劑：miR-487b、miR-208、miR-19b、 miR-19a、miR-352、miR-93、miR-494、miR-106b，以及它們的任意組合。
16. 根據(jù)權(quán)利要求15所述的方法，其中，所述miRNA化合物選自由以下任一 miRNA種 類的 miRNA 激動劑組成的組：miR-125b*、miR-139-3p、miR-532-3p、miR-212、miR-139-5p、 miR-33、miR_let7b，以及以下任一 miRNA種類的miRNA拮抗劑組成的組：miR-494、 miR-487b，以及它們的任意組合。
【文檔編號】A61P9/10GK104053775SQ201280062508
【公開日】2014年9月17日 申請日期:2012年10月17日 優(yōu)先權(quán)日:2011年10月17日
【發(fā)明者】彼得·費迪南德, 佐爾坦·沃爾高, 塔馬斯·坎森特, 阿尼哥·戈爾比 申請人:醫(yī)藥匈牙利2000有限公司